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DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LOS FOSFITOS COMO FUNGICIDA Y

FERTILIZANTE EN SEMILLAS DE RYEGRASS.

PRESENTADO POR:

ANGELA MARIA ARIAS SIERRA ANDREA XIMENA HERNANDEZ MARTINEZ

Tesis presentada como requisito para optar al título de Microbiología Industrial

DIRECTOR:

VIVIANA GUTIERREZ R. MS. Departamento de Microbiología Pontificia Universidad Javeriana

CODIRECTOR

RODRIGO A. ORTEGA BLU. Ph.D.

Departamento de Ingeniería Comercial Universidad Técnica Federico Santa María, Santiago-Chile

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

Julio 2015

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DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LOS FOSFITOS COMO FUNGICIDA Y FERTILIZANTE EN SEMILLAS DE RYEGRASS.


APROBADO ______________________________ _________________________________ CONCEPCION PUERTA BULA. Ph.D MARCELA FRANCO CORREA. Ph.D. Decana Académica Directora De Programa Académico

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DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LOS FOSFITOS COMO FUNGICIDA Y FERTILIZANTE EN PLANTULAS DE RYEGRASS (Lolium perenne L.).


APROBADO _________________________________ ___________________________ VIVIANA GUTIERREZ ROMERO, MSc. RODRIGO ORTEGA BLU. Ph.D. DIRECTOR CODIRECTOR

______________________________________

MARIA MERCEDES MARTINEZ S. Ph.D. EVALUADOR

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Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos

en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra

persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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AGRADECIMIENTOS Primero que todo queremos agradecer a Dios por brindarnos la oportunidad de culminar de forma satisfactoria parte de nuestra carrera, brindarnos cada día sabiduría y fortaleza para asumir uno de los retos que se presentaban. A nuestros padres y hermanos les dedicamos este trabajo ya que fueron ellos los que nos dieron su voz de aliento e inmenso apoyo para la realización de este mismo. Su compresión y compañía fue de gran valor en los momentos difíciles. Muchas gracias por hacer nuestras vidas mejor. A la profesora Viviana Gutiérrez, sin su colaboración, guía y supervisión este trabajo no podría haberse realizado. Nuestro más profundo agradecimiento por todas las enseñanzas que nos dio y por depositar su confianza en nosotras. Así mismo, al doctor Rodrigo Ortega, quien a pesar de la distancia, acompañó el trabajo, nos asesoró y brindó su confianza. Al profesor Alejandro Reyes por su acompañamiento y asesoramiento en el desarrollo de la cromatografía liquida. Al profesor Ricardo Vera porque siempre estuvo dispuesto a prestar su ayuda y colaboración, también porque fue una voz de apoyo y motivación para terminar este proyecto de forma exitosa. A los integrantes del Laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos encabezado por la profesora Aura Marina Pedroza, el profesor David Gómez, Tania, Lizeth, Daniel y Laura que se convirtieron en guías y apoyos, su acompañamiento e interés en el trabajo muy fue importante.

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INDICE DE CONTENIDO

Resumen………………………………………………………………………….. 8 1. Introducción ………………..……………………………………………......... 9

2. Planteamiento del problema …………………….…………………………… 11 3. Justificación…………………………………………………………………….. 12 4. Marco Teórico………………………………………………………………….. 13

4.1. Fosforo…………………………………………………………………….. 13 4.2. Fosfito……………………………………………………………………… 14

4.3. P. infestans……………………………………………………………….. 15 4.4. Cromatografía Liquida…………………………………………………… 16 4.5 Cromatografía Fase Normal…………………………………………….. 17 4.7. Cromatografía Fase Reversa…………………………………………… 16

5. Objetivo General………………………………………………………………. 17 5.1. Objetivos específicos…………………………………………………. 18

6. Metodología…………………………………………………………………….. 18 6.1. Evaluación del tratamiento con fosfito contra Phytophthora infestans………. ………. 19

Obtención de productos comerciales…………………………………………… 19 Obtención de la cepa……………………………………………………………. 19 Selección de CMI y CMT……………………………………………………….. 19

6.2. Estimación de la concentración de fosfitos por HPLC y técnica de color………….. 20 Diseño Factorial…………………………………………………………………. 20 Extracción de Fosfitos y Fosfatos ……………………………………………. 20 Detección de fosfitos por HPL con detección luz UV …......................................... 19

Condiciones de la HPLC…………………………………………………. 20 Detección de Fosfitos por método de Yodo…………………………………….. 20 Cuantificación de Fosfatos ……………………………………………………… 20

7. Resultados y Discusión………………………………………………………………… 21 7.1. Aislamiento y crecimiento de P. infestans …………………………………………………….21 7.2. Correlaciona entre HPLC y método de color……………………………………………... 24 7.3 Evaluacion del Tratamiento de Fosfitos en plantas………………………………………... 26

8. Conclusiones……………………………………………………………………................ 33 9. Recomendaciones…………………………………………………………………….......... 33 10. Bibliografía……………………………………………………………………………… 33

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INDICE DE FIGURAS

Figura 1 Movilidad y disponibilidad del Fosforo en suelo………………………………………14 Figura 2. Comparación entre moléculas de Pi y Phi…………………………………………… 15 Figura 3. Ciclo de Vida de Phytophthora sp………………………………………………………16 Figura 4. Crecimiento de Phytophthora infestans en tres tipos de medio…………………………..21 Figura 5. Crecimiento Radial de Phytophthora infestans en tres medios de cultivo en función del tiempo 22 Figura 6.Crecimiento de P. infestans en el medio V8……………………………………………..23 Figura 7. Crecimiento radial de P. infestans con los dos productos comerciales………………….24 Figura 8 Correlación entre mediante ambas técnica. para cuantificar Fosfitos …………………25 Figura 9 . Montaje del diseño factorial irregular de semillas de Ryegrass ………………………....26 Figura 10. Comportamiento del crecimiento del Ryegrass y el índice de verdor en función del tiempo y los productos de fosfito…………………………………………………………………………………………….27 Figura 11. Crecimiento de hojas durante el tiempo y empleando las tres concentraciones………...28 Figura 12. Integración de datos obtenidos a partir de las concentraciones de Fosfito en las diferentes matrices evaluadas con respecto a las concentraciones…………………………………………………………………… ………………29

Figura 13 Concentración de fosfatos finales matrices con distintas concentraciones............30 Figura 14. Relación de Peso seco bajo distintas concentraciones de Phi con respecto al tipo de aplicación …………………………………………………………………………………..32

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Resumen

Debido a la importancia del fosforo como macroelemento para las plantas, se evaluaron diferentes concentraciones de fosfito como alternativa nutricional para el crecimiento vegetal y su efecto antagónico contra Phytophthora infestans, con el fin de conocer la cantidad óptima de fosfito que limita el crecimiento del patógeno y al mismo tiempo que estimula el desarrollo de la planta. Se realizó una prueba de antagonismo en agar v8 y agar arveja pata determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración máxima tolerada (CMT) de dos productos de fosfito comercial sobre el desarrollo del Oomycete. Posteriormente se estableció un diseño factorial irregular para evaluar diferentes concentraciones de fosfito y dos tipos de aplicaciones (foliar y suelo) sobre el crecimiento del modelo vegetal de Ryegrass. Para poder establecer la concentración de fosfitos en el extracto de la planta se estandarizaron dos técnicas, primero cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) utilizando una columna C-18 y segundo, técnica colorimétrica yodo-yoduro. Por ulúltimo se evaluaron los factores mas significativos en las variables respuesta, que fueron biomasa, peso seco, índice de verdor, concentración de fosfitos y de fosfatos por medio de una análisis estadístico ANOVA. Con respecto al efecto inhibitoria de los productos sobre P. infestans, la CMI fue de 0,1% y la CMT fue 0,08%. Por otro lado se determinó que no hay una correlación entre las técnicas debido a la presencia de interferentes en los extractos que puede afectar el correcto desarrollo de la prueba y finalmente, en la evaluación del fosfito como nutriente, se evidenció la existencia de diferencias significativas entre concentraciones tanto para biomasa como para índice de verdor, estableciendo a 0,2% como la concentración óptima para el desarrollo vegetal. En cuanto al rendimiento, se señaló que la biomasa fue mayor cuando la aplicación se hizo en el suelo con un peso seco de 1,5 g aproximadamente contrario a la aplicación foliar con valores de 0,5 g. En conclusión se determinó que el fosfito puede ser utilizado como fuente de fosforo teniendo en cuenta la dosis y el tiempo de aplicación.

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INTRODUCCIÓN El fósforo (P) es uno de los elementos más importantes, requerido por todas las especies vivientes para su crecimiento y desarrollo, debido a que el fosfato, que es la forma de P más oxidada, está involucrada en procesos de regulación metabólica y energía celular y también es un importante componente estructural de macromoléculas, como ácidos nucleicos y fosfolípidos (McDonald et al 2001). En las plantas, los aportes de fosforo son de gran importancia, gracias a que este elemento se encuentra involucrado con moléculas que regulan la síntesis de proteínas (DNA, RNA), por lo tanto es esencial en procesos de división celular y como consecuencia favorece el crecimiento adecuado de la planta por el desarrollo de nuevos tejidos, además, aestá asociado con el transporte de electrones durante reacciones metabólicas fundamentales, como la fotosíntesis, en la cual la luz es absorbida por la clorofila y almacenada en forma de ATP para ser utilizada como fuente primaria de energía en las transformaciones biológicas (Grant et al 2000). Por otro lado, la deficiencia del fosforo es uno de los factores más relevantes de estrés abiótico que limita el crecimiento de las plantas y por consiguiente, disminuye el desarrollo de las raíces, inhibe la producción de hormonas y se generan alteraciones en el metabolismo. (Wissuwa 2003; Stewart et al 2002; Bonser et al 1996) Para contrarrestar los efectos de suelos deficientes de fosforo se impulsó el uso de fertilizantes fosfatados, fabricados en base a roca fosfórica acidificada, en los cuales el P se encuentra como fosfato (PO4

3-). Por otra parte, el fosfito (PO3

3-), ha sido identificado como un compuesto que sirve para controlar diversas enfermedades en los cultivos, sin embargo, investigaciones previas, sugieren que el fosfito también podría ser utilizado como fertilizante, debido a que incrementa la floración, el tamaño de los frutos y mejora el rendimiento de la plantación, además, se ha evidenciado que los cambios en el metabolismo del nitrógeno a causa de la ausencia del fosforo, pueden ser reestablecidos con la aplicación foliar del fosfito y posteriormente, recuperar el crecimiento normal de la planta (Lovatt 1990; Thao y Yamakawa 2009). Por muchos años, el fosfato fue considerado como el único componente que suplementa los requerimientos de fósforo (P) para la nutrición de las plantas, sin embargo, el fosfito ha sido reconocido, en investigaciones recientes, como posible fuente de P e intensificador del efecto nutricional, debido a que es rápidamente absorbido y translocado dentro de la planta y además porque tiene una movilidad similar a la del fosfato en el xilema y el floema (Stasikowski et al. 2013; Borza et al. 2014; McDonald et al. 2001), no obstante, hay que tener en cuenta que estos dos compuestos no se metabolizan de igual forma, por lo que se cree que los efectos nutricionales que se observan posterior a la aplicación de fosfito, se debe a una oxidación de la molécula, por microorganismos del suelo para obtener fosfato disponible (Varadarajan et al 2002). Por otro lado, se ha comprobado la eficacia de este compuesto como fungicida para controlar enfermedades causadas por Oomycetes (Daniel y Guest 2006). Entre estos se encuentra Phytophothora sp, que son conocidos por provocar podredumbre en los cultivos, lo que ocasiona grandes pérdidas que oscilan entre 3.5 y 6.7 billones de dólares anuales, dependiendo de la severidad de la enfermedad (Nowicki et al 2012). Estos se caracterizan por ser prolíficos, es decir, que se reproducen con facilidad, generando aproximadamente 300,000 esporangios por lesión, lo que facilita la dispersión del patógeno, incrementando las posibilidades de propagar la enfermedad (Mayton et al 2008). Distintos estudios han evidenciado que la infección es crítica cuando el cultivo está en crecimiento, y en algunos casos, en el momento en que se originan los frutos (Singh et al 1977; Vyas et al 1983). Aunque se ha reportado la presencia de este oomycete en distintos cultivos, la papa y el tomate se consolidan como uno de los productos más vulnerables, generando perjuicios a nivel económico y social (Lamour,2013). El fosfito/fosfonato, por lo general, es comercializado como fungicida para contrarrestar la acción de Phytophthora sp, sin embargo, tras algunos reportes como el de Lovatt et al. (1990) han surgido compuestos a base de fosfito, que por encima de ser fertilizantes, son denominados como bioestimulantes, a consecuencia de la controversia generada, si puede o no, actuar como fuente de fosforo (Thao y Yamakawa 2009). Aunque aún no se ha establecido la forma exacta del mecanismo de acción de los fosfitos, se ha reportado que estos compuestos tienen un efecto directo sobre el patógeno, en la inhibición del crecimiento del micelio y por la reducción o alteración de la

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fosforilación oxidativa entre otros procesos metabólicos, esto porque según Guest y Grant (1990) cuando el fosfonato es introducido al micelio, las concentraciones de ATP y NAD disminuyen rápidamente y se incrementa la cantidad de pirofosfato, estos cambios son consistentes con la inhibición de la biosíntesis del adenilato, lo que limita la producción de los ácidos nucleicos; así mismo, también tienen un efecto indirecto por la estimulación de las respuestas de defensa naturales de las plantas (Machinandiarena et al 2012; Lobato et al. 2011), por la liberación de metabolitos de estrés, que son conocidos como elicitores, igualmente, hay una reducción en la reducción de supresores, que normalmente bloquea el reconocimiento de señales, además se da la acumulación de fitoalexinas, lo que termina en la fortificación de la pared celular (Guest y Grant 1990). Las grandes pérdidas que provoca una infección por Phytophthora infestans requiere la aplicación de sustancias que inhiban en crecimiento de este organismo en los cultivos, sin que afecte el desarrollo normal de la planta; entre los fungicidas más empleados se encuentran las fenilamidas y los fosfonatos/fosfitos (Guest y Grant 1990). Estos últimos, han tenido un papel importante dentro la agricultura al demostrar que podrían ser una alternativa como control de phytophtora, sin generar daños a la salud ni al medio ambiente (Jackson et al 2000). Sin embargo, existen otros estudios que indican que el uso inadecuado de las sales de fosfito pueden alterar el crecimiento y generar efectos negativos sobre los procesos metabólicos en plantas que tienen deficiencias de P (Abel et al 2002). Thao et al (2008) evaluó la respuesta de crecimiento de Brassica rapa var peruviridis, luego de aplicaciones radiculares y foliares de fosfitos y pudo concluir que estos compuestos no pueden ser utilizados como una única fuente de P por ambas vías de aplicación y que las respuestas de la planta pueden depender del estado de deficiencia de P que pueda tener esta. Teniendo en cuenta lo anterior es importante conocer y establecer los posibles mecanismos de acción de los fosfitos como fertilizantes, y que tipos de estimulación pueden generar en las plantas también para crear mecanismos de respuesta a patógenos, en específico a Phytophthora sp. Es por esto que la presente investigación pretende estandarizar una técnica sencilla para la determinación de fosfitos en el tejido de las hojas, raíces y suelo para evaluar los efectos de dicho compuesto.. 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

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El fósforo es uno de los elementos esenciales para el crecimiento de las plantas, por lo que la aplicación de fertilizantes a base de este elemento es una de las prácticas más utilizadas en la actualidad para suplir las demandas globales de alimento, fibras y energía. No obstante, el uso excesivo de fertilizantes fosforados, como los ortofosfatos, pueden quedar almacenados en el suelo como excedente, lo que genera un desequilibrio en la entrada y salida de nutrientes, debido a pérdidas por erosión y lixiviación, y como consecuencia, se producen grandes daños ecológicos y pérdida de biodiversidad acuática por procesos de eutroficación. Algunas estrategias que permiten mitigar estos impactos son: la explotación del P existente en las reservas del suelo, uso de microorganismos que incorporen estos nutrientes para su desarrollo metabólico y optimización de las aplicaciones y fuentes de este elemento en el suelo. En relación a este último, los fosfitos han sido reportados y utilizados como fungicidas, bioestimulantes y fertilizantes, ya que incrementan los rendimientos en las plantaciones en comparación con los que no están suplementados con una fuente de fosforo, además de limitar el crecimiento de patógenos que afecten el desarrollo normal del cultivo, no obstante, las elevadas aplicaciones de este compuesto, pueden generar efectos fitotóxicos, como consecuencia del estrés osmótico provocado por altas concentraciones de sales solubles. La implementación y estudio de estos compuestos ha enfocado su uso como fungicidas de Oomycetes, principalmente del género Phytophtora, sin embargo, poco se conoce sobre su efecto como fertilizante y fuente de P en el desarrollo vegetal. Aunque los fosfitos son de gran importancia y útiles en los cultivos, debido a sus beneficios y ventajas con respecto a los rendimientos que se obtienen, aún no se cuenta con mucha información de cómo estos fosfitos pueden ser obtenidos por parte de la planta, y a su vez, como inducen una respuesta frente a patógenos y condiciones adversas en la que esta misma se encuentre. Por lo tanto, es importante evaluar tanto el efecto del fosfito como fungicida o fuente de fósforo y establecer metodologías rápidas y sencillas que permitan identificar la absorción o residualidad de estos compuestos en tejidos vegetales y suelo. Por otro lado se han implementado distintos métodos para cuantificar fosfitos tales como resonancias nucleares y cromatografía de intercambio iónico; aunque muchas de estas técnicas pueden brindar información sobre la asimilación y el papel de compuestos a base de fosforo, suelen tener costos muy altos y son de difícil realización. A partir de esto, se considera importante realizar y proponer un método que logre ser económico, sensible y lo suficientemente robusto para determinar las concentraciones de fosfito en extractos de plantas. Ademas de poder establecer si estos compuestos pueden ser una alternativa para la nutrición de plantas

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3. JUSTIFICACIÓN La disponibilidad de fósforo como nutriente en el suelo es normalmente deficiente y dependiente de múltiples factores y condiciones. Ya que estas condiciones son limitadas, el empleo de fertilizantes a base de fosforo es la alternativa para suplir las necesidades de P de las plantas. Los fosfitos corresponden a sales aniónicas derivadas del ácido fosforoso, que son empleados como fungicidas en distintos cultivos, para la prevención de fitopatógenos, particularmente, contra oomycetes del genero Phytophthora sp, y algunos nematodos. Así mismo, algunos de los efectos que se presentan sobre Phytophthora son, la disminución en el desarrollo de las hifas, reducción en la actividad enzimática, cambios en la composición del micelio superficial y supresión en la germinación y la esporulación. El fosfito, comúnmente es comercializado como fungicida lo que evita la presencia de enfermedades en cultivos y disminuye las pérdidas económicas generadas a causa de los patógenos, sin embargo, se ha evidenciado que estos compuestos también pueden contrarrestar las deficiencias de fósforo que existen en el suelo, ya que al ser oxidado a moléculas de fosfato por los microorganismos del suelo, se suministra un elemento importante en las funciones biológicas de la planta como la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos, garantizando un buen desarrollo del cultivo y esto puede estar relacionado directamente con factores como pH, relación C/N/P que hacen parte de la calidad del suelo. Gracias a su acción fungicida, bajo costo de manipulación y su amplio espectro de acción sobre diferentes cultivos, los fosfitos se catalogan como una opción ecológicamente sostenible, puesto que no se han encontrado como sustancias toxicas para salud de humanos y no presentan efectos ambientales significativos y así mismo son una alternativa como fuente de fósforo. Sin embargo existe poca información acerca de estos compuestos como nutriente y a su vez los procesos de asimilación e inmovilización por parte de la planta. Es por esto que es necesario el desarrollo de metodologías y métodos lo suficientemente robustos que permitan determinar el efecto de estos compuestos en el desarrollo de la planta y evaluar sus efectos como agente controlador de patógenos y alternativa nutricional en ellas. El desarrollo del trabajo está basado principalmente en la hipótesis que los fosfitos, además de tener un efecto fungicida, pueden ser una empleados como fuentes de fosforo para las plantas, y pretende dilucidar cómo podrían ser los mecanismos de asimilación de estos. 4. MARCO TEÓRICO

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4.1 Fósforo El fósforo (P) es uno de los elementos más importantes para los organismos vivos debido a que hace parte del material genético y además está implicado en el crecimiento vegetal y funcionamiento celular (Turner et al 2005). Asimismo, juega un papel importante en la mayoría de los procesos metabólicos de las plantas como la fotosíntesis y la respiración, y también hace parte de biomoléculas de trascendencia biológica, entre las que se encuentran, fosfolípidos NADPH, ATP y ácidos nucleicos (Tran et al 2010). El fosforo existe en formas orgánicas e inorgánicas y puede variar de acuerdo a las características del entorno, no obstante, en muchos suelos, la fracción orgánica es aproximadamente la mitad del fosforo total, lo que disminuye la accesibilidad del macroelemento (Simpson et al 2012). Por otro lado, esta molécula es adquirida y asimilada por las plantas en forma de ortofosfatos, sin embargo dicho nutriente se caracteriza por ser de poca movilidad en el suelo, debido a que puede reaccionar fácilmente con óxidos, hidróxidos y metales como hierro, calcio, aluminio y magnesio bajo diferentes condiciones de pH, humedad y concentraciones de cationes en el suelo, lo que dificulta la disponibilidad del fosforo para las plantas y los microorganismos (Mukherjee et al 2015, Porier y Bucher 2002). Para favorecer la asimilación del fosforo, existen ciertos mecanismos de solubilización, dentro de las se encuentran, la utilización de bacterias fosfato solubilizadoras, las cuales, disminuyen el pH del medio, a través de la liberación de H+, o por la secreción de ácidos orgánicos y metabolitos quelantes permitiendo la disociación de sales, por la sustitución del protón. (Tripura et al 2007; White y Hammond 2008). Por otro lado, están los microorganismos capaces de producir fosfatasas, que son enzimas encargadas de transformar diferentes formas orgánicas como el inositol, en fosforo inorgánico disponible, por la ruptura del enlace ester; dentro de este grupo enzimático, se encuentran las fosfatasas acidas, que actúan en un pH inferior a 5 y las fosfatasas alcalinas interviniendo en un pH superior a 7 (Richardson y Simpson 2011, Maseko y Dakora 2013). Otra forma de mejorar la disponibilidad del elemento es por medio de la aplicación de fertilizantes a base de fosforo con la finalidad de que las plantas tengan un mejor crecimiento, y por lo tanto, las plantaciones generen mayores rendimientos. Muchos de estos fertilizantes tienen como componente principal el fosfato, sin embargo la aplicación de fosfitos se ha implementado por su efecto para contrarrestar enfermedades de Phytophthora infestans (Barret et al 2001) no obstante, poco se ha establecido sobre estos compuestos y su función nutricional. Aunque los iones de fosforo pueden llegar a grandes cantidades en plantaciones con altas tasas de fertilización, en muchos suelos las concentraciones de este elemento son bajas y se encuentran en un

rango que varía entre 0,1 y 10 μM (Hinsinger 2001). Según Deubel y Merbach (2005) el contenido de fosforo total, en suelos cultivables varia de 0,02 a 0,5% con un promedio de 0,05%, tanto en formas orgánicas como inorgánicas.

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Figura 1. Movilidad y disponibilidad del Fosforo en suelo

Fuente: Shen et al (2011)

Se ha establecido que la forma de absorción del fosforo puede ser a partir de la forma primaria o secundaria de aniones orto fosfatos como H2PO-

4 y HPO-4, en función del pH del suelo Se han

realizado distintos estudios de cinética acerca del sistema que usan las plantas para poder transportar este elemento en su interior ( Drew and Saker 1984; Nandi et al 1987). En lo que respecta a estudios de biología molecular se ha establecido que las plantas tienen un potente sistema transportador de Pi en sus células. Se ha reportado la presencia de distintos genes que pueden codificar estas proteínas con una gran afinidad por Pi que está ingresando a la planta favoreciendo así su eficiencia al distribuir el elemento por las células. En la mayoría de plantas jóvenes es posible obtener el fosforo en tejidos de crecimiento, mientras que las plantas maduras tienen una concentración aceptable del elemento en semillas y frutos. 4.2. Fosfito Los fosfitos (H2 PO3

-) son formas reducidos de los fosfatos (H2PO4) y que se utilizan como un fungicida para contrarrestar enfermedades de oomicetos en cultivos especialmente del genero Phytopthora sp.. En términos químicos los fosfitos (Phi) son distintos a los fosfatos (Pi), puesto que aunque comparten la misma forma tetraédrica los primero tienen un átomo de hidrogeno demás, haciendo que la simetría del tetraedro no sea tan perfecta como ocurre con los iones fosfato siendo un poco más inestable y que cuando sea reconocido por un sitio activo enzimático no tendrá la misma especificidad. En la actualidad el suministro de fertilizantes a base de fosfito favorece a la prevención de enfermedades y garantiza una resistencia a los cultivos (Niere et al 1994, 1998). Se ha demostrado que los compuestos pueden inhibir actividades de fosforilación en rutas como la glucolisis y pentosas fosfato (Stechman y Grant 2000). Por otro lado se ha establecido que los fosfitos tienen relación con algunas respuestas que tienen las plantas cuando se encuentra en condiciones de estrés.

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Figura 2. Comparación entre moléculas de Pi y Phi .

Fuente: Mc Donald et al ( 2001)

Lovatt y Mickkelsen (2008) indican que los fosfitos estimulan la producción de compuestos aromáticos mejorando la actividad de las enzimas peroxidasa y la degradación de lignina. La actividad de la peroxidasa conlleva respuestas de defensa contra patógenos (Cavalcanti et al 2007, 2008). También se ha establecido que son inductores de respuestas inmunes por parte de plantas infectadas por el Oomycete. Machinandiarena et al. (2012) concluyeron que la adición de fosfitos a las raíces en cultivos de papas induce los genes que transcriben la formación de ácidos salicílico y jasminico que son mecanismos de protección contra patógenos. La inducción de los promotores como SnTPR1y StWRY1 se evidenció luego de suministrar concentración de fosfitos de potasio, luego de 42 horas. Estos ácidos no permiten que el hongo se desarrolle. Otros estudios han planteado la hipótesis que estos compuestos además de tener un efecto inhibitorio contra el hongo, puede estimular a que a misma planta logre una respuesta para mitigar su efecto. Thao et al. (2008) reportaron que las concentraciones de Fosfitos (Phi) cuando son muy elevadas con respecto a las de Fosfatos en fertilizantes generan un decrecimiento en las velocidades de desarrollo de Brassica rapa de forma foliar y radicular. Evidenciaron que las plantas morían cuando las concentraciones fueron 0:100 de Pi y Phi respectivamente y concluyen que los fertilizantes a base de fosfitos no pueden ser usados únicamente como una fuente de P, pues este debe estar acompañado por sales de fosfato que mitiguen su acción inhibitoria. Lo que deja un panorama abierto en el estudio de los compuestos a base de fosfitos y las condiciones de uso que deben emplearse. 4.3. Phytophtora infestans Conocido por ser uno de los fitopatogenos que causan graves lesiones en los cultivos y así mismo afectando los rendimientos. Este hongo pertenece a la familia Oomycete y es el segundo género con mayor número de especies. Fue aislado por primera vez en Irlanda en el siglo XIX luego de que causara podrición en cultivos de papa y fue descrito por primera vez en 1876 por Anton de Bary , sin embargo en 1846 Miles Berkeley fue el primero en observar una infección por hongos en cultivos de papas, pero sus observaciones fueron imprecisas pues no tenía la instrumentación adecuada para un caracterización profunda. Fue considerado de esta clase luego de la década de los 80 causando toda una discusión sobre si se consideraba como un hongo verdadero, pues haría parte ahora del reino cromista y no fungí. Muchos estudios a nivel molecular se han realizado con el fin de establecer conocimientos cerca de su taxonomía y relación entre otros géneros y familia del reino Fungi. Halvey et al. (2010) Propusieron un esquema en el cual se muestra la clasificación de especies pertenecientes a la orden Perenosporaceae, que según últimos estudios, Phytophthora haría parte. Actualmente el aislamiento y caracterización molecular de especies nuevas están aumentando gracias a la adaptabilidad del hongo a distintos ambientes (Ribero 2010). Se consideran que hay alrededor de 124 especies descritas a nivel morfológico y filogenético. Gracias a todas las técnicas moleculares que se emplean hoy en día es posible analizar e identificar todas las especies existentes de este género.

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Figura 3. Ciclo de Vida de Phytophthora sp.

Fuente: Ribeiro O (2010) Phytophthora infestans es una de las especies más conocidas por causar la enfermedad de tizón tardío en papa y podrición en cultivos como hortalizas, tomate y maíz. Además fue uno de los primeros fitopatogenos en poderse identificar. Contiene pared celular a base de celulosa y β glucanos (Bartnicki-Garcia 1983; Wener et al 2002) y a diferencia de los hongos verdaderos, la mayoría de su vida son células diploides, con un micelio cenocítico y casi no cuenta con septos. Tienen la capacidad de producir zoosporas y algo interesante es que son células biflageladas. Su ciclo de vida empieza con una fase asexual y con la infección de tejidos del hospedero al producir esporangiosporas que crecerán dentro de este. Si las condiciones de humedad son adecuadas y se está a una temperatura a 12°C, las zoosporas se liberan a partir del esporangio. Estas zoosporas tienen la capacidad movilizarse por todo los tejidos antes de generar un quiste. A partir de este quiste ellas formaran un tubo germinal que luego tomara forma de un apresorio. El apresorio penetra el tejido para formar una vesícula infecciosa favoreciendo el desarrollo de hifas en subcapas de las células. La infección en la planta permite un comienzo al ciclo y que se potencialice como tal la enfermedad en la planta. Luego de dos a cuatro días el crecimiento de micelio se hace evidente en hojas. 4.4. Cromatografía líquida La cromatografía liquida es una técnica utilizada para la separación de diferentes componentes en una solución, siguiendo una migración diferencial de los solutos en un flujo líquido a través de una columna con partículas sólidas (Lough y Wainer 1996). En este método los componentes a separar son eluidos en una columna que contiene una fase estacionaria. En un sistema cromatográfico, la fase móvil transporta a los componentes de la muestra, y los pone en contacto con la fase estacionaria, a lo largo de la columna. Debido a las interacciones de los compuestos, se van a presentar diferentes tiempos de retención, lo que permite la cuantificación de un elemento especifico (Lundanes et al 2013). Los compuestos separados luego serán detectados en la salida de la columna por un detector que mide además su concentración. Este detector se llama cromatograma y permite ver los compuestos separados en una muestra. La versatilidad de la HPLC se da a partir de distintas formas de obtener la separación de un compuesto de interés y como este puede interaccionar con la fase estacionaria, favoreciendo su retención. Las interacciones que se realizan durante el proceso de separación pueden ser por intercambio iónico, adsorción, exclusión de tamaño entre otras más.

Cromatografía fase normal

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Este tipo de cromatografía favorece la separación de moléculas cuando la fase estacionaria es de tipo polar. Los analitos se adhieren a la columna por medio de interacciones polar-polar lograda por la fase. En este caso se emplean compuestos como Silica o Aluminio. Aquellos analitos que no poseen una polaridad lo suficientemente fuerte, son llevados por la fase móvil, al no ser retenidos.

Cromatografía fase reversa Se emplea una columna que por lo general está compuesta por hidrocarbonados que no son polares pero la fase móvil si lo es. Se emplea para la separación de compuestos polares y no polares e incluso a algunas muestras que puedan contener gran número de moléculas. Sería una separación en simultánea. La separación de los analitos se da por una separación entre ambas fases. En el caso de los analitos que son de baja polaridad, estos serán retenidos de forma más fácil ya que se adhieren en la columna; dificultando la unión con la fase móvil. Mientras que las moléculas de naturaleza polar son eluidas por la fase móvil Para la cuantificación de las concentraciones de los analitos eluidos en una HPLC, se emplea un detector de luz UV que mide las absorbancias registradas en esta longitud de onda. La luz atraviesa una celda y si el analito absorbe la luz, este genera un cambio en la energía de la luz que será medido por el sensor que se encuentra incluido en el detector. Este cambio de energía se registra como señales eléctricas y que son reconocidas por el sistema adaptado al equipo. Este tipo de detectores son los más empleados en este tipo de cromatografías 4.5. Ryegrass Lolium perenne es una de las especies de hierbas más importantes, comprende el 55% del área de producción en Europa debido a que combina altos rendimientos y calidad en el forraje (Altpeter et al 2000). Se caracteriza por ser un organismo con amplio rango de adaptabilidad gracias a que tolera diversas condiciones ambientales como por ejemplo, largos periodos de inundación, suelos ácidos y alcalinos con valores que varían de 5,1 a 8,4 con un pH óptimo de 6,5, y la temperatura de crecimiento se encuentra entre 20 – 25°C (Casler y Duncan 2003). En cuanto a su composición, este tipo de organismos, se identifican por acumular polímeros de almidón y de fructano en sus tejidos de reserva (Turner et al 2005). Los fructanos, son los carbohidratos principales de almacenamiento en las especies de Ryegrass, los cuales son sintetizados por la polimerización de la sacarosa. Estas moléculas, predominan en las células más jóvenes y en zonas de expansión y tienden a acumularse, a largo plazo, en tejidos maduros y raíces (Johnson et al 2003). Con respecto al fosforo, mejorar la eficiencia de este nutriente en plantas de Ryegrass, probablemente resulta, en considerables beneficios económicos y ecológicos (Byrne et al 2010). 5. OBJETIVO GENERAL Evaluar el efecto de dos tipos de fosfitos comerciales sobre Oomycetes fitopatógenos pertenecientes al género Phytophotora y su acción como fertilizante en un modelo vegetal con Ryegrass. 5.1. Objetivos específicos

- Evaluar el efecto antagónico de dos productos de fosfito comercial bajo condiciones in vitro como controladores biológicos del fitopatógeno Phytophotora sp.

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- Estimar la concentración de fosfitos en suelo y tejido vegetal mediante la técnica de HPLC-RP con detector UV y la técnica cromógena Iodo-Ioduro.

- Determinar la acción de dos productos de fosfito comercial como fertilizantes fosforados en plántulas de Ryegrass

6. METODOLOGIA 6.1. Evaluación del tratamiento con fosfito contra Phytophthora infestans Obtención de productos comerciales. Los productos evaluados fueron fertilizantes como Fosfito de Potasio (AGRIFOS 600) Y Fosfonato de Aluminio (FOSETAL). Los fertilizantes se emplearon en soluciones a distintas concentraciones para las aplicaciones foliares y de suelo en las plantaciones de Ryegrass. El primero está compuesto por Mono y di fosfito de potasio y se comercializan para un control efectivo en enfermedades causadas por Phytophthora en distintos cultivos. Mientras que el segundo su componente activo es el tris-o-etil-fosfonato de aluminio y se comercializa como un fungicida contra enfermedades causadas por el mismo hongo. Obtención del microorganismo (Phytophthora infestans): Se utilizó una cepa conservada de Phytophthora infestans, la cual fue suministrada por el laboratorio de micología y fitopatología de la universidad de los andes (LAMFU). Para la recuperación de la cepa, se tomaron discos de agar con el microorganismo, y fueron inoculados sobre Agar Centeno, Arveja y V8 (Anexo 1) para su crecimiento, se incubaron a 20 °C. Las cajas se revisaron diariamente para evidenciar las señales de crecimiento de Phytophthora infestans. Posterior a la recuperación de la cepa, se realizó una evaluación de medios de cultivos para Phytophthora. Se eligieron el agar centeno, el agar V8 y el agar Arveja como medios de cultivo iniciales para el crecimiento de este organismo. Se incubó por un periodo de 5 días a una temperatura de 20°C y se observó el crecimiento periódicamente. Continuamente a esto se sembró cajas de Petri con medio de cultivo agar V8 pues este medio contienen mayor cantidad de nutrientes para favorecer el aislamiento del fitopatógeno. Selección de la concentración mínima inhibitoria y máxima tolerada (CMI y CMT)

Se evaluaron concentraciones de 0% 0.1% 0.2% 0.3% y 0.5% de fosfitos comerciales (Agrifos 400 g/L, Fosetal 800 g/Kg), con el fin de determinar la concentración mínima a la cual se inhibe el crecimiento de Phytophthora infestans. Para ello, se utilizó el agar V8 y el agar arveja que fueron suplementados con cada una de las concentraciones mencionadas anteriormente. Se realizó por cuadruplicado y se tuvo en cuenta un control negativo. Para la siembra, discos de agar cortados con una pipeta Pasteur de cultivos de 10 y 12 días de crecimiento, fueron colocados en el centro de las cajas de Petri, se incubaron a 25 °C y se observaron continuamente para evidenciar los cambios en el crecimiento de Phytophthora infestans. 6.2. Estimación de la concentración de fosfitos por los métodos de HPLC y método Colorimétrico 6.2.1. Diseño factorial Se realizó un diseño factorial que guiara el procedimiento de aplicación de fertilizantes en las semillas. Las semillas de ryegrass con un porcentaje de germinación del 85%, crecieron en macetas en un fotoperiodo de 12 horas , a 26°C, bajo condiciones de luz artificial y fueron evaluadas con concentraciones de 0% 0.1% 0.2% y 0.3% de fosfitos comerciales (Agrifos 400 g/L, Fosetal 800 g/Kg). El suelo fue tamizado a un tamaño de 12 mm. El tratamiento incluía dos tipos de aplicación, tipo foliar y en el suelo. La aplicación a nivel de suelo se realizó en el mismo momento de la siembra

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con ambos fertilizantes. Se aplicaron de forma superficial en el suelo equivalente a 15 shots. Se llevaron al fotoperiodo y se realizaba medición de longitud de hojas cada 8 días luego de la siembra por tres semanas. La aplicación foliar se inició a la semana siguiente de la siembra de las plantas, Se rociaron cada 8 días y se medían semanalmente las hojas largas como cortas. Esto también se realizó durante tres semanas. Los fertilizantes fueron aplicados con un volumen inicial de 5 shots donde para Agrifos era equivalente en la concentraciones de 0.1% a 3.3 ml ; 0.2% a 2.9 ml y 0.3% a 4.4 ml y para Fosetal era un equivalente de 3 ml en las tres concentraciones que iban aumentando exponencialmente tres veces hasta la tercera semana de aplicación. Se tenían en cuenta cambios de textura, color, forma, aparición de manchas en cada una de las réplicas.

Tabla 1 Diseño experimental de aplicaciones foliar y suelo en las semillas

.

Tratamiento Forma Dosis concentración

1 suelo 0 0

2 suelo 1 0,1

3 suelo 2 0,2

4 suelo 3 0,3

5 foliar 0 0

5 foliar 0 0

5 foliar 0 0

6 foliar 1 0,1

6 foliar 1 0,1

6 foliar 1 0,1

7 foliar 2 0,2

7 foliar 2 0,2

7 foliar 2 0,2

8 foliar 3 0,3

8 foliar 3 0,3

8 foliar 3 0,3 6.2.2Extracción de fosfito y fosfato a partir de las muestras Luego de cuatro semanas de la siembra, las plantas fueron cortadas. Las muestras a las cuales se les cuantificó Phi y Pi fueron las raíces, hojas y suelo previamente secado a 60°C por 17 horas. La extracción de tejido vegetal en raíces y hojas se realizó luego de estar secas se maceraron en un mortero y se adicionó 20 ml de agua destilada para hacer la extracción de los compuestos de fosforo. Se llevó a centrifugar 8000 rpm por 10 min. El sobrenadante se extrajo y se llevó a ser cuantificado por HPLC y método colorimétrico a base de yodo. En el caso de la muestra de suelo, se extrajo 15 gramos de éste, contenido en los vasos de cultivo de las plantas que fue secada en el horno a las mismas condiciones. Para eliminar los compuestos fenólicos se adicionó polivinilpolipirrolidona (PVPP) en una cantidad equivalente a la décima parte del extracto acuoso; se incubo en agitación a temperatura ambiente por 30 minutos y finalmente se centrifugo a 5000 rpm/4 minutos. Las muestras se dejaron a 25°C hasta que el sobrenadante se clarificara (Stasikowski P et al 2014).

6.2.3 Detección de fosfitos por cromatografía liquida fase revesa con detección luz UV

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La columna C18 se limpió con Acetonitrilo y agua, en una proporción 50:50 (v/v). Luego, se cargó con la fase móvil (Anexo 2) por 1 h, con el fin de, lograr la adsorción del Tetrabultilamonio hidróxido y del hidrogeno Biftalato de potasio, sobre la fase estacionaria de la columna. La fase móvil empleada para este fin, se descartó, y finalmente, el sistema queda equilibrado por 24 h (Dorland et al. 1989). Las muestras estándar se prepararon con las soluciones concentradas de fosfitos (Agrifos 400 g/L, Fosetal 800 g/Kg) y a partir de estas, se establecieron diferentes cantidades para obtener sustancias de concentraciones conocidas (10 50 100 200 300 500 1000 ppm). El volumen final para cada una fue de 10 ml. Esto se realizó con el fin de elaborar una curva patrón, que sirvió para la cuantificación de sales inorgánicas de fosforo en extractos de plantas y suelo. Condiciones de la cromatografía La separación por medio de la técnica de la cromatografía, fue realizada sobre una columna C18, con un buffer a pH: 8.2 (1 mM de ftalato y 0,5 mM de TBAOH) y acetonitrilo (95+5 v/v) como fase móvil. La tasa de flujo fue de 2 ml/min y la temperatura se mantuvo a 25°C. La detección del fosfito a partir del extracto acuoso de la planta y el suelo, se llevó a cabo a 248 nm, invirtiendo la muestra y las longitudes de onda de referencia (Brezovska et al. 2010) 6.2.4. Detección de fosfitos por medio de solución de yodo

Para la elaboración de la curva, se prepararon soluciones de fosfito estándar, con concentraciones de 0 a 100µM a partir de Fosetil aluminio (Fosetal) y Fosfito Mono potásico y Di potásico (Agrifos 400 g/L) Luego se preparó una mezcla con las soluciones de yodo (Anexo 2), HCl y agua, teniendo en cuenta el siguiente orden: 10 ml de la solución de yoduro, 10 ml de HCl, 5 ml de solución yodato y 5 ml de agua destilada. Posteriormente, se dejó en reposo por 10 min hasta que cambiara el color a naranja. Por otro lado, se tomaron 10 ml de las muestras de fosfitos en tubo Falcón y se añadieron 2 ml del reactivo de yodo (Anexo 2), y se realizaron movimientos en un vortex que seguirán con la adición de 20µL de las soluciones de NaOH y NaNO2 . Nuevamente se llevaron a un vortex y se dejaron por 30 min. Finalmente, se procedió con la adición de 50 µL del almidón a la solución y se repitió el movimiento en el vortex. La lectura se realizó con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 580 nm 6.3 Determinación de P disponible (PO4) A partir de la muestra se tomó 1 ml y adiciono 12 ml de agua destilada. Después se añadió 2 ml de reactivo B (anexo) . Se homogenizó en un vortex y la reacción toma 10 min en llevarse a cabo, así que después de este tiempo se leyó en espectrofotómetro a una longitud de onda de 882 nm

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7. Resultados y Discusión 7.1. Aislamiento y crecimiento de Phytophthora infestans El crecimiento radial del Oomycete fue evaluado en tres medios de cultivo diferentes (Centeno, Arveja y V8) con el fin de establecer en cual hay un mejor desarrollo de Phytophthora, y de esta manera, elegir el medio apropiado para la prueba de inhibición, con diferentes concentraciones de fosfito. En la Figura 1, es posible observar que en el agar V8, el diámetro de la colonia es mayor (7,7 cm) a diferencia de los medios Centeno y Arveja, con valores de 5,55 y 6,65 respectivamente. Sin presentar diferencias significativas (p>0,05) Por lo tanto, se estableció que el medio V8 fue el apropiado para la esporulación del Oomycete y así mismo, fue elegido como el óptimo para pruebas posteriores. Las características macroscópicas evidenciadas en cada uno de los medios evaluados, se observan en la figura 5, la cual, demuestra que las colonias son diferentes con cada sustrato utilizado.

Figura 4. Crecimiento de Phytophthora infestans en tres tipos de medio. Agar centeno, Agar arveja y Agar V8 con

respecto al tiempo de incubación.

Según literatura, la formación de esporangios y la composición nutricional son factores clave para la elección adecuada del medio de cultivo, por lo tanto, en un estudio realizado por Tsopmbeng et al (2012), indicó que tanto el agar V8 como el V6, son apropiados para el crecimiento de diferentes especies del género Phytophthora, debido a las altas tasas de esporulación, siendo de 18x106 esporangios/ml para el agar V6, y 17x106 esporangios/ml para el medio V8. Igualmente Medina y Platt (1999) determinaron que el agar V8 clarificado, con y sin la presencia de esteroles, fueron los indicados tanto para el crecimiento del micelio con para la producción de esporangios y de oosporas, por lo que se utilizó en el presente estudio

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Figura 5. Crecimiento Radial de Phytophthora infestans en tres medios de cultivo diferentes: Agar Centeno, Agar Arveja y

Agar Centeno en función del tiempo

Dentro de las características macroscópicas evidenciadas en cada uno de los medios evaluados, se observan en la Figura 5 que la morfología es diferente con cada uno de los sustratos utilizados. En V8 las colonias son blancas, algodonosas, con crecimiento regular y sin pigmento difusible, mientras que en Centeno y Arveja, el color cambia, siendo este más opaco, y además el crecimiento se vio reducido, esto, por la complejidad del componente principal de los medios de cultivo.

Tabla 1. Características macroscópicas y microscópicas de los medios de cultivo evaluados para el crecimiento de P.

infestans

Medio de cultivo Características Macroscópicas

Característica Microscópicas

Agar Arveja Colonias algodonosas, crecimiento regular, sin

pigmento difusible

Hialino, cenocítico, oospora y esporangioforo

Agar Centeno Colonias algodonosas, crecimiento regular, sin

pigmento difusible

Hialino, cenocítico, presencia de esporangios

esféricos

Agar V8 Colonias blancas, algodonosas, crecimiento

regular, sin pigmento difusible

Hialino, cenocítico, oospora y esporangioforo

Una vez establecido el V8 como medio de crecimiento, se evaluaron diferentes concentraciones de fosfito comercial para establecer la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración máxima tolerada (CMT). Sin embargo la velocidad de crecimiento de Phytophthora en el medio disminuyó y fue evidente la proliferación de bacterias debido a la variada fuente nutricional del medio (Gonzáles et al 2014), por lo cual fue necesaria la adición de cloranfenicol al 0,01%. Durante este

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ensayo después de 8 días de incubación no fie evidente el crecimiento del microorganismo por lo que se considera que la CMI fue de 0,1% y la CMT <0,1% A partir de esto , en la Figura 6, es posible observar el crecimiento de Phytophthora en el medio V8 suplementado con antibiótico, en concentraciones de 0, 0,03, 0,05 y 0.08%, pero, se evidencia que la morfología de la hifa en este organismo varia, incluso en el control. Lo cual indica que la presencia de cloranfenicol, posiblemente está afectando el desarrollo normal del Oomycete y por ende, podría ser clasificado como un resultado falso positivo, debido a que el porcentaje de inhibición no sería por el compuesto estudio, sino por elementos adicionales en el medio de cultivo, como los antibióticos. A) B)

Figura 6 . A. Crecimiento de P. infestans en el medio V8 suplementado con cloranfenicol B. Crecimiento de P. infestans en agar V8 sin cloranfenicol

En una investigación realizada por Khatua et al (2013), en el que estudiaron el efecto de diferentes antibióticos y desinfectantes en el desarrollo de Phytophthora en plantas, determinaron, que en el caso del cloranfenicol a una concentración de 0,02% el crecimiento de la hifa era deforme y había ausencia en la formación y germinación de esporangios. Por esta razón los resultados observados en la figura

6, demostraron el posible efecto inhibitorio del antibiótico sobre el Oomycete. De esta manera, los resultados obtenidos en el agar arveja fueron los utilizados para la determinar la CMI y CMT. La prueba de antagonismo en Phytophthora infestans se presentó en dos fases, primero se realizó la evaluación en el desarrollo de este Oomycete sobre una concentración teórica que equivale a 0,3%, que corresponde a 36,6 mM (Stasikowski et al 2014). Este valor se ha reportado como la concentración de fosfito aplicada en el campo para el control de enfermedades causadas por este fitopatógeno. Por lo tanto, para determinar la concentración mínima inhibitoria y la concentración máxima tolerada, se analizó el crecimiento del micelio en concentraciones de 0%, 0,1%, 0,2%, 0,3% y 0,5%, sin embargo se observó que no había crecimiento del Oomycete sobre el medio de cultivo establecido, por lo que se procedió a la segunda fase de la prueba, la cual consistió en la evaluación de concentraciones menores a 0,1%, dentro de las cuales se encuentran 0%, 0,03%, 0,05%, 0,08% y 0,1% para determinar la CMI y la CMT. Los resultados obtenidos en la gráfica 7, permiten establecer que no hay diferencias entre productos (p>0.05) y se observa, que el crecimiento radial, tanto en Agrifos como en Fosetal, es similar para cada una de las concentraciones. Para cada fosfito comercial se determinó a 0,1% como la CMI, y a 0,08% como la CMT. Un estudio realizado por Lobato et al (2010), P. infestans fue completamente inhibido a una concentración de 1% y 0,67% de fosfito de potasio y a una concentración de 0,1% tuvo un alto porcentaje de inhibición (aproximadamente del 85%).

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A) B)

Figura 7. A. Crecimiento radial de P. infestans en diferentes concentraciones de Fosetal B. Crecimiento radial de P.

infestans en diferentes concentraciones de Agrifos

7.2. Correlación entre HPLC y método Colorimétrico a base de Yodo La cuantificación de fosfitos puede ser empleada por distintos técnicas analíticas que pueden ir desde electroforesis capilar a Resonación Magnética Nuclear (P-NMR) (Huikoo K et al 2000; Danova et al 2008), sin embargo, el empleo de cada uno de ellos está determinado por costos, simplicidad y sensibilidad. Es por eso la importancia de identificar un mejor método que permita cuantificar dichos compuestos fosforados con una sensibilidad y robustez alta y así mismo sea de fácil realización. Debido a esto se realizaron las cuantificaciones de Phi a partir de dos métodos que fueron la HPLC fase revesa con detección UV y el método de color a base de compuestos yodados. Las concentraciones obtenidas de fosfito a partir del montaje del diseño factorial, arrojaron que entre los dos no hay ninguna correlación (p=- 0.009) indicando así que ambas técnicas no pueden ser comparadas entre ellas dado que sus datos son muy dispersos. Se observó que a pesar de que ambas técnicas cuantificaron concentraciones de fosfitos en tejidos vegetales, las concentraciones de estos compuestos obtenidas en la HPLC fueron mayores que las que se obtuvieron en el método a base de Yodo (figura 8). La HPLC es una técnica muy sensible y favorece a la obtención de datos con mayor exactitud sin embargo esto conlleva a que su realización pueda ser más compleja debido a la preparación de los compuestos que hacen parte de las fase móvil y estacionaria para la separación de los Phi- Brezovska et al (2010) desarrollaron una estandarización de HPLC fase reversa con detección por luz UV, que pudiera identificar fosfatos y fosfitos como impurezas de Resedronato de sodio. La validación del método incluía elementos como especificidad, selectividad por parte de los compuestos empleados como fase estacionaria y móvil, robustez y precisión. La cuantificación de Phi se realizó bajo un pH alcalino (8,2) y una longitud de onda de 248 nm. Establecen que el tiempo de retención de fosfatos y fosfitos se mejora cuando se adiciona un catión lipofilico como fase móvil, por eso se recomienda el uso de Tetrabutilamonio (TBAOH). Además indican el que valor de pH es muy importante a la hora de realizar el método puesto que en el incide la presencia de interferentes y así mismo en la forma de los picos que se obtienen en el cromatograma, .ya que la separación adecuada de los picos no se logra hasta no tener un pH óptimo de 8,2 Por otro lado se encuentra que el método de color es una técnica interesante al identificar los análogos de fosfato de forma indirecta al tener una solución de compuestos yodados en diferentes estados de oxidación que cuando están en exceso reaccionan con los Phi presentes en las muestras, en lugar de reaccionar con el almidón y generar el complejo azul.. Este método propuesto por Barco et al (2006)

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anticipa que pueden existir elementos como el Arsenico, Nitrogeno y azufre tanto en su formas reducidas como oxidadas que pueden afectar la lectura de las muestras al también reaccionar con los compuestos yodados. Establecieron que el As (+3) y el S (+5) fueron los elementos que tenían comportamientos similares como los fosfitos al interaccionar con el compuesto yodado, En el caso de tener dichos compuestos es recomendable emplear agentes oxidantes para eliminar estas interferencias. Continuamente a esto, el método de color brinda una lectura sencilla y rápida comparada con HPLC, pues la lectura de absorbancia se puede hacer luego de 30 minutos de reacción. Sin embargo se recomienda que esta lectura se haga luego de una hora para que una mejor estabilización de la reacción y obtener resultados más exactos. Al realizar el método de yo los procedimientos no son complejos en sí, pero para favorecer una mejor obtención de resultados es esencial el tiempo de lectura. Como se ha mencionado ambos métodos están calificados para cuantificar compuestos a base de fosforo, sin embargo los resultados obtenidos en las dos técnicas permiten concluir que para realizarlas requieren del control de factores que pueden incidir en sus resultados tales como el pH, el tiempo de reacción la elección de compuestos como fase móvil y estacionario en el caso de la HPLC y esta sería una razón por la cual la diversidad de datos entre ellas. También es importante destacar que las curvas patrón fueron realizadas con los mismos fertilizantes y que estos deben tener interferentes. Debido a esto no se logra las mismas características de curvas realizadas por compuestos analíticos si fuera el caso. Esto incide en parámetros tales como exactitud y precisión que puedan tener ambas técnicas por lo cual hacen que estas no puedan ser comparadas entre ellas. A partir de esto puede decirse que para una estimación de Phi cuando son empleados en cultivos, los métodos de color son una opción recomendable puesto que no necesita de mayores costos, es más simple y no requiere de otros procedimientos largos para eliminar interferentes como seria en el caso de la HPLC.

Figura 8 Correlación entre los datos analizados para determinar fosfitos mediante ambas técnica. Los datos no tienen

una relación directa y muestran distintos grados de varianza (p=-0.009)

7.3. Evaluación del tratamiento con fosfito como fertilizante para la planta

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Para evaluar el efecto de los fosfitos sobre el crecimiento de la planta (Ryegrass), se estableció un diseño factorial con tres dosis de aplicación, tres concentraciones (0.1%, 0.2%, 0.3%) y dos formas de aplicación (suelo y foliar). Las variables de respuesta utilizadas fueron promedio de longitud de hoja e Índice de verdor, los cuales se midieron semanalmente durante las tres semanas del ensayo. Mientras que las concentraciones de fosfito (Phi), fosfato (Pi) y Peso seco como variables de punto final. A) B)

Figura 9 . A. Montaje del diseño factorial irregular de semillas de Ryegrass B. Evaluacion de los Índices de verdor y

altura de hojas durante el tiempo de ensayo (3 semanas)

Como primera medida se evidenció que bajo las condiciones del ensayo no se presentaron diferencias significativas entre los dos fungicidas empleados (p=0,879). Los valores más altos obtenidos para cada variable de respuesta fueron obtenidos en su gran mayoría con Agrifos, el cual se compone por un ingrediente activo de fosfito mono potásico y di potásico. Estudios realizados anteriormente han establecido que compuestos como el ácido fosforoso, que al neutralizarse con una base para formar sal de fosfito, se oxidan lentamente a fosfato en el suelo, en el follaje y dentro de las plantas, lo que significa que el fosfito puede servir como un fertilizante de fosfato de lenta disponibilidad (Lovatt 1990) y pudo evidenciarse en el estudio comparando con los datos de los controles. Además de fuente nutricional a base de fosforo, se han demostrado como fertilizantes ya que contienen un catión que puede servir de nutriente para las plantas como K+, NH4

+, Ca2+, Mg2+, Cu2+, Zn2+, entre otros (Ávila et al 2013).

Para las variables analizadas semanalmente se observa que existen diferencias significativas en la tasa de crecimiento de las hojas durante el tiempo de evaluación (p<0.001) (Figura 10 A) Por otro lado también fue posible observar que hay diferencias entre las concentraciones de fosfito (0,1, 0,2 y 0,3%) aplicadas y el control (p=0.00056) lo que indica que podría haber una asimilación del nutriente; incorporándose en compuestos orgánicos en la planta. (Figura 10 C). Schroetter et al (2006) determinaron que la aplicación foliar tanto del fosfito como del fosfato sobre el crecimiento de un cultivo de maíz no tuvo, estadísticamente, diferencias significativas en el desarrollo adicional de las plantas, es decir, cualquiera de los dos podría ser utilizado como fuente de fosforo en suelos con presencia de fosforo. Puede que los fertilizantes fosfatados generen una respuesta favorable en el crecimiento de plantas, sin embargo hay que destacar que los Phi además de actuar como fungicida en potencia, también podrían desarrollar un papel en la nutrición de las plantas , lo cual lo convertiría en un producto con doble funcionalidad y así mismo favorece un óptimo rendimiento en los cultivos en los cuales son aplicados.

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De igual forma, Lobato et al (2008), analizaron los efectos del fosfito sobre el crecimiento vegetal teniendo en cuenta dos parámetros: el contenido y la longitud del ciclo del cultivo, finalmente establecieron que la mejora en la defensa de las plantas por el fosfito no fue perjudicial en el desarrollo de la plantación y además sugieren que los rendimientos pueden mejorar debido a que el periodo fotosintéticamente activo se extiende por más tiempo. Avila et al (2011), señalaron que el efecto del fosfito sobre la producción de biomasa en un cultivo de maíz, fue significativo solo en plantas expuestas a bajas concentraciones de fosforo.

Figura 10. Comportamiento del crecimiento del Ryegrass (cm) y el índice de verdor en función del tiempo y los

productos de fosfito (Agrifos y Fosetal). A)Crecimiento en función del tiempo; B) Índice de verdor en función del tiempo; C) Crecimiento en función del producto y concentración de los productos; D) Índice verdor en función del

producto y concentración de los productos

A B

A B

C D

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Figura 11. Crecimiento de hojas durante el tiempo de evaluación empleando las tres concentraciones del fertilizante

(Agrifos) a) semana 1 b) semana 3

En contraste, Varadarajan et al (2002) evidenciaron reducción sobre el crecimiento de la planta cuando se suministran compuestos reducidos de fosfato. De otra manera, Pilbeam et al (2000), establecieron la presencia de síntomas fitotóxicos en una concentración de 0,5% de fosfito. Teniendo en cuenta lo anterior, es evidente que la concentración de fosfito que entra en contacto con la planta, es un factor crítico y resulta ser definitivo en la efectividad de este compuesto como nutriente, debido a que, en grandes cantidades, puede generar fitotoxicidad (Herrera et al 2012). Adicionalmente, para el índice de verdor fue posible observar que durante las 3 semanas de estudio hubo diferencia significativas en esta variable, así como entre las concentraciones evaluadas (p<0.005). Al igual que para la longitud de biomasa (crecimiento), el índice de verdor no presentó diferencias entre la aplicación de Agrifos y Fosetal. (p>0.05) De manera general, se observa (Figura 10 b y d) que los valores más altos en los índices de verdor se presentan en la segunda semana de aplicación con valores de 0.77, en la tercera semana disminuyen a 0.74 comparados con la semana inicial donde el promedio de los valores fue de tan solo 0.64. Estos valores se presentaron cuando se aplicó una concentración de 0.2% de fosfitos. También es de destacar que a pesar que en los controles no se adicionó ningún tipo de fosfitos, el Ryegrass tuvo un crecimiento de 19.06 cm para Agrifos comparado con 16.83 cm en Fosetal. Tendencias similares se vieron con los índices de color, pues en el primero se tuvo un índice mayor (0.6263) que con respecto al segundo (0.6221) Estos índices de verdor se han reportado como mediciones espectrales que pueden indicar el desarrollo de la planta, vegetación y por ende la producción de pigmentos como la clorofila. De forma indirecta estas estimaciones podrían indicar un estado Aunque hay pocos reportes previos sobre el efecto de los compuestos fosforados como estimulantes de la producción de clorofila, puede relacionarse como un nutriente más que favorece su síntesis. Se ha determinado la importancia de nutrientes como Nitrógeno en la generación de color en las hojas (Bojovic y Markovic 2009; Wang et al 2014) lo que indicaría que las plantas tienen unas buenas condiciones nutricionales y que las relaciones de C/N/P serian adecuadas para su desarrollo. Es importante también tener en cuenta la exposición de luz a la cual las plantas fueron sometidas, pues esto es elemental en la síntesis de clorofila. Las plantas fueron expuestas a luz cada 12 horas de forma directa. Bajo las condiciones de estudio, se puede inferir que estos compuestos fosforados han influenciado de cierta manera sobre el desarrollo del Ryegrass y así mismo, en los índices de verdor, comparando los datos con el control. Sin embargo, se ha reportado que no en todas las plantas que emplean estos compuestos son asimilados de la misma forma, generando algunos efectos negativos en el desarrollo de estas (Lee et al 2005; Thao et 2008) lo cual generaría una discusión sobre realmente el papel que realizan los fosfitos en la nutrición de plantas y cultivos. Comparando los resultados obtenidos en la investigación contrastan con lo que reportaron Zambrosi et al (2010) donde evaluaron fertilizantes a

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base de Phi en cultivos de naranjos. Las aplicaciones fueron con concentraciones de Pi solas y en mezcla con Phi, las cuales serían determinadas en tejido como hojas, raíces y tallos. Reportaron que las aplicaciones de Phi solas no generan un efecto positivo en la nutrición de los naranjos, puesto que no se evidenció un desarrollo óptimo en ellas y aunque no hubo efectos de toxicidad, establecieron que los Phi no pueden ser oxidados a fosfatos, las formas asimilables de Fosforo por las plantas. Así mismo los niveles de clorofila en las plantas no fueron los mejores en comparación a los tratados con fosfatos únicamente. Contrario a lo que ocurrió en este estudio pues los fosfitos si contribuyeron a que los índices de color aumentaran en cierta manera en las semillas de Ryegrass. Teniendo en cuenta lo anterior si hay evidencia que los Phi generan una estimulación, puede ser mínima, para la producción de pigmentos como clorofila en las plantas y no podría establecerse que no son un aporte nutricional en todas las plantas. Esto puede incidir en las distintas plantas que se evalúen, factores como condiciones de suelo, pH de este mismo e incluso la población de microorganismos que pueden desarrollar una acción solubilizadora de estos Phi en las plantas.

Tanto en el índice de verdor como en la longitud de la hoja, se determinó que la mejor concentración de fosfito es 0,2% (p/v), debido a que en esta, se presentaron los valores más altos para cada una de las variables y no se presentaron diferencias significativas con la concentración del 0.3% (p>0.05). Ávila et al (2013) estudiaron diferentes concentraciones de fosfito sobre un cultivo de frijol común en dos tratamientos, el primero no se suplemento con ningún nutriente de fosforo y al segundo se le adicionó un contenido adecuado de fosfato, estableciendo finalmente, que el índice de consumo de

fosforo aumentó con concentraciones de fosfito superiores a 128 μM en plantas que presentan deficiencias del nutriente, y esto sucedió, como consecuencia del incremento en el nivel de este compuesto en la solución de suelo, no obstante, demostraron que en plantaciones suplementadas con cantidad suficiente de fosfato, no existieron diferencias significativas entre el control y los niveles de fosfito. Lo que demuestra, que el efecto de esta sustancia (Phi) sobre el crecimiento vegetal, es fuertemente dependiente de la cantidad de fosfato suministrado (Thao et al 2009).

Además de las variables de respuesta medidas en el tiempo ya mencionadas anteriormente, los puntos finales del estudio tenidos en cuenta fueron las concentraciones de Pi, Phi y peso seco, este último importante ya que es el factor que determina el rendimiento de las plantas luego de la aplicación de los tratamientos. En primer lugar las concentraciones obtenidas de fosfitos finalmente luego de tener en cuenta la forma de aplicación (foliar y suelo), junto con las diferentes concentraciones empleadas permitieron determinar que hay diferencias significativas (p=0.00024) entre la forma y las diferentes concentraciones analizadas. En la Figura 12 se observa que en hojas, raíces y suelo, contienen residuos de fosfito (Phi) donde las concentraciones 0.2% y 0.3% presentan diferencias comparado con el control (p=0,013 y p=0,045 respectivamente) indicando que la aplicación de fosfitos está generando un efecto en cada una de las matrices De igual forma, se logró evidenciar que existe una acumulación de los compuestos a base de fosfitos en las hojas diferente a las concentración en suelo y raíces (p<0.001). Lo anterior indica que la aplicación foliar genera un efecto en comparación con las concentraciones suministradas en suelo y a su vez en las concentraciones que se pudieron recuperar luego de estas aplicaciones en las dos matrices (suelo y raíz)

30

Figura 12. Integración de datos obtenidos a partir de las concentraciones de Fosfito en las diferentes matrices

evaluadas con respecto a las concentraciones.

Algo similar ocurrió con las concentraciones de fosfato obtenidas a final del experimento, pues se logró evidenciar que el factor de aplicación foliar está siendo representativo en comparación con la aplicación de suelo (p<0.0001) (Figura 14). Su promedio de concentraciones en hojas fue 763,685 ppm mientras que en el suelo y raíces fueron respectivamente 168,720 y 103,274 ppm. No obstante, las aplicaciones de Phi no están relacionadas con la alta presencia de fosfatos en hojas ya que se observa que en las entre las concentraciones no hay diferencias significativas entre ellas (p= 0.9774). Aunque se mencionó anteriormente que hay una concentración elevada de fosfatos en hojas, comparado con el suelo y las raíces; no se presentaron diferencias entre raíces y suelo y tampoco en los productos (Agrfos y Fosetal) (p>0.05)

Figura 13 Concentración de fosfatos finales en las tres matrices evaluadas luego de la aplicación de distintas concentraciones

A partir de lo anterior se puede estimar que las concentraciones de Phi están siendo acumulados, y probablemente no se están llevando a cabo procesos de oxidación en hojas, mientras que en el suelo las concentraciones de Phi fueron mucho más bajas pero sus niveles de Pi son más altas a medida que las concentraciones adicionadas van en aumento; caso contrario a lo que ocurre con las hojas y sus concentraciones de fosfatos. Es así como se puede establecer que en el suelo se están realizando procesos de oxidación que aunque pueden ser lentos, se logran a medida que las concentraciones de Phi son mayores y esto favorece a que las plantas puedan tener una mejor movilidad de los compuestos oxidados adicionados cuando son aplicados en el suelo y no de forma foliar. Este efecto indirecto de los Phi como un posible nutriente contrasta con reportes anteriores que indican que el uso de los fosfitos como única fuente de fósforo genera toxicidad en distintos cultivos e incluso suprime la actividad normal del metabolismo del P (Abel et al 2002; Carswell et al 1996 , 1997) Sin embargo, es importante aclarar que las concentraciones adicionadas de fosfitos son importantes ya que en este estudio se logró observar que las concentraciones máximas (0.3%) generan una respuesta contraria a un buen desarrollo en el caso de los índices de color o incluso en las concentraciones de Pi cuando se adicionan de forma foliar. Esto quiere decir que para obtener un crecimiento adecuado por parte de las plantas estas concentraciones deben estar por debajo de 0.3 % para lograr una mejor absorción, movilidad e incluso favorecer la reacciones de oxidación. Estas reacciones de oxidación se realizan gracias a las poblaciones microbianas que están en el suelo y desempeñan un papel de agentes solubilzadores de fósforo para las plantas (Ehrlich 1995). Así las concentraciones de microorganismos están relacionadas de forma directa con la nutrición de los cultivos. En este caso, el suelo está contenido con distintas especies microbianas que favorecen las

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oxidaciones de los compuestos de fosfitos. Orbovic et al (2008) reportaron actividad de microorganismos en suelo luego de que éste fue autoclavado antes de ser utilizado en plantaciones de naranjos bajo tratamiento de Pi. Las oxidaciones se evidenciaron luego de 10 días de experimentos, concluyendo que el alto crecimiento en los cultivos se evidenció cuando fueron suministradas concentraciones de fosfato y fosfito de forma separada. Consecuente a esto, aquellas plantas que puedan tener problemas en la asimilación de los análogos reducidos de fosfato, la actividad de los microorganismos es imprescindible para lograr mayores rendimientos y quizás este ha sido clave en la toxicidad que han presentado algunas especies vegetales. Otro factor que debe tenerse en cuenta son las actividades metabólicas que se realizan en cada una de las plantas puesto que esta puede ser la respuesta de porque en algunas se genera efectos positivos, mientras que hay estudios que indican lo contrario; es por eso que los procesos de asimilación y transporte de nutrientes deben ser considerados en la determinación del efecto del compuesto como nutriente. Es poca la información que se tiene de como son los procesos de translocación y entrada de fosfitos en las plantas pero Ouimette y Coffey (1990) concluyeron luego de aplicar un producto comercial (Fosetal) que la movilidad de los fosfonatos (esteres de fosfitos) se puede dar por medio del floema y este mecanismo es eficiente porque se cuenta con transportador específico para estos compuestos, que requiere de grandes cantidades de anergia para poder introducirlo. Y dentro del floema este fosfonato es atrapado con dificultades de ser liberado al medio y que en muchos casos se necesita de procesos con alta demanda de energía en la cual permita poder ser tomado finalmente por las células. Este análisis se hizo a partir de semillas de remolacha (Beta vulgaris) y Frijol de recinio (Ricinus communis L var gibsonni) donde se analizaron exudados de raíces. Se evidencio también una acumulación de estos compuestos en las hojas en un tiempo de 24 horas. Los efectos que puedan generar los fosfitos en las plantas está determinado por varios elementos que no siempre se podrán generalizar a las plantas y cultivos que siendo empleados para aumentar su crecimiento gracias a la adición de este tipo de fertilizantes, pues como se ha visto las respuestas a las distintas concentraciones suministradas están relacionadas con el tipo de aplicación que se realiza, la población microbiana que hay el suelo y los procesos metabólicos que pueden realizar las plantas de acuerdo a su estado nutricional. Esto último es muy importante porque las plantas no tendrán respuestas que afecten su desarrollo siempre y cuando las concentraciones de fosfato también estén presentes en forma óptima (Thao y Yamakawa 2008 a Thao et al 2008 b) De esta manera la aplicación de fosfitos es posible como fertilizantes y ser una alternativa más para suplir necesidades nutricionales en los cultivos.

Por último y con respecto al peso seco, se pudo determinar que con la aplicación de fosfitos en el suelo se obtenía un mayor rendimiento (1,7 g aproximadamente), que estaba determinado en términos de biomasa seca. En contraste, la aplicación foliar de fosfitos, presentó valores promedio de 0,55 g (Figura 14 ). En una investigación realizada por Moor et al (2009) determinaron que entre distintas aplicaciones de fosfito sobre un cultivo de fresas, no había diferencias significativas que afectaran el rendimiento de la plantación. Por otro lado, Schroetter et al (2006, estableció que en la aplicación foliar de fosfitos en suelos con deficiencias de nutrientes, el peso seco de las matices evaluadas eran menores que en suelos fertilizados, por lo tanto y corroborando lo encontrado en el presente estudio, la aplicación de suelo permite un mejor desarrollo de la planta a diferencia de la aplicación foliar, en la cual se evidencio una acumulación de este compuesto en las hojas, a diferencia de las otras dos matrices estudiadas

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

Factor Tipo.de.aplicacion

Concentracion

Pes

o.s

eco

0 0.1 0.2 0.3

Suelo

Foliar

Peso

seco

(g

)

32

Figura 14. Relación de Peso seco a medida que las concentraciones de Phi subían con respecto al

tipo de aplicación

En la Figura 16 se evidencia la correlación que existe entre el fosfito para los dos tipos de aplicaciones, sin embargo, es posible concluir que no hay una correlación significativa entre la concentración de fosfitos y el peso seco y tampoco se evidencia una correlación entre las variables de respuesta (fosfitos, fosfatos y peso seco), lo que quiere decir, que a mayor concentración de fosfito no habrá mayor peso seco. Un estudio realizado por Ali M et al (2014), establecieron que las concentraciones de fosforo incrementaron con la aplicación foliar de fosfito, no obstante, y en contraste con lo evidenciado, determinaron que debido a este aumento, existía una mejora en el rendimiento de los cultivos. Esto fue debido a que las concentraciones utilizadas, con respecto al control, estaban suplementadas con diferentes fuentes de fosforo y nitrógeno, lo que permite concluir que la aplicación de fosfitos con deficiencias en nutrientes influyen en el rendimiento en las plantaciones.

Por otro lado, Avila et al (2013), determinaron que el peso seco del grano de un cultivo de frijol crecido con fosforo suficiente no tuvo diferencias significativas con cada una de las concentraciones de fosfito evaluadas, a diferencia de las plantaciones suplementadas con fosfito que presentaban deficiencias de este elemento, en las que se evidenció una disminución en el peso seco en concentraciones superiores a 32 uM

Esto anterior permite establecer que los fosfitos no son compuestos apropiados para el incremento de biomasa de las plantas y que este no está relacionado propiamente con los procesos de crecimiento. No hay evidencias en su totalidad que determinen que los fosfitos suministrados como única fuente de P puedan lograr altos rendimientos de biomasa. Si bien puede ser empleado de forma indirecta para proveer este elemento en la planta, mas no puede ser considerado que cumple con los requerimientos nutricionales de la planta ( Mac Donald et al-, 2000). Sin embargo la variabilidad de respuestas que se han reportado en las distintas plantas y los efectos que han tenido ellas cuando son aplicados Phi, puede ser dependiente de las mismas plantas. Como se mencionó anteriormente factores como la absorción y asimilación del mismo fosfito y el estado nutricional en el que se encuentre son claves en el uso de Phi como fertilizantes. En este estudio las concentraciones empleadas no lograron una respuesta de impacto en las plántulas de Ryegrass, tanto positivo como negativo, lo cual indica que las concentraciones para evaluar las respuestas en este tipo de semillas deberían ser mayores que 0,3 %, teniendo en cuenta que a altas concentraciones se logran efectos fitotóxicos. Además es importante tener en cuenta que las formas de aplicación y dosis suministradas afectan la translocación de PO3. Además que las respuestas de Phi pueden ser distintas entre especies de plantas, se considera que los Phi y los Pi tienen un efecto y relación directa en la mayoría de ellas. Debido a lo anterior en muchos estudios se considera que las concentraciones de PO4 deben estar presentes en el suministro de Phi como fertilizantes.

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CONCLUSIONES La concentración mínima inhibitoria del fosfito comercial sobre el crecimiento de P. infestans fue de 0.1%, mientras que la concentración máxima tolerada fue de 0.08%, con un % de inhibición de 74.66% para Agrifos y de 57.69% para Fosetal, respectivamente, lo cual indica que el fosfito en bajas cantidades es un potente inhibidor del fitopátogeno. No hay una correlación entre la concentración de fosfito y el peso seco, lo cual indica que no es posible el uso de este elemento como fertilizante para las plantas Para las condiciones del presente estudio se determinó que la técnica colorimétrica de yodo-yoduro fue la mejor para cuantificar fosfitos, debido a que la presencia de interferentes en las matrices evaluadas no impide la cuantificación de este compuesto como si se evidencio en la técnica de HPLC RECOMENDACIONES

- Para las aplicaciones de fosfitos como fertilizantes hay que tener en cuenta las dosis, concentraciones y las veces de aplicación en las plántulas de Ryegrass

- Para la realización de la cromatografía liquida, la fase estacionaria debe realizarse a pH a 8 y no superior a 9 pues la separación de los picos es dificultosa si se realiza en otro valor

- Se recomiendan evaluar concentraciones por encima de 0,3% para evidenciar posible crecimiento y máximo rendimiento de cultivos

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}

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ANEXOS

ANEXO 1. Medios de cultivo

AGAR ARVEJA COMPOSICION CANTIDAD Arveja congelada 60 g

Sacarosa 20 g Agar 12 g Preparación Dejar en remojo 60 g de arveja congelada durante 12 h. Posteriormente filtrar las arvejas, y al líquido que quedar agregar 20 g de sacarosa y 12 g de agar, completar con 1 L de agua destilada. Ajustar pH a 7,2. Autoclavar AGAR CENTENO COMPOSICION CANTIDAD

Harina de centeno 25 g Sacarosa 20 g Agar 18 g Preparación Dejar en remojo 25 g de harina de centeno durante 24 h. Posteriormente filtrar la harina, y el líquido restante agregar 20 g de sacarosa y 18 g de agar, completar con 1 L de agua destilada. Ajustar pH a 7,2. Autoclavar AGAR V8 COMPOSICION CANTIDAD

Jugo V8 100 ml Carbonato de calcio 1 g

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Agar 15 g Preparación Pesar 1 g de carbonato de calcio y 15 g de agar, disolverlo con 100 ml de jugo V8 y completar hasta 1 L con agua destilada. Autoclavar AGAR V8 (Suplementado con antibiótico) COMPOSICION CANTIDAD

Jugo V8 100 ml Carbonato de calcio 1 g Agar 15 g Cloranfenicol 0,01 g Preparación Pesar 1 g de carbonato de calcio y 15 g de agar, disolverlo con 100 ml de jugo V8 y completar hasta 1 L con agua destilada. Agregar 0,01 g de cloranfenicol. Autoclavar

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ANEXO 2. Preparación de reactivos Cromatografía líquida (HPLC) Preparación de la fase móvil La fase móvil se preparó por la adición de un buffer compuesto por 5 ml de tetrabutilamonio hidróxido (TBAOH) a 0.5 mM y 0.4 ml de una solución de hidrogenoftalato de potasio a 0.1 mM, el pH final fue de 8.2. Posteriormente, se mezcló con 50.55 ml acetonitrilo y se situó sobre un filtro de 0.22 µm (GWMP milipore France).

Técnica de Yodo – Yoduro La solución de yoduro de potasio se preparó disolviendo 0.2212 g de KI en agua destilada a 250 ml, mientras que la solución de yodato de potasio se elaboró por la mezcla de 0.0357 g de KIO3 en agua.

Para la preparación de la solución de almidón se diluyeron 0.25 g en 50 ml de agua destilada y se llevó la mezcla a ebullición. Se dejó por 1 día en un cuarto a temperatura ambiente para que la amilosa se solubilizara totalmente. Por otro lado, se empleó una concentración de HCl 4.0 mM y fue llevado a un volumen final de 250ml. Por último, el hidróxido de sodio se preparó a una concentración de 0.1 N en un volumen de 250 ml y la solución de nitrito de sodio (NaNO2) fue realizada por la adición de 1.725g a 250 ml de agua destilada.

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ANEXO 3. Curvas patrón Tecnicas colorimétricas para cuantificacion de PO4 y PO3.

Curva Patrón para cuantificación de Fosfatos 𝑦 = 0,0443𝑥 − 0,012 𝑟2 = 0,9981

Curva Patrón para cuantificación de Fosfitos

𝑦 = −0,0199𝑥 + 0,6333

𝑟2 = 0,9822

determinaciÓn del efecto de los fosfitos como …

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