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DETERMINACIÓN DE BACTERIAS EN EL AIRE DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y
RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO
JOSÉ DE CALDAS ASOCIADAS A POSIBLES AFECCIONES EN LA
SALUD.
CÉSAR ALBERTO ROMERO BOHÓRQUEZ
CÓDIGO: 20092485018
DIEGO FERNANDO CASTAÑEDA ALVARADO
CÓDIGO: 20111085018
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES.
TECNOLOGÍA EN SANEAMIENTO AMBIENTAL.
BOGOTÁ D.C., 2015
DETERMINACIÓN DE BACTERIAS EN EL AIRE DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA DE LA FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y
RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO
JOSÉ DE CALDAS ASOCIADAS A POSIBLES AFECCIONES EN LA
SALUD.
CÉSAR ALBERTO ROMERO BOHÓRQUEZ
DIEGO FERNANDO CASTAÑEDA ALVARADO
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO EN TECNOLOGÍA EN
SANEAMIENTO AMBIENTAL.
DIRECTORA: GLORIA STELLA ACOSTA PEÑALOZA, MSc.
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES.
TECNOLOGÍA EN SANEAMIENTO AMBIENTAL.
BOGOTÁ D.C., 2015
Nota de aceptación:
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__________________________________________
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__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________
Firma de la Directora.
__________________________________________
Firma del Jurado.
Bogotá D.C., Noviembre de 2015.
4
AGRADECIMIENTOS.
Ofrecemos nuestros agradecimientos
A Dios por brindarnos la vida y sabiduría para realizar el proyecto de
investigación.
A nuestros padres por su paciencia, acompañamiento y solidaridad en todo el
transcurso del proyecto.
Al Centro de Investigaciones y Desarrollo Científico de la Universidad Distrital
Francisco José de Caldas (CIDC) por el apoyo financiero que permitió el
cumplimiento de los objetivos y la finalización del proyecto de investigación.
A la profesora Gloria Stella Acosta Peñaloza por su constante apoyo, su
enseñanza, paciencia y ser motivadora en el planteamiento del proyecto de
investigación.
A los auxiliares del laboratorio de microbiología Oscar Romero y Aleyda Ariza
por ser una guía en el proceso del laboratorio durante la ejecución del
proyecto de investigación.
5
TABLA DE CONTENIDO.
AGRADECIMIENTOS. ........................................................................................ 4
LISTA DE TABLAS. ............................................................................................ 7
LISTA DE FIGURAS. .......................................................................................... 8
LISTA DE ANEXOS. ........................................................................................... 9
RESUMEN. ....................................................................................................... 10
ABSTRACT. ...................................................................................................... 11
1. INTRODUCCIÓN. ......................................................................................... 12
2. OBJETIVOS.................................................................................................. 16
2.1. Objetivo general. .................................................................................. 16
2.2. Objetivos específicos. .......................................................................... 16
3. MARCO TEÓRICO. ...................................................................................... 17
3.1. Aerobiología. ........................................................................................ 17
3.2. Métodos e instrumentos para la recuperación de bacterias en el aire. 19
3.2.1. Técnica de sedimentación por gravedad. ...................................... 19
3.2.2. Técnica de filtración. ..................................................................... 19
3.2.3. Técnica de impacto sobre superficies sólidas. .............................. 20
3.2.4. Técnica de borboteo en líquidos. .................................................. 20
3.3. Ambientes internos. ............................................................................. 20
3.4. Síndrome del edificio enfermo. ............................................................ 22
3.5. Patógenos en el aire. ........................................................................... 23
3.5.1. Bacterias Gram positivas en el aire. .............................................. 24
3.5.2. Bacterias Gram negativas en el aire. ............................................ 26
3.6. Grupos de riesgo de los agentes biológicos. ....................................... 28
3.7. Estadísticas BBL Crystal. ..................................................................... 29
4. METODOLOGÍA. .......................................................................................... 30
4.1. Recolección de muestras. .................................................................... 30
6
4.2. Conteo y aislamiento de bacterias. ...................................................... 33
4.3. Identificación de las bacterias recuperadas. ........................................ 33
4.3.1. Identificación macroscópica y microscópica de las bacterias
recuperadas. .......................................................................................... 33
4.3.2. Siembra en medios selectivos y realización de pruebas
bioquímicas. ........................................................................................... 34
4.3.3. Identificación de bacterias mediante el kit BBL Crystal. ................ 35
4.4. Procesos de inocuidad en los procedimientos del laboratorio. ............ 36
4.4.1. Protocolo de esterilidad. ................................................................ 36
4.4.2. Control de calidad de medios de cultivo. ....................................... 37
4.4.3. Control de ambientes. ................................................................... 37
5. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS. ......................................... 38
5.1. Conteo de colonias recuperadas. ........................................................ 38
5.2. Relación entre los factores del entorno del laboratorio con las bacterias
recuperadas durante los muestreos. ............................................................. 39
5.3. Características microscópicas de las colonias recuperadas. ............... 43
5.4. Siembra en medios selectivos de las colonias recuperadas. ............... 44
5.5. Identificación de bacterias obtenidas en la toma de muestras para la
recuperación de Clostridium sp. mediante pruebas bioquímicas. .................. 49
5.6. Identificación de bacterias seleccionadas mediante BBL Crystal. ....... 50
5.7. Pruebas confirmativas para las bacterias identificadas mediante el kit
BBL Crystal. ................................................................................................... 51
5.8. Relación entre las bacterias identificadas con las afecciones en la
salud. ………………………………………………………………………………..53
6. CONCLUSIONES ......................................................................................... 58
7. RECOMENDACIONES ................................................................................. 59
8. BIBLIOGRAFIA. ............................................................................................ 60
9. ANEXOS. ...................................................................................................... 67
7
LISTA DE TABLAS.
Tabla 1. Toma de muestras para bacterias presentes en el aire del
laboratorio de microbiología. ......................................................................... 31
Tabla 2. Toma de muestras para la recuperación de Clostridium sp. en el
laboratorio de microbiología. ......................................................................... 31
Tabla 3. Conteo de colonias por punto muestreo. ........................................ 38
Tabla 4. Relación de las variables ambientales con el número de bacterias
recuperadas (UFC/15 min/63.61cm2) ........................................................... 40
Tabla 5. Morfología microscópica de las bacterias recuperadas. ................. 44
Tabla 6. Bacterias presuntivas seleccionadas para identificar a partir de
medios selectivos. ......................................................................................... 45
Tabla 7. Identificación mediante pruebas bioquímicas por punto de muestreo.
...................................................................................................................... 49
Tabla 8. Resultados de identificación de bacterias mediante el Kit BBL
Crystal ........................................................................................................... 51
Tabla 9. Pruebas bioquímicas confirmativas. ............................................... 52
Tabla 10. Relación de enfermedades e infecciones con bacterias
identificadas. ................................................................................................. 53
8
LISTA DE FIGURAS.
Figura 1. Puntos de recolección de muestras. ............................................. 32
Figura 2. Relación entre la humedad relativa y el número de colonias en la
clase de microbiología. ................................................................................. 41
Figura 3. Relación entre la humedad relativa y el número de colonias en la
clase de biorremediación. ............................................................................. 42
Figura 4. Relación entre la humedad relativa y el número de colonias en la
toma de muestras para la recuperación de Clostridium sp. .......................... 43
9
LISTA DE ANEXOS.
Anexo 1. Toma de muestras preliminares de bacterias en el aire.
Anexo 2. Procedimiento de anaerobiosis en la cámara Anaerojar de Oxoid.
Anexo 3. Procedimiento de identificación BBL Crystal.
Anexo 4. Preparación de medios de cultivo.
Anexo 5. Número y morfologías por punto de muestreo.
Anexo 6. Número y morfologías por punto de muestreo para la recuperación
de Clostridium sp.
10
RESUMEN.
La investigación se realizó para determinar la posible exposición a bacterias
patógenas transmitidas por el aire y determinar riesgos potenciales sobre la
salud del personal que realiza actividades en el laboratorio de microbiología
de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco José de Caldas.
Las muestras de aire se tomaron por el método de sedimentación por
gravedad en agar nutritivo (AN) para bacterias aerobias y en Sulfito
Polimixina Sulfadiazina (SPS) para anaerobias. Los muestreos se realizaron
en dos puntos del laboratorio en tiempos con diferentes actividades. Después
de la incubación (37C, 48 h.) se realizaron recuentos y se informaron como
UFC/15min/63.61cm2. Después de obtener colonias puras por repiques en
AN a partir de las bacterias recuperadas, las colonias fueron caracterizadas
microscópicamente (Gram) y macroscópicamente (morfología de colonia), y
fueron sembradas en medios selectivos y diferenciales, para posteriormente
ser identificadas por el sistema BD BBL Crystal.
En los muestreos se obtuvo mayor cantidad de bacterias Gram positivas que
Gram negativas, identificándose Micrococcus sedentarius, Staphylococcus
sp., S. haemolyticus, S. capitis, S. cohnii sp. cohnii, S. hominis y S. lentus.
Así mismo, Leuconostoc pseudomesenteroides, Bacillus subtilis y
Corynebacterium renale Group. asociados con infecciones pulmonares y
reacciones alérgicas. En cuanto a las Gram negativas se identificaron
Pseudomonas sp., P. stutzeri y P. Putida, Yersinia pseudotuberculosis, Y.
enterocolitica Group., Serratia fonticola, Shigella sp., Klebsiella pneumoniae
sp. ozaenae, Citrobacter freundii y Acinetobacter iwoffii, causantes de
infecciones respiratorias y linfadenitis.
Palabras clave: Aerobiología, bioaerosoles en el aire, síndrome del edificio
enfermo, bacterias patógenas del aire.
11
ABSTRACT.
This research has been conducted to find possible exposure to airborne
bacterial pathogens, and evaluate potential risks to human health who
performing activities at the Microbiology Laboratory of Environment and
Natural Resources Faculty at the Distrital Francisco José de Caldas
University.
Air samples were taken by the sedimentation technique in Nutrient Agar (NA)
for aerobic bacteria and Sulfite Polymyxin Sulfadiazine (SPS) for anaerobic
bacteria in two points of the laboratory, different times with different activities.
After incubation to 37C for 48 h., the results were reported as
UFC/15min/63.61cm2, and the pure cultures of recuperated colonies were
characterized with Gram strain and colony morphology. The isolated bacteria
were re-cultured in selective and differential agars and finally they were
identified using the BD BBL Crystal system.
The results showed that the number of Gram positive bacteria were greater
that Gram negative bacteria, Micrococcus sedentarius, Staphylococcus sp.,
S. haemolyticus, S. capitis, S. cohnii sp. Cohnii, S. hominis and S.
lentus. Likewise, Leuconostoc pseudomesenteroides, Bacillus subtilis and
Corynebacterium renale Group. associated with pulmonary infections and
allergic reactions. Gram negative bacteria were identified as Pseudomonas
sp., P. stutzeri and P. Putida, Yersinia pseudotuberculosis, Y. enterocolitica
Group., Serratia fonticola, Shigella sp., Klebsiella pneumoniae sp. ozaenae,
Citrobacter freundii and Acinetobacter iwoffii, cause respiratory infections and
lymphadenitis.
Key words: Aerobiology, bioaerosol, sick building syndrome, airbone
pathogenic bacteria.
12
1. INTRODUCCIÓN.
La aerobiología es una ciencia multidisciplinaria que se encarga de estudiar
la retención, dispersión, deposición, supervivencia e incidencia atmosférica
de los microorganismos del aire incluyendo el estudio de partículas y/o gases
abióticos que afectan a los organismos vivos, teniendo como referencia la
microbiología y la química atmosférica (Recio, 1999; Rosas, Gravioto &
Ezcurra, 2004).
Aunque la atmósfera no cuenta con una microbiota autóctona, es un medio
de dispersión de microorganismos que pueden ser transportados en forma de
bioaerosoles con el movimiento del aire (Labarrere, Gómez, Ávila, Guevara,
& Fernández, 2003).
Estos agentes biológicos transportados tienen un impacto en la calidad del
aire interno y externo de edificios, viviendas, hospitales y laboratorios, dentro
de los cuales se encuentran hongos, bacterias, virus, insectos y roedores
(Campos Rodríguez, 2001).
La composición y la concentración de los microorganismos, varía de
acuerdo, al tipo de edificación, características de construcción, localización
geográfica, número de personas presentes, actividades que se realizan,
sistemas de ventilación, limpieza del sitio y condiciones microclimáticas como
humedad relativa y temperatura (Jones y Harrison, 2004). Los laboratorios,
por ejemplo, pueden proporcionar las condiciones de acumulación y
proliferación de microorganismos, así como la acumulación de compuestos
orgánicos (Campos Rodríguez, 2001).
Algunos microorganismos resisten condiciones de sequedad y pueden
permanecer vivos en el polvo durante largos periodos de tiempo, facilitando
su supervivencia y su dispersión. Estudios recientes demuestran que el aire
juega un papel importante en la transmisión de infecciones, evidenciando que
13
ciertas infecciones que son transmitidas por medio del aire provocan
enfermedades, causan brotes epidémicos, contaminación y alteración de
alimentos, de materiales orgánicos e inorgánicos, como cueros, textiles y
papel (De la Rosa, Ullán, Prieto, & Mosso, 2000).
Las bacterias presentes en el aire interior que generalmente predominan
debido a su mayor supervivencia son las Gram positivas. Las bacterias Gram
negativas suelen permanecer y sobrevivir en el aire aunque por periodos de
tiempo cortos (González Becerra, 2006).
En la actualidad, no existen parámetros que determinen las concentraciones
permisibles de patógenos en el aire. Algunos estudios consideran que el
límite permisible para bacterias Gram negativas en ambientes internos esta
entre 300 a 1000 UFC/m3; es por ello que algunos investigadores han visto la
necesidad de determinar las fuentes, concentraciones y/o la transmisión
potencial de especies patógenos como ejemplo Clostridium, Escherichia,
Salmonella, Bacillus entre otros (González Becerra, 2006).
Estas bacterias patógenas pueden llegar a producir infecciones y
enfermedades que al complicarse pueden ocasionar la muerte,
especialmente si las defensas en la persona se debilitan; los casos de
enfermedades más relacionadas son las neumonías, endocarditis, meningitis,
faringitis, fiebre y problemas cardiovasculares, entre otras (Cruz Orjuela &
Jiménez Pallares, 2010).
Por otro lado, se han utilizado diferentes métodos e instrumentos para la
captura de microorganismos en el aire, antes de elegir alguno de ellos se
debe considerar el tipo de investigación, la información que se necesita,
determinar previamente si el interés es saber el número total de
microorganismos, si se desea identificarlos y cultivarlos o sólo observar su
morfología microscópica, así como tener en cuenta el dinero para invertir en
el proyecto a investigar, puesto que, algunos métodos o la utilización de
14
varios de ellos puede resultar costosa (Hernández López & Marín Ramírez,
2013).
Es así que, la técnica de sedimentación por gravedad implementada por
primera vez en el año de 1887, se encuentra dentro de las más utilizadas, al
ser económica, práctica, que puede realizarse en cualquier espacio y
representa una excelente herramienta para trabajos cualitativos (González
Becerra, 2006).
El laboratorio de microbiología objetivo del estudio se encuentra ubicado en
un primer nivel en el costado del edificio de la parte norte de la sede Vivero
de la Facultad de Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco José de Caldas. Actualmente, en este laboratorio se llevan
a cabo trabajos académicos de clases y de investigación, con un número alto
de estudiantes en donde hay manipulación directa e indirecta de
microorganismos, siendo un lugar físico que no consigue brindar las
condiciones requeridas de infraestructura, ventilación y espacio; situación
que puede ser una causa de contaminación, diseminación y reserva de
microorganismos, aumentando la probabilidad de presentarse efectos sobre
la salud de las personas que lo ocupan.
Debido a esta situación y puesto que no se conoce un estudio de
microorganismos en el aire del laboratorio, fue apropiado realizar el conteo y
la identificación de las bacterias presentes en el aire y relacionarlas con
posibles afecciones en la salud, considerando que es imprescindible conocer
géneros y especies y/o concentración de microorganismos en ambientes
internos como componente elemental de prevención de enfermedades
(Labarrere et al, 2003).
Actualmente se reconoce que diferentes bacterias causan infecciones y
enfermedades tales como, neumonías, endocarditis, meningitis, tuberculosis,
infecciones respiratorias, otitis, infecciones en heridas y afecciones
15
superficiales en la piel, principalmente en personas inmunodeprimidas (Cruz
Orjuela & Jiménez Pallares, 2006).
El presente proyecto planteó la determinación de las bacterias en el aire del
laboratorio de microbiología de la Facultad de Medio Ambiente y Recursos
Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas mediante el
método de sedimentación por gravedad, realizando conteo, reconocimiento
macroscópico, microscópico e identificación mediante BBL Crystal de
colonias previamente seleccionadas con medios selectivos, haciendo
relación con las posibles afecciones a la salud a la que pueden estar
expuestos los grupos que realizan actividades académicas, laborales y de
investigación en el laboratorio.
16
2. OBJETIVOS.
2.1. Objetivo general.
Cuantificar e identificar las bacterias presentes en el aire del laboratorio de
microbiología relacionadas con posibles afecciones en la salud.
2.2. Objetivos específicos.
Clasificar microscópicamente las bacterias obtenidas en cada uno de los
muestreos.
Determinar la presencia o ausencia de bacterias patógenas como
Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., Bacillus sp., Clostridium sp. y
Enterobacterias.
Relacionar las bacterias encontradas con posibles afecciones sobre la
salud.
17
3. MARCO TEÓRICO.
3.1. Aerobiología.
La aerobiología es una ciencia en desarrollo que siendo una rama de la
biología, busca enfocarse en el estudio del transporte de organismos y
partículas de origen biológico presentes en el aire de ambientes internos y
externos; que incluye la medicina, la física y la química, con el objetivo de
conocer, el origen de los organismos, la liberación, la dispersión y la
sedimentación sobre las superficies, la biodiversidad, concentraciones y
puntos de distribución de las mismas, con el fin de buscar enfermedades que
pueden ser transmitidas por el aire (Cruz Orjuela & Jiménez Pallares, 2006).
Durante la segunda Guerra Mundial, hubo un gran interés en conocer cómo
se propagaban las infecciones respiratorias, especialmente en instalaciones
militares estadounidenses, realizándose numerosos estudios sobre
Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae, en los ambientes
internos de los barcos de guerra y submarinos, con el fin de prevenir
enfermedades como faringitis, neumonía, endocarditis, neumonía lobular,
sinusitis, meningitis, septicemia. Sin embargo, estos ambientes no tuvieron la
presencia de ninguna de las bacterias mencionadas, calificando el ambiente
como puro, aunque se desconoció la posibilidad de crecimiento y
propagación de otros géneros y especies de bacterias (De la Rosa, Mosso &
Ullán, 2002).
Aunque existe una amplia variedad de partículas de origen biológico, en la
mayoría de los ambientes de trabajo de interior, como en los hospitales,
áreas estériles e industrias farmacéuticas, el estudio de los microorganismos
tiene gran importancia haciéndose una práctica habitual e incluso obligatoria.
Por ejemplo, la Agencia Estadounidense del Espacio y la Aeronáutica
(NASA) promovió el estudio de los microorganismos en el aire, con el fin de
mantener la esterilidad de los equipos, al considerar que, el aire interior
18
puede contener granos de polen, fragmentos de insectos, plantas, ácaros y
sus productos de excreción, en bioaerosoles que pueden afectar la calidad
del aire (Guardino Solá, 2001).
Diferentes trabajos han buscado determinar las concentraciones microbianas
en ambientes como la Biblioteca Central Jorge Palacios Preciado de la
Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, en donde se comprobó
que la densidad microbiana del ambiente estaba dentro de los límites de
sanidad aceptados para ambientes de lugares públicos. Sin embargo, el
estudio determinó que el ambiente de la Biblioteca Central podría representar
un riesgo para la salud de las personas, principalmente a nivel respiratorio
(Toloza Moreno, Lizarazo Forero & Blanco Valbuena, 2012).
Las partículas biológicas en el aire (bioaerosoles) están formadas por gotas
dispersas o partículas de diferentes tamaños desde 0.5 hasta 30 µm, en
donde el aire es su principal medio de dispersión. Estas incluyen las
bacterias que ocupan gran parte del material suspendido, cuya presencia ha
sido investigada al relacionarse con afecciones a plantas, animales y
personas. Los bioaerosoles en ambientes internos representan un riesgo
importante, ya que ciertas personas inmunocomprometidas pueden ser
afectadas por microorganismos patógenos u oportunistas (Rosas et al, 2004).
Es por esto, que la contaminación biológica dentro de los hospitales es de
gran preocupación debido a que las bacterias son una causa importante de
infecciones al llegar a dispersarse por vía aérea. Dado un estudio piloto que
buscó determinar la calidad del aire en dos hospitales en León, Guanajuato,
México, las concentraciones indicaron que la calidad de aire fue pobre, ya
que los niveles de bacterias estuvieron por arriba de los aceptables
(Maldonado Vega, Peña Cabriales, De Los Santos Villalobos, Castellanos
Arévalo, Camarena Pozos, Arévalo Rivas et al., 2014).
19
Para la realización de los estudios de los bioaerosoles, es necesario utilizar
técnicas desarrolladas para la toma de muestras del aire. Desde el siglo XIX
comenzaron las investigaciones y se han diseñado diversidad de aparatos y
técnicas para su análisis. Actualmente, existen una gran cantidad de
métodos e instrumentos para detectar microorganismos en el aire, son
técnicas diversas, de las cuales, la sedimentación, filtración, el impacto sobre
superficies sólidas y el borboteo en medios líquidos son los más importantes
(Hernández López & Marín Ramírez, 2013).
3.2. Métodos e instrumentos para la recuperación de bacterias en el aire.
3.2.1. Técnica de sedimentación por gravedad.
Esta técnica utiliza una toma de muestra de bioaerosoles simple, siendo
ampliamente utilizada por primera vez en 1887 por Frankland y Hart. En esta
técnica las placas con medio de cultivo estéril, permanecen abiertas durante
determinados periodo de tiempo, permitiendo la sedimentación de los
microorganismos. Este método es sencillo, económico, y es un procedimiento
útil para estudios iniciales y para la estimación aproximada de la carga
microbiológica tanto desde el punto de vista cuantitativo como cualitativo
(González Becerra, 2006).
3.2.2. Técnica de filtración.
La filtración se realiza a través de un material poroso, fibra de vidrio u otros
filtros de membrana. Dependiendo del tipo de microorganismos los filtros
recogen por sedimentación, impacto, difusión o atracción electrostática. Los
filtros de membrana utilizados son de policarbonato, ésteres de celulosa o
cloruros de polivinilo, con un diámetro de poro desde 0,01μm a 10μm, según
la naturaleza de los bioaerosoles. Al realizar la filtración se han diseñado
aparatos portátiles con una bomba de vacío y un flujo de aire determinado.
Las muestras obtenidas en los filtros de membrana, los microorganismos se
20
pueden estudiar por microscopía o por cultivo, colocando los filtros en medios
de cultivo sólido para determinar el número de colonias (Hernández López &
Marín Ramírez, 2013).
3.2.3. Técnica de impacto sobre superficies sólidas.
Esta técnica es la más usada en la actualidad, los microorganismos se
separan de la corriente de aire utilizando la inercia para forzar su
sedimentación sobre una superficie sólida. El proceso de impacto depende
de las propiedades de inercia de la partícula (tamaño, densidad y velocidad)
y de las propiedades físicas del aparato tales como las dimensiones de la
boquilla y el recorrido del flujo de aire. En la mayoría de dispositivos, los
microorganismos quedan retenidos sobre un medio de cultivo sólido
contenido en cajas Petri de distinto tamaño, en tiras de plástico y en placas
de contacto (Hernández Calleja, 2001).
3.2.4. Técnica de borboteo en líquidos.
El fundamento es similar al del impacto sobre medios sólidos y la fuerza de
inercia es esencial para separar los microorganismos contenidos en el aire y
que se depositan en el medio líquido, requiriendo también una bomba de
vacío. Estos dispositivos hacen pasar el aire mediante un aspirador, a través
de líquidos que retienen los microorganismos (Hernández Calleja, 2001).
3.3. Ambientes internos.
La conexión entre el uso de un edificio como lugar de trabajo o vivienda y la
aparición, de molestias y síntomas que responden a la definición de una
enfermedad es un hecho que se ha convertido en un problema de salud
ambiental. Se ha demostrado que los habitantes de las ciudades pasan el 80
% de su tiempo en un ambiente interior, un porcentaje mayor en tiempo
pasan los ancianos y los niños convirtiéndolos en las poblaciones más
susceptibles. Los cambios en el estado de salud de una persona debidos a la
21
composición microbiológica del aire interior pueden manifestarse en diversos
síntomas agudos y crónicos así como en forma de diversas enfermedades
específicas (Carazo Fernández, Fernández Álvarez, González Barcala &
Rodríguez Portal, 2013).
El estudio de la microbiología en el aire ha permitido promover el
mejoramiento de la asepsia, reducir la contaminación cruzada, mejorar los
procesos de limpieza y desinfección, establecer normas de aislamiento
dentro de los laboratorios, identificar zonas críticas y mejorar el saneamiento
de ambientes internos (Herrera, Cóbar, De León, Rodas, Boburg, Quan,
Pernilla, Mancilla & Gudiel, 2012).
El origen de la cantidad y tipo de bacterias en ambientes interiores es debido
a diferentes factores; los propios ocupantes, materiales inadecuados o con
defectos técnicos utilizados en la construcción del edificio, el trabajo que se
realiza en el interior, el uso excesivo o inadecuado de productos de limpieza
y la conjugación de contaminantes procedentes de otras zonas.
Adicionalmente, la permanencia y la supervivencia de las bacterias en el aire
está influenciada por factores ambientales tales como temperatura,
humedad, luz, polvo, viento y turbulencia, como de la cantidad de agua
biodisponible que exista (Venegas Mata, 2010; Herrera et al, 2012).
En un estudio realizado en Portugal se obtuvieron resultados que
demostraron que las concentraciones de bacterias fueron altos en guarderías
para niños y escuelas primarias, lo que podría explicarse por las diferencias
en densidad de ocupación, actividades de los ocupantes y la ventilación
inadecuada (Madureira, Paciência, Cavaleiro Rufo, Pereira, Teixeira & de
Oliveira Fernández, 2015).
Todos los materiales generan contaminación, unos en pequeña y otros en
gran cantidad y juntos contribuyen a cambios en la composición biológica del
aire, originando cambios cuantitativos y cualitativos en la carga biológica en
22
ambientes internos. Entre ellos se encuentran los tableros a base de madera,
el ladrillo y el acero; incluso el aumento y/o la reducción del tamaño de los
edificios junto con el desarrollo de sistemas de tratamiento del aire que han
culminado en los sistemas de calefacción, ventilación y aire acondicionado
(CVAA) modernos (Carazo Fernández et al, 2013).
En las dos últimas décadas, se han desarrollado edificios con una infiltración
y exfiltración de aire muy reducidas, lo que permite la concentración de
microorganismos de transmisión aérea y de otros contaminantes. En este
tipo de edificios o la dificultad de acceso al sistema CVAA para su
mantenimiento y limpieza o desinfección, generan un ambiente hermético en
donde, el vapor de agua, que anteriormente habría sido ventilado hacia el
exterior, se condensa sobre superficies frías. Esta situación genera las
condiciones adecuadas para el crecimiento de microorganismos exponiendo
a los ocupantes a cifras elevadas de microorganismos de transmisión aérea
específicos (Guardino Solá, 2001).
3.4. Síndrome del edificio enfermo.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) define el ―síndrome del edificio
enfermo‖ como el conjunto de enfermedades originadas o estimuladas por la
contaminación del aire en espacios cerrados; haciendo referencia a edificios
en los cuales la mayoría de los ocupantes experimentan efectos agudos en la
salud y el confort, que parecen estar relacionados con el tiempo que pasan
en el edificio (Venegas Mata, 2010).
Las quejas pueden ocurrir en una zona particular o en todo el edificio; los
síntomas que generalmente se atribuyen son dolor de cabeza, fatiga, falta de
aliento, congestión nasal, tos, estornudos, irritación ocular, nasal y de
garganta, irritación dérmica, mareos y náuseas; así mismo se ha
documentado la ausencia de estos síntomas en edificios bien diseñados,
ventilados y con un mantenimiento adecuado (Berenguer Subils, 1991).
23
Todo lo que respiramos, puede ser considerado un contaminante, pero no
todos los gases inhalados accidentalmente o partículas de polvo son
considerados relevantes para la salud. La enfermedad o condiciones
insalubres resultantes de exposiciones nocivas incluyen diferentes
enfermedades relacionadas con edificios, afecciones alérgicas, sensibilidad
química múltiple, y efectos vistos por personas de los sectores más
susceptibles de la sociedad; niños, ancianos, mujeres embarazadas y
personas inmunocomprometidos (Observatorio de Salud y Medio Ambiente
en Andalucía, 2011).
Hasta ahora, la influencia de los factores de riesgo derivados de la
exposición a agentes biológicos en el aire interior ha sido poco estudiada.
Por lo tanto, la incertidumbre de riesgos para la salud, y cómo prevenir estos,
efectivamente permanece (Madureira et al, 2015).
3.5. Patógenos en el aire.
Los microorganismos son un componente normal y esencial de los
ecosistemas. La presencia de microorganismos en el aire interior, puede
causar problemas de carácter infeccioso y alérgico, siendo objeto de interés
en los últimos años, por lo que el aire es principal vehículo y diseminador de
infinidad de componentes biológicos causantes de alergias al polen, alergias
a toxinas y enfermedades nosocomiales, que pueden derivar en
enfermedades graves como endocarditis o septicemias (Olaya Escobar &
Pérez Rojas, 2006).
Por otro lado, existe un interés sobre el impacto y los efectos ocasionados
por la composición bacteriana en el aire sobre la salud ocupacional. Dentro
de las bacterias de interés es posible encontrar bacterias Gram positivas
como Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Bacillus subtilis y Micrococcus
y en menor frecuencia bacterias Gram negativas como Klebsiella sp.,
Pseudomonas sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp., y Serratia sp. Debido a
24
la pared celular delgada de las bacterias Gram negativas, algunas tienen
baja probabilidad de permanecer expuestas en el ambiente; solo
permanecen 10 minutos. Por lo tanto al encontrar estas bacterias en 15
minutos, es un indicador de contaminación ambiental (Herrera et al, 2012).
3.5.1. Bacterias Gram positivas en el aire.
El género Staphylococcus comprende microorganismos que están presentes
en la mucosa y en la piel de los humanos así como de otros mamíferos y
aves, incluyendo 35 especies y 17 subespecies de las cuales la mayoría se
encuentran en humanos. Las especies que se asocian a enfermedades en
humanos son Staphylococcus aureus (el más virulento y conocido del
genero), S. epidermidis, S. saprophyticus, S. capitis, S. afarensis, S.
haemolyticus, S. hominis, y S. cohnii (Olaya Escobar & Pérez Rojas, 2006).
En la comunidad, las infecciones por género Staphylococcus son a menudo
agudas, piogénicas y superficiales, aunque también se pueden producir con
menor frecuencia, infecciones profundas como osteomielitis, neumonía,
endocarditis aguda e intoxicación alimentaria. Muchas de las infecciones
producidas suelen presentarse en mayor cantidad de casos en personas
inmunocomprometidas (Seija, 2006).
Micrococcus se asemeja morfológicamente a los estafilococos y aparece
individualmente y en grupos de tamaño variable, por lo general en tétradas.
Es una bacteria Gram positiva o Gram variable y aerobia estricta. Esta
bacteria generalmente es saprofítica y está presente normalmente en la
microflora cutánea, productos lácteos, agua y suelo (Miloslav Kocur, Wesley
& Karl Heinz, 2006). Este género es raramente asociado con enfermedades,
aunque actualmente se cataloga como patógeno oportunista, particularmente
en pacientes con inmunodeficiencia, tales como enfermos con Síndrome de
Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). En estos pacientes, Micrococcus puede
25
producir infecciones pulmonares y en raras ocasiones bacteriemia recurrente,
shock séptico, endocarditis o neumonía (Cole, 1990).
El género Bacillus contiene gran diversidad de bacterias formadoras de
esporas incluyendo desde aerobios estrictos hasta anaerobios obligados,
cocos y bacilos, tanto psicrófilos como termófilos. La mayoría de especies de
este género se encuentran en mayor proporción en muestras de suelo, aire y
polvo (Cuervo Lozada, 2010). Las especies pertenecientes a este género son
bastante heterogéneas, debido a su gran diversidad metabólica, de tipo
nutricional y de la composición y estructura de la pared celular. De igual
manera se encuentran especies psicrófilas, mesófilas y termófilas, así como
alcalófilas, neutrófilas y acidófilas. Las especies más reconocidas son B.
anthracis, B. cereus, Bacillus licheniformis y Bacillus subtilis (Cruz Orjuela &
Jiménez Pallares, 2006).
De la familia Streptococcaceae, Leuconostoc sp. es un coco Gram positivo
anaerobio facultativo y no móvil. Las infecciones con Leuconostoc sp. son
raras. Por lo general afectan a los pacientes con una subyacente enfermedad
produciendo meningitis y neumonías (Taşkapılıoğlu, Bahar, Yılmaz, & Bakar,
2011).
El género Clostridium está formado por un grupo de bacilos Gram positivos
anaerobios esporulados; distribuido en la naturaleza, encontrándose
aproximadamente 150 especies, principalmente en el suelo y en el tracto
intestinal de muchas especies de animales incluido el hombre. Al tener la
capacidad de producir exotoxinas potentes puede causar infecciones con
cuadros tóxicos graves como la gangrena gaseosa. Entre las especies
patógenas más conocidas se encuentran Clostridium botulinum, C. tetani y C.
difficile (Morris & Fernández Miyakawa, 2009).
Gemella sp. es un coco Gram positivo, anaerobio facultativo, que hace parte
del componente habitual de la microbiota orofaríngea, intestinal y
26
genitourinaria, que da origen a procesos infecciosos en contadas ocasiones.
Las infecciones asociadas a este patógeno son generalmente
endovasculares y fundamentalmente endocarditis. Las localizaciones
cutáneas no son habituales, describiéndose hasta ahora pocos episodios
(Villamil, Villar del C. & Masa V., 2009).
3.5.2. Bacterias Gram negativas en el aire.
El género Pseudomonas sp. se encuentra en distintos medios como el suelo,
el agua y en ocasiones en el aire, pasando a las plantas, animales y a las
personas, como bacterias oportunistas produciendo una exotoxina
responsable de diarreas al ser ingerida por vía oral (Herrera et al, 2012).
La familia Enterobacteriaceae está formada por bacilos y cocobacilos
gramnegativos. Estas bacterias están diseminadas en la naturaleza,
encontrándolas en el agua, en la tierra, en los animales. En el hombre se
localizan en las vías aéreas superiores (en pequeña proporción), en la piel
(sobre todo en la región perianal), en la uretra anterior y sobre todo en el
intestino; aumentando la concentración a lo largo del tubo digestivo desde el
estómago al intestino grueso.
Los géneros y especies de Enterobacterias que con mayor frecuencia se
aíslan son Escherichia coli, Shigella, Salmonella, Klebsiella sp., K.
pneumoniae, Enterobacter, Serratia, S. fonticola, Citrobacter sp., C. freundii,
Yersinia sp., Y. enterocolitica y Y. pestis (Puerta García & Mateos Rodríguez,
2010).
La mayoría de las Enterobacterias producen diarrea relacionada con la
ingestión de agua y alimentos contaminados con materia fecal,
transmitiéndose además de persona a persona por la vía ano-mano-boca. En
otros casos pueden producir peritonitis, abscesos, meningitis, endocarditis y
27
neumonías nosocomiales (Lösch, Gariboglio Vázquez, Rivas, & Merino,
2015).
Algunas de las Enterobacterias solo se mencionan en casos de zoonosis que
habitualmente afectan a roedores, cerdos y aves, siendo el ser humano un
huésped accidental de la infección, siendo causa relativamente infrecuente
de diarrea, de adenitis mesentérica. También se han descrito casos de
eritema nodoso, que en ocasiones se han presentado de forma epidémica
(Puerta García, & Mateos Rodríguez, 2010).
Acinetobacter sp. es un cocobacilo Gram-negativo no fermentador, aerobio,
que sobrevive con facilidad en superficies con polvo, colonizando con
frecuencia la piel humana. Esta bacteria es causante de infecciones
nosocomiales, neumonías, meningitis e infecciones urinarias (Herrera et al,
2012).
Corynebacterium es un género con numerosas especies. Algunas de ellas
forman parte de la flora normal de mucosas y piel del ser humano, y
excepcionalmente algunas de ellas causan enfermedad en pacientes
inmunodeprimidos. La especie patógena por excelencia es C. diphtheriae,
responsable de una grave enfermedad denominada difteria. Este
microorganismo es un bacilo pleomórfico, no esporulado, en su mayoría
fermentador de glucosa y catalasa positivo (Macedo & Vola, 2006).
Las bacterias mediante mecanismos bioquímicos causan enfermedad y
virulencia, pero no todas tienen la misma probabilidad de causar infección y
subsecuentemente una enfermedad. El desarrollo de la enfermedad depende
tanto del patógeno como del hospedero. De este modo los cambios en el
estado de salud de una persona en un ambiente interno pueden manifestarse
en diversos síntomas agudos y crónicos, así como en formas de diferentes
enfermedades específicas tales como neumonías, endocarditis, meningitis y
28
tuberculosis, como también dolor de cabeza y conjuntivitis (Herrera et al,
2012; Cruz Orjuela & Jiménez Pallares, 2006).
3.6. Grupos de riesgo de los agentes biológicos.
La clasificación de los agentes biológicos se proporciona en cuatro grupos
atendiendo exclusivamente al riesgo de infección que suponen para
personas sanas. A continuación se muestran las características de los
distintos agentes biológicos para su clasificación dentro de un grupo de
riesgo determinado (Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo,
1997).
1) Agente biológico del grupo 1: Aquel que resulta poco probable que cause
una enfermedad en el hombre.
2) Agente biológico del grupo 2: Aquel que puede causar una enfermedad en
el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco
probable que se propague y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento
eficaz.
3) Agente biológico del grupo 3: Aquel que puede causar una enfermedad
grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con
riesgo de que se propague y existiendo generalmente una profilaxis o
tratamiento eficaz.
4) Agente biológico del grupo 4: Aquel que causando una enfermedad grave
en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas
probabilidades de que se propague y sin que exista generalmente una
profilaxis o un tratamiento eficaz.
La inclusión de cada género y especie de bacterias se determina por las
características de la misma; la patogenicidad en humanos, el peligro para los
trabajadores, la facilidad de propagación y la existencia o disponibilidad de
29
tratamientos eficaces (Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el
Trabajo, 2014).
3.7. Estadísticas BBL Crystal.
El valor de confianza emitido por la base de datos BBL Crystal es una
medida de comparación entre la probabilidad de una determinada especie
que contiene un patrón de reacción especifica con otras especies. Este valor
de confianza es tomado para la selección del microorganismo siempre y
cuando los valores sean elevados cercanos a uno (Becton & Dickinson,
2010).
En otras ocasiones el software no emite un resultado de identificación si el
valor de confianza no es normalizado aunque este sea cercano a uno. Esto
puede ocurrir cuando el cultivo es mixto o el patrón no corresponde a un
microorganismo que esté en la base de datos, produciendo una identificación
inaceptable. Por lo tanto el usuario debe tener en cuenta la estadística del
valor de biotipo y confirmar la pureza del cultivo, así como realizar pruebas
confirmativas adicionales para establecer una identificación aceptable
(Becton & Dickinson, 2010).
30
4. METODOLOGÍA.
Para la recuperación de bacterias en el aire del laboratorio de microbiología,
se tomaron muestras del aire, con el fin de identificarlas y asociarlas a
posibles problemas en la salud de las personas que desempeñan actividades
dentro del laboratorio.
Esta investigación se realizó en el laboratorio de microbiología de la Facultad
de Medio Ambiente y Recursos Naturales con la financiación del Centro de
Investigaciones y Desarrollo Científico (CIDC) de la Universidad Distrital
Francisco José de Caldas.
4.1. Recolección de muestras.
Para la recolección de las muestras (40) se llevaron a cabo 20 muestreos en
dos lugares distintos del laboratorio entre la última semana de octubre, el
mes de noviembre y la primera semana de diciembre del año 2014 para la
recuperación de todas las bacterias presentes en el aire (Tabla 1) y se
realizaron otros 20 muestreos en los mismos lugares seleccionados
anteriormente, entre la última semana de febrero y las siguientes de marzo
de 2015 para la búsqueda de Clostridium sp. (Tabla 2).
Se realizó la toma de las muestras en diferentes horas, durante el desarrollo
de actividades académicas dentro del laboratorio y un día adicional sin que
se realizara ninguna actividad académica; esto con el fin de poder observar
los cambios que podrían presentarse en los tipos y concentraciones de
microorganismos de acuerdo con las condiciones generadas durante el día.
31
Tabla 1. Toma de muestras para bacterias presentes en el aire del laboratorio de microbiología.
Muestreo Fecha T (°C) HR (%)
1 Martes/21 de octubre. 24 56
2 Jueves/23 de octubre. 24 59
3 Miércoles/29 de octubre. 22 66
4 Martes/4 de noviembre.* 21 62
5 Viernes/7 de noviembre. 22 70
6 Miércoles/12 de noviembre. 22 67
7 Jueves/13 de noviembre. 22 64
8 Martes/18 de noviembre. 21 70
9 Martes/25 de noviembre. 22 62
10 Lunes/1 de diciembre. 21 66
M: Mesa, A: Armario, *: Sin ocupantes, T: Temperatura, °C: Grados centígrados, HR: Humedad Relativa, %: Porcentaje.
Fuente: Los autores.
Tabla 2. Toma de muestras para la recuperación de Clostridium sp. en el laboratorio de microbiología.
Muestreo Fecha T (°C) HR (%)
1 Martes/24 de febrero. 23 51
2 Viernes/27 de febrero. 26 48
3 Lunes/2 de marzo. 25 55
4 Miércoles/4 de marzo. 25 54
5 Viernes/6 de marzo. 24 51
6 Lunes/9 de marzo. 23 57
7 Martes/10 de marzo. 25 61
8 Jueves/12 de marzo. 25 54
9 Miércoles/9 de marzo. 25 64
10 Viernes/20 de marzo. 24 64
M: Mesa, A: Armario, T: Temperatura, °C: Grados centígrados, HR: Humedad Relativa, %: Porcentaje.
Fuente: Los autores.
32
Las muestras de aire se tomaron por el método de sedimentación por
gravedad (De la Rosa et al, 2000), con Agar Nutritivo (AN) para la
recuperación de las bacterias totales presentes en el aire y Agar Sulfito
Polimixina Sulfadiazina (SPS) para la recuperación de Clostridium sp.
Para la toma de muestras se dejaron las cajas abiertas con el medio de
cultivo correspondiente a una altura de noventa y dos centímetros (0,92 m)
desde el nivel del suelo sobre el segundo mesón cercano a la entrada,
denominado Mesa (M) y sobre el armario de provisión que se encuentra
diagonal a la entrada con una altura de dos metros (2 m) denominado
Armario (A) por un tiempo de 15 minutos (Figura 1). Estos puntos de
muestreo se seleccionaron de acuerdo a un muestreo preliminar realizado
durante tres días diferentes de la semana dentro del laboratorio, con
ausencia de personal como también en horario de actividades académicas.
El parámetro de selección fue la escogencia de los sitios donde se obtuvieron
mayor variedad y cantidad de bacterias (Anexo 1).
Figura 1. Puntos de recolección de muestras.
Fuente: Los autores.
33
4.2. Conteo y aislamiento de bacterias.
Las muestras en AN fueron incubadas a una temperatura de 37ºC durante 48
horas, las cajas con SPS se incubaron en las mismas condiciones pero en
anaerobiosis en la cámara Anaerojar de Oxoid, con sobre GasPak EZ de BD
con indicador de generación de atmósfera anaerobia (Anexo 2). Al término de
la incubación se realizó el conteo usando un contador de colonias Boeco y
los recuentos se informaron como Unidades Formadoras de Colonia (UFC)
por tiempo de exposición y área de la caja de muestreo (UFC/15
minutos/63.61cm2) (Pérez Ochoa, 2009). El conteo de las colonias
recuperadas se relacionó con los factores ambientales generados dentro del
laboratorio como la Humedad Relativa (HR), Temperatura, número de
estudiantes y la clase que se desarrollaba en el momento de la toma de las
muestras.
Una vez realizado el conteo, se procedió al aislamiento en AN para las
bacterias aerobias, incubadas a una temperatura de 37ºC durante 48 horas y
en Agar SPS para las bacterias obtenidas en la recuperación de Clostridium
sp. incubadas en condiciones anaeróbicas a una temperatura de 37ºC
durante 48 horas.
4.3. Identificación de las bacterias recuperadas.
4.3.1. Identificación macroscópica y microscópica de las bacterias
recuperadas.
Una vez realizado el aislamiento de las bacterias recuperadas durante los
muestreos hasta obtener cultivos puros, se procedió a realizar la
caracterización macroscópica de las colonias (color, forma y tamaño) y se
realizó la identificación microscópica con la coloración de Gram y
observación en un microscopio Zeiss (Herrera et al, 2009).
34
4.3.2. Siembra en medios selectivos y realización de pruebas bioquímicas.
De acuerdo a la clasificación obtenida, las cepas puras se sembraron en
Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) para el crecimiento de Enterobacterias,
Agar Cetrimide para el crecimiento de Pseudomonas sp., Agar Baird Parker
para el crecimiento de Staphylococcus sp. y en Agar Brilliance Bacillus
cereus para el crecimiento de Bacillus cereus, y se incubaron a 37ºC por 48
horas (Hernández López & Marín Ramírez, 2013).
Las bacterias recuperadas para la determinación de Clostridium sp. se
evaluaron por siembra en AN con NaCl al 6,5% para determinar la tolerancia
al NaCl y se realizaron pruebas de Oxidasa mediante cintas de
determinación de oxidasa, catalasa utilizando peróxido de hidrogeno al 30%,
medio Basal O.F. para prueba de Oxidación – Fermentación (OF) glucosa,
caldo urea para prueba de la ureasa, agar Sulfuro Indol Motilidad (SIM) para
prueba de producción de indol y prueba de motilidad (MacFaddin, 2003). Las
pruebas se incubaron a 37ºC por 48 horas en la cámara de anaerobiosis.
Adicionalmente, se realizó una réplica con las mismas pruebas bioquímicas
pero incubadas en condiciones aerobias para determinar si algunas de las
bacterias recuperadas eran anaerobias facultativas.
Una vez se evidenciaron los resultados en los respetivos medios selectivos y
pruebas bioquímicas, se procedió a la identificación, en donde se
identificaron los géneros de las bacterias de la toma de muestras para la
recuperación de Clostridium sp., en tanto que para las bacterias incubadas
en condiciones aerobias se hizo una selección entre Gram positivas y Gram
negativas, con el fin de identificarlas por medio del kit BBL Crystal. Para la
selección de estas bacterias se tuvieron en cuenta características
morfológicas, microscópicas, resultado en medios selectivos y fecha de
recolección de la muestra.
35
Ya realizada la selección de las bacterias, se sembraron en Agar Sangre,
puesto que este medio permite el crecimiento rápido de las bacterias (Becton
& Dickinson, 2010; Becton & Dickinson , 2012). Las siembras se incubaron
por un tiempo de 24 horas a 37ºC para obtener un cultivo fresco y, pasado el
tiempo de incubación, se procedió la identificación mediante el kit BBL
Crystal de BD. Esta prueba requiere una prueba de oxidasa y de indol
previamente para las bacterias Gram negativas seleccionadas, necesarias
para la información que requiere la base de datos para la identificación por
medio del kit BBL Crystal (Becton & Dickinson, 2010).
Las pruebas bioquímicas de oxidasa e indol, tienen el objetivo de identificar
de manera presuntiva el género o especie de bacterias, que funciona como
marco de identificación, permitiendo direccionar una identificación hacia el
grupo de las enterobacterias o el grupo de Pseudomonas sp. de acuerdo a
los resultados. Por ejemplo, la prueba de oxidasa permite sospechar la
presencia de bacterias de género Pseudomonas sp. y Campylobacter sp.
entre otras y excluye las Enterobacterias que dan reacciones negativas
(Rojas Triviño, 2011).
4.3.3. Identificación de bacterias mediante el kit BBL Crystal.
Para realizar la identificación mediante el kit BBL Crystal de BD fue necesario
tomar con un hisopo debidamente esterilizado una colonia de la cepa a
identificar del cultivo sembrado en Agar Sangre y se inoculó en un tubo de
ensayo con una solución de 2,3 mililitros (ml) con 7,5 gramos (g) de Cloruro
de Potasio (KCl), 0,5g de Cloruro de Calcio (CaCl2), 0,895g de Glicina y agua
purificada a 1000mL; este contenido es específico para la identificación de
bacterias Gram positivas. Para las bacterias Gram negativas se utilizó un
fluido de inóculo de 2,2mL con 8,50g de Cloruro de Sodio (NaCl), 0,8372g
de ácido 3-morfolinpropanosulfónico y agua purificada hasta 1000mL. La
solución se agitó durante 15 segundos en un Vórtex Heidolph.
36
Posteriormente el contenido se vertió en un panel con 30 pocillos, los cuales
contienen distintas reacciones, el panel se cerró debidamente y se incubó
durante 48 horas a 37°C. Al término del periodo de incubación, se
examinaron los pocillos para determinar cambios de color o fluorescencia
resultante de las actividades metabólicas de los microorganismos.
Una vez obtenidos estos resultados, se introdujeron en la base de datos del
kit BBL Crystal, en el cual se debe tener en cuenta si la bacteria es Gram
negativa o Gram positiva, ya que existe un programa correspondiente para
cada una. Adicionalmente se introdujo el resultado de las pruebas de
oxidasa e indol que se realizaron previamente para bacterias Gram negativas
y el resultado de la coloración de Gram para las bacterias Gram positivas
(Anexo 3). Este procedimiento se realizó con cada una de las bacterias que
se seleccionaron previamente, las cuales se identificaron con el kit BBL
Crystal tanto para bacterias Gram positivas como para bacterias Gram
negativas (Becton & Dickinson, 2010; Becton & Dickinson, 2012).
Por último se procedió a realizar una serie de pruebas confirmativas a las
bacterias con un valor de confianza bajo para evaluar la certeza de la
especie encontrada según el kit BBL Crystal tanto para el sistema de
bacterias Gram positivas como para el sistema de bacterias Gram negativas.
4.4. Procesos de inocuidad en los procedimientos del laboratorio.
4.4.1. Protocolo de esterilidad.
En la preparación de los medios de cultivo se debe tener muy en cuenta las
técnicas de asepsia correspondientes, como el uso de los diferentes
implementos de protección personal como guantes y tapabocas, con el fin de
evitar la contaminación de los medios en el proceso de preparación.
Antes de cada preparación se desinfectaron con hipoclorito los mesones del
laboratorio de microbiología en donde se trabajó, al igual que la Cabina de
37
Flujo Laminar que se limpió con alcohol antiséptico esterilizando en cada
proceso con la luz ultravioleta, proceso que dura 20 minutos en total. Así
mismo, se esterilizaron todos los materiales en seco en un horno a 160°C
durante 15 minutos y los medios de cultivo en autoclave durante 15 minutos
a 121°C.
4.4.2. Control de calidad de medios de cultivo.
Durante el proyecto de investigación se prepararon distintos medios de
cultivo; medios generales, selectivos y diferenciales, y medios para pruebas
bioquímicas para la captura, aislamiento e identificación de las bacterias
(Anexo 4). Para garantizar la eficacia del procedimiento de esterilización de
los medios de cultivo y así mismo certificar que las bacterias recuperadas e
identificadas correspondieran a las de la toma de muestras de aire, se
realizaron pruebas de control de calidad. De este modo cada vez que se
prepararon los medios a utilizar, se tomó al azar una caja de Petri o tubo de
ensayo según correspondiera del medio preparado, y se incubó bajo las
mismas condiciones que los medios que se utilizaron para la toma de
muestras y el aislamiento de las bacterias; esto con el fin de verificar la
ausencia de cualquier crecimiento de microorganismos que pudieran alterar
los resultados.
4.4.3. Control de ambientes.
Se colocaron cajas abiertas con AN en las zonas de trabajo, lugares donde
se prepararon medios de cultivo, aislamientos, incubación y esterilización.
Estas cajas fueron sometidas bajo las mismas condiciones de incubación que
las muestras, con el fin de probar la esterilidad de estos lugares y garantizar
que las bacterias obtenidas fueran las recuperadas del aire.
38
5. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.
5.1. Conteo de colonias recuperadas.
Al comparar el número de colonias recuperadas en AN en aerobiosis, se
evidencia mayor número en el punto de la mesa (M) que en el armario (A)
(Muestreos 1-10). En cuanto a la recuperación de bacterias en SPS se
obtuvieron recuentos en los muestreos 18 y 20 en el punto de la mesa (M)
(Muestreos 18 y 19) (Tabla 3).
Tabla 3. Conteo de colonias por punto muestreo.
Muestreo No. UFC/15 minutos/63.61cm
2
Mesa Armario
1 8 2
2 22 7
3 13 1
4 13 0
5 20 14
6 9 7
7 16 13
8 15 3
9 4 3
10 5 2
18* 1 0
20* 5 0
Total 131 52
UFC: Unidades Formadoras de Colonia, *: Incubación en anaerobiosis.
Los recuentos mayores obtenidos en M (131) pueden ser debidos a que la
mesa se encuentra más cercana a fuentes de contaminación externa e
interna como ventanas y puertas. Adicionalmente, la mesas se encuentra
ubicada en un espacio donde se movilizan estudiantes constantemente y
donde se desarrollan prácticas de laboratorio propias de las clases. En el
punto A se contó un número menor de colonias de bacterias (52) respecto al
39
punto M, ya que solo se utiliza como depósito de materiales, estando lejos de
estos focos de contaminación.
La altura de los puntos donde se tomaron las muestras resulta importante,
puesto que el punto A es más alto que el punto M. Como se esperaba, los
recuentos en A (mayor altura) fueron menores que en M (menor altura), de
acuerdo a la afirmación de De la Rosa et al. (2002) que el crecimiento y la
variedad microbiana es mayor cerca al suelo, sobre todo en los dos metros
inferiores, que constituyen el microclima del hombre.
La recuperación baja de colonias en la toma de muestras para la
recuperación de Clostridium sp. puede ser debido a los factores ambientales
que inciden en el crecimiento óptimo de esta bacteria, como por ejemplo, la
disponibilidad de nutrientes y temperatura del ambiente, puesto que la
mayoría crecen de manera óptima en tracto colonico de las personas, siendo
el ambiente propicio para su desarrollo (Barra Carrasco, Hernández Rocha,
Ibáñez, Guzmán Durán, Álvarez Lobos et al., 2014).
Por otro lado, durante la toma de muestras se tuvo la puerta del laboratorio
abierta; estos movimientos como abrir puertas pueden contribuir o no a la
dispersión de colonias de bacterias. Es por eso que los flujos de aire se
controlan en el momento de cualquier toma de muestra, recalcándose que la
recuperación de Clostridium sp. en muestreos de aire resulta sin embargo
esporádica (Riedel, 2010).
5.2. Relación entre los factores del entorno del laboratorio con las
bacterias recuperadas durante los muestreos.
Durante la toma de los muestreos se registraron diferentes parámetros de las
condiciones ambientales y actividades dentro del laboratorio; el número de
estudiantes presentes, la temperatura y la humedad relativa señaladas por el
40
higrómetro, y así relacionar estos parámetros con la cantidad de colonias
totales (Tabla 4).
Tabla 4. Relación de las variables ambientales con el número de bacterias recuperadas
(UFC/15 min/63.61cm2)
Actividad o clase realizada No.
Personas
Variable climática Total
T (°C) HR (%)
Biorremediación 18 24 56 10
Biorremediación 18 24 59 28
Microbiología 20 22 66 14
Sin Actividad 0 21 62 13
Manejo e Higiene de Alimentos
16 22 70 34
Microbiología 14 22 67 16
Biorremediación 23 22 64 26
Microbiología 10 21 70 18
Microbiología 16 22 62 7
Investigación 2 21 66 7
Biología* 12 25 54 1
Manejo e Higiene de Alimentos*
30 24 64 5
Promedio 22,5 63,3
Desviación Estándar 1,4 5,0
*Muestreos para la recuperación de Clostridium sp.
La temperatura en el laboratorio de microbiología durante los muestreos fue
de 22,51,4°C (Tabla 4). La temperatura es una variable ambiental muy
importante para el crecimiento de las bacterias, ya que determina el tipo de
bacterias que se puede encontrar en el aire. En el estudio, la variación de la
temperatura no incidió en la cantidad de colonias recuperadas entre los
muestreos, observándose en los puntos con mayor temperatura un conteo
mayor, menor o igual que los demás puntos (Tabla 4).
Existe una flora bacteriana normal en los humanos, en distintas partes y
capas de su cuerpo y otra transitoria, es por eso que los seres humanos
presentan una incidencia sobre la cantidad y tipo de bacterias que se pueden
41
encontrar en el aire, ya que son reservorios y medios de transporte de
bacterias (Aburto Torres, 2011). En la investigación no se observó relación
entre el número de personas presentes en el laboratorio y el número de
colonias recuperadas, ya que en el muestreo realizado en la actividad
denominada investigación (2 personas) y en la clase de microbiología (16
personas) se obtuvieron los mismos recuentos (7 UFC/15 min/63.61cm2),
mientras que en el muestreo donde no se realizó actividad y por lo tanto no
hubo presencia de personas se obtuvieron 13 UFC/15 min/63.61cm2.
En cuanto a la humedad relativa del laboratorio presentó un valor de
63,35,0 durante los muestreos, humedad que tuvo incidencia en los
recuentos obtenidos.
Con respecto al aumento de la humedad relativa se evidenció un aumento en
el número total de colonias obtenidas en los cuatro muestreos realizados en
la clase de microbiología (Figura 2).
Figura 2. Relación entre la humedad relativa y el número de colonias en la clase de microbiología.
Fuente: Los autores.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
62 66 67 70
Nú
mero
de c
olo
nia
s
Humedad Relativa HR (%)
42
En los datos obtenidos en la clase de biorremediación no se evidencia un
aumento tan evidente del número de bacterias recuperadas con respecto al
aumento de la humedad relativa, pero se observa una tendencia de aumento
con el aumento de la HR (Figura 3).
Figura 3. Relación entre la humedad relativa y el número de colonias en la clase de
biorremediación.
Fuente: Los autores.
En los muestreos realizados para la recuperación de Clostridium sp. se
evidenció un aumento de la humedad relativa y el número de colonias
obtenidas, tanto para la clase de biología como para la clase de Manejo e
Higiene de Alimentos. Esta comparación coincide con el análisis de la
relación HR y recuento, indicando que a mayor humedad relativa mayor
presencia de bacterias (Figura 4).
0
5
10
15
20
25
30
56 59 64
Nú
mero
de c
olo
nia
s
Humedad Relativa HR (%)
43
Figura 4. Relación entre la humedad relativa y el número de colonias en la toma de muestras para la recuperación de Clostridium sp.
Fuente: Los autores.
La humedad relativa es un factor extrínseco del crecimiento de los
microorganismos, el cual es propio de las condiciones del ambiente. Este
factor es importante en el crecimiento de bacterias; entre más alta sea la
humedad relativa más elevada será la concentración de bacterias. Por otra
parte cuando la HR se encuentra entre el 40% y 60% el vapor de agua en el
aire es mínimo y no es óptimo para el crecimiento de bacterias (Cruz Orjuela
& Jiménez Pallares, 2006).
En general, los resultados obtenidos muestran que a medida que aumenta la
HR aumenta también el número de colonias, pero que esto también depende
de la actividad o clase que se está realizando, ya que existen diferentes
prácticas y fuentes de contaminación.
5.3. Características microscópicas de las colonias recuperadas.
En la caracterización en cuanto a la morfología microscópica se obtuvieron
cocos, bacilos y cocobacilos (Tabla 5; Anexo 5). Por otro lado, en cuanto a
las bacterias recuperadas en SPS en anaerobiosis, se evidenciaron cocos
Gram positivos (Anexo 6).
0
1
2
3
4
5
6
54 64
Nú
mero
de c
olo
nia
s
Humedad Relativa HR (%)
54 64
Manejo e Higiene de Alimentos Biología
44
Tabla 5. Morfología microscópica de las bacterias recuperadas.
Colonias Gram positivas Colonias Gram negativas
Cocos Bacilos Cocobacilos Cocos Bacilos Cocobacilos
133 2 2 18 6 16
6* 0 0 0 0 0
143 40
(*) Incubación en anaerobiosis.
Los resultados evidencian una mayor presencia de bacterias Gram positivas
(137) en comparación con las bacterias Gram negativas (40). La mayor
predominancia de las bacterias Gram positivas puede deberse a que estas
bacterias sobreviven mucho más tiempo en el aire de ambientes internos,
las cuales son más resistentes como consecuencia de la presencia de polvo
y de las actividades de las personas, predominando la familia Coccaceae
(Cruz Orjuela & Jiménez Pallares, 2006; Toloza Moreno, Lizarazo Forero &
Blanco Valbuena, 2012).
5.4. Siembra en medios selectivos de las colonias recuperadas.
Las bacterias recuperadas se clasificaron según su crecimiento en el medio
selectivo y sus características macroscópicas, determinando la bacteria
presuntiva que se recuperó y así mismo realizando una selección para su
identificación (Tabla 6).
Para la clasificación de bacterias Gram negativas se utilizaron los medios
selectivos Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) y Agar Cetrimide (CT), en
donde se obtuvieron 10 bacterias de las cuales 8 crecieron en EMB y 2 en
CT. Para la clasificación de las bacterias Gram positivas se utilizaron los
medios selectivos Agar Baird Parker (BP) y en Agar Brilliance Bacillus cereus
(BC), en donde se obtuvieron 117 bacterias de las cuales 76 crecieron en BP
y 41 en BC. Para la clasificación de Clostridium sp. se utilizó el medio
45
selectivo Agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS) en el cual no se presentó
crecimiento, con resultado negativo para recuperación de Clostridium sp.
Tabla 6. Bacterias presuntivas seleccionadas para identificar a partir de medios selectivos.
Medio Descripción de resultado Bacteria presuntiva
No.
De bacterias
encontradas
No.
De bacterias
seleccionadas
EMB
Color gris, sin brillo metálico Enterobacterias 7
10 Transparentes Salmonella y
Shigella 1
CT Colonias azul verdoso Pseudomonas sp. 2
BC
Cambio de color en el medio
azul Bacillus cereus 6
10 Colonias amarillas, con
cambio de color azul del
medio
Bacillus sp. 35
BP
Colonias negras, convexas
brillantes, con halo claro
Staphylococcus
aureus 10
10 Negras, lustrosas, con forma
irregular
Staphylococcus
sp. 26
Colonias pequeñas, pardas
negras ausencia de halos Micrococcus sp. 40
SPS Cambio de color del medio a
Negro Clostridium sp. 0 0
EMB: Eosina Azul de Metileno, BC: Bacillus cereus, BP: Baird Parker, CT: Cetrimide, SPS: Sulfito
Polimixina Sulfadiazina.
En el medio EMB se obtuvieron 7 bacterias presuntivas de Enterobacterias
las cuales por lo general se encuentran sobre la piel humana, el tracto
intestinal, las plantas, los suelos, el agua y en productos lácteos (García &
Mateos Rodríguez, 2010). Es así que los resultados encontrados son los
esperados, ya que el flujo de personas en el laboratorio es alto, y
adicionalmente se procesan diferentes muestras de agua, suelo y alimentos
contaminados durante las clases. La temperatura óptima de crecimiento de
las Enterobacterias se encuentra entre los 22°C y 37°C, lo cual coincide con
la temperatura promedio del laboratorio (22,5°C1,4°C).
46
En el medio EMB se obtuvo 1 bacteria presuntiva de Salmonella y Shigella,
las cuales crecen en un rango óptimo de temperatura entre 30°C a 37°C. El
reservorio principal de estas bacterias es el humano y este las transmite de
manera vía oral-fecal por contacto directo o indirecto a través del consumo
de alimentos o aguas contaminadas con heces (Pascual Anderson, 2005;
Pachón Cubillos, 2009). Una de las razones de haberse encontrado muy
pocas bacterias presuntivas de Salmonella o Shigella puede deberse a la
temperatura promedio del laboratorio por debajo del óptimo de crecimiento
de estas bacterias. Adicionalmente, el reservorio de estas bacterias depende
de una mala higiene, aunque es posible encontrarlas en algunas muestras de
alimentos contaminados que son llevados en las clases de Manejo e Higiene
de Alimentos para el análisis dentro del laboratorio.
En el medio CT se obtuvieron 2 bacterias presuntivas de Pseudomonas sp.
De acuerdo con los requerimientos de crecimiento de esta bacterias es muy
posible encontrarla en el laboratorio. El género Pseudomonas no requiere
factores de crecimiento específicos, crece a temperaturas mesófilas a la cual
se encuentra en promedio el laboratorio y es posible encontrarla en el medio
ambiente, como el suelo, agua, en la piel de animales y del ser humano. En
el laboratorio, en algunas de sus clases, se analizan muestras de suelo y
agua contaminada que pueden contener esta bacteria. Adicionalmente en su
presencia incide la circulación de personas constantemente (Rubio Aranda,
2009).
En el medio BC se obtuvieron 35 bacterias presuntivas de Bacillus sp. y 6
bacterias presuntivas de Bacillus cereus. Esta bacteria es caracterizadas por
encontrarse en suelo, polvo, aguas, alimentos y vegetación, además de ser
un patógeno productor de esporas el cual lo hace resistente a condiciones
extremas. La temperatura óptima de crecimiento de Bacillus cereus se
encuentra entre los 30°C y 40°C (Fundación Vasca para la Seguridad
Agroalimentaria, 2015). Este tipo de bacteria es posible encontrarla en el
47
laboratorio, ya que se acumulan cantidades considerables de polvo, sobre
todo en los depósitos de materiales y en algunos equipos como las neveras,
además durante las actividades académicas en el laboratorio es constante el
análisis de muestras de suelo, agua y alimentos contaminados. Otro factor
importante a considerar es la capacidad de formar esporas, el cual lo hace
muy resistente en el ambiente, aunque la temperatura promedio del
laboratorio sea de 22,5°C y el crecimiento óptimo de Bacillus sp. esta entre
los 30°C y 40°C, no es un problema sobrevivir en el laboratorio gracias a esta
condición. Es por estas razones que se obtuvo un número alto de bacterias
en BC, siendo las más presuntivas Bacillus sp. y Bacillus cereus.
En el medio BP se obtuvieron 26 bacterias presuntivas de Staphylococcus
sp. y 10 bacterias presuntivas de Staphylococcus aureus, este tipo de
bacteria es muy común encontrarla en el aire, agua, residuos, alimentos y en
la piel, cabello, fosas nasales y garganta de animales y seres humanos, es
muy resistente en el medio ambiente y puede sobrevivir durante largos
periodos de tiempo en un ambiente seco, además su crecimiento es óptimo
en temperaturas mesófilas (Fundación Vasca para la Seguridad
Agroalimentaria, 2013). Dentro del laboratorio es muy probable encontrar
diferentes especies de Staphylococcus, ya que es muy común encontrarla en
el ambiente, donde el aire es uno de los principales medios de transporte y
en donde los seres humanos son su principal reservorio, teniendo en cuenta
el constante flujo de personas en el laboratorio. Adicionalmente esta género
sobrevive mucho tiempo en ambientes secos, lo que hace que pueda
encontrarse en diferentes partes del laboratorio.
En este mismo medio selectivo se obtuvo un crecimiento de 40 bacterias
presuntivas de Micrococcus sp., la bacteria persistente en el aire según los
resultados obtenidos en los medios selectivos. Este género es muy común en
el ambiente, ya que sus condiciones de crecimiento no son exigentes, pues
crece en temperaturas mesófilas como las del laboratorio y se encuentra en
48
la piel de los seres humanos; encontrándose en la cara, manos, brazos y
piernas. Es posible encontrar este género en el suelo, agua, plantas, polvo y
aire y de este modo en las muestras contaminadas de todo tipo que se
trabajan en el laboratorio. La acumulación de polvo incide también en su
presencia (Canet, Hernández, Almagro & Garau, 2001) que es considerable
en muchas zonas de este espacio.
En el medio SPS no se obtuvo ninguna bacteria presuntiva de Clostridium sp.
esto puede ser debido a que es una bacteria anaerobia y el laboratorio se
encuentra en un ambiente aeróbico, aunque no se puede descartar la
existencia de esta bacteria, ya que Clostridium sp. es formador de esporas la
cual la hace ser una bacteria resistente a condiciones extremas, además es
habitual encontrarla en el polvo, el suelo, agua y tracto digestivo de animales,
aunque su mayor fuente de transmisión son los alimentos (Fundación Vasca
para la Seguridad Agroalimentaria, 2013).
En el conteo inicial de colonias se obtuvieron un total de 183 UFC, las cuales
143 colonias eran Gram positivas y 40 Gram negativas. Al sembrar todas las
colonias en medios selectivos se obtuvo un total de 127 colonias, de ellas
117 Gram positivas y 10 Gram negativas, entre las colonias restantes (56)
se encontraban 26 Gram positivas y 30 Gram negativas. De estas colonias
no se obtuvo ningún crecimiento en los medios selectivos, ya que pueden ser
pertenecientes a otras clases de bacterias, puesto que estos medios y esta
clasificación se hizo basado en los objetivos y en la búsqueda principal de las
bacterias patógenas nombradas durante el estudio.
Las bacterias a identificar fueron seleccionadas teniendo en cuenta las
características morfológicas y metabólicas de las colonias, para ordenarlas
dentro de un género establecido al que tienen mayor semejanza (Zaragoza
Crespo, Gimeno Cardona, Pemán García, & Salavert Lletí, 2007).
49
5.5. Identificación de bacterias obtenidas en la toma de muestras
para la recuperación de Clostridium sp. mediante pruebas
bioquímicas.
Las pruebas bioquímicas realizadas para identificar las colonias recuperadas
en la búsqueda de Clostridium sp. indicaron como bacterias a Micrococcus
sp. y Gemella sp. en los muestreos (8 y 10).
Tabla 7. Identificación mediante pruebas bioquímicas por punto de muestreo.
Muestra Lugar/ No.
de Colonia
Pruebas bioquímicas
NaCl
6.5% Ur In Ca Ox Mo He OF Género Identificado
8 M 1 + - - + - - ɣ +/-
Micrococcus sp.
10
M 1 + - - + - - α +/-
M 2 - - - + - - α -/-
Gemella sp.
M 3 - - - + - - α -/-
M 4 - - - + - - α +/-
M 5 - - - + - - α -/-
M: Mesa, NaCl 6.5%: Cloruro de Sodio 6.5 %, Ur: Ureasa, In: Indol, Ca: Catalasa, Ox: Oxidasa, Mo:
Motilidad, He: Hemólisis, OF: Oxidación/Fermentación, +: Positivo, -: Negativo, α: Alpha, β: Beta, ɣ:
Gamma, M1: Mesa número 1, M2: Mesa número 2, M3: Mesa número 3, M4: Mesa número 4, M5:
Mesa número 5.
Estas bacterias son cocos Gram positivos correspondientes a la flora
bacteriana normal humana, en donde aparece el género Microccocus sp.
como bacteria predominante al persistir en diferentes muestreos con distintas
condiciones. También se encuentra Gemella sp. que es una bacteria
microaerofílica, es decir, puede crecer con niveles mínimos de oxígeno o en
condiciones anaeróbicas, además tiene un crecimiento en un amplio rango
de temperaturas pero optimo entre los 35°C y 37°C, son parte de la flora
50
humana normal en la cavidad oral y del tracto respiratorio superior. Según
sus reservorios y características de crecimiento es posible encontrar esta
bacteria en el laboratorio, el cual se encuentra constantemente utilizado por
personas y su temperatura promedio se encuentra cerca del óptimo de
crecimiento de esta bacteria (Canet, Hernández, Almagro & Garau, 2001).
5.6. Identificación de bacterias seleccionadas mediante BBL Crystal.
De las colonias seleccionadas previamente, con el uso de los medios
selectivos, fueron identificadas 30 bacterias mediante los Kit de identificación
BBL Crystal. La identificación mostró mayor variedad en las bacterias Gram
negativas, encontrándose 7 géneros de bacterias diferentes con 9 especies
distintas; Pseudomonas stutzeri, P. putida, Yersinia pseudotuberculosis, Y.
enterocolitica Group, Serratia fonticola, Shigella sp., Klebsiella pneumoniae
sp. ozaenae, Citrobacter freundii, Acinetobacter iwoffii). Con respecto a las
bacterias Gram positivas, se identificaron 5 géneros con 9 especies
diferentes de bacterias; Micrococcus sedentarius, Staphylococcus
haemolyticus, S. capitis, S. cohnii sp. cohnii, S. hominis, S. lentus,
Leuconostoc pseudomesenteroides, Bacillus subtilis, Corynebacterium renale
Group, predominando el género Micrococcus (Tabla 8).
Los géneros y especies de bacterias determinadas corresponden a un
ambiente interno en donde los niveles de ocupación son altos y/o la
renovación o flujos de aire insuficientes. Como se evidencia se trata de
bacterias Gram positivas correspondientes a la flora bacteriana normal
humana, en donde aparecen como dominantes los géneros Microccocus y
Staphylococcus (Hernández Calleja, 1996).
Por otro lado, la existencia de focos de contaminación inusuales como los
residuos del lavado, de aguas estancadas o contaminadas que normalmente
se manejan como muestras que hacen parte de trabajo de clase y de
investigación dentro del laboratorio, aportan al aire diferentes géneros de
51
bacterias sobre todo Gram negativas, lo que se evidencia en la variedad de
las bacterias Gram negativas recuperadas (Hernández Calleja, 1996).
Tabla 8. Resultados de identificación de bacterias mediante el Kit BBL Crystal
Coloración Gram
Microorganismo Valor de
Confianza BBL Crystal
No. De Identificadas
Positiva
Micrococcus sedentarius 0.99 9
Micrococcus sedentarius 0.46 1
Staphylococcus haemolyticus 0.93 2
Staphylococcus capitis 0.99 2
Staphylococcus cohnii sp. cohnii 0.86 1
Staphylococcus hominis 0.99 1
Staphylococcus lentus 0.99 1
Leuconostoc pseudomesenteroides 0.92 1
Bacillus subtilis 0.99 1
Corynebacterium renale Group 0.99 1
Negativa
Pseudomonas stutzeri 0.98 1
Pseudomonas putida 0.95 1
Yersinia pseudotuberculosis 0.92 1
Yersinia enterocolitica Group. 0.51 1
Serratia fonticola 0.74 1
Shigella sp. 0.99 1
Klebsiella pneumoniae sp. ozaenae 0.96 1
Citrobacter freundii 0.91 1
Acinetobacter iwoffii 0.99 2
En las colonias identificadas como Micrococcus sedentarius con valores de
confianza de 0.46 en el grupo de bacterias Gram positivas y en el grupo de
las bacterias Gram negativas como Yersinia enterocolitica Group con un
valor de confianza de 0,51 y Serratia fonticola valor de confianza de 0,74, el
Software no emitió un resultado de identificación, produciéndose inaceptable,
por lo tanto, se realizaron pruebas confirmativas.
5.7. Pruebas confirmativas para las bacterias identificadas mediante
el kit BBL Crystal.
Las pruebas confirmativas se realizaron mediante pruebas bioquímicas
tradicionales a las bacterias cuyo resultado fue inaceptable en la
52
identificación con el BBL Crystal; Micrococcus sedentarius, Yersinia
enterocolitica Group. y Serratia fonticola con el fin de confirmar el resultado
obtenido con el kit (Tabla 9) (Becton & Dickinson, 2012).
Tabla 9. Pruebas bioquímicas confirmativas.
Microorganismo
Pruebas bioquímicas
NaCl
6.5% Ur In Ca Ox Mo He TSI Lac Gluc H2S Gas
Micrococcus
sedentarius + + - + - - α
Micrococcus
sedentarius + - - + - - β
Yersinia Enterocolitica
Group. - + - - β Alc/A - + - -
Serratia fonticola - - + + ɣ A - + - -
Las pruebas bioquímicas fueron realizadas teniendo en cuenta, la reacción a
la coloración de Gram, así como la prueba propuesta por el BBL Crystal.
Debido a sus características metabólicas las pruebas de crecimiento en
medio NaCl 6.5%, prueba de catalasa positiva, oxidasa e indol negativas,
confirmaron la identificación Micrococcus sedentarius. Así mismo, los
resultados el resultado Alcalino/Ácido obtenido en agar TSI que determina
fermentación solamente de la glucosa, y los resultados catalasa positiva y
motilidad negativa confirmaron la determinación de Yersinia enterocolitica
Group (MacFaddin, 2000; Bannerman & Peacock, 2006).
Finalmente los resultados confirmaron la recuperación de Serratia fonticola;
no fermentación de la lactosa, catalasa positivo, oxidasa-negativa y
fermentación de la glucosa (Powell & Marcon, 2012).
NaCl 6.5%: Cloruro de Sodio 6.5 %, Ur: Ureasa, In: Indol, Ca: Catalasa, Ox: Oxidasa, Mo: Motilidad,
He: Hemólisis, TSI: Triple Sugar Iron, Lac: Lactosa, Gluc: Glucosa, H2S: Sulfuro de Hidrogeno,
+: Positivo, -: Negativo, α: Alpha, β: Beta, ɣ: Gamma, Alc: Alcalino, A: Acido.
53
5.8. Relación entre las bacterias identificadas con las afecciones en
la salud.
Con respecto a la presencia de los géneros y especies de bacterias, se
encontraron consideradas patógenas, Pseudomonas sp., Staphylococcus
sp., Bacillus sp. y las pertenecientes a las Enterobacterias. Así mismo, se
recuperaron otros géneros, Yersinia pseudotuberculosis, Y. enterocolitica
Group, Serratia fonticola, Shigella sp., Klebsiella pneumoniae sp. ozaenae,
Citrobacter freundii, Acinetobacter iwoffii, Leuconostoc pseudomesenteroides
y Corynebacterium renale (Tabla 10).
Los géneros y las especies son correspondientes a la flora bacteriana natural
humana por lo que se recuperaron mayor cantidad de Micrococcus y de
Staphylococcus, como de Enterobacterias provenientes del aporte de
bacterias al aire de otros focos de contaminación propios de las actividades
desarrolladas en el laboratorio (Rojo Molinero, Alados, Gómez de la Pedrosa,
Leiva & Pérez, 2015; Hernández Calleja, 1996).
Tabla 10. Relación de enfermedades e infecciones con bacterias identificadas.
Familia Genero Especie Enfermedades y/o
infecciones asociadas
Coccoceae
Micrococcus
sedentarius Infecciones naso-faríngeas (Cole, 1990).
Staphylococcus
haemolyticus Infecciones en la piel y tejidos blandos, infecciones oftalmológicas (Carpinelli, Samudio, Guillén, Laspina, Sanabria et al., 2013).
cohnii
capitis
hominis
lentus
No considerado patógeno (Romeu Álvarez, Lugo Moya, & Rojas Hernández 2011)
Streptococcaceae Leuconostoc pseudomesenteroides Neumonías (Taşkapılıoğlu et al., 2011).
Bacilliaceae Bacillus subtilis Reacciones alérgicas, algunos casos de infecciones respiratorias
54
Familia Genero Especie Enfermedades y/o
infecciones asociadas
(Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo 2014).
Gemella Sp.
Ocasionalmente, infecciones del tipo cutáneo o subcutáneo (Villamil et al., 2009)
Corynebacteriaceae Corynebacterium renale Group Conjuntivitis (Macedo & Vola, 2006).
Pseudomonadaceae Pseudomonas
stutzeri
Otitis media, conjuntivitis y neumonía (Baron, Miller, Weinstein, Richter, Gilligan, Thomson et al., 2013).
putida Infecciones en las extremidades, (Baron et al., 2013).
Enterobacteriaceae
Yersinia pseudotuberculosis
Linfadenitis y diarreas (Puerta García, 2010).
enterocolitica Group. Linfadenitis y diarreas (Puerta García, 2010).
Serratia fonticola Neumonía (Long et al., 2012).
Shigella sp. Diarrea (Lösch,
Gariboglio Vásquez, Rivas & Merino, 2015).
Klebsiella pneumoniae sp. ozaenae
Neumonía primaria, infecciones en heridas (Cruz Orjuela & Jiménez Pallares, 2006)
Citrobacter freundii Otitis media (Baron et al., 2013).
Moraxellaceae Acinetobacter iwoffii Neumonías (Long et al., 2012).
La causa de una infección y subsecuentemente de una enfermedad depende
de la especie, de la persistencia y multiplicación exitosa de una bacteria, así
como del estado de salud del hospedero y de su edad. Por lo tanto, estas
bacterias patógenas o patógenas oportunistas identificadas, pueden
contribuir en la incidencia de enfermedades respiratorias y gastrointestinales
en cualquier persona (Herrera et al, 2012; Cruz Orjuela & Jiménez Pallares,
2006).
55
Comprendiéndose la salud ocupacional, como la salud física y mental del
trabajador dentro de su ambiente laboral como fuera del mismo, asociando
las patologías que lleven a una enfermedad, tratando los efectos crónicos al
dar importancia a los estudios que determinen riesgos a la salud, las
personas que realizan actividades dentro del laboratorio pueden llegar a
verse afectados aun cuando se consideren personas sanas. Es decir, que los
trabajadores en el laboratorio no presenten sensibilidad afectada por
patologías previas, medicación, trastornos inmunitarios, embarazo o lactancia
y no estén dentro de un grupo de personas vulnerables, niños, ancianos y
con sistema inmunológico débil (Berenguer Subils, 1991; Rojo Molinero et al,
2015).
Se pueden presentar algunas infecciones y enfermedades importantes que
pueden afectar, infecciones oftalmológicas, inflamación del oído medio
conocida como otitis media y linfadenitis conocida como inflamación de los
ganglios (Fariña et al, 2013; Puerta García, 2010).
Se destaca que la transmisión y el contagio de algunas de las enfermedades
mencionadas suelen ocurrir de manera horizontal, es decir, por contacto de
persona a persona, personas a objetos y objetos a personas, actuando como
vectores principales de bacterias. Este es el caso de Shigella sp. y las demás
enterobacterias identificadas, haciendo parte de los bioaerosoles presentes
en el aire del laboratorio, que a su vez pueden llegar contaminar a las
personas u objetos en el momento de su sedimentación natural y transmisión
aérea, que constituye la vía de transmisión más efectiva en la mayoría de las
bacterias identificadas (Barra Carrasco et al, 2014, Riedel, 2010; Guardino
Solá, 2001).
El riesgo de contagio existe de acuerdo a la clasificación de los agentes
biológicos en función del riesgo de infección, por lo tanto Corynebacterium
renale Group, Klebsiella pneumoniae sp. ozaenae, Yersinia enterocolitica
56
Group. y Yersinia pseudotuberculosis, se encuentran clasificadas en el grupo
2 como aquellos que pueden causar una enfermedad en el hombre y pueden
suponer un peligro para los trabajadores, con poca probabilidad de
propagación (Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo, 2014).
Los demás géneros y especies identificadas se encuentran dentro del grupo
1, esto no significa que aquellos resulten poco probables en causar una
enfermedad, puesto que pueden ocasionar neumonías, infecciones
pulmonares, naso-faríngeas y alergias en su mayoría, producidas por
Micrococcus sedentarius, Pseudomonas stutzeri, Leuconostoc
pseudomesenteroides, Bacillus subtilis, Serratia fonticola, Acinetobacter
iwoffii y algunas infecciones en la piel y eritema nodoso producidas por
Serratia fonticola, Staphylococcus haemolyticus, S. cohnii, S. capitis y S.
hominis (Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo, 2014;
Taşkapılıoğlu et al, 2011; Long et al, 2012; Cruz Orjuela & Jiménez Pallares,
2006; Fariña et al, 2013).
Existen otras infecciones y enfermedades que afectan a personas con el
sistema inmunológico débil como meningitis, septicemia, bacteriemia y
endocarditis producidas por Leuconostoc pseudomesenteroides, Citrobacter
freundii, Acinetobacter iwoffii y Gemella sp. Algunas suelen ocasionar
infecciones y enfermedades actuando como invasores secundarios u
oportunistas (Taşkapılıoğlu et al, 2011; Powell & Marcon, 2012).
Dentro de las enfermedades destacadas, se encuentran las infecciones en el
tracto respiratorio superior, que por lo general implican las orejas, las
membranas mucosas que recubren la nariz y la garganta, que pueden ser
causados por Micrococcus sedentarius, Pseudomonas stutzeri, Citrobacter
freundii, Yersinia enterocolitica Group. y Yersinia pseudotuberculosis (Baron
et al, 2013).
57
La mayoría de los casos de infecciones oftalmológicas como la conjuntivitis,
una infección que puede amenazar la vista, son causadas por bacterias que
normalmente se asocian con infecciones de las vías respiratorias superiores
y por ciertas bacterias que son parte de la microflora de la piel como
Corynebacterium renale Group y las especies de Staphylococcus
identificadas excepto Staphylococcus lentus (Baron et al, 2013).
Es importante la identificación de estas bacterias por su medio de
propagación y evidencia de supervivencia, al conocerse que el riesgo no se
limita al ámbito estricto del laboratorio y que la evaluación del riesgo
biológico, está sujeta a continuos cambios, quedando por definir, la
importancia epidemiológica de esta vía de transmisión.
58
6. CONCLUSIONES
En total se recuperaron 183 colonias de bacterias en los 20 muestreos
realizados en el laboratorio, de las cuales 30 colonias fueron
identificadas por medio del Kit BBL Crystal, 20 colonias Gram positivas
y 10 Gram Negativas. Finalmente 6 colonias de bacterias fueron
identificadas por medio de pruebas bioquímicas.
Se lograron clasificar las colonias de bacterias recuperadas,
encontrando 3 morfologías diferentes; cocos, bacilos y Cocobacilos,
ordenadas previamente como Gram Positivas y Gram Negativas,
notándose una mayor cantidad de cocos en todos los muestreos así
como un mayor número de bacterias Gram positivas.
Se evidenció la presencia de géneros de bacterias consideradas como
patógenas tales como Staphylococcus sp. con 4 especies diferentes y 5
para Enterobacterias, en menor variedad Pseudomonas sp. con 2
especies diferentes y una sola especie de Bacillus sp. Por otro lado se
notó alta presencia de Micrococcus sp., junto con otras bacterias
patógenas en menor cantidad como Acinetobacter iwoffii y Leuconostoc
pseudomesenteroides y una no considerada patógena Staphylococcus
lentus. Por último no se encontró ninguna colonia perteneciente al
género Clostridium sp.
Se estableció que los géneros y especies de bacterias identificadas
pueden afectar la salud, entre ellos mencionados el género
Staphylococcus sp. y el grupo encontrado de Enterobacterias,
señalando infecciones y enfermedades tales como conjuntivitis,
linfadenitis, diarreas e infecciones pulmonares, casos que pueden
presentarse en cualquier persona y a cualquier edad.
59
7. RECOMENDACIONES
Continuar con el estudio de aerobiología en el ambiente interno del
laboratorio, que determine otros focos de contaminación y/o
proliferación, incluyendo otros géneros y especies de microorganismos.
Efectuar la identificación de las bacterias mediante métodos
moleculares para obtener un valor de confianza más exacto.
Realizar muestreos para la recolección de microorganismos aéreos
utilizando un equipo que succione un volumen de aire establecido de
direcciones diferentes permitiendo un mejor análisis cuantitativo.
Se recomienda aplicar las medidas de seguridad propuestas y
garantizar la limpieza del laboratorio, logrando una disminución de la
cantidad de bacterias en el aire para garantizar la prevención de
enfermedades e infecciones.
60
8. BIBLIOGRAFIA.
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9. ANEXOS.
Anexo 1. Toma de muestras preliminares de bacterias en el aire.
Las muestras se realizaron en el mes de febrero del año 2014 durante el
desarrollo de clases en el laboratorio de microbiología y un día adicional sin
que se realizara ninguna actividad dentro del laboratorio. La toma de
muestras de aire se desarrolló por el método de sedimentación por gravedad
(De la Rosa et al., 2000). Para la toma de las muestras se dejaron las cajas
con medio AN abiertas durante 15 minutos y luego se incubaron a 37°C
durante 48 horas. Las cajas se dejaron encima de los mesones en diferentes
costados, esto para la toma de muestras del aire durante el desarrollo de
actividades académicas, en tanto para la toma de la muestra del aire sin
desarrollarse ningún tipo de actividad en el laboratorio se empleó un modelo
diagonal al laboratorio dejando una caja sobre la Nevera 1 que se encuentra
cercana a la entrada, otra sobre la Mesa 2 y la última sobre el Armario
(Toloza Moreno et al., 2012).
Puntos de toma de muestras preliminares.
Fuente: Los autores.
68
a. Toma de muestras del aire con actividades académicas.
La primera muestra se realizó el día jueves 13 de febrero de 8 a 10 de la noche y la
segunda toma de muestras se realizó el día viernes 14 de febrero de 4 a 6 de la
tarde.
Durante la toma de muestras del aire con actividades académicas se dejaron
abiertas las cajas durante 15 minutos ubicadas a la altura de los mesones en cada
uno de los costados de estos mismos. Además se tuvieron en cuenta diversos
factores como la cantidad de personas que se encontraban en el laboratorio en
donde se obtuvo un total de 15 personas en el primer muestreo y 18 personas en el
segundo muestreo entre estudiantes, profesores y auxiliares de laboratorio.
También se tuvieron en cuenta factores ambientales como humedad y temperatura
dentro del laboratorio, en el cual el día jueves se presentó una humedad relativa del
52% y una temperatura de 25° C., mientras que para el día viernes una humedad
relativa del 56% y una temperatura de 25° C.
Resultados de la toma de muestras del día jueves.
Lugar Descripción de la muestra UFC/15 minutos/63.61cm2
M1 Punto A
3 Colonias amarillo brillante, borde circular y elevada. 6 Colonias Blanco brillante, borde circular, cóncava. 3 Colonias beige, borde circular y elevada.
12
M1 Punto B
2 Colonias marrón brillante, borde circular elevada. 2 Colonias amarillo verdoso, borde circular, elevada. 4 Colonias blancas circular brillante, elevada. 2 Colonias beige y redonda plana. 2 Colonias rosadas, circulares. 1 Colonia roja brillante, circular.
13
M2 Punto A
4 Colonias amarillas opacas, redondas planas. 2 Colonias naranja brillante, redondas con borde circular, cóncava. 4 Colonias blanca beige, redondas planas.
14
M3 Punto A
3 Colonias blancas, bordes circulares y planas. 3 Colonias amarillas oscuras, borde circular, planas 3 Colonias color gris, borde circular y planas. 2 Colonias rosadas, borde irregular y poroso.
11
M4 Punto A
5 Colonias amarillo verdoso, borde circular. 1 Colonia blanca transparente. 5 Colonias blancas beige brillante, borde circular y cóncava.
11
M: Mesa, UFC: Unidades Formadoras de Colonia, 15 minutos: Tiempo de exposición de la caja de
Petri, 63.61cm2
: Área de la caja de Petri, M1: Mesa número 1, M2: Mesa número 2, M3: Mesa número
3, M4: Mesa número 4.
69
Resultados de la toma de muestras del día jueves.
Lugar
Descripción de la muestra UFC/15 minutos/63.61cm2
M1 Punto A
4 Colonias amarillo brillante, borde circular. 2 Colonias amarillo oscuro, borde circular. 1 Colonia marrón, borde Irregular. 2 Colonias blancas opacas. 1 Colonia blanca clara, cóncava 1 Colonia blanca opaca. 3 Colonias marrón, borde circular. 2 Colonias color gris, planas.
16
M1 Punto B
1 Colonia color amarillo cóncava. 2 Colonias amarillo oscuro. 3 Colonias blancas planas. 3 Colonias marrón planas irregulares.
9
M2 Punto A
6 Colonias amarillas claras, borde circular, cóncavas. 13 Colonias color gris, puntos pequeños y elevados. 4 Colonias marrón, bordes circulares y planos. 2 Colonias marrón, bordes irregulares y planas. 3 Colonias blancas, bordes circulares y planos.
28
M3 Punto A
3 Colonias amarillas, borde circular. 2 Colonias marrón, planas. 3 Colonias blancas brillante y planas. 1 Colonia color café, borde circular. 3 Colonias blancas. 1 Colonia rosada, borde irregular y porosa.
13
M3 Punto B
5 Colonias blancas, borde circular. 1 Colonia blanca, borde irregular. 1 Colonia amarillo claro, borde circular. 1 Colonia café, borde circular. 1 Colonia beige, con borde circular, plana. 1 Colonia beige, borde irregular.
10
M4 Punto A
2 Colonias borde blanco, centro marrón, 1 Colonia amarillo, borde circular. 1 Colonia marrón, borde circular. 1 Colonia blanca, borde circular. 2 Colonias beige, borde irregular.
7
M: Mesa, UFC: Unidades Formadoras de Colonia, 15 minutos: Tiempo de exposición de la caja de
Petri, 63.61cm2
: Área de la caja de Petri, M1: Mesa número 1, M2: Mesa número 2, M3: Mesa número
3, M4: Mesa número 4.
b. Toma de muestras de aire sin actividades en el laboratorio.
La toma de la muestra del aire se realizó el día miércoles 26 de febrero del
año 2014, ese día en el laboratorio no se realizaron actividades académicas
ni de investigación. Se utilizaron 3 cajas con medio de cultivo AN las cuales
se dejaron en diferentes posiciones dentro del laboratorio. El laboratorio
permaneció con la puerta abierta todo el tiempo y con las ventanas cerradas,
70
la humedad relativa del laboratorio en su momento era de 51% y la
temperatura de 25ºC.
Resultados de la toma de muestras del aire sin actividades en el laboratorio.
Lugar Descripción de la muestra UFC/15 minutos/63.61cm2
Nevera 1 1 Colonia color blanco brillante y uniforme. 1
M2 No hubo crecimiento de ningún microorganismo. 0
A > 200 colonias de bacterias blancas y uniformes. 3 Colonias color blanco brillante e irregular. 3 Colonias color blanco opaco e irregular.
> 200
M: Mesa, A: Armario, M2: Mesa número 2, UFC: Unidades Formadoras de Colonia, 15 minutos:
Tiempo de exposición de la caja de Petri, 63.61cm2
: Área de la caja de Petri.
c. Selección de los puntos de muestreo durante la investigación.
Para la selección de los puntos de la toma del aire para la investigación se
tuvieron en cuenta los resultados de este análisis preliminar en donde se
mostró que en el primer muestreo la ubicación de la caja en la mesa número
dos es la que tiene mayor crecimiento y variedad de bacterias, 13 colonias
para el día jueves y 28 para el día viernes; así mismo la caja ubicada en el
Armario evidenció un crecimiento alto de bacterias > 200 colonias sin que se
realicen actividades académicas o de investigación; de este modo se
seleccionaron estos puntos en donde se priorizo la cantidad de colonias
obtenidas con actividades y sin actividades dentro del laboratorio.
71
Anexo 2. Procedimiento de anaerobiosis en la cámara Anaerojar de Oxoid.
La Anaerojar de Oxoid es una cámara de anaerobiosis que está compuesta
por una base de policarbonato y un cestillo porta placas en donde se
colocaron las cajas de Petri, los sobres generadores y los indicadores de
anaerobiosis, esta base se aseguró a una tapa con 4 pinzas, la tapa posee
una goma alrededor y una válvula de compensación de vacío la cual se abre
en el momento que haya una presión negativa y no se permita abrir la tapa
(Oxoid Ltd, 2006).
Se inició colocando dos placas con muestra por cada toma de muestras en el
cestillo, una vez colocadas se abrió el sobre generador de anaerobiosis
GasPak EZ de BD y el indicador que se compone de una pastilla color
blanco, estos se colocaron en las pinzas del cestillo, una vez hecho esto, se
tapó con las 4 pinzas de la cubierta, verificando que la válvula de
compensación estuviera completamente cerrada, se empleó un tiempo muy
corto entre la acción de abrir el sobre generador y cerrar la tapa, menos de
un minuto, ya que una exposición más prolongada hace disminuir la
reactividad y no poder conseguir los resultados esperados. Lo siguiente fue
llevar la cámara a una incubación de 37ºC por 48 horas (Becton & Dickinson
2011; Oxoid Ltd, 2006).
La utilización de los sobres GasPak EZ de BD, producen una atmósfera
anaeróbica la cual es necesaria para microorganismos anaeróbicos,
microaerófilos y capnófilos. El componente activo que contiene el sobre es
carbonato inorgánico, carbón activado, ácido ascórbico y agua. Su
efectividad consiste en que el oxígeno atmosférico que contiene la jarra es
rápidamente reducido con la generación simultanea de dióxido de carbono
producido por el carbonato inorgánico, esta reacción continua sin producción
de hidrogeno y por lo tanto no requiere de un catalizador. La reacción del
ácido ascórbico con el oxígeno es exotérmica, sin embargo la temperatura
72
del sobre generador no sobrepasa los 65ºC. En 30 minutos se puede
observar una condensación dentro de la cámara, en 2,5 horas se alcanzan
las condiciones anaeróbicas y el nivel de oxigeno es menor o igual al 1%, en
24 horas se obtiene el 13% o más de dióxido de carbono siguiendo los 37ºC
de incubación. La pastilla indicadora inicialmente era de color blanca, una
vez expuesta a una atmosfera oxigenada cambia su color a un tono azul,
poco a poco al ir reduciendo el oxígeno los sobres generadores, la pastilla se
vuelve de nuevo blanca lo que nos indica que la cámara se encuentra en un
estado de anaerobiosis, esto tarda aproximadamente 9 horas (Becton &
Dickinson, 2011).
73
Anexo 3. Procedimiento de identificación BBL Crystal.
Se utilizaron dos sistemas de identificación BBL Crystal, uno para bacterias
Gram positivas y otro para bacterias Gram negativas. Los equipos incluyen
tapas del panel, bases y tubos de fluido de inóculo. El sistema de
identificación de bacterias Gram positivas cuenta con la utilización de 29
substratos convencionales, fluorogénicos y cromogénicos modificados,
además de un líquido utilizado para el inóculo, el cual está compuesto por
KCl, CaCl2, tricina, glicina y agua utilizados para llenar los 30 pocillos de la
base. Por otra parte el sistema de identificación para bacterias Gram
negativas cuenta con un test de fermentación, oxidación, degradación e
hidrólisis de 30 Substratos (carbohidratos, glucósidos, aminas, amidas,
aminoácidos, citrato, tetrazolio), el líquido utilizado para el inóculo está
compuesto por NaCl, ácido morfolinpropanosulfónico y agua, utilizado para
llenar una base de 30 pocillos para las reacciones. Ambos sistemas están
diseñados para la identificación de bacterias de importancia clínica. (Becton
& Dickinson, 2010; Becton & Dickinson, 2012).
Una vez el inoculo se vierte en todos los pocillos del panel se alinea la tapa
con la base, y luego se cierra en dos clic, el inóculo de la prueba rehidrata los
substratos secos e inicia las reacciones de las pruebas. Después de un
periodo de incubación a 37°C en 48 horas, se examinaron los pocillos para
determinar cambios de color o fluorescencia que resultan de las actividades
metabólicas de los microorganismos; las pruebas se basan en la utilización y
degradación microbiana de substratos específicos detectados por varios
sistemas indicadores, se producen cambios de color que pueden detectarse
visualmente. Además, hay pruebas que detectan la capacidad de un
organismo de hidrolizar, degradar, reducir o de alguna forma utilizar un
substrato en los sistemas. La serie de colores resultante de las 29 o 30
reacciones según el sistema, se convierte en un número de perfil de diez
dígitos que se utiliza como la base de identificación. Las series de reacciones
74
bioquímicas y enzimáticas de todos los substratos para una gran variedad de
microorganismos que están almacenados en la base de datos. La
identificación se deriva de un análisis comparativo entre las series de
reacciones del aislado de la prueba y las de la base de datos. El número de
perfil resultante y los resultados de las pruebas Independientes (Tinción de
Gram, Prueba de la oxidasa y Prueba del Indol) se tabularon en un
computador con el libro electrónico de códigos instalado para obtener la
identificación (Becton & Dickinson, 2010; Becton & Dickinson, 2012).
75
Anexo 4. Preparación de medios de cultivo.
a. Medios generales.
Agar Nutritivo (AN) (Merk, 1990).
- Suspender 28g de AN en polvo en 1000mL de agua destilada en un
Erlenmeyer.
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
- Luego el medio se pasa a esterilizar en un autoclave durante 15
minutos a 121°C.
- Después se sirve aproximadamente 20mL de medio en cajas de Petri
debidamente esterilizadas y marcadas.
- Por ultimo las cajas de Petri se dejan enfriar para que el medio se
solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
b. Medio selectivos.
Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) (Merk, 1990).
- Suspender 36g de Agar EMB en polvo en 1000mL de agua destilada
en un Erlenmeyer.
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
- Luego el medio se pasa a esterilizar en un autoclave durante 15
minutos a 121°C.
76
- Después se sirve aproximadamente 20mL de medio en cajas de Petri
debidamente esterilizadas y marcadas.
- Por ultimo las cajas de Petri se dejan enfriar para que el medio se
solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
Agar Brilliance Bacillus cereus (Merk, 1990).
- Suspender 43,14g de Agar Brilliance Bacillus cereus en polvo en
1000mL de agua destilada en un Erlenmeyer.
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
- Luego el medio se pasa a esterilizar en un autoclave durante 15
minutos a 121°C.
- Una vez estéril se le adiciona al medio 52,62mL de emulsión yema de
huevo con una pipeta estéril, Luego se le agregan 0,05g de Polimyxina
B y se agita muy bien hasta su homogenización.
- Después se sirve aproximadamente 20mL de medio en cajas de Petri
debidamente esterilizadas y marcadas.
- Por ultimo las cajas de Petri se dejan enfriar para que el medio se
solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
Agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS) (Merk, 1990).
- Suspender 40g de Agar SPS en polvo en 1000mL de agua destilada
en un Erlenmeyer.
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
77
- Luego el medio se pasa a esterilizar en un autoclave durante 15
minutos a 121°C.
- Después se sirve aproximadamente 20mL de medio en cajas de Petri
debidamente esterilizadas y marcadas.
- Por ultimo las cajas de Petri se dejan enfriar para que el medio se
solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
Agar Baird Parker (Merk, 1990).
- Suspender 58g de Agar Baird Parker en polvo en 1000mL de agua
destilada en un Erlenmeyer.
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
- Luego el medio se pasa a esterilizar en un autoclave durante 15
minutos a 121°C.
- Una vez estéril se le adiciona al medio 50mL de emulsión yema de
huevo con telurito en una pipeta estéril y se agita muy bien hasta su
homogenización.
- Después se sirve aproximadamente 20mL de medio en cajas de Petri
debidamente esterilizadas y marcadas.
- Por ultimo las cajas de Petri se dejan enfriar para que el medio se
solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
Agar Cetrimide (Merk, 1990).
- Suspender 45,8g de Agar Cetrimide en polvo en 1000mL de agua
destilada en un Erlenmeyer, además se le adiciona 10mL de glicerina
antes de fundir el medio.
78
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
- Luego el medio se pasa a esterilizar en un autoclave durante 15
minutos a 121°C.
- Después se sirve aproximadamente 20mL de medio en cajas de Petri
debidamente esterilizadas y marcadas.
- Por ultimo las cajas de Petri se dejan enfriar para que el medio se
solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
Agar Sangre (Merk, 1990).
- Suspender 40g de Agar Sangre en polvo en 1000mL de agua
destilada en un Erlenmeyer.
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
- Luego el medio se pasa a esterilizar en un autoclave durante 15
minutos a 121°C.
- Una vez estéril se le adiciona al medio 25mL de sangre de cordero
estéril y se agita muy bien hasta su homogenización.
- Después se sirve aproximadamente 20mL de medio en cajas de Petri
debidamente esterilizadas y marcadas.
- Por ultimo las cajas de Petri se dejan enfriar para que el medio se
solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
79
Agar MacConkey (Merk, 1990).
- Suspender 50g de Agar MacConkey en polvo en 1000mL de agua
destilada en un Erlenmeyer.
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
- Luego el medio se pasa a esterilizar en un autoclave durante 15
minutos a 121°C.
- Después se sirve aproximadamente 20mL de medio en cajas de Petri
debidamente esterilizadas y marcadas.
- Por ultimo las cajas de Petri se dejan enfriar para que el medio se
solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
c. Medios para pruebas bioquímicas.
Caldo Urea (MacFaddin, 2003).
- Colocar 1000mL de agua destilada en un Erlenmeyer, el cual se tapa y
se lleva a esterilizar en un autoclave durante 15 minutos a 121°C.
- Luego se suspenden 38g de Urea en polvo en el agua destilada ya
estéril y se agita suavemente hasta su completa dilución.
- Después se sirve aproximadamente 4mL de medio por cada tubo de
ensayo debidamente estériles y marcados.
- Por último los tubos de ensayo con medio líquido se tapan, se dejan
enfriar y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
80
Agar Triple Sugar Iron (TSI) (MacFaddin, 2003).
- Suspender 64,4g de Agar TSI en polvo en 1000mL de agua destilada
en un Erlenmeyer.
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
- Después se sirve aproximadamente 9mL de medio en tubos de
ensayo debidamente estériles y marcados.
- Luego los tubos con el medio se pasa a esterilizar en un autoclave
durante 15 minutos a 121°C.
- Por último se inclinan los tubos en un ángulo de 10° sobre la
horizontal aproximadamente y se dejan enfriar para que el medio se
solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
Agar Sulfuro Indol Motilidad (SIM) (MacFaddin, 2003).
- Suspender 31,4g de Agar SIM en polvo en 1000mL de agua destilada
en un Erlenmeyer.
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
- Después se sirve aproximadamente 5mL de medio en tubos de
ensayo debidamente estériles y marcados.
- Luego los tubos con el medio se pasa a esterilizar en un autoclave
durante 15 minutos a 121°C.
- Por último se dejan enfriar en posición vertical para que el medio se
solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
81
Medio Basal O.F. (MacFaddin, 2003).
- Suspender 9,8g de Medio Basal O.F. en polvo en 1000mL de agua
destilada en un Erlenmeyer.
- Se tapa el Erlenmeyer y se funde en una plancha de calentamiento
hasta su ebullición, se debe de agitar suavemente hasta su completa
dilución.
- Después se sirve aproximadamente 9mL de medio en tubos de
ensayo debidamente estériles y marcados.
- Luego los tubos con el medio se esterilizan en un autoclave durante
15 minutos a 121°C.
- Por último se le agrega al medio hidratos de carbono en concentración
final del 1% y se dejan enfriar en posición vertical para que el medio
se solidifique y se almacenan en una nevera para su posterior uso.
82
Anexo 5. Clasificación de las características microscópicas de las colonias
por cada punto de muestreo.
En esta tabla se pueden ver el número total de las tres diferentes morfologías
determinadas y del resultado de la coloración de Gram por cada muestreo
realizado y por cada punto en donde se tomó la muestra. Encontrándose un
total de 137 bacterias Gram Positivas en donde predominan 133 cocos,
seguido de 2 bacilos y 2 cocobacilos en total, en comparación con las
bacterias Gram negativas, en las cuales se obtuvo un total de 40 bacterias,
clasificándose en 18 Cocos, 16 cocobacilos y 6 bacilos.
Número de colonias según su morfología y el resultado de la coloración de Gram por cada punto de
muestreo
Muestreo Lugar
de muestra
Colonias Gram positivas Colonias Gram negativas
Cocos Bacilos Coco
bacilos Cocos Bacilos
Coco bacilos
1 M 5 0 0 0 2 1
A 2 0 0 0 0 0
2 M 12 1 1 2 1 5
A 6 0 0 1 0 0
3 M 11 1 0 0 1 0
A 1 0 0 0 0 0
4 M 9 0 0 1 1 2
A 0 0 0 0 0 0
5 M 16 0 0 2 0 2
A 12 0 0 1 0 1
6 M 8 0 0 1 0 0
A 6 0 0 1 0 0
7 M 10 0 0 3 0 3
A 8 0 1 1 1 2
8 M 12 0 0 3 0 0
A 3 0 0 0 0 0
9 M 4 0 0 0 0 0
A 2 0 0 1 0 0
10 M 4 0 0 1 0 0
A 2 0 0 0 0 0
Total 133 2 2 18 6 16
137 40
M: Mesa, A: Armario.
83
Anexo 6. Clasificación de las características microscópicas de las colonias
por cada punto de muestreo para la recuperación de Clostridium sp.
En esta tabla se pueden ver el número total de las tres diferentes morfologías
determinadas y del resultado de la coloración de Gram por cada muestreo
realizado y por cada punto en donde se tomó la muestra. Encontrándose un
total de 6 bacterias Gram positivas en donde predominan los cocos (6), con
ninguna evidencia de bacilos y/o cocobacilos, por otro lado, tampoco hubo
crecimiento de bacterias Gram negativas.
Número de colonias según su morfología y el resultado de la coloración de Gram por cada punto de
muestreo para la recuperación de Clostridium sp.
Muestreo Lugar
de muestra
Colonias Gram positivas Colonias Gram negativas
Cocos Bacilos Coco
bacilos Cocos Bacilos
Coco bacilos
1 M 0 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0
2 M 0 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0
3 M 0 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0
4 M 0 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0
5 M 0 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0
6 M 0 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0
7 M 0 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0
8 M 1 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0
9 M 0 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0
10 M 5 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0
Total 6 0 0 0 0 0
6 0
M: Mesa, A: Armario.