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DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFA TASA ÁCIDA DE Actinobacillus pleuropneumoniae

OROZCO SOLIS JENNY BERENICE

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DETERMINACIÓN DE PARAMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFA TASA ÁCIDA DE Actinobacillus pleuropneumoniae

OROZCO SOLIS JENNY 1

INDICE

Pág.

1. Antecedentes teóricos 1

1.1 Enzima 4

1.2 Hidrolasas 6

1.3 Fosfatasas 6

1.4 Fosfatasas ácidas 7

1.5 Parámetros cinéticos 8

1.5.1 Temperatura 8

1.5.2 pH 8

1.5.3 Efecto de la concentración de sustrato 8

1.5.4 Efecto de Inhibidores 9

2. Justificación 10

3. Objetivos 10

3.1 Objetivo General 10

3.2 Objetivos Específicos 10

4.. Secuencia experimental 11

5 Metodología 12

5.1. Cepas y cultivos bacterianos 12

5.2. Lavado e células 12

5.3. Extracción de la enzima a partir de las células 12

5.4. Determinación de Actividad de Fosfatasa Ácida 12

5.5. Cuantificación de proteínas 13

5.6. Efecto de Temperatura 13

5.7. Efecto de pH 13

5.8. Determinación de Km y Vmax 13

5.9. Efecto de Inhibidores 14

6 Resultados y Discusión 15

6.1 Cepas y cultivos bacterianos 15

6.2 Curva tipo de p-NPP 15

6.3 Cuantificación de proteínas 16

6.4 Actividad enzimática y concentración de proteínas 18

6.5 Efecto de Temperatura 19

6.5.1 Temperatura de inactivación 20

6.6 Efecto de pH 23



1

6.7 Determinación de Km y Vmax 24

6.8 Efecto de Inhibidores 27

6.8.1 Efecto de EDTA 28

6.8.2 Efecto de Fósforo 30

6.8.3 Efecto de Molibdato de Sodio y Tartrato de Sodio 31

7. Conclusiones 34

8. Perspectivas para trabajo a Futuro 34

9 Bibliografía 35

Anexo 1 Reactivos 37

Anexo 2 Técnicas 40



2

INDICE DE TABLAS

Pág

Tabla 1. Absorbancias obtenidas del Método de determinación

de la curva tipo de p-NPP para Actividad Enzimática 15

Tabla 2. Absorbancias obtenidas del Método de cuantificación

de proteínas 17

Tabla 3. Actividad enzimática y concentración de proteína a partir de los

extractos periplásmicos obtenidos 18

Tabla 4. Actividad enzimática de 2hr 18

Tabla 5.Efecto de temperatura 19

Tabla 6.Temperatura de inactivación 21

Tabla 7. Temperatura de inactivación 21

Tabla 8. Efecto de pH 23

Tabla 9. Ecuación de Michaelis-Menten 25

Tabla 10. Ecuación de Lineaweaver-Burk 26

Tabla 11. EDTA 28

Tabla 12. Fósforo 30

Tabla 13. Molibdato de Sodio 31

Tabla 14 Tartrato de Sodio 32

INDICE DE GRÁFICAS

Pág

Gráfica 1. Curva tipo de p-NPP 16

Gráfica 2. Curva tipo para cuantificar proteínas (Bradford) 17

Gráfica 3. Curva de efecto de temperatura 20

Gráfica 4. Temperatura de inactivación 22

Gráfica 5. Efecto de pH 24

Gráfica 6. Ecuación de Michaelis-Meneen 25

Grafica 7. Ecuación de Lineaweavwer-Burk 26

Gráfica 8. EDTA 29

Gráfica 9. Fósforo 30

Gráfica 10. Molibdato de Sodio 31

Gráfica 11. Tartrato de Sodio 32



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AGRADECIMIENTOS

A DIOS

Quiero agradecer antes que nada a Dios, por darme la oportunidad de estar viva y así

consumar una de las metas más importantes en la vida, el término de mi carrera y por

darme la Familia que tengo.

A MIS PADRES

Que me dieron el mayor regalo que se le puede dar a una persona, la vida.

Por inculcarme los valores, darme la familia, el ejemplo que me ha llevado hasta

donde estoy. Por tenerme la paciencia, comprensión y entenderme en los momentos

más difíciles de la carrera, con todas mis presiones provocando que no estuviera todo

el tiempo que me necesitaban consigo y por estar conmigo siempre ahora que

concluye una de las etapas mas importantes de mi vida, Gracias. (Víctor y Leonor)

A MIS HERMANAS

Quienes me han enseñado a luchar por alcanzar los sueños, a no desistir en el camino

y sobre todo, por la dicha de poder compartir la vida con ellas, Gracias. (Erika y

Claudia)

A MI CUÑADO

Por haber llegado a nuestra vida, ayudarme a superar mis miedos y a ser una persona

independiente. Gracias (Álvaro)

A MIS TIOS

Por enseñarme que el mejor camino para conseguir lo que quieres es trabajando,

Gracias (Martín y Lilia).

PROFESOR RODRIGO

Gracias por haberme permitido estar en esta investigación, le agradezco su

disposición para asesorarme en este trabajo, por su confianza, por sus consejos y

enseñanzas.



4

A MIS AMIGOS

Por haber estado en los momentos en el cual yo los necesite, por confiar en mi, y por

ser mis amigos, Gracias (Jacqueline, Susana, Ana Luisa, Cristina, Gemma, Marisol,

Oscar y Anayeli)



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p H óp t i mo

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DETERMINACIÓN DE PARAMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA DE ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIA

JENNY BERENICE OROZCO SOLIS, * M. en C. RODRIGO MARTINEZ ZUÑIGA UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA. Av. Acueducto s/n, Col. Barrio la Laguna Ticomán C.P. 07340 México, D.F. Tel. 57296000 Ext. 56318 y 56320 fax 56305 Mail. [email protected]

Palabras clave:.Actinobacillus pleuropneumoniae (Ap),Pleuroneumonía Contagiosa Porcina(PCP) Introducción. La producción y consumo de carne de cerdo es de gran importancia nacional. La industria porcícola se ve afectada económicamente por una gran variedad de enfermedades que puede contraer el cerdo. El Actinobacillus pleuropneumoniae es un cocobacilo gramnegativo de la familia Pasteurellaceae, es anaerobio facultativo. Las enzimas son en general proteínas altamente especializadas, son catalizadores muy potentes y eficaces, capaces de acelerar la velocidad de reacción de la célula, químicamente son proteínas, se clasifican en: Oxidorreductasas, Transferasas, Hidrolasas, Isomerasas, Liasas, Ligasas. Las fosfatasas ácidas son producidas por bacterias, hongos, levaduras, entre otros, presentan actividad óptima a pH bajo, se localizan en lisosomas, algunas fosfatasa ácidas están asociadas a la membrana celular en otros casos están secretadas al medio de cultivo, el sustrato utilizado a nivel laboratorio es p-nitrofenilfosfato (p-NPP), este puede actuar de manera especifica y no específica, depende de la reacción en la célula. Hay una serie de factores que se deben de tomar en cuenta cuando se estudia la cinética de una reacción enzimática entre los cuáles tenemos: Temperatura, pH, Efecto de la concentración de sustrato, Efecto de inhibidores. Se debe establecer las condiciones óptimas en todos los factores para tener el máximo rendimiento en la actividad enzimática. Metodología. Cepas y cultivos bacterianos. Se emplean para la cepa de A. pleuropneumoniae, que crezca en medio Luria Bertani con glucosa (LBG) líquido o Infusión Cerebro Corazón (BHI) y mantener la cepa en el mismo agar del medio; en cualquier caso el medio es suplementado con NAD. Emplear cultivos de toda la noche, realizar Lavado de células; Centrifugar, recuperar la pastilla y resuspender con amortiguador., empleando Desoxicolato de Sodio. Se mide la actividad y se determina la cantidad de proteínas presentes. Y por ultimo medir. :Efecto de Temperatura, Efecto de pH, Determinación de Km y Vmax, Efecto de inhibidores. Resultados y discusión. Se logro determinar actividad enzimática y cuantificación de proteínas .Se determinaron parámetros cinéticos de la actividad de fosfatasa ácida

Gráfica1 Efecto de pH, En la Gráfica 1 se observa la presencia de 2 picos de actividad a pH ácido entre 5 y 6 muestra que nuestra enzima tiene límites de

pH óptimo no muy estrechos, mientras que en el lado alcalino se observa actividad entre pH 7.5 y 8 esto nos indica que tenemos la presencia de mas de una fosfatasa, sin embargo nuestro extracto está enriquecido en fosfatasas ácidas.

Gráfica 2. EDTA

En la gráfica 2 se observa que el EDTA disminuye la actividad de la enzima, conforme se aumenta la concentración del mismo se puede ver que la actividad disminuye en un 50% con aproximadamente 15mM de EDTA., la enzima requiere la presencia de algún Ion metálico. Conclusiones. De acuerdo ala manipulación que se tuvo con el Actinobacillus pleuropneumoniae, podemos decir que es una bacteria muy sensible, es por eso que se recomienda que se debe de resembrar cada 10 días. La temperatura óptima para la actividad de la enzima fue de 37ºC. Al someter la enzima a 10 minutos de calentamiento a 38ºC inicia un proceso de desnaturalización, la cual alcanza su máximo al calentar a 48 ºC. Para la determinación del pH óptimo se encontró que este ocurre entre 5 a 6. Los valores obtenidos de Vmax= 2.29 mM/ml y se pudo obtener la Km= 1.031mM La enzima requiere algún ión metáLa enzima no fue sensible a Tartrato y muy poco sensible a Molibdato La enzima es sensible a la inhibición por retroalimentación. Perspectivas. Determinar si la molécula tiene un papel esencial en el metabolismo de la bacteria. Determinar la funcionalidad de la enzima en la bacteria. Realizar estudios de patogenicidad de la enzima en la bacteria. Agradecimientos. Al Instituto Polit la Unidad Profesional Interdisciplinaria deBiotecnología, al Departamento de Bioquímica, al M. en C. Rodrigo Martinez Zúñiga. Referencias. 1. Fenwick B. (1994). Porcine Pleuropneumonia, JAVMA 204: 1334-1340 2. Lehninger, A.; “Bioquimica”, 2da. Edición, Ed. Omega, Barcelona. 1978, pág 189 – 222.

E D T A

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4 0

6 0

8 0

10 0

0 1 5 10 15 2 0 4 0 6 0

E D T A ( mM )

DETERMINACIÓN DE PARAMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFA TASA ÁCIDA DE Actinobacillus pleuropneumoniae

OROZCO SOLIS JENNY 1

ANTECEDENTES TEÓRICOS

En México, la producción y consumo de carne de cerdo es de gran importancia

nacional (15,16). La industria porcícola se ve afectada económicamente por una gran

variedad de enfermedades que puede contraer el cerdo. Entre ellas se encuentra la

Pleuroneumonía Contagiosa Porcina (PCP), una enfermedad de vías respiratorias

causada por Actinobacillus pleuropneumoniae, que se presenta a nivel mundial. La

bacteria induce una neumonía fibrinohemorrágica que eventualmente desencadena la

muerte de los cerdos. El primer brote se observó a principios de la década de los 60’s

en Argentina (8). (Fig. 1).

Para la PCP, la morbilidad puede exceder el 50%, alcanzando en ocasiones hasta un

90% con un índice de mortalidad variable alrededor del 10%(5).

Fig. 1.- Fotografía del brote causado por Actinobacillus pleuropneumoniae

Actinobacillus pleuropneumoniae es un cocobacilo gramnegativo de la familia

Pasteurellaceae, es anaerobio facultativo (Fig. 2).

Es capsulada, no esporulada y puede presentar formas filamentosas cuando las

condiciones de crecimiento no son las óptimas. Se le consideraba inmóvil hasta que

recientemente se ha descrito la presencia de flagelo y se ha observado movilidad in

vitro.

Fig. 2.- Fotografía mostrada del Actinobacillus pleuropneumoniae

1



1

Las principales vías de contagio de la Pleuropneumonia Contagiosa Porcina (PCP) es

aérea y por contacto directo de un cerdo portador o enfermo a un cerdo susceptible,

pero también existe la forma indirecta donde el mismo personal de la granja podría

actuar como vector. La susceptibilidad del cerdo será dependiente de las condiciones

en que vive y crece (8), observándose mayor incidencia de la enfermedad en épocas de

frío en la que el hacinamiento facilita la transmisión. La enfermedad se presenta en

tres formas: hiperaguda, aguda o crónica. En el nivel hiperagudo, los cerdos presentan

tos, rigidez, anorexia, fiebre y se postran hasta su muerte; en el nivel agudo, existe

dificultad respiratoria, conservación de los síntomas de la fase hiperaguda, y los

animales pueden o no morir; los que no mueren quedan inmunes contra todos los

serotipos. En el nivel crónico, los cerdos se convierten en portadores de la enfermedad

infectando a los demás cerdos, provocando un retraso en el crecimiento y en la

ganancia adecuada de peso. La evolución de esta enfermedad es tan rápida que la

muerte de los cerdos puede ocurrir de 8 a 12 horas después de los primeros signos

clínicos (5).

Desde las primeras descripciones, por Ligniers y Spitzen 1902 y la posterior fijación por

Brumpt en 1910, hasta la actualidad al género Actinobacillus se le han incorporado y

excluido diversos microorganismos: A. mallei fue traspasado a Pseudomona mallei,

mientras, Bacillus nephritidis equi (Meyer 1910) pasó a Shigella viscosa (Bergey 1930)

para ser incluida finalmente como A. equuli (Haupt 1934). La última incorporación ha sido

Haemophillus pleuropneumoniae y finalmente con los avances de Biología Molecular

surgió la clasificación mas apropiada como miembro del género Actinobacillus(3).

La actinobacilosis porcina en su moderna concepción ha sido diagnosticada en Europa

(Alemania, Reino Unido, Francia, Italia, España) y América (Canadá, Venezuela y

Argentina). Sin embargo, el mecanismo de transmisión vertical y el creciente intercambio

de productores hace pensar que se trata de una enfermedad de presentación universal.

El tamaño aproximada del genoma de esta bacteria es de unos 2,4Mpb, con un

contenido en G+C del 42.1%, (Fig. 3).

2



2

Fig 3.- Cultivo de A. pleuropneumoniae en medios sólidos. 2 A: colonias en agar chocolate. 2B: colonias

en agar PPLO enriquecido con NAD; 2C: satelitismo en agar sangre. 2D. Efecto CAMP; 2E: colonias

hemolíticas en la presencia sangre.

Es un microorganismo altamente específico de los cerdos, no patógeno para los seres

humanos. Se reconocen dos biotipos: biotipo 1, que agrupa las cepas dependientes de

NAD, (nicotin-adenosin-dinucleótido) como cofactor para su crecimiento biotipo 2, que

agrupa las cepas NAD independientes(4). Sus colonias en agar sangre son pequeñas,

de menos de 1 mm de diámetro, blanquecinas, brillantes y mucoides con variedades

lisa y rugosa; el biotipo 2 presenta colonias de aproximadamente 2 mm de diámetro de

aspecto opaco y bordes redondos. Se tienen evidencias de que las cepas del biotipo 2

son menos virulentas.

3



3

1.1 ENZIMAS

Las enzimas son en general proteínas altamente especializadas, son catalizadores

muy potentes y eficaces, capaces de acelerar la velocidad de reacción de la célula,

químicamente son proteínas (Fig 4). Como catalizadores , actúan en pequeña

cantidad y se recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean

energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos,

sino que aceleran su consecución, son esenciales para la vida, además su actividad

no se limita a realizarse en el interior de la célula o del organismo que las produce sino

que muchas de ellas son liberadas al exterior y es ahí donde ejecutan su función, la

cual, en el caso de las enzimas hidrolíticas, es principalmente digerir los sustratos del

ambiente (11).

Fig 4.- Principio de enzimas

No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que solamente aceleran las que

espontáneamente podrían producirse. Ello hace posible que en condiciones

fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones

extremas de presión, temperatura o pH.

Tienen pesos moleculares que oscilan entre 12,000 y un millón. Algunas enzimas son

proteínas conjugadas; ya que poseen un grupo no proteico o prostético.

La característica más sobresaliente de los enzimas es su elevada especificidad. Esta

es doble y explica que no se formen subproductos:

4



4

1. Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la molécula sobre la que la

enzima ejerce su acción catalítica.

2. Especificidad de acción. Cada reacción está catalizada por una enzima

específica.

La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa

el estado de transición.

El sustrato se une a la enzima a través de numerosas interacciones débiles como son:

puentes de hidrógeno, electrostáticas, hidrófobas, etc., en un lugar específico, el

centro activo . Este centro es una pequeña porción de la enzima, constituido por una

serie de aminoácidos que interaccionan con el sustrato. Los enzimas son

catalizadores específicos : cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi

siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos (11).

(Fig. 5).

1.- La enzima y su

sustrato

2.- Unión al centro

activo

3.- Formación de

productos

Fig. 5.- Aspectos generales de las enzimas

En función de la reacción catalizada por la enzima Se clasifican en (9) :

� Oxidorreductasas: Catalizan reacciones de oxido-reducción, las que implican la

ganancia (reducción) o pérdida de electrones (oxidación). Las más importantes

son las deshidrogenasas y las oxidasas

� Transferasas: transfieren grupos funcionales de una molécula a otra.

� Hidrolasas: Rompen varios tipos de enlaces introduciendo radicales -H y -OH.

� Isomerasas: Reacciones de Isomerización, convierten los sustratos isómeros

unos en otros

� Liasas: Adición de grupos funcionales a los dobles enlaces

5



5

� Ligasas: Se conocían como sintetasas, participan en la formación de enlaces

con hidrólisis de ATP

1.2 HIDROLASAS

Catalizan la ruptura de enlaces con la participación de una molécula de agua, se

clasifican de acuerdo al tipo de enlace químico sobre el que actúan, hidrolizando

enlaces peptídicos, enlace éster, enlace glucosídico y enlace C-N.(12)

Fig.- 6 Mecanismo de las Hidrolasas.

1.3 FOSFATASAS

Son un grupo de enzimas hidrolíticas que actúan sobre los ésteres del ácido fosfórico,

son capaces de desfosforilar compuestos orgánicos, realizan una ruptura hidrolítica de

enlaces ésteres fosfóricos o fosfoanhidridos, en general son enzimas de baja

especificidad aunque hay algunas con elevada especificidad principalmente las que

actúan sobre azúcares fosforilados. Algunas fosfatasas actúan específicamente sobre

un sustrato determinado, pero la mayoría actúan sobre diversos sustratos.

Las fosfatasas se clasifican de acuerdo a sus propiedades fisicoquímicas tal como el

pH óptimo, de tal modo que existen fosfatasas ácidas, alcalinas o neutras (9).

Las bacterias tienen a la enzima en el citoplasma o en el espacio periplásmico situado

entre la pared celular y la membrana plasmática, en periplasma se ha detectado la

presencia de fosfatasas que catalizan la hidrólisis de fosfoester o fosfoanhidrido.

Algunas de estas enzimas son secretadas fuera de la membrana plasmática. Entre los

grupos bacterianos se han determinado además diversas fosfatasas producidas como

proteínas periplásmicas o como lipoproteínas unidas a membrana. Estas enzimas

bacterianas se les ha denominado fosfatasas ácidas no especificas, se piensa que su

función esencial es la de proveer nutrientes requeridos por la célula, son capaces de

desfosforilar un amplio grupo de sustratos no relacionados estructuralmente y exhiben

actividad catalítica óptima en valores de pH ácido o neutro, aunque algunas han

6



6

evolucionado hacia funciones más especializadas, relevantes en la virulencia

microbiana para diferentes bacterias como lo son para Yersinia pseudotuberculosis, es

una bacteria patógena que causa enteritis aguda y linfadenitis mesentérica en

mamiferos incluyendo humanos y en aves. Las fosfatasas son también importantes en

procesos vitales como regulación del metabolismo y conversión de energía (9).

Algunas fosfatasas son secretadas fuera de la membrana plasmática, de modo que

pueden permanecer como proteínas unidas a membrana o libres en el espacio

periplásmico (4), o definitivamente liberarse por completo de la célula y encontrarse en

el medio donde habita la bacteria. Se cree que la función esencial de las fosfatasas

extracelulares es quitarle el fosfato a otros compuestos como nucleótidos, azúcares-

fosfato, ácido fítico, etcetera., que no pueden atravesar la membrana citoplásmica

como tales pero que sí lo hacen una vez que son liberados del fosfato (1). Como se

mencionó anteriormente, algunas fosfatasas extracelulares son parte importante de la

batería de factores de virulencia que tienen diversos microorganismos patógenos, las

que también les permiten la sobrevivencia en su huésped, o en el medio ambiente (10).

1.4 Fosfatasas Ácidas

Las fosfatasas ácidas son producidas por bacterias, hongos, levaduras, protozoarios,

micorrizas, raíces de plantas entre otras, presentan actividad óptima a pH bajo, se

localizan en lisosomas, sus pesos moleculares van de 18 a 130KDa. Algunas fosfatasa

ácidas están asociadas a la membrana celular; en otros casos están secretadas al

medio de cultivo, el sustrato utilizado a nivel laboratorio es p-nitrofenilfosfato (p-NPP),

este puede actuar de manera especifica y no específica, depende de la reacción en la

célula.

En general se les considera como enzimas secretadas, son enzimas monoméricas o

poliméricas con cadenas peptídicas de bajo peso molécular, de acuerdo a la similitud

en su estructura primaria se han agrupado en clases: Fosfatasas ácidas clase A son

enzimas con una amplia variedad de sustratos entre los que se incluyen nucleósidos

monofosfato 3´y 5´, nucleósidos di y trifosfato, hexosas y pentosas fosfato, α y β-

glicerol fosfato, p-nitrofenil fosfato (p-NPP), fenolftalein difosfato (PDP), α-naftil fosfato

y pirofosfato, pero no diésteres, su pH óptimo es de 5.5, son inhibidas por iones F- y

Hg+, no le afecta el EDTA ni la presencia de cationes metálicos, Fosfatasas ácidas

clase B son enzimas homotetraméricas, tienen actividad sobre varios

fosfomonoésteres incluyendo uridin monofosfato p-NPP y α-naftil fosfato pero no sobre

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7

diésteres, son inhibidas por EDTA, Ca++ y por nucleósidos, resisten bajas

concentraciones de SDS y su actividad es estimulada por Mg++.

1.5 Parámetros cinéticos

Hay una serie de factores que se deben de tomar en cuenta cuando se estudia la

cinética de una reacción enzimatica entre los cuáles tenemos:

• Temperatura

• pH

• Efecto de la concentración de sustrato

• Efecto de inhibidores

Se debe establecer las condiciones óptimas en todos los factores para tener el

máximo rendimiento en la actividad enzimática.

1.5.1 Temperatura

La temperatura Influye en toda actividad de las enzimas. Generalmente a

temperaturas muy bajas, la actividad de las enzimas sobre sus sustratos disminuye,

mientras que la elevación de la temperatura aumenta la velocidad de la reacción hasta

un punto en que ocurre su desnaturalización.

1.5.2 pH

La acción catalitica de las enzimas tiene lugar dentro de los limites de pH. Cada

reacción enzimatica posee un pH óptimo, el cual depende de los sustratos

involucrados y de las condiciones de reacción (tiempo, temperatura, concentración de

sustrato, etc.)

Un pH muy alto o muy bajo causará por lo general, una desnaturalización irreversible

de las enzimas.

La influencia del pH sobre la actividad enzimática se puede utilizar para retardar

reacciones enzimáticas o acelerar las deseables, por medio del control del pH del

medio.

1.5.3 Efecto de la concentración de sustrato

La descripción del comportamiento enzimático de la mayoría de las enzimas esta

basada en el modelo de Henry-Michaellis-Menten, el cual describe los cambios en la

velocidad inicial de una reacción enzimática con respecto a la variación de la

concentración del sustrato.

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Para obtener valores más precisos de Vmax y Km se pueden obtener determinando el

inverso de la velocidad inicial y de la concentración del sustrato.

El valor de Km da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato: A menor Km, mayor

afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor Km, menor afinidad.

1.5.4 Efecto de inhibidores

A partir del estudio de los inhibidores de las enzimas se ha obtenido información de la

importancia sobre el mecanismo y camino de la catálisis enzimática, la especificidad

de sustrato de las enzimas, la naturaleza de los grupos funcionales en el centro activo

y la participación de ciertos grupos funcionales en el mantenimiento de la

conformación activa de la molécula de la enzima. La inhibición de algunas enzimas por

metabolitos específicos constituye un elemento importante en la regulación del

metabolismo intermediario.

Los tres tipos principales de inhibición reversible de las enzimas, competitiva,

acompetitiva y no competitiva, pueden distinguirse por los efectos que produce el

inhibidor sobre la cinética de reacción de la enzima, la cual puede analizarse mediante

la ecuación básica de velocidad propuesta por Michaelis-Menten.

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9

2. JUSTIFICACIÓN

La pleuroneumonía contagiosa porcina (PCP), ocasionada por Actinobacillus

pleuropneumonia, es una enfermedad de importancia económica para la industria

porcícola.

Para controlarla hace falta conocer la patógenia y fisiología del microorganismo

causante lo cual nos permitirá modificar el manejo, las condiciones ambientales y los

tratamientos. No se ha reportado la presencia de fosfatasas ácidas en esta bacteria

pero estudios preliminares en nuestro laboratorio nos han permitido definir su

presencia en el periplasma de la misma, por lo que en este trabajo pretendemos

caracterizar la actividad de la enzima.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General:

Caracterización de la actividad de Fosfatasa ácida, a partir de un extracto crudo de

periplasma de Actinobacillus pleuropneumoniae.

3.2 Objetivos Específicos:

� Obtener del extracto crudo.

� Evaluar el efecto de condiciones ambientales (Temperatura, pH)

� Determinar el efecto de inhibidores comunes de este tipo de enzimas ( EDTA,

Fosforo, Molibdato de Sodioy Tartrato de sodio.)

� Determinar constantes cinéticas (Km, Vmax), empleando como sustrato

p–Nitrofenilfosfato.

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SECUENCIA EXPERIMENTAL

Cultivo de toda la noche

(12h , 37ºC)

Obtención de

Células

Extracción de periplasma

Cuantificación de Ensayo de Actividad

Proteínas

Efecto de:

• pH

• Temperatura

• Inhibidores

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METODOLOGÍA

5.1 Cepas y cultivos bacterianos.

Se emplean para este proyecto la cepa Shope de A. pleuropneumoniae serotipo 1

donada por La Dra. Mireya de La Garza Amaya del Laboratorio 52 del Departamento

de Biología Celular del CINVESTAV, A. pleuropneumoniae crece en medio Luria

Bertani con glucosa (LBG) líquido o Infusión Cerebro Corazón (BHI) y la cepa se

mantiene en agar del mismo medio; en cualquier caso el medio es suplementado con

NAD (10 µg/ml). Para todos los ensayos se emplean cultivos de toda la noche (12h,

37ºC) a menos que se especifique lo contrario.

5.2 Lavado de células

Centrifugar el cultivo 5000rpm/30min, recuperar la pastilla y resuspender con

amortiguador (Tris 10mM pH 8.4) y volver a centrifugar 5000rpm/30min, recuperar la

pastilla y resuspender con el regulador.

5.3 Extracción de la enzima a partir de las célula s

A la pastilla resuspendida con (Tris 10mM pH 8.4) adicionar Desoxicolato de Sodio

(0.5%) a una concentración de 1g/L, agitar durante 30min/37ºC/180rpm, después

centrifugar a 5000rpm/15min/25ºC, colectar el sobrenadante libre de células y

almacenar a -25ºC hasta su uso. Siendo este nuestro extracto crudo, debemos medir

actividad y determinar la cantidad de proteínas presentes.

5.4 Determinación de actividad de fosfatasa ácida.

Agregar 450µl de sustrato para fosfatasas p-Nitrofenolfosfato (p- NPP) 7.6 mM en

amortiguador de acetatos 0.2M a pH 5.5 se agregan 50µl de la muestra problema,

incubar a 37ºC durante 4hrs, al terminó de la incubación la reacción se detiene con

1.1ml NaOH 1M, dejar reposar por 15 min. y leer en el espectrofotómetro de longitud

de onda a una absorbancia de 415nm.

Preparar un blanco con 50µl de amortiguador (Tris 10 mM pH 8.4) + 450µl de sustrato

para fosfatasas p-Nitrofenilfosfato (pNPP) 7.6mM y adicionar 1.1ml NaOH 1M.

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5.5 Cuantificación de proteínas

Colocar 150µl de Cloruro de sodio 0.15M + 50µl de muestra problema, adicionar 1.5ml

del reactivo de Bradford y leer a 595 nm.

Preparar un blanco con 200µl de Cloruro de Sodio + 1.5ml del reactivo de Bradford

5.6 Efecto de Temperatura

Colocar 450µl de sustrato para fosfatasas p-Nitrofenolfosfato (pNPP) 7.6 mM en

amortiguador de acetatos 0.2M a pH 5.5, preincubar a la temperatura correspondiente

durante 10 min. agregar 50µl de la muestra problema, incubar a la temperatura

correspondiente durante 2hrs, al termió de la incubación la reacción se detiene con

1.1ml NaOH 1M, dejar reposar por 15 min. y leer en el espectrofotómetro a una

absorbancia de 415 nm.

Preparar un blanco a cada temperatura con 450µl de sustrato para fosfatasas

p-Nitrofenilfosfato (pNPP) 7.6mM, preincubar a la temperatura correspondiente

durante 10 min., agregar 50µl de amortiguador (Tris 10 mM pH 8.4), volver a incubar

durante 2 horas y detener la reacción con 1.1ml de NaOH 1M.

5.7 Efecto de pH

Colocar 450µl de sustrato para fosfatasas p-Nitrofenolfosfato (p-NPP) a diferentes

concentraciones, agregar 50µl de la muestra problema, incubar a 37ºC durante 2hrs,

al terminó de la incubación la reacción se detiene con 1.1ml NaOH 1M, dejar reposar

por 15 min. y leer en el espectrofotómetro a una absorbancia de 415 nm.

Preparar un blanco con 450µl de sustrato para fosfatasas p-Nitrofenilfosfato (p-NPP)

7.6mM, agregar 50µl de amortiguador (Tris 10 mM pH 8.4) y detener la reacción con

1.1ml de NaOH 1M.

5.8 Determinación de Km y Vmax

Agregar 450µl de sustrato para fosfatasas p-Nitrofenolfosfato (p- NPP) a diferentes

concentraciones resuspendidas en amortiguador de acetatos 0.2M a pH 5.5 se

agregan 50µl de la muestra problema, incubar a 37ºC durante 4hrs, al término de la

incubación la reacción se detiene con 1.1ml NaOH 1M, dejar reposar por 15 min. y leer

en el espectrofotómetro a una absorbancia de 415 nm.

13



13

Preparar un blanco con 50µl de amortiguador (Tris 10 mM pH 8.4) + 450µl de sustrato

para fosfatasas p-Nitrofenilfosfato (pNPP) 7.6mM y adicionar 1.1ml NaOH 1M.

5.9 Efecto de inhibidores

Colocar 440µl de sustrato para fosfatasas p-Nitrofenolfosfato (pNPP) 7.6mM en

amortiguador de acetatos 0.2M a pH 5.5, adicionar 10µl del inhibidor, agregar 50µl de

la muestra problema, incubar a 37ºC durante 2hrs, al termino de la incubación la

reacción se detiene con 1.1ml NaOH 1M, dejar reposar por 15 min. y leer en el

espectrofotómetro a una absorbancia de 415 nm.

Preparar un blanco con 450µl de sustrato para fosfatasas p-Nitrofenilfosfato (pNPP)

7.6 mM, preincubar a 37ºC durante 2hrs., agregar 50µl de amortiguador (Tris 10 mM

pH 8.4) y detener la reacción con 1.1ml de NaOH 1M.

14



14

6. RESULTADOS Y DISCUCIÓN

6.1. Cepas y cultivos bacterianos

Se tuvo una serie de problemas para poder mantener la cepa viable, ya que s muy

sensible a la manipulación, esta se mantiene congelada a -25ºC hasta su utilización

puede permanecer viable hasta 6 meses. Este es un microorganismo muy sencible,

por lo cuál se determinó que en cada resiembra se debe realizar con extremas

medidas de esterilidad. No olvidar adicionar el factor NAD y al día siguiente de la

resiembra volver a resembrar un control para corroborar que sea Actinobacillus

pleuropneumoniae, este procedimiento se sigue también al realizar los ensayos de

extracción (medio liquido) para cerciorarse que se este llevando a cabo la extracción

de la enzima deseada del microorganismo.

6.2. Curva Tipo de PNP

En la construcción de la curva tipo de PNP para evaluar la Actividad Enzimática, se

emplearon concentraciones de 50 a 800 nM/ml, en volúmenes de 50µl, utilizando

además como reactivos Regulador de Acetatos 0.2M pH 5.5 e Hidróxido de Sodio 1M.

En la tabla 1 se muestran las Absorbancias obtenidas a una longitud de onda de

415nm

Tabla 1. Absorbancias obtenidas por el Método de determinación de la curva tipo de

PNP para Actividad Enzimática

[ PNP ]

(nM/ml)

Abs

(415 nm)

50 0.0326

100 0.1873

200 0.4496

400 0.8463

600 1.3726

800 1.847

15



15

En la Gráfica 1 se muestra la curva de PNPen el cual se puede observa una

tendencia lineal, con concentraciones de 50 a 800 nM/ml

.

Gráfica 1 .- Curva tipo de pNP realizada como se explica arriba.

6.3. Cuantificación de Proteínas.

Para la cuantificación de proteínas se realizaron pruebas con diferentes métodos

(Lowry, Folin-Ciocalteu y Bradford), para determinar que método sería mas factible.

El método mas factible fue el de Bradford ya que es fácil de trabajar, los reactivos son

estables hasta por 6 meses, es rápido, conocido y común para cuantificar proteínas,

sin embargo se debe tener los cuidados adecuados para que no se contaminen, ya

que este reactivo es muy susceptible a contaminación, las Absorbancias son

mostradas en la tabla 2.

Curva tipo de PNP para Actividad Enzimática

y = 0,0024x - 0,0977R2 = 0,9973

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 200 400 600 800 1000

[p-NP] nM/ml

Abs

(415

nm)

16

DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVID AD DE FOSFATASA ÁCIDA DE Actinobacillus pleuropneumoniae


16

Tabla 2. Absorbancias obtenidas en la cuantificación de proteínas por Bradford.

BSA

(µg/ml)

Abs

(595nm)

20 0.087

40 0.15

60 0.207

80 0.262

100 0.305

En la Gráfica 2, se muestra la Curva tipo para cuantificación de proteínas.

Gráfica 2 . Curva tipo para cuantificar proteínas (Bradford).

Se realizó una curva tipo para la cuantificación de proteínas donde se utilizó como

proteína patrón Albúmina Sérica Bovina (BSA) ya que ésta es la mas común para este

tipo de ensayos, se utilizaron concentraciones de 0 a 50µg/ml y se completa el

volumen correspondiente con NaCl 0.15M de 150 a 200µg/ml, por último se le agrega

el reactivo de Bradford. Las Absorbancias se leen en el espectrofotómetro a una

longitud de onda de 595nm.

Curva tipo Bradford

y = 0,0027x + 0,0378R2 = 0,9956

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

10 20 30 40 50

Β Σ Α[µΒ Σ Α[µΒ Σ Α[µΒ Σ Α[µg/ml]

Abs

(59

5 nm

)

17



17

6.4. Actividad Enzimática y concentración de proteí nas

Para realizar la actividad enzimática se trabajó con el método ya mencionado, se

realizaron 2 ensayos empleando diferentes condiciones de obtención del extracto, una

a 180rpm y la otra a 220rpm durante 30 minutos; esto se hizo para determinar en cual

se mostraba mayor actividad enzimática y se pudo observar que al haber una mayor

agitación obtenemos una mayor actividad, del mismo modo se determinó la

concentración de proteínas para conocer la cantidad de proteínas presentes en las

muestras, las Absorbancias obtenidas se muestran en la tabla 3 ya que son

superiores y no entran entre los límites de la curva tipo, se tuvo que hacer una

dilución de la enzima para que entraran en los rangos de la curva.

Tabla 3 . Actividad enzimática y concentración de proteína a partir de los extractos

periplásmicos obtenidos.

M1

(180rpm)

M2

(180rpm)

M1

(220rpm)

M2

(220rpm)

Actividad

(As) 1.241 1.299 1.459 1.450

[Proteína] 0.593 0.596 0.585 0.595

Del mismo modo se realizó el ensayo pero se disminuyó el tiempo de incubación, se

realizó a 2 hrs. ya que se obtiene una actividad adecuada, se puede obtener en

menor tiempo y se ajustan a la curva tipo, las absorbancias se muestran en la tabla 4.

Tabla 4. Actividad enzimática durante 2hrs.

M1

(180rpm)

M2

(220rpm)

Actividad

(As) 1.241 1.454

Con este ensayo tomamos la decisión de ajustar nuestro extracto para que al realizar

nuestros siguientes experimentos todos fueran realizados con 2.5 Unidades de Enzima

con un tiempo de reacción de 2hrs.

18



18

Se definen las unidades de enzima, como la cantidad de enzima necesaria para

generar un 1nm / min.

6.5. Efecto de Temperatura

El punto óptimo de temperatura esta definido cuando la enzima presenta el máximo de

actividad. A temperaturas bajas, las enzimas se encuentran "muy rígidas" los

reacomodos e interacciones moleculares están limitados. En general se ha

determinado que los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por

cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones

catalizadas por enzimas siguen esta ley general, por el contrario cuando se supera un

determinado valor de temperatura, generalmente mayor de 60ºC, la actividad cae

bruscamente porque dada su naturaleza química, las enzimas tienden a

desnaturalizarse.

Se realizó el ensayo para determinar la temperatura óptima, se probaron 6

temperaturas, que se muestran en la tabla 5 con la cantidad de unidades de enzimas.

Los ensayos se realizaron empleando 2.5 Unidades de enzima y la reacción ocurrió

durante 2hrs, a las temperaturas indicadas en el sistema ya señalado.

Tabla 5. Efecto de temperatura:

Temperatura

(ºC)

Unidad de Enzima

(nM/ml)

4 0.66

25 1.35

30 1.77

37 2.19

50 0.74

60 0.44

19



19

Gráfica 3 . Curva de Efecto de temperatura.

En la gráfica se puede observar el comportamiento de la actividad enzimática a

diferentes temperaturas, se observa claramente que nuestra enzima tiene mayor

actividad conforme aumenta la temperatura, observando un ascenso mas pronunciado

al superar los 25ºC, alcanzando su máxima velocidad a los 37ºC, iniciando un

descenso brusco en su actividad, la gráfica nos muestra que desde los 40ºC la enzima

ha empezado a disminuir su actividad.

El comportamiento de la enzima, refleja lo que la bibliografía indica en relación al

efecto de la temperatura, una variación importante es que para nuestra enzima la

inactivación empieza inmediatamente al sobrepasar los 40ºC, mientras que para otras

enzimas la inactivación ocurre al superar los 50ºC, esto es, nuestra enzima es mas

sensible a la temperatura, lo que podría ser relevante en el proceso de la enfermedad.

La aparente temperatura óptima de 37ºC es, por tanto, la resultante de 2 procesos:

1)El incremento habitual de la velocidad de reacción con la temperatura, 2) y el

incremento a la velocidad de desnaturalización térmica de la enzima al sobrepasar una

temperatura critica.

Temperatura óptima

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60

T (ºC)

Uez

(mM

/ml)

20



20

6.5.1. Temperatura de inactivación.

Para conocer sobre la sensibilidad de nuestra enzima a temperaturas superiores

realizamos ensayos de inactivación de la enzima calentando nuestro extracto

enzimático durante 10min a diferentes temperaturas y provándolo posteriormente en

ensayo de actividad, la tabla 6 muestra los resultados obtenidos

Tabla 6.Temperatura de inactivación. Se calentaron en Baño Maria extractos

enzimáticos durante 10min,

Temperatura

(ºC)

Unidad de Enzima

(nM/ml)

60 0.46

70 0.48

80 0.46

92 0.48

De estos resultados podemos decir que nuestra enzima no soporta 10 min de

calentamiento a esas temperaturas. Sin embargo como se muestra en la gráfica 3 el

declive en la actividad inicia desde aproximadamente los 40ºC, se repitió el

experimento de inactivación aplicando temperaturas mas bajas, los resultados se

muestran en la tabla 7 y la gráfica 4.

Tabla 7 Temperatura de inactivación.

Temperatura

(ºC)

Unidad de Enzima

(nM/ml)

38 1.29

40 1.28

42 1.10

44 0.82

46 0.66

48 0.45

Se inactivó como en el experimento anterior en Baño Maria durante 10minutos.

21



21

Gráfica 4 . Temperatura de inactivación.

En la gráfica mostrada, el extracto enzimatico se calentó durante 10 minutos y se

ensayó actividad enzimática.

Realizamos ensayos de inactivación con temperaturas que van de 38 a 48ºC, y la

actividad se desarrolló a 37ºC, se observa un claro decrecimiento en la actividad de la

enzima el cual aparentemente es irreversible si consideramos que a 37ºC de acuerdo

a lo observado en la gráfica 3, 37ºC es la temperatura óptima. Esto puede ser debido a

que cuando la enzima se somete a calentamiento, esta inicia un proceso de

desnaturalización al parecer irreversible, la inconcordancia que se observa entre las

gráficas 3 y 4 podría ser explicada si consideramos que cuando una enzima esta en

presencia de su sustrato es mas resistente a los cambios ambientales, mientras que

cuando el cambio ambiental ocurre en ausencia de su sustrato el efecto sobre ella es

mas notorio observándose aquí como un fenómeno de desnaturalización irreversible.

Temperatura de Inactivación

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

38 40 42 44 46 48

T (ºC)

Uez

(nM

/ml)

22



22

6.6 Efecto de pH.

La mayoría de las enzimas poseen un pH característico en el cual su actividad es

máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye, aunque los

perfiles de las curvas de la actividad en función del pH de muchas enzimas son

acampanados. Para observar como afecta el pH a la actividad enzimática realizamos

ensayos de actividad en condiciones de pH diferentes. Los resultados obtenidos se

muestran en la tabla 8 y en la gráfica es la número 5, se muestran a continuación.

Los ensayos se realizaron con 2.5 Unidades de Enzima y la actividad procedió durante 2 hrs..

Tabla 8.- Efecto de pH

pH Unidad de Enzima

(nM/ml) 4.5 0.813 5 1.64

5.5 1.73 6 1.73

6.5 1.15 7 0.80

7.5 1.015 8 1.031

8.5 0.855 9 0.82

23



23

Gráfica 5 Efecto de pH, se realizó como se indica arriba. En la gráfica se observa la presencia de 2 picos de actividad a pH ácido entre 5 y 6 lo

que muestra que nuestra enzima tiene límites de pH óptimo no muy estrechos,

mientras que en el lado alcalino se observa actividad entre pH 7.5 y 8, esto nos indica

que tenemos la presencia de más de una fosfatasa, sin embargo nuestro extracto está

enriquecido en fosfatasas ácidas.

6.7. Determinación de K m y Vmax

Para la determinación de Km y Vmax se representa una gráfica de la ecuación de

Michaelis-Menten, esta es una hipérbola, como se observa en la (Gráfica 6). La Vmax

corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la Km corresponde

a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la

Vmax.

En la Tabla 9 se muestran las diferentes concentraciones manejadas de p-NPP y la

cantidad de Unidad de enzimas.

pH óptimo

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

4 5 6 7 8 9

pH

Uez

(nM

/ml)

24



24

Tabla 9 .- Ecuación de Michaelis-Menten

p-NPP (mM)

Unidad de Enzima (mM/ml)

0.25 0.45 0.5 0.73 1 1.05 2 1.39 3 1.62 4 1.92 5 1.98 6 2.18 7 2.18

Gráfica 6 .- Representación Gráfica de la Ecuación de Michaelis-Menten

Podemos observar en la gráfica 6 que a concentraciones altas de sustrato, produce

un aumento rápido de la velocidad de la reacción y por lo tanto la velocidad va

alcanzar un máximo, pero debemos de considerar, que si se sigue aumentando la

concentración de sustrato, no cambia la velocidad de reacción ya que los centros

activos de la enzima se encuentran saturados.

Para determinar gráficamente los valores de Km y Vmax es más sencillo utilizar la

representación de doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta.

Esta representación de doble recíproca recibe el nombre de representación de

Lineweaver-Burk (Gráfica 7).

Michaelis-Menten

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

p-NPP(mM)

Uez

(m

M/m

l)

25 25



25

En la Tabla 10 se muestran los resultados obtenidos del inverso de la ecuación de

Michaelis–Menten.

Tabla 10 .- Ecuación de Lineaweaver-Burk

1 / pNPP (mM) 1 / Unidad de Enzima 4 2.20 2 1.37 1 0.94

0.5 0.71 0.33 0.61 0.25 0.52 0.2 0.50

0.167 0.45 0.143 0.45

Grafica 7. Representación grafica de la ecuación de Lineaweavwer/Burk

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente,

los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

La pendiente es KM/Vmax

La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM

La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax

Lineaweaver-Burk

y = 0.4505x + 0.4366

R2 = 0.9939

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 1 2 3 4 5

1/[pNPP]

1/U

Ez

26



26

Determinar Vmax y Km

Km/Vmax = 0.4505 Km = Vmax (Km/Vmax)

1/Vmax = 0.4366 Km = 2.29 (0.4505) = 1.031 mM

Vmax = 2.29 mM/ml

27



27

6.8 Efecto de inhibidores

Diversas sustancias tiene la facultad de disminuir o anular la actividad biológica de las

enzimas estas sustancias se conocen como inhibidores, la acción de los inhibidores

ocurre por diferentes mecanismos, provocando la desnaturalización de la proteína,

uniéndose al sitio activo, o capturando algún elemento esencial para la actividad de la

enzima. Para las fosfatasas se han identificado diferentes inhibidores específicos,

entre los cuales tenemos al Molibdato, Tartrato y Vanadato. Existen otros que son

inhibidores generales para diversas enzimas.

6.8.1 Efecto de EDTA

Se determino el efecto del EDTA sobre la actividad de la enzima para ello se

ensayaron diferentes concentraciones de del inhibidor las concentraciones probadas

se encuentran en la taba 11 y los resultados obtenidos se muestran en la misma tabla

y en la grafica 8.

Los ensayos se realizaron empleando 2.5 Unidades de enzima y la reacción ocurrió

durante 2hrs.

Tabla 11. EDTA

EDTA

(mM) % Actividad

Control 100

1 99.8

5 94.7

10 76.9

15 46

20 36.6

40 28

60 22.4

28



28

Gráfica 8. EDTA

El EDTA es un agente quelante que se une reversiblemente al Mg2+ y otros cationes

divalentes, inhibiendo a algunas enzimas que precisan de tales iones para su

actividad. En la gráfica se observa que el EDTA disminuye la actividad de la enzima,

conforme se aumenta la concentración del mismo se puede ver que la actividad

disminuye en un 50% con aproximadamente 15mM de EDTA. El resultado nos indica

que la enzima requiere la presencia de algún Ion metálico muy probablemente el

magnesio aunque se reporta en la bibliografía que diversas fosfatasas requieren

algunos otros iones como podría ser el caso de zinc, mismo que también es un Ion

divalente.

EDTA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 5 10 15 20 40 60

EDTA (mM)

% A

ctiv

idad

29



29

6.8.2. Efecto de Fósforo.

Para determinar si la enzima es susceptible a inhibición por retroalimentación por

producto probamos el efecto que tendria el fosforo sobre la actividad de la enzima los

resultados se muestran en la tabla 12 y grafica 9.

Tabla 12. Fósforo

Fósforo

(mM) % Actividad

Control 100

10 98.

20 95.8

40 68.8

60 42.5

80 37.8

100 17.7

Gráfica 9 Fósforo

Fósforo

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 40 60 80 100

P(mM)

% A

ctiv

idad

30



30

En la gráfica podemos observar que la enzima es inhibida por el Fósforo cuando se

presenta en concentraciones superiores a los 20 mM, se observa que a

concentraciones inferiores la enzima prácticamente no se ve afectada en su actividad

6.8.3 Efecto de Molibdato de sodio y Tartrato de so dio.

Al igual que el Vanadato, el Molibdato y el tartrato son sustancias que se consideran

inhibidores comunes de las fosfatasas para observar el comportamiento de nuestra

enzima en presencia de Molibdato y tartarto, realizamos el experimento probando

diferentes concentraciones de las sustancias los resultados obtenidos se muestran en

las tablas 13 y grafica 10. (para el molibdato) y tabla 14 y grafica 11 (para el tartrato)

Tabla 13. Molibdato de Sodio

Molibdato de Sodio

(mM) % Actividad

Control 100

1 94.97

5 91.5

10 90.9

25 89.4

50 84.7

100 80.1

Gráfica 10 Molibdato de Sodio

Molibdato de Sodio

0

20

40

60

80

100

0 1 5 10 25 50 100

Molibdato (mM)

% A

ctiv

idad

31



31

En la gráfica 10 se puede observar que el Molibdato de Sodio presenta una tendencia

inhibitoria, la cual no es muy marcada si consideramos las concentraciones utilizadas,

ya que para las fosfatasas sensibles las concentraciones inhibitorias estan en el. orden

de microgramos entonces podemos decir que nuestra enzima es resistente al

Molibdato de sodio.

Tabla 14. Tartrato de Sodio

Tartrato de Sodio

(mM) % Actividad

Control 100

20 98.9

40 103.6

60 99.9

80 102.4

100 101.1

Gráfica 11 Tartrato de Sodio

Similar al comportamiento con el olibdato, nuestra enzima se muestra resistente a la

acci’on el tartrato, en este caso no se observa ni siquiera una tendencia inhibitoria, el

ensayo nos dice ademas que muy posiblemente nuestra enzima tenga un peso

molecular bajo en virtud que de acuerdo a la bibliografía muchas fosfatasas acidas

Tartrato de Sodio

0102030405060708090

100

0 20 40 60 80 100

Tartrato de Sodio (mM)

% A

ctiv

idad

32



32

resistentes tartrato son de bajo peso molecular inferior a 40 kDa, esto es reforzado

dado que en estudios preliminares se han obtenido datos en ese sentido, que la

enzima en cuestión tiene un peso molecular de alrededor de 40kDa.

33



33

7. CONCLUSIONES

o De acuerdo ala manipulación que se tuvo con el Actinobacillus

pleuropneumoniae, podemos decir que es una bacteria muy sensible, es por

eso que se recomienda que se debe de resembrar cada 10 días.

o La temperatura óptima para la actividad de la enzima fue de 37ºC.

o Al someter la enzima a 10 minutos de calentamiento a 38ºC inicia un proceso

de desnaturalización, la cual alcanza su máximo al calentar a 48 ºC.

o Para la determinación del pH optimo se encontró que este ocurre entre 5 a 6.

o Los valores obtenidos de Vmax= 2.29 mM/ml y se pudo obtener la Km=

1.031mM

o La enzima requiere algún ión metálico.

o La enzima no fue sensible a Tartrato y muy poco sensible a Molibdato

o La enzima es sensible a la inhibición por retroalimentación.

8. PERSPECTIVAS PARA TRABAJO A FUTURO

• Determinar si la molécula tiene un papel esencial en el metabolismo de la

bacteria.

• Determinar la funcionalidad de la enzima en la bacteria

• Realizar estudios de patogenicidad de la enzima en la bacteria.

34



34

9. BIBLIOGRAFIA

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10. Salvano M. A. Y Doménech C. E. (1999) Kinetic properties of purified

Pseudomonas aeruginosa phosphorylcholine phosphatase indicated that this

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11. www.arrakis.es/~lluengo/enzimas.html (Noviembre, 2005)

12. www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ1.htm (Noviembre, 2005)

13. www.e-histologia.unileon.es/1inicio/home/tecnicas.htm (Agosto,2005)

14. www.forest.ula.ve/~rubenhg/enzimas/ ( Septiembre,2005)

15. www.inegi.gob.mx/estadistica/español/economia/biosa/bio 11.htm (Mayo,2005)

16. www.inegi.gob.mx/estadistica/español/economia/biosa/bio 04.html (Mayo,2005)

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18.www.tdx.cesca.es/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX-1222103-

154458/amm1de1.pdf (Enero, 2006)

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ANEXO 1 REACTIVOS

Preparación de medio de cultivo

• Agar infusión cerebro corazón (BHI)

52g de agar infusión cerebro corazón, 1000ml de agua destilada.

• Caldo de Infusión de Cerebro y corazón (BHI)

INGREDIENTE CANTIDAD

Infusión de cerebro de

ternera

200 g

Infusión de corazón de res 250 g

Peptona de gelatina 10 g

Cloruro de sodio 5 g

Fosfato disodico 2.5 g

Dextrosa 2 g

pH final= 7.4 +(-) 0.2

Disolver 37g de polvo en un litro de agua destilada. Si es necesario calentar

suavemente para disolverlo.

Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos, para obtener buenos resultados el

medio debe utilizarse el mismo día de su preparación.

• Agar Luria Bertani (LB)

15g de Agar bacteriológico, 1000ml de agua destilada.

• Caldo Luria bertani (LB)

Para 1000ml de medio de cultivo

INGREDIENTE CANTIDAD

Peptona Biotriptasa 10g

Extracto de Levadura 5g

Cloruro de Sodio 5g

Glucosa 5g

Agregar 900ml de agua destilada y ajustar pH entre 7 y 7.4, se recomienda que se

deje a un pH 7.2, una vez ajustado el pH aforar con agua destilada a 1000ml

• Nicotin adenosin dinucleotido (NAD)

Preparar una solución de NAD de 10mg/ml, una vez preparado el reactivo se esteriliza

por medio de filtración y se almacena A 4ºC hasta su uso.

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Reactivos para actividad enzimática

• p-Nitrofenil (1mg/ml)

1mg de p-nitrofenil, en 1ml de agua destilada.

Para realizar una dilución 1:10 tomar 0.1ml de p-Nitrofenil en 0.9 ml de regulador de

acetato 0.2M pH 5.5

• p-Nitrofenilfosfato 5mM

1855.5g de p-Nitrofenilfosfato en 1000ml de regulador de acetatos 0.2M pH 5.5

• p-Nitofenilfosfato 7.6mM

2.82g de p-NPP, 1000ml de regulador de acetatos 0.2M pH 5.5

• Hidróxido de Sodio (NaOH) 1M

40 g de NaOH, aforar en 1000ml con agua destilada.

• Desoxicolato de Sodio a 0.5%

0.5g de Desoxicolato de Sodio, 100ml de amortiguador Tris 10 mM pH 8.4

• Regulador de acetato de Sodio 0.2M pH 5.5

16.408g de Acetato de Sodio, 1000ml de agua destilada.

Ajustar el pH a 5.5

• Tris 10mM pH 8.4

1.2114g de Tris, 1000ml de Agua desionizada.

Ajustar pH a 8.4

Reactivos para el Método de Bradford

• Preparación de NaCl 0.15M

0.8766g de Cloruro de sodio, 100ml de agua desionizada

almacenar a 4ºC hasta su uso

• Preparación de Albúmina Sérica Bovina (BSA) 1mg/ml

10mg de BSA, 10ml de NaCl 0.15M, aforar a 100ml.

Esta solución se prepara en el momento que se va a utilizar

Reactivos de efecto de pH

• Ácido citrico 0.05M

0.96g de ácido citrico , 100ml de agua destilada.

• Citrato de Sodio 0.05M

1.31g de Citrato de Sodio, 100ml de agua destilada.

Reactivos para la determinación de constantes cinét icas


0.03711g de p-NPP, 10ml de regulador de acetato 0.2M pH 5.5


0.0222g de p-NPP, 10ml de regulador de acetato 0.2M pH 5.5 38



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Reactivos para la determinación de inhibidores

• Solución tipo Fosforo 5M

6.8g de K2HPO4 , 10ml de agua desionizada.

• EDTA 1mM

0.0018g de EDTA, 5ml de agua desionizada

• EDTA 5mM


• EDTA 10mM


• EDTA 15mM


• EDTA 20mM


• EDTA 40mM


• EDTA 1M


• Molibdato de Sodio 1mM

0.0012g de Molibdato de Sodio, 5ml de agua desionizada







• Molibdato de Sodio 50mM 39



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• Tartrato de Sodio 20mM










Anexo 2 Técnicas

• Metodo de congelación

Utiliza Glicerol 60% estéril

Se mezcla el cultivo nuevo con el glicerol 1:1, se mete a congelar y se va resembrando

el 1ro en 15 días y los siguientes después de cada semana así se ve cuál es la

resistencia de la bacteria y su resistencia ideal.

• Reactivo de Bradford

Azul de Coomassie G-250

Etanol 95%

Ácido Fosforito (H3PO4) 85%

Disolver 100mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50ml de etanol al 95% a esta

solución se le agrega 100ml de Ácido Fosforito al 85% y aforar con agua destilada a

1Litro.

Agitar durante toda la noche y filtrar la solución con papel Whatman, guardar el

reactivo a 4ºC hasta su uso.

El reactivo se mantiene estable hasta por 6 meses.

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determinaciÓn de parÁmetros cinÉticos de la actividad de …

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