determinaciÓn de la topologÍa de la isoforma v2b del
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Profesor Patrocinante Dr. Carlos B. González Instituto de Fisiología Facultad de Medicina
DETERMINACIÓN DE LA TOPOLOGÍA DE LA ISOFORMA V2b DEL RECEPTOR DE VASOPRESINA.
Tesis de Grado presentada como parte Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico
ALEXIS ENRIQUE GONZÁLEZ CÁRDENAS
VALDIVIA - CHILE 2010
Dedico esta tesis a mi familia.
Agradecimientos.
Quiero agradecer a mi profesor patrocinante Dr. Carlos González, por haber permitido
realizar mi tesis en su laboratorio y por la confianza entregada en mí durante su realización.
También quiero expresar mis agradecimientos al Dr. José Sarmiento por guiarme en mis
comienzos en el trabajo que se realiza en el laboratorio. Así como también a Carolina Villanueva,
Profesor Carlos Reyes, Pamela Carmona, Cesar Trigo, Marianne Brennet, Mauricio Borquez y
Dewis Saez y a cada una de las personas que me acompañaron, me ofrecieron su confianza y
apoyo durante este tiempo.
Quiero agradecer a mi padre Héctor y a mi madre Orieta por haberme entregado su entera
confianza y libertad de elegir lo que yo quiero y por darme siempre el apoyo que necesito.
También a mi hermano Felipe, mi tía Yovana y mis abuelos Mario y Edda, quienes, junto a mis
padres, me han enseñado el camino para ser una buena persona.
Este trabajo fue realizado en el Instituto de Fisiología de la Facultad de Medicina de la
Universidad Austral de Chile y financiado por el proyecto Fondecyt 1060158.
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Página
1. Resumen 1
1.1. Summary 2
2. Introducción 3
3. Materiales y Métodos 11
3.1. Materiales 11
3.1.1. Reactivos 11
3.1.2. Anticuerpos 13
3.1.3. Equipos 13
3.1.4. Programas 14
3.2. Métodos 15
3.2.1. Generación de mutantes puntuales del receptor V2a y la isoforma V2b,
fusionadas a proteína fluorescente.
15
3.2.1.1. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 15
3.2.1.2. Electroforesis de DNA en geles de agarosa. 19
3.2.1.3. Purificación de productos de amplificación obtenidos por PCR y digestión
con endonucleasas de restricción.
19
3.2.1.4. Clonamiento de productos de amplificación en vectores pECFP-N1 y
pEYFP-N1.
20
3.2.1.5. Reacción de Ligación. 21
3.2.1.6. Transformación de células competentes 21
ii
3.2.1.7. Purificación del DNA plasmidial a pequeña escala 22
3.2.1.8. Purificación del DNA plasmidial a mediana escala 23
3.2.1.9. Cuantificación de DNA plasmidial y fragmentos de DNA 24
3.2.2. Expresión y detección por Western blot del receptor V2a de
vasopresina, la isoforma V2b y de las mutantes puntuales, generadas
como proteína de fusión a proteína fluorescente (YFP).
25
3.2.2.1. Cultivo celular 25
3.2.2.2. Transfecciones pasajeras 25
3.2.2.3. Extracción de proteínas 26
3.2.2.4. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes
(SDS-PAGE)
27
3.2.2.5. Inmunodetección por Western blotting 27
3.2.2.6. Tratamiento con tunicamicina 28
3.2.3. Estudio de la topología del extremo carboxilo terminal de V2b y la
relación de esta con su distribución subcelular en las etapas temprana
de la vía secretora, mediante ensayos de accesibilidad de anticuerpos a
epítopes en células semipermeabilizadas con digitonina.
29
3.2.3.1. Ensayos de Inmunofluorescencia Indirecta en células semipermeabilizadas
con digitonina.
29
3.2.3.2. Microscopía 31
3.2.3.2.1.
3.2.3.2.2
Microscopía de Epifluorescencia
Microscopía Confocal
31
31
iii
3.2.3.3.
3.2.3.4.
4.
Análisis de Imágenes
Co-localización
Resultados.
34
34
35
4.1. Generación de mutantes puntuales de las isoformas V2a y V2b. 35
4.2. Tratamiento con tunicamicina de las isoformas V2b-YFP, V2a-YFP y de
las mutantes V2aN22QN185QNXT-YFP y V2bN22QN185QNXT-YFP
expresadas de forma heteróloga en el modelo celular COS-7.
40
4.3. Determinación de la orientación del extremo carboxilo terminal de V2b
mediante ensayos de accesibilidad de anticuerpos a epítopes en células
semipermeabilizadas con digitonina.
48
4.4. Inmunocolocalización de la proteína de fusión V2b-CFP con el marcador
de Golgi 58K, en células COS-7 semipermeabilizadas con digitonina.
53
4.5. Predicción de la topología de la isoforma V2b. 55
5. Discusión. 59
6. Conclusiones 68
7. Bibliografía 69
iv
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1: Configuración de los caminos ópticos, utilizados en el microscopio
confocal para los fluoróforos (A.) CFP, YFP y (B.) Alexa 488, Alexa
633.
32
Figura 2:
Liberación de los insertos V2aN22QN185QNXT y
V2bN22QN185QNXT generados como proteína de fusión a proteína
fluorescente.
37
Figura 3: Secuencias aminoacídicas y predicción de N-glicosilación de las
mutantes diseñada como proteínas de fusión a YFP, (A.)
V2bN22QN185Q NXT-YFP; (B.) V2a N22QN185Q NXT-YFP.
38
Figura 4: Inmunodetección de las isoformas V2a, V2b y de las mutantes
V2aN22QN185QNXT y V2bN22QN185QNXT generadas como
proteína de fusión a YFP, después del tratamiento con tunicamcina.
41
Figura 5: Representación gráfica de la topología de las dos especies moleculares
deducidas del análisis de N-glicosilación de V2bN22QN185QNXT-YFP.
43
Figura 6: Inmunodetección de las construcciones V2a 242 tail NXT y V2b 242 tail
NXT generadas como proteína de fusión a YFP, después del tratamiento
con tunicamicina.
46
Figura 7: Representación gráfica de la topología de las construcciones (A.) V2b
242 tail NXT-YFP y (B.)V2a 242 tail NXT-YFP.
47
v
Figura 8:
(A.)Determinación de la topología del extremo carboxilo terminal de
V2b mediante ensayos de accesibilidad de anticuerpos a epítopes. (B.)
Determinación de la topología de la isoforma V2a mediante ensayos de
accesibilidad de anticuerpos a epítopes
50
Figura 9:
Figura 10:
Inmunocolocalización del extremo carboxilo terminal de V2bCFP con el
marcador de Aparato de Golgi, 58K, en células COS-7
semipermeabilizadas con digitonina.
Comparación de la topología de V2b obtenida por medio de diferentes
predictores. (A.) Algoritmo de Kyte-Doolittle. (B.) Predicción de la
topología de V2a y V2b mediante el servidor TMHMM v2.0. (C.)
Método de predicción MemBrain. (D.) Predicción de los dominios de
TM de las isoformas V2a y V2b mediante el método OCTOPUS.
54
56
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
ADH
AQ2
AVP
Hormona Antidiurética
Aquaporina 2
Hormona arginina vasopresina
AMPc
CCDS
Adenosina monofosfato cíclico
Consensus Coding Sequence
CFP
CNS
Proteína Cian Fluorescente
Sistema Nervioso Central
COS-7 Línea celular derivada de riñón de mono verde africano.
DAG Diacilglicerol
DMSO Dimetilsulfóxido
EtBr Bromuro de etidio
GFP
GPCR
Proteína verde fluorescente
Receptores acoplados a proteína G
HA
HEPES
IFI
IUPHAR
LB
NCBI
Epítope de hemaglutinina
ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico
Inmunofluorescencia Indirecta
Unión Internacional de Farmacología Clínica y Básica.
Medio de cultivo Luria-Bertani
Centro Nacional de Información Biotecnológica
NEM
OCTOPUS
N-Etilmaleimida
Obtainer of correct topologies for uncharacterized sequences
vii
ORFs
OST
Open Reading Frame (Marco de Lectura Abierto)
Oligosacariltransferasa
PBS Tampón fosfato salino
PCR
PFA
Reacción en cadena de la polimerasa
Paraformaldehído
PKA Proteína quinasa A
PMSF
RE
RIPA
Fenilmetilsulfonil fluoruro
Retículo Endoplásmico
Radioinmuno precipitation assay Buffer
RT-PCR Reacción de la Cadena de Polimerasa en Transcripción Reversa
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes
snRNPs Ribonucleoproteínas pequeñas nucleares.
TMHMM
TM
TransMembrane prediction using Hidden Markov Models
Transmembrana
V1a Receptor V1a de vasopresina
V1b Receptor V1b de vasopresina
V2a Receptor V2 de vasopresina
V2b Isoforma corta del receptor V2 de vasopresina
YFP Proteína Amarilla Fluorescente.
WB Western blot
viii
1
1. Resumen
La isoforma V2b se genera por empalme alternativo del gen de V2 con la pérdida de 76
nucleótidos que codifican para la parte C-terminal, incluyendo el VII dominio de transmembrana.
Como resultado V2b posee una secuencia más corta y completamente distinta a partir del tercer
asa extracelular. A partir de esto se planteó determinar la topología de la isoforma V2b del
receptor de vasopresina.
Se determinó la orientación del extremo C-terminal del V2b mediante la N-glicosilación
de una secuencia consenso Asn-X-Thr, incorporada después del último residuo del receptor, el
cual se continúa con YFP. Células que expresan esta construcción fueron tratadas con
tunicamicina y luego se realizó Western blotting. Se llevaron a cabo también ensayos de acceso
de anticuerpos a epítopes en células semipermeabilizadas con digitonina para definir la
orientación del extremo C-terminal de la isoforma V2b en compartimentos intracelulares.
El tratamiento con tunicamicina mostró que al menos la mitad de la isoforma V2b
contenía un séptimo dominio de transmembrana mientras que la otra mitad solo tendría 6
dominios de transmembrana. Los resultados fueron corroborados por la accesibilidad de
anticuerpo dirigido contra un epítope localizado en el extremo carboxilo terminal de V2b (CFP),
en células permeabilizadas con digitonina, indicando que la cola carboxiterminal esta orientada
hacia el citosol mientras que el epítope localizado en el amino terminal de V2b (HA) y que está
orientado hacia el lumen vesicular no fue accesible para su respectivo anticuerpo.
Por último se realizó una co-localización, en células semipermeabilizadas con digitonina,
entre la IFI contra CFP, epítope localizado al extremo carboxilo terminal de V2b, y el marcador
de Golgi 58K. Estos resultados indicaron que el isómero topológico del V2b que orienta su
extremo carboxilo terminal hacia el citosol es la que se co-localiza con el aparato de Golgi.
2
1.1 Summary
V2b isoform, is generated by an alternative splicing at a site 76 bp downstream of the V2
receptor splice site, resulting in a frameshift in the 3’ –end coding region. Thus, the downstream
sequence of the splice variant encodes a distinct amino acid sequences from the seventh TM
domain to the C terminus of the V2 receptor. The specific objective of this work was determinate
the V2b topology.
The transmembrane orientation of the C-terminus of V2b was determinated through the
N-glycosylation of a consensus sequence, Asn-X-Thr, that was incorporated after the last amino
acid protein. This construct was fused to the N-terminal of YFP. Cells expressing this construct
were treated with tunicamycin and then performed Western blotting. It also was performed assays
using antibody accessing to epitopes, in cells permeabilized with digitonin to define the
orientation of the C-terminus of V2b, in intracellular compartments.
Treatment with tunicamycin showed that, at least, half of the V2b isoform contained a
seventh transmembrane domain while the other half only has six transmembrane domains. The
results were confirmed by the accessibility of an antibody directed against an epitope located in
the carboxy terminus of V2b (CFP), in cells permeabilized with digitonin, indicating that the C-
terminus is oriented toward the cytosol, while the epitope located in the amino terminal of V2b
(HA), and that it is oriented toward the ER lumen and therefore, it is not accessible for its
respective antibody. Finally, was performed a co-localization study in cells permeabilized with
digitonin, between the IF using antibodies against the epitope CFP, located in the carboxy
terminus of V2b, and the 58K Golgi marker. These results showed that the topological isomer of
V2b that it is oriented with its carboxy terminus to the cytosol reached the Golgi apparatus.
3
2. Introducción.
Vasopresina es un nonapéptido cíclico sintetizado en los núcleos supraópticos y
paraventriculares del hipotálamo, siendo liberada a la sangre a nivel del lóbulo neural de la
hipófisis. En la mayoría de los mamíferos presenta el residuo arginina en posición 8 y por esta
razón se le denomina arginina vasopresina (AVP) (Ferguson y Héller, 1965). AVP u hormona
antidiurética (ADH), a nivel periférico participa en la inhibición de la diuresis (Klussmann y col.,
2000), contracción de la musculatura lisa vascular (Nemenoff, 1998), agregación de plaquetas
(Inaba y col., 1988) y liberación de adrenocorticotrofina (Liu y col., 1994). Por otro lado, a nivel
del sistema nervioso central (CNS), AVP facilita el flujo de agua dependiente de actividad
neuronal (Niermann y col., 2001), determina diferencias en el comportamiento social de
mamíferos (Lim y col., 2004) y modula funciones cognitivas como el aprendizaje y memoria (De
Wied y col., 1988; Reijmers y col., 1998).
Estos efectos son mediados por la unión de AVP a receptores de superficie celular
pertenecientes a la superfamilia de receptores de siete dominios transmembrana (TM) acoplados
a proteína G (GPCR). Los segmentos de TM de esta superfamilia de proteínas intrínsecas de
membrana se caracterizan por estar organizados en alfa hélices hidrofóbicas, conectados por tres
bucles intracelulares y tres bucles extracelulares. Estas proteínas presentan el extremo N-terminal
orientado hacia el extracelular y el extremo C-terminal orientado hacia el citoplasma celular.
Recientemente se ha demostrado que numerosos miembros de esta superfamilia poseen la
capacidad de formar homoligómeros, así como también heteroligómeros entre si (Steven y col.,
2005).
4
A la fecha se han identificado para AVP tres isoformas de GPCRs, las cuales se
denominan receptores V1, V2 y V3. Estas isoformas son codificadas por genes distintos, poseen
perfiles farmacológicos característicos y se expresan mayoritariamente en hígado, riñón e
hipófisis respectivamente (Morel y col., 1992; Lolait y col., 1992; Saito y col., 1995; Thibonnier
y col., 2001).
Una de las principales funciones de AVP es controlar el balance electrolítico. Para ello, es
liberada al torrente sanguíneo en respuesta a cambios en la osmolaridad sérica, actuando a nivel
de túbulo colector en el riñón. En este lugar, inhibe la diuresis, lo cual es realizado a través de la
unión específica al receptor V2. Esto desencadena la transducción de señal que implica un
incremento en el AMPc intracelular por estimulación de la actividad adenilato ciclasa, a través de
la proteína heterotrimérica del subtipo Gαs. A su vez esto produce la activación de la proteína
quinasa regulada por AMPc (PKA) (Thibonnier y col., 2001), la cual, entre otros muchos
blancos, fosforila al canal de agua aquaporina 2 (AQ2) presente, junto con el receptor V2, en
células principales de túbulos colectores del riñón. La fosforilación de AQ2 promueve la fusión
de vesículas, que contienen al canal, a la membrana plasmática apical, aumentando el número de
canales de agua en la superficie de la célula (Fushimi et al., 1997; Katsura et al., 1997). Esto
aumenta marcadamente la permeabilidad al agua del epitelio (Nielsen y col., 1995).
El gen de la isoforma V2 de vasopresina, se localiza en la región q28-qter del cromosoma
X y está compuesto por 2 intrones y 3 exones que codifican para una proteína de 371 residuos
aminoacídicos tanto en rata (Lolait y col., 1992), como en humanos (Birnbaumer y col., 1992). El
primer exón codifica para los primeros 9 aminoácidos del dominio N-terminal, el segundo exón
codifica para los dominios de TM I-VI y el tercer exón codifica el dominio VII de TM y región
carboxilo terminal (Seibold y col., 1992).
5
El receptor V2 presenta 2 sitios consenso de N-glicosilación en rata (Asn22 y Asn185) y uno
en el humano (Asn22). Observándose que la glicosilación no cumple un rol en el transporte de la
proteína a la superficie celular ni tampoco altera la función del receptor en la membrana
plasmática, pero sí se ha observado una disminución en la vida media de una mutante no
glicosilada (Innamorati y col., 1996). También se ha observado que esta isoforma se O-glicosila
en residuos de Ser y Thr presentes en el N-terminal (Sadeghi y Birnbaumer, 1999). Además, este
receptor es palmitoilado en las Cys341/Cys342, modificación que tiene un rol importante en la
destinación a membrana plasmática (Schülein y col., 1996; Sadeghi y col., 1997). La formación
de un puente disúlfuro entre primer y segundo bucle extracelular producto de las Cys112/Cys192,
también se ha demostrado que es esencial para el eficiente tráfico del receptor y a su vez participa
en la unión del ligando (Pávó y Fahrenholz, 1990; Schülein y col., 2000).
La coexpresión de una variante de la isoforma responsable del efecto antidiurético de
AVP (V2a) se determinó en riñón de rata. Esta nueva isoforma se genera por empalme alternativo
(Firsov y col., 1994; Sarmiento y col., 2005) y se denomina V2b (Sarmiento y col., 2005). Los
transcritos V2a y V2b se coexpresan en epitelio de túbulos de riñón de rata y ambos alcanzan su
mayor nivel en tubos colectores medulares, donde AVP ejerce su mayor efecto antidiurético. La
expresión heteróloga en diferentes líneas celulares de la isoforma V2b, a diferencia de V2a, no
conduce a un incremento del AMP cíclico (cAMP) intracelular al estímulo con AVP. Así
tampoco, se observa un aumento de la concentración intracelular de Ca2+, efecto descrito para la
hormona al unirse a receptores V1 y V3 de AVP (Firsov y col., 1994). Por otro lado, la isoforma
V2b no alcanza la superficie celular y es retenida en compartimentos intracelulares de líneas
celulares, en cultivo, epiteliales y no epiteliales. Además, en estas líneas celulares
heteroligomeros entre la isoforma V2b y V2a son retenidos en el intracelular y por este
6
mecanismo la isoforma V2b posee un efecto dominante negativo sobre la isoforma V2a
disminuyendo así el número de sitios de unión en superficie celular para AVP (Sarmiento y col.,
2004). A su vez, también ha sido demostrado, mediante hibridación in situ, inmunocitoquímica y
RT-PCR, la expresión postnatal de V2a y V2b en cerebelo de rata. Este estudio destacó que
ambas isoformas son expresadas preferencialmente en células de Purkinje, observándose niveles
de expresión similar durante todo el desarrollo postnatal. Sin embargo, la distribución celular de
V2a y V2b es regulada durante el desarrollo, debido a resultados que mostraron expresión
pasajera de las variantes en fibras de Bergmann en la capa granular externa, durante etapas
tempranas del desarrollo y en forma permanente en las células de Purkinje. Esto sugirió a los
autores que el receptor V2 está involucrado en mecanismos de citodiferenciación cerebelar,
mediados por AVP (Vargas y col., 2009).
El empalme alternativo que genera la isoforma V2b implica la utilización de un sitio
dador y dos sitios aceptores distintos en el procesamiento del intron II del gen del receptor V2 de
AVP. Este procesamiento alternativo implica la pérdida de 76 nucleótidos, los cuales codifican el
VII dominio de TM completo del receptor V2a. Además, involucra un cambio en el marco de
lectura con codón de término prematuro. Como resultado V2b posee una secuencia más corta y
completamente distinta a partir del tercer bucle extracelular respecto de V2a (Firsov y col.,
1994).
El empalme alternativo es un proceso en el cual exones o bien parte de estos, pueden ser
incluidos o excluidos del mRNA precursor (pre-mRNA), resultando en múltiples variantes del
mRNA maduro. Este proceso es llevado a cabo por un gran complejo denominado espliceosoma
que se compone de cinco ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNPs) (Wahl y col., 2009).
El resultado final del corte y empalme de un pre-mRNA es la traducción de variantes de una
7
proteína, las que han sido codificadas por el mismo gen, pero difieren en su secuencia y por ello,
potencialmente, en sus propiedades biomoleculares y celulares. A su vez este evento puede
conducir a la introducción de un codón de término prematuro (Markovic y Challiss, 2009), tal
como ocurre con V2b.
La base de datos IUPHAR (http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorListForward)
usando el banco de datos de secuencias CCDS disponible en NCBI (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi), ha descrito que aproximadamente un 52% de un total de
365 GPCRs de la especie humana posee al menos 2 exones en su marco de lectura abierto
(ORFs), lo que sugiere la existencia de un intrón en el gen y lo que implica posibles eventos de
empalme alternativo (Markovic y Challiss, 2009).
El empalme alternativo de GPCRs puede conducir a la expresión de proteínas con
diversos cambios en relación a la topología de siete dominios de transmembrana descrita para
estos receptores. Se han reportado isoformas solubles de GPCRs, que son severamente truncadas
y que solo se componen del dominio N-terminal extracelular, esto ha sido observado para los
receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) (Ferraguti y Shigemoto, 1996), los receptores
de la hormona liberadora de corticotropina (CRH-Rs) (Chen y col., 2005), y el receptor de la
hormona luteinizante (LH-R) (Apaja y col., 2006). También existen aquellas variantes de
empalme que poseen cambios en los segmentos citoplasmáticos, lo que ha sido reportado para
CRH-R tipo 1 (Grammatopoulos y col., 2006), el receptor B de colecistocinina (CCKB)
(Hellmich y col., 2000), receptor D2 de dopamina (Monsma y col., 1989) y H3 de histamina
(Leurs y col., 2005). A su vez hay variantes que tienen inserciones o deleciones en los segmentos
extracelulares, como son los casos descritos para el receptor de calcitonina (CT-R) (Hossami y
col., 1994) y el receptor de nociceptina/orfanina FQ (Kilpatrick y col., 1999). El número más
8
importante de isoformas reportadas corresponden a las que presentan variaciones en su extremo
C-terminal, producto del empalme alternativo, observándose que estas variantes pueden no
poseer parte del TM7, carecer del dominio de TM entero o bien presentar modificaciones en la
cola citoplamática. Algunos ejemplos son el receptor EP3 de prostaglandinas (Breyer y col.,
2001), el α1-adrenoceptor (α1-AR) (Hawrylyshyn y col., 2004), el receptor de ácido γ-amino
butírico tipo B2 (GABAB2) (Bowery y col., 2002), mGluR1 (Francesconi y col., 2002), receptores
de somatostatina subtipo 2 (sst2) (Moller y col., 2003), receptor de neurokinina 1 (NK-1) (Lai y
col., 2006) y el receptor de serotonina (Bockaert y col., 2006). Las variantes de empalme de estos
GPCRs poseen propiedades de señalización y regulación alteradas con respecto al receptor
normal.
En la isoforma V2b el dominio C-terminal es drásticamente alterado por el empalme
alternativo que la genera. La secuencia más corta y distinta a partir del tercer bucle extracelular
respecto de V2a ha sido analizada por Firsov y col. (1994) con el fin de postular la topología de
transmembrana de esta isoforma. En estos estudios se observó la posibilidad de la formación de
un nuevo segmento TM VII el cual estaría compuesto por residuos aminoacídicos que son parte
de la nueva secuencia. De cumplirse esto la región correspondiente al carboxilo terminal sería
citoplasmática y además, el nuevo segmento TM VII sería completamente distinto al de V2a.
El conocimiento de la estructura de una proteína es crucial para entender su función.
Desafortunadamente, todavía no se desarrollan métodos fiables para formar cristales tri-
dimensionales de proteínas de membrana y a la fecha se cuenta con pocas estructuras de alta
resolución correspondientes a esta clase de proteínas (Van Geest y Lolkema, 2000). Para el caso
de los GPCRs, la estructura de rodopsina ha sido la más estudiada. Estudios cristalográficos de
cristales bidimensionales de rodopsina permitieron dilucidar el plegamiento y orientación de las
9
hélices de transmembrana, lo cual ha permitido elaborar modelos para otros GPCRs. Rodopsina
ha sido el único GPCR, cuya estructura ha sido determinada cerca de la resolución atómica (Tate
y Schertler, 2009).
Afortunadamente, a pesar de las dificultades encontradas en la obtención de estructuras de
alta resolución, las restricciones fisicoquímicas impuestas por el ambiente hidrofóbico de la
membrana celular proveen un método simple para predecir la topología de proteínas de
membrana, un aspecto fundamental de su estructura. A su vez, la predicción puede ser verificada
mediante una variedad de técnicas moleculares y bioquímicas, las cuales se basan en
modificaciones de la proteína, a través de la ingeniería genética, que permite la manipulación de
los genes que codifican las proteínas. Las aproximaciones bioquímicas para determinar
topologías de proteínas de membrana han tenido gran éxito, debido en gran parte al
entendimiento de la dinámica de las vías biosintéticas y de los procesos de plegamiento de estas
proteínas, en la membrana (Van Geest y Lolkema, 2000; Ott y col., 2002).
10
En virtud a los antecedentes recién mencionados, nos planteamos la siguiente hipótesis:
“La isoforma V2b del receptor de AVP de rata posee siete dominios de TM, cuyo VII
segmento se compone de la nueva secuencia en V2b, generada por el corrimiento en el
marco de lectura que implica el empalme alternativo.”
Objetivo general:
- Determinar la topología de transmembrana de la isoforma V2b del receptor de AVP de rata.
Objetivos específicos:
- Generación de mutantes puntuales del receptor V2a y la isoforma V2b, fusionadas al extremo
N-terminal de proteína fluorescente (YFP), las cuales contengan sustituciones de residuos
específicos, que permitan eliminar o incorporar secuencias consenso de N-glicosilación.
- Determinar la topología del extremo C-terminal de V2b mediante el análisis de la N-
glicosilación de la secuencia consenso Asn-X-Thr incorporada después del último residuo de la
proteína.
- Determinar la topología del extremo C-terminal de V2b mediante ensayos de accesibilidad a
epítope en células semipermeabilizadas con digitonina.
- Analizar la topología de V2b a través de algoritmos de predicción y comparar con los resultados
experimentales.
11
3. Materiales y Métodos
3.1. Materiales.
3.1.1. Reactivos.
MERCK: Acido acético glacial, ácido clorhídrico (HCl), aceite de inmersión, cloruro de sodio
(NaCl), cloruro de magnesio (MgCl2), cloruro de calcio (CaCl2), cloruro de potasio (KCl),
hidróxido de sodio (NaOH), etanol absoluto (EtOH), metanol absoluto (MeOH), glicerol,
glucosa, isopropanol, rojo de metilo y extracto de levadura.
SIGMA CHEMICAL Co.: Agar, azul de bromofenol, bicarbonato ácido de sodio (NaHCO3),
sulfato de magnesio (MgSO4), fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4), fosfato de sodio díbásico
(Na2HPO4), ácido etilendiamonotetraacético (EDTA), ácido (N(2 hidroxietilpiperazina-N(2
etansulfónico)) (HEPES), acetato de sodio (NaAc), tampones para calibración (pH 4, 7 y 10),
bromuro de etidio (BrEt), kanamicina, ampicilina, RNAsa A, Azul de Comassie G, Nonidet P40,
leupeptin, inhibidor de tripsina, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), N,N,N’,N’-
tetrametiletilendiamina (TEMED), Tween 20, deoxicolato de sodio, persulfato de amonio,
paraformaldehído, Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Ham‘s F12,
antibiótico antimicótico (Penicilina 10000 U/ml, estreptomicina 10 mg/ml, anfotericina 8 25
ug/ml), tripsina, poli-L-lisina, dimetil sulfóxido (DMSO), tunicamicina, trypan blue, rojo fenol y
digitonina.
INVITROGEN: Desoxiribonucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), tampón
endonucleasa (React 2, 3 y 4), EcoRI (10 U/ l), Sal I (10 U/ l), Xba I (10 U/ l), KpnI (10 U/
l), DNAsa I libre de RNAsa, cianol de xileno, células competentes DH5 , triptona, agarosa
12
ultra pura, agarosa bajo punto de fusión, marcador de tamaño molecular de 1 Kb DNA ladder,
marcador tamaño molecular 100 pb ladder, fracción V de albúmina sérica de bovino (BSA).
FERMENTAS Inc.: Pfu DNA polimerasa, tampón Pfu 10X, MgSO4 25 mM y marcador de peso
molecular preteñido para proteínas.
BIO-RAD LABORATORIOS, Inc.: Dodecil sulfato de sodio (SDS) y ensayo de medición de
proteínas (Bio-Rad Dc Protein assay).
PROMEGA Co.: T4 DNA ligasa y su tampón y el Kit Wizard Plus para purificación de DNA
plasmidial a mediana escala, glicina, tris ultrapuro, archilamida, bisacrilamida.
QIAGEN Inc.: Sistema de purificación de DNA Qiaex II.
BD BIOSCIENCES CLONTECH: Los vectores plasmidiales de expresión en eucariontes
pEGFPN1, pECFPN1, pEYFPN1 y pcDNA 3.1(+).
ROCHE DIAGNOSTICS: Reactivo de transfección FuGENE 6.
PIERCE: Sistema de quimioluminiscencia ECL y placas autorradiográficas.
DAKO: El medio de montaje para preparaciones celulares fluorescentes.
13
El suero bovino fetal fue adquirido en Frigorífico Osorno (Osorno, X región, Chile) y se
esterilizó por filtración e inactivó (56°C por 30 min.) en el laboratorio.
3.1.2. Anticuerpos:
Anticuerpo policlonal anti-proteína verde fluorescente (GFP) generado en conejo,
anticuerpo anti-IgG de ratón generada en cabra conjugado a Alexa Fluor 488, anticuerpo anti-IgG
de conejo, generada en cabra conjugado a Alexa Fluor 633, fueron adquiridos en Molecular
Probes, Inc. Anticuerpos secundarios policlonales anti-IgG de conejo (generado en cabra) y anti-
IgG de ratón (generado en burro), ambos conjugados a peroxidasa fueron adquiridos en Jackson
Inmuno Research Laboratorios, Inc. Anticuerpo monoclonal anti-HA (HA.11) generado en
ratón, fue adquirido a COVANCE. Anticuerpo monoclonal anti-58K generada en ratón fue
adquirido en Abcam.
3.1.3. Equipos:
Termociclador M.J. Research (MiniCyclerTM), MyGeneTM Series Gradient Termal Cycler
Model MG96G, centrífuga Eppendorf 5415 D, centrífuga refrigerada Eppendorf 5415 R,
centrífuga clínica Heraus christ (Biofuge A), baños termorregulados Memmert WB 7 y WB 22,
lámpara UV Camag (Type TL900/U), iluminador UV Vilber-Lourmat, cámara fotográfica digital
Kodak, agitadores termorregulados Lab-Line y ZHICHENG® (Environ Shaker), agitador orbital
VRN-360 (Germany Industrial Corp.), fuente de poder Bio-Rad (Power PAC200), cámaras de
electroforesis y transferencia de proteínas Bio Rad (Mini-PROTEAN 3), cámara para
electroforesis de DNA Life technologies (Horizon 58), micropipetas Gilson P-1000, P200, P-20,
P-10, estufa de cultivo Memmert, cámara de electroforesis de DNA Life technologies (modelo
14
1160), cámara de flujo laminar Nuaire 8 (clase II tipo A), baño termorregulado Kottermann,
estufa de cultivo con CO2 Forma Scientific (Water Jacketed Incubator), centrífuga clínica
internacional Equipment (Mod. CL), microscopio óptico invertido Nixon-TMS, pipeteador
automático Drummond, agitador magnético Cole Palmer (Mod. 4658. Stirrer / Hot plate),
pHmetro WTW (pH521), agitador Scientific Industries (Vortex-2 Genie), balanza electrónica
Shimadzu (321-33557), balanza analítica Sartorius (LA250S), microscopio de epifluorescencia
Zeiss (Axioskop HBO50), cámara digital Nikon, microscopio confocal “Olympus FLUOVIEW
1000”, centrifuga Kubota (8KR-20000T), ultracetrífuga Beckman modelo LE-80k y su rotor 80
Ti, espectrofotómetro Shimadzu (UV-150-02), bomba de vacío Meduak, autoclave ORSA y
estufa de secado de material plástico ORSA.
3.1.4. Programas:
Para los análisis de secuencia de DNA se utilizó el programa OMIGA versión 2.0 (Oxford
Molecular Ltd.) y para la cuantificación de DNA a través de electroforesis en gel de agarosa, se
utilizó el programa UN-SCAN-IT gel versión 4.1 (Silk Scientific, Inc., Orem, UT, USA).
15
3.2. Métodos.
3.2.1. Generación de mutantes puntuales del receptor V2a y la isoforma V2b, fusionadas a
proteína fluorescente.
3.2.1.1. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Mediante mutagénesis sitio dirigida, utilizando como templado los cDNA del receptor
V2a y de la isoforma V2b en el vector pcDNA3.1 (+), se sustituyeron los residuos de
asparragina, por los de glutamina, de las dos secuencias consenso de N-glicosilación presentes en
ambas isoformas, ubicadas en las posiciones 22 y 185. Esto se realizó mediante partidores
internos que contenían la mutación deseada. El producto de amplificación conteniendo ambas
mutaciones se insertó en marco de lectura con el extremo N-terminal de YFP, en el vector
pEYFP-N1. Para este clonamiento, el partidor sentido externo se diseñó con la secuencia de
reconocimiento para la endonucleasa de restricción Eco RI y el partidor externo antisentido con
la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa SalI. Estas mutantes se denominaron
V2aN22QN185Q-YFP y V2bN22QN185Q-YFP.
Partidores internos que contienen la mutación puntual:
Partidor Sentido N22Q F: 5’ CTCCCAGCCAAAGCAGCCAG 3’
Partidor Antisentido N22Q R: 5’ CTGGCTGCTTTGGCTGGGAG 3’
Partidor Sentido N185Q F: 5’ GATGTGGGACAAGGCAGTGG 3’
Partidor Antisentido N185Q R: 5’ CCA CTGCCTTGTCCCACATC 3’
16
Partidores externos
V2aN22QN185Q-YFP:
Partidor Sentido: V2FN 5’ GGAATTCGGTGTGTTAGGTCATCATCAA 3’
Partidor Antisentido: V2apEGFP-N1 5’ ACGCGTCGACGTGGAGGGTGTATCC 3’
V2bN22QN185Q-YFP:
Partidor Sentido: V2FN 5’ GGAATTCGGTGTGTTAGGTCATCATCAA 3’
Partidor Antisentido: V2bpEGFP-N1 5’ ACGCGTCGACGTAAGAGGAGCTGG 3’
Los cDNA mencionados en el párrafo anterior se utilizaron como templados para
incorporar una secuencia consenso de N-glicosilación (Asn-X-Thr), después del último residuo
aminoacídico de V2aN22QN185Q y V2bN22QN185Q. Esto se realizó mediante partidores
antisentido conteniendo la mutación. Estas mutantes fueron clonadas, en marco de lectura, al
extremo N-terminal de YFP. Se utilizó un partidor sentido con la secuencia de reconocimiento
para la endonucleasa de restricción Eco RI y un partidor antisentido con la secuencia de
reconocimiento para la endonucleasa KpnI. Estas mutantes se denominaron
V2aN22QN185QNXT-YFP y V2bN22QN185QNXT-YFP. A su vez, estas fueron utilizadas
como templados para generar fragmentos compuestos de solo el dominio C-terminal, que se
define aquí, como la región que incluye desde el residuo E 242, localizado en la mitad del tercer
segmento intracelular, hasta el extremo carboxilo terminal, tanto de V2a como de V2b. Además
poseen el sitio de N-glicosilación incorporado después del último residuo aminoacídico en ambas
isoformas. Estas construcciones fueron clonadas, en marco de lectura, al extremo N-terminal de
YFP y se denominaron V2a 242 tail NXT-YFP y V2b 242 tail NXT-YFP.
17
Partidores utilizados:
V2aN22QN185Q NXT-YFP
Partidor Sentido: V2FN 5’ GGAATTCGGTGTGTTAGGTCATCATCAA 3’
Partidor Antisentido: V2aGFPT372N 5’ CGGGGTACCGTCGAGTTGGAGGG 3’
V2bN22QN185Q NXT-YFP
Partidor Sentido: V2FN 5’ GGAATTCGGTGTGTTAGGTCATCATCAA 3’
Partidor Antisentido: V2bGFPT372N 5’ CGGGGTACCGTCGAGTTAAGAGG 3’
V2a 242 tail NXT-YFP
Partidor sentido V2 242 tail: 5’ GGAATTCATCATGGAGAGGGCA 3’
Partidor Antisentido: V2aGFPT372N 5’ CGGGGTACCGTCGAGTTGGAGGG 3’
V2b 242 tail NXT-YFP
Partidor sentido V2 242 tail: 5’ GGAATTCATCATGGAGAGGGCA 3’
Partidor Antisentido: V2bGFPT372N 5’ CGGGGTACCGTCGAGTTAAGAGG 3’
Por PCR también se agregó en marco de lectura la secuencia del epítope HA de
hemoaglutinina (YPYDVPDYA) al extremo N-terminal del receptor V2a de rata y de la isoforma
V2b. Este producto de amplificación fue clonado, en marco de lectura, al extremo N-terminal de
CFP. Los partidores usados permiten la incorporación a los extremos 5` y 3` de los productos de
amplificación, los sitios de restricción Eco RI y Sal I respectivamente. De esta manera las
proteínas V2a y V2b quedaron etiquetadas en el N-terminal con el epítope HA y en C-terminal
con CFP. Estas construcciones se denominaron HAV2a-CFP y HAV2b-CFP.
18
Partidores utilizados:
HAV2a-CFP
Partidor sentido V2HAF3:
5’GGAATTCCGCCACCATGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTATGCTCCTGGTG
TCTA 3’
Partidor Antisentido: V2apEGFP-N1 5’ ACGCGTCGACGTGGAGGGTGTATCC 3’
HAV2b-CFP
Partidor sentido V2HAF3:
5’GGAATTCCGCCACCATGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTATGCTCCTGGTG
TCTA 3’
Partidor Antisentido: V2bpEGFP-N1 5’ ACGCGTCGACGTAAGAGGAGCTGG 3’
Las amplificaciones se llevaron a cabo en termociclador Minicycler M.J. Research (Bio-
Rad, Hercules, CA, USA) y la reacción incluyó 25 ηg de DNA plasmidial, 5 l de tampón 10X
Pfu DNA polimerasa, oligonucleótidos partidores 0,2 M, dNTPs 0,2 mM, 0,5 U de Pfu DNA
polimerasa y agua destilada estéril para completar un volumen final de 50 l. El programa
consistió en una primera etapa de denaturación por 1 min a 95 °C, apareamiento por 1 min a 55
°C y extensión por 3 min a 72°C, completando 35 ciclos y una extensión final por 20 min a 72
°C. Los productos de amplificación se fraccionaron por electroforesis en geles de agarosa al 1 %
en tampón TAE 1X y se purificaron según se describe en métodos 3.2.1.3.
19
3.2.1.2. Electroforesis de DNA en geles de agarosa.
Para la separación e identificación de fragmentos de DNA se prepararon geles de agarosa
al 0,8%, 1% y 1,2% conteniendo 0,5 μg/ml de bromuro de etidio y preparado en tampón TAE 1X
(Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM). Para cargar las muestras se utilizó tampón de carga (glicerol
30%, Azul de bromofenol 0,25% o xilencianol 0,25%, preparado en TAE 1X) en relación 1:6 con
respecto al volumen de la muestra. Como marcador de tamaño molecular de DNA se utilizó 1 μg
de 1 Kb plus DNA ladder y/o 100 pb DNA ladder. Los fragmentos de DNA fueron sometidos a
fraccionamiento por aproximadamente 40 minutos a 100 V en tampón de corrida TAE 1X. El
DNA se observó por exposición del gel sobre el trans-iluminador UV a 254 nm y la digitalización
de la imagen se obtuvo con una cámara fotográfica digital Kodak.
3.2.1.3. Purificación de productos de amplificación obtenidos por PCR y por digestión con
endonucleasas de restricción.
Los productos de amplificación por PCR y productos de digestión con endonucleasas de
restricción, se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron con ayuda de
una lámpara UV con emisión a los 350 nm. Con un bisturí se cortó el gel en la región que
contenía el producto de interés, evitando la sobre exposición del gel a la fuente UV para evitar la
generación de dímeros de timidina en el DNA. Posteriormente se utilizó el Kit de extracción de
DNA desde geles de agarosa QIAEX II (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Finalmente el DNA se eluyó agregando entre 10 y 20 μl de agua destilada, estéril y libre de
nucleasas.
20
3.2.1.4. Clonamiento de productos de amplificación en vector pECFP-N1 y pEYFP-N1.
Los productos de amplificación purificados, correspondiente a las mutantes
V2aN22QN185Q, V2bN22QN185Q y a las construcciones HAV2a y HAV2b, junto a los
plasmidios pECFP-N1 y pEYFP-N1 (1 g de DNA) fueron digeridos por 5 h a 37°C con 10 U de
Eco RI, 10 U de Sal I, 2 l de tampón de digestión común a las enzimas de restricción (Tris-Cl
100 mM pH 7,6, MgCl2 10 mM, NaCl 150 mM) y agua destilada estéril para completar un
volumen final de 20 l. En el caso de los productos de amplificación purificados de las mutantes
V2aN22QN185QNXT, V2bN22QN185QNXT, de las construcciones V2a 242 tail NXT, V2b
242 tail NXT y el plasmidio pEYFP-N1 (1 g de DNA) fueron digeridos de manera secuencial.
Primero por 5 h a 37°C con 10 U de Eco RI, 2 l de tampón de digestión (Tris-Cl 50 mM pH 8,0,
MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM) y agua destilada estéril para completar un volumen final de 20 l.
Luego, se diluyó cuatro veces la solución anterior con 10 U KpnI, 8 l de tampón de digestión
(Tris-Cl 20 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, KCl 50 mM) y agua destilada estéril para completar un
volumen final de 80 l. Posteriormente los productos de digestión fueron fraccionados por
electroforesis en gel de agarosa al 1 % en tampón TAE y purificados según el protocolo antes
descrito (métodos 3.2.1.3), seguido de reacción de ligación (métodos 3.2.1.5.), transformación de
células competentes (métodos 3.2.1.6. ) y purificación plasmidial a pequeña (métodos 3.2.1.7.) y
mediana escala (métodos 3.2.1.8.).
21
3.2.1.5. Reacción de ligación.
Para ligar fragmentos de DNA se trabajó con una proporción molar inserto/vector de 3:1
respectivamente. La cuantificación de los fragmentos se realizó por electroforesis en gel y
posterior digitalización de la imagen, de acuerdo a lo descrito en métodos 3.2.1.9. La mezcla de
ligación se incubó a 4 ºC durante 18 horas.
Vector linealizado 50 ng (aproximadamente15 fM)
Inserto 45 fM
Tampón T4 DNA ligasa 10X 2 l
Agua grado biología molecular 14 l
T4 DNA ligasa (1UE/ μl) 1 l
20 l
3.2.1.6. Transformación de células competentes.
La transformación se realizó agregando 2 l (aproximadamente 10 ηg DNA total) de
mezcla de ligación a un tubo que contenía 50 l de células competentes DH5 , se incubó por 30
min en hielo, posteriormente a 37°C por 20 seg. y luego por 2 min nuevamente en hielo. Se
agregó 950 l de medio LB (triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l y NaCl 10 g/l pH 7,5) e
incubó por 1 h a 37 °C con agitación constante (225 rpm). Posteriormente se centrifugaron a
6.000 x g por 5 min y el pellet de células fue resuspendido en 100 l de medio LB. Finalmente,
se sembraron placas de agar LB (agar 15 g/l) conteniendo kanamicina (pECFP-N1 y pEYFP-N1)
a 100 g/ml y se incubaron por 18 h a 37 °C.
22
3.2.1.7. Purificación del DNA plasmidial a pequeña escala.
Se aislaron colonias únicas de las placas agar LB kanamicina y se inocularon en 3 ml de
medio LB líquido, conteniendo kanamicina a una concentración de 100 g/ml. Posteriormente se
incubaron las bacterias por 18 h a 37°C con agitación constante a 225 rpm. La extracción fue
realizada utilizando el método de minipreparación de DNA plasmidial por lisis alcalina con SDS
(Sambrok and Russel, 3era edición, vol. 1 pág. 132). En breve, se centrifugó 1,5 ml del cultivo a
16.000 x g por 30 seg a 4ºC y el precipitado de células fue lavado con 500 μl de solución STE
(Tris-Cl 10 mM, pH 8.0, NaCl, EDTA 1mM) y resuspendido por vortex en 100 l de solución de
lisis alcalina I (Tris-Cl 25 mM pH 8.0, EDTA 10 mM, Glucosa 50 mM). Luego, se agregó 200 l
de solución alcalina II (NaOH 0.2 N y SDS 1%), mezclándose la solución resultante por
inversión. Luego se añadió solución de lisis alcalina III o de neutralización (KAc 5M), se mezcló
por inversión y se centrifugó la muestra a 13.000 x g por 2 min. Posteriormente, se traspasó el
sobrenadante a un nuevo tubo, se agregaron 900 l de etanol 100 % y se mezcló, para luego
centrifugar a 13.000 x g por 10 min. El precipitado se lavó 3 veces con 500 l de etanol 70 %,
mezclando por inversión y centrifugando a 13.000 x g por 2 min. Finalmente se secó el
precipitado y se resuspendió en 50 l de agua destilada estéril conteniendo RNAsa libre de
DNAsa 0,1 g/ml. Una alícuota de 5 l fue sometida a digestión por 5 h a 37°C con 10 U de cada
una de las enzimas de restricción (EcoR I y Kpn I ó EcoR I y Sal I, según corresponda). La
liberación del inserto se verificó por electroforesis en gel de agarosa al 1 % en tampón TAE 1x
(métodos 3.2.1.2).
23
3.2.1.8. Purificación de DNA plasmidial a mediana escala.
El protocolo utilizado fue el recomendado por Promega para el DNA Wizard Plus
Midipreps DNA Purification System. En breve, 100 ml de medio LB con antibiótico (Kanamicina
100 μg/ml) inoculado con el cultivo de minipreps (método 3.2.1.7.) de interés se incubó a 37 ºC
por 14 h con agitación constante (aprox 225 rpm). Luego, se centrifugó el cultivo a 10.000 x g
por 10 min a 4 ºC y se resuspendió el precipitado en 3 ml de tampón de resuspensión (Tris-Cl 50
mM pH 7,5, EDTA 10 mM pH 8,0 y RNAsa A 100 g/ml). Se agregó 3 ml de solución de lisis
(NaOH 200 mM, SDS 1%) y se mezcló. Posteriormente, se adicionó 3 ml de solución de
neutralización (KAc 1,32 M pH 4,8) y nuevamente se mezcló. Se centrifugó a 14.000 x g por 15
min a 4 ºC, se traspasó el sobrenadante a un tubo nuevo, se agregó 10 ml de resina de
purificación de DNA y se transfirió a una minicolumna suministrada por el fabricante. La resina
se empacó por aspiración y se efectuaron 3 cambios de 15 ml de solución de lavado (Tris-Cl 8,3
mM pH 7,5 NaAc 80 mM, etanol 55%, EDTA 40 M). Finalmente el DNA fue eluído de la
columna con 300 μl de agua destilada estéril, se cuantificó (métodos 3.2.1.9.) y se almacenó
a -20º C.
24
3.2.1.9. Cuantificación de DNA plasmidial y fragmentos de DNA.
La concentración de DNA plasmidial se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm a
diluciones de las muestras en un espectrofotómetro Shimadzu UV 150-02, calculando la
concentración por la relación que una unidad de absorbancia (DO) a 260 nm equivale a 50 ng/ml
de DNA doble hebra (Sambroock y Russell, 2002). Además la concentración fue corroborada
mediante la cuantificación en gel de agarosa, para ello el vector se linealizó por digestión con la
endonucleasa de restricción Eco RI (métodos 3.2.1.4.). Luego, una alícuota de la mezcla de
digestión se fraccionó por electroforesis en gel (métodos) junto con el estándar de masa
molecular DNA/Hind III fragments. La digitalización de la imagen se realizó con una cámara
fotográfica digital Kodak y los píxeles de las bandas de interés se cuantificaron con el programa
UN-SCAN-IT gel, versión 4.1. La cuantificación de fragmentos para la ligación se realizó por el
mismo método y utilizando los estándares de masa molecular DNA/Hind III fragments y X174
RF DNA/Hae III fragments para fragmentos sobre 1kb y de entre 100 y 1400 pb,
respectivamente.
25
3.2.2. Expresión y detección por Western blot del receptor V2a de vasopresina, la isoforma
V2b y de las mutantes puntuales diseñadas, generadas como proteína de fusión a proteína
fluorescente (YFP).
3.2.2.1. Cultivo celular.
Se cultivaron células COS-7 (línea celular derivada de riñón de mono verde africano) en
una mezcla de los medios comerciales F12 (HAM) y DMEM LG (Dulbecos Modified Eagle Medium
Low Glucose); en proporción 1:1, suplementado con SBF a una concentración de 7,5% final,
antibiótico/antimicótico y L-Glutamina 2mM final., a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de
CO2. Cada 2 o 3 días las células se subcultivaron utilizando tripsina (tripsina 0,25%, EDTA 1
mM en PBS pH 8,0) a 37 °C. En su defecto, se congelaron en SBF conteniendo DMSO al 10%.
3.2.2.2. Transfecciones pasajeras.
Para las transfecciones de células COS-7, se sembraron 500.000 y 150.000 células por ml
de cultivo en placas de 60 mm y 35 mm respectivamente. A las 24 h de cultivo se transfectaron
con el reactivo comercial de transfección Fugene 6 en una razón masa DNA ( g) / volumen
Fugene 6 ( l) de 1:3 y se siguió las instrucciones del fabricante. Los tiempos de transfección
fueron desde 24 a 48 horas.
26
3.2.2.3. Extracción de proteínas.
Transcurridas las 24 h desde la transfección, las células transfectadas con las isoformas V2a
y V2b y sus diferentes mutantes generadas como proteína de fusión a YFP se lavaron 3 veces con
PBS 1X frío y se solubilizaron en hielo por 1 h con 500 ul de tampón radioinmuno precipitation
assay (RIPA: Tris-Cl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, nonidet P-40 1%, deoxicolato de sodio
0,5%, EDTA 10 uM, SDS 0,1%, NEM 10 mM, PMSF 0,1 mM, leupeptin 1 µg/ml, inhibidor de
tripsina 5 µg/µl) en constante agitación. Posteriormente, el solubilizado se centrifugó a 16.000 x
g por 30 minutos a 4 ºC. Se tomó una alícuota de cada extracto total para resuspenderlos en
tampón de carga Laemmli 1X (Tris-Cl 0,06 M, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, azul de
bromofenol 0,025%) con agente reductor (β-Mercaptoetanol 5%), se calentaron por 1 h a 37 °C y
se fraccionaron por SDS-PAGE. A su vez, también se obtuvieron muestras de membranas totales.
Las células transfectadas con construcciones o mutantes de interés, se lavaron 3 veces con PBS
1X frío, se rasparon de la placa con 3 ml de PBS 1X y se centrifugaron a 1.000 x g por 5 min. A
continuación el sedimento celular se resuspendió en tampón hipotónico (Tris-Cl 5 mM pH 7,4,
EDTA 15 mM, PMSF 1mM, inhibidor de tripsina 5 µg/ml, leupeptin 10 µg/ml), se homogenizó
por sonicación y se centrifugó a 6.000 x g por 10 min a 4 ºC. El sobrenadante postnuclear se
sometió a 45.000 rpm por 45 min a 4 °C en ultracentrífuga Beckman con rotor 70 Ti y el
sedimento fue resuspendido en 100 μl de tampón hipotónico. Se midió la concentración de
proteínas a 750 nm utilizando el kit comercial de Dc Protein assay de Bio-Rad, siguiendo las
instrucciones del fabricante. 50 μg de proteína de membrana fue resuspendida en buffer de
muestra Laemli 1x (Tris-Cl 0,06 M, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10 %, azul de bromofenol
0,025%) con agente reductor (β-Mercaptoetanol 5%), calentadas por 1 h a 37°C y fraccionadas
en SDS-PAGE.
27
3.2.2.4. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes (SDS-PAGE).
Se prepararon geles separadores de poliacrilamida al 10% y 12% (Tris-Cl 0,375 M pH
8,8, SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,05% y TEMED 0,1%) y geles apiladores al 4% (Tris-Cl
0,125 M pH 6,8, SDS 0,1%, Persulfato de amonio 0,05% y TEMED 0,2%), ambos a partir de un
stock de acrilamida/bisacrilamida 30:0,8% (30% T, 2,67% C). Las muestras se cargaron en los
pocillos de los geles junto con los estándares de masa preteñidos y se sometieron a
fraccionamiento por alrededor de 2 h, a 150 V en tampón de corrida 1X (Tris-Cl 25 mM, glicina
0,192 M y SDS 1%).
3.2.2.5. Inmunodetección en Western blotting.
Las proteínas fraccionadas por SDS-PAGE fueron electrotransferidas a membranas de
nitrocelulosa en cámara Miniprotein III (Bio-Rad) por 90 min a 300 mA a 4°C, utilizando tampón
de transferencia 1x (Tris 25 mM, glicina 0,192 M, metanol absoluto 20 % y SDS 0,5 %). Las
membranas se lavaron por 10 min con una solución para eliminar el SDS (isopropanol 25%,
ácido acético 10%), seguido de tres lavados por diez minutos con TTBS 1x pH 7,4 (Tris-Cl 20
mM pH 7,4, NaCl 50 mM y Tween 20 al 0,1 %). Luego se bloquearon las membranas incubando
con leche descremada 5% en TTBS 1x por 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente se
incubó toda la noche a 4°C con anticuerpo policlonal anti-GFP diluído 1.10.000 en leche
descremada 5% TTBS 1x. Las membranas fueron lavadas 3 veces por 10 min a temperatura
ambiente con TTBS 1x y luego se incubó 2 h a temperatura ambiente, con anticuerpo anti-IgG de
conejo conjugado a peroxidasa (Jackson Laboratorios) diluído 1:50.000 en leche descremada 5%
TTBS 1x. Finalmente la inmunodetección fue visualizada mediante el kit de quimioluminiscencia
(ECL) de Pierce, siguiendo las instrucciones del fabricante
28
3.2.2.6. Tratamiento con tunicamicina.
El cultivo celular COS-7 fue tratado con tunicamicina, agregando directamente a la placa
la cantidad necesaria para lograr una concentración de 5 μg/ml. Esto se realizó al momento de
transfectar las células con las construcciones diseñadas. El tiempo de tratamiento fue el mismo
que el de transfección.
29
3.2.3. Estudio de la topología del extremo carboxilo terminal de V2b y la relación de esta
con su distribución subcelular en las etapas temprana de la vía secretora, mediante ensayos
de accesibilidad de anticuerpos a epítopes en células semipermeabilizadas con digitonina.
3.2.3.1. Ensayos de Inmunofluorescencia Indirecta en células semipermeabilizadas con
digitonina.
Con el objetivo de estudiar la topología del extremo carboxilo terminal de V2b, se
cultivaron células COS-7 en cubreobjetos, expresando de forma pasajera, las construcciones
HAV2a-CFP y HAV2b-CFP. Las células fueron lavadas con buffer KHM (20 mM HEPES (pH
7.4), 110 mM acetato de potasio y 2 mM cloruro de magnesio), y posteriormente tratadas con 20
ug/ml de digitonina por 1 minuto sobre hielo. Luego, las células fueron lavadas con PBS1X y
fijadas en PFA 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron las
células con una solución que contiene 50mM Tris-HCl (pH 8.0) y 100mM NaCl, y se incubo con
esta, 10 minutos a temperatura ambiente. En breve, se lavaron las células con PBS 1X y se
bloqueó con BSA 2% en PBS 1x por 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se
realizó una doble IFI incubando con ambos primeros anticuerpos, αHA monoclonal generado en
ratón y αCFP policlonal generado en conejo, diluidos 1:3000 en BSA 2%, por toda la noche a
4°C, en una cámara húmeda. Pasado el tiempo de esta incubación, los cubreobjetos se lavaron
tres veces con PBS 1x y se incubaron durante dos horas a 4°C, con Alexa Fluor 488 generado en
cabra contra ratón y Alexa Fluor 633 generado en cabra contra conejo, en una dilución 1:1000 en
BSA 2%. Los cubreobjetos fueron deshidratados con etanol 50%, 70%, 90% y finalmente 100%,
incubando por 5 minutos con cada uno. Finalmente los cubreobjetos fueron montados con medio
30
de montaje (DAKO), sobre portaobjetos y visualizados en primer lugar a través de microscopía
de epifluorescencia y luego en un microscopio confocal Fluoview 1000 Olympus.
También se fijaron células COS-7 en cubreobjetos con metanol 100 % por 45 minutos a -
20ºC para lograr una permeabilización completa de las células. Luego se procedió tal como se
explicó anteriormente con la IFI.
A su vez, con el objetivo de realizar una inmunocolocalización de la proteína de fusión
V2b-CFP con el marcador de Golgi 58K, en células COS-7 semipermeabilizadas con digitonina
se realizó la siguiente doble IFI. Células COS-7 se transfectaron con V2b-CFP durante 48 horas.
Las últimas 24 horas de expresión, el cultivo celular fue privado de suero. Luego del tiempo de
transfección, se procedió tal como se detalló previamente, para semipermeabilizar las células con
digitonina y bloquear con BSA 2% en PBS1x. La doble IFI se realizó incubando con ambos
primeros anticuerpos, αCFP policlonal generado en conejo y α58K monoclonal generado en ratón
diluidos 1:3000 en BSA 2%, por toda la noche a 4°C. Pasado el tiempo de esta incubación, los
cubreobjetos se lavaron tres veces con PBS 1x y se incubaron durante dos horas a 4°C, con Alexa
Fluor 488 generado en cabra contra ratón y Alexa Fluor 633 generado en cabra contra conejo, en
una dilución 1:1000 en BSA 2%. Finalmente se montaron los cubreobjetos tal como se explicó
anteriormente y posteriormente fueron visualizados.
31
3.2.3.2. Microscopía.
3.2.3.2.1. Microscopía de Epifluorescencia.
Se utilizó un microscopio de epifluorescencia “ZEIS Axioscop”, equipado con una
lámpara de fluorescencia “HBO 50” y los siguientes set de filtros:
GFP/Alexa 488 (set 10). BP 450 – 490; FT 510; BP 515 – 565
YFP (set 46). BP 490 – 510; FT 515; BP 520 – 550
CFP (set 47). BP 426 – 446; FT 455; BP 460 – 500
3.2.3.2.2. Microscopía Confocal.
Se utilizó un microscopio confocal “OLYMPUS FLUOVIEW 1000”, equipado con una
línea láser de diodo de 440nm, láser Helio-Neón-R de 633nm, láser Helio-Neón-G de 543nm y
un láser Argón multilínea de 458, 488 y 515 nm. Las configuraciones del camino óptico utilizado
para los fluoróforos CFP e YFP se detallan en la figura 1A. A su vez, en la figura 1B, se muestra
los caminos ópticos utilizados para Alexa 488 y Alexa 633.
32
Figura 1A. Configuración del camino óptico de CFP e YFP.
Configuraciones del camino óptico utilizado en el microscopio confocal, para la
observación y registro de los fluoróforos CFP, YFP. Las siglas SDM están referidas a espejo
dicroico secundario, MDM a espejo dicroico primario y BP a filtro de pasa banda.
440 nm
SDM 510
BP 465-495
Láser Diodo
Preparación
Detector 1
MDM 405/440/515
515 nm
SDM 640
BP 535-565
Láser Argón
Línea 515 nm Preparación
Detector 2
MDM 405/440/515
SDM 510
CFP
YFP
33
Figura 1B. Configuración del camino óptico de Alexa 488 y Alexa 633.
Configuraciones del camino óptico utilizado en el microscopio confocal, para la
observación y registro de los fluoróforos Alexa 488 y Alexa 633. Las siglas SDM están referidas
a espejo dicroico secundario, MDM a espejo dicroico primario y BP a filtro de pasa banda.
488 nm
SDM 510
BP 505-525
Láser Argón Línea 488 nm.
Preparación
Detector 1
MDM 488/543/633
Alexa 488
633 nm
Mirror
BP-650 IF
Láser He-Ne 633 nm
Preparación
Detector 3
MDM 488/543/633
SDM 640
SDM 510
Alexa 633
34
3.2.3.3. Análisis de imágenes. Todo el análisis de imágenes se realizó mediante el software “WCIF ImageJ”, un programa
gratuito de dominio público (http://www.uhnresearch.ca/facilities/wcif/fdownload.html). Con la
función Image/Type/8 bit, las imágenes registradas en el microscopio de epifluorescencia fueron
transformadas a escala de grises con una profundidad de 8 bit, y ajustado el mejor despliegue de
intensidades mediante la función Image/Adjust/Brightness/Contrast.
3.2.3.4. Co-localización.
El análisis de co-localización se realizó mediante el algoritmo matemático ICA (Intensity
Correlation Analysis), del cual se ha desarrollado un plug-in para aplicar en el software WCIF
ImageJ (Li et al. 2004), la ruta de esta aplicación en el software es Plugins/Colocalisation
Analysis/Intensity Correlation Analysis
35
4. Resultados
4.1. Generación de mutantes puntuales de las isoformas V2a y V2b
En células eucariontes, la N-glicosilación es un proceso que se realiza en el lumen del
retículo endoplásmico a través de la enzima oligosacaril transferasa (OST) que incorpora
oligosacáridos al grupo amino de la asparragina de la secuencia consenso Asn-X-Thr/Ser. La
modificación de este sitio ocurre de manera compartimiento-específica, por lo que la presencia de
N-glicosilación en una determinada secuencia consenso ofrece información topológica de
proteínas de membrana. Mediante mutagénesis sitio dirigida es posible incorporar secuencias
Asn-X-Thr/Ser en proteínas de membrana y la localización de esta, ya sea luminal o hacia el
citosol, se puede inferir a través de la presencia o ausencia de N-glicosilación, respectivamente.
Para realizar lo anterior es importante remover los sitios de N-glicosilación nativos de la proteína
de manera que no interfieran en el ensayo.
Teniendo en cuenta lo señalado en el párrafo anterior, se estudió la topología de
transmembrana del extremo carboxilo terminal de la isoforma V2b. Para ello se incorporó una
secuencia Asn-X-Thr después del último residuo aminoacídico de esta isoforma. Previamente se
removieron las dos secuencias consenso de N-glicosilación presentes en V2b, que se encuentran
en las posiciones 22 y 185. Todo lo mencionado, se realizó mediante partidores específicos, que
poseían la mutación deseada, diseñados a partir de la secuencia nucleotídica del receptor V2 de
vasopresina de rata depositada en base de datos (GeneBank Z22758). Esta mutante se fusionó al
extremo N-terminal de la proteína fluorescente amarilla (YFP).
36
En la figura 2, carril 3, se observa el éxito del proceso de clonamiento debido a la
liberación del inserto, posterior a la doble digestión con las enzimas Eco RI y KpnI, siendo el
tamaño del inserto 1,1 kb, lo cual corresponde a lo esperado. A su vez se observa el tamaño del
vector utilizado, pEYFP-N1, que es de 4,7 kb. Esta mutante se denominó V2bN22QN185QNXT-
YFP.
De la misma manera se procedió para la isoforma V2a, diseñándose la mutante
V2aN22QN185QNXT-YFP, la cual no posee las dos secuencias nativas de N-glicosilación, en
las posiciones 22 y 185 y que además cuenta con la incorporación de una secuencia Asn-X-Thr
después del último residuo, continuándose con YFP. El proceso de clonamiento se verifica en la
figura. 2, carril 2, en la que se observa que el oligonucleótido aislado tiene el tamaño esperado de
1,2 kb. Esta mutante se utilizó como control negativo para N-glicosilación ya que el extremo
carboxilo de esta isoforma se orienta hacia el citosol. En la figura 3A y 3B se muestran las
secuencias aminoacídicas de las mutantes V2bN22QN185QNXT-YFP y V2aN22QN185QNXT-
YFP, respectivamente. Junto a ello, se muestran los resultados de los análisis de predicción de N-
glicosilación realizados a través del servidor NetNGlyc 1.0, que muestran que si las secuencias
Asn-X-Thr añadidas se disponen hacia el lumen del RE, estas serían modificadas por la
maquinaria de N-glicosilación. Se menciona esto último, debido a que las predicciones que
realiza el servidor NetNGlyc 1.0, no discriminan si se tratan de regiones intra o extracelulares, en
el caso de las proteínas de transmembrana y solo se rigen por un análisis de la secuencia
aminoacídica, tanto del sitio putativo de N-glicosilación como de las regiones flanqueantes.
37
Figura 2: Liberación de los insertos V2aN22QN185QNXT y V2bN22QN185QNXT
generados como proteína de fusión a proteína fluorescente. Electroforesis en gel de agarosa al
0,8% preparado en TAE 1X y teñido con bromuro de etidio. Las diferentes mutantes se
sometieron a doble digestión con las enzimas Eco RI y KpnI de acuerdo a métodos 3.2.1.4. Carril
1: estándar de tamaño molecular 1 kb Plus DNA ladder. Carril 2: V2aN22QN185QNXT-YFP.
Carril 3: V2bN22QN185QNXT-YFP. Esto se realizó para comprobar el proceso de clonamiento
pb 1 2 3
4.7 kb peYFP-N1
1,2 kb V2a N22QN185Q NXT 1,1 kb V2b N22QN185Q NXT
1000
200
5000
500
3000
2000 1500
700
38
Potencial Umbral
Secuencia Aminoacídica
MLLVSTVSAV PGLFSPPSSP SQSSQEELLD DRDPLLVRAE LALLSTIFVA 50
VALSNGLVLG ALIRRGRRGR WAPMHVFISH LCLADLAVAL FQVLPQLAWD 100
ATDRFHGPDA LCRAVKYLQM VGMYASSYMI LAMTLDRHRA ICRPMLAYRH 150
GGGARWNRPV LVAWAFSLLL SLPQLFIFAQ RDVGQGSGVF DCWARFAEPW 200
GLRAYVTWIA LMVFVAPALG IAACQVLIFR EIHASLVPGP SERAGRRRRG 250
RRTGSPSEGA HVSAAMAKTV RMTLVIVIVY VLCWAPFFLV QLWAAWDPEA 300
PLEIAVSPRS CVACFAVLRG TPHTAWVLKM NPVPQPAPLN STVPRARDPP 350
VATMVSKGEE LFTGVVPILV ELDGDVNGHK FSVSGEGEGD ATYGKLTLKF 400
ICTTGKLPVP WPTLVTTLTY GVQCFSRYPD HMKQHDFFKS AMPEGYVQER 450
TIFFKDDGNY KTRAEVKFEG DTLVNRIELK GIDFKEDGNI LGHKLEYNYN 500
SHNVYIMADK QKNGIKVNFK IRHNIEDGSV QLADHYQQNT PIGDGPVLLP 550
DNHYLSTQSA LSKDPNEKRD HMVLLEFVTA AGITLGMDEL YK 600
Figura 3A: Secuencia aminoacídica y predicción de N-glicosilación de la mutante V2b
N22QN185Q NXT diseñada como proteínas de fusión a YFP. En la parte superior, se destaca
en azul la secuencia aminoacídica de V2bN22QN185Q y en amarillo la que corresponde a YFP.
En los cuadros blancos se muestran las mutaciones puntuales de las Asparraginas 22 y 185,
ambas sustituidas por glutamina. En verde se denota la secuencia de residuos que enlaza la
secuencia de V2bN22QN185Q con la de YFP. Es en esta región, donde se incorporó la secuencia
consenso de N-glicosilación, (residuo de Asn marcado en rojo y en azul los de Ser y Thr). En la
parte inferior, se muestra la gráfica de predicción de N-glicosilación, realizada en el servidor
NetNGlyc 1.0, y se observa que el sitio añadido posee un potencial de N-glicosilación sobre el
umbral, de modo que puede ser modificado por la maquinaria de N-glicosilación del RE.
39
Potencial
Umbral
Secuencia Aminoacídica
MLLVSTVSAV PGLFSPPSSP SQSSQEELLD DRDPLLVRAE LALLSTIFVA 50
VALSNGLVLG ALIRRGRRGR WAPMHVFISH LCLADLAVAL FQVLPQLAWD 100
ATDRFHGPDA LCRAVKYLQM VGMYASSYMI LAMTLDRHRA ICRPMLAYRH 150
GGGARWNRPV LVAWAFSLLL SLPQLFIFAQ RDVGQGSGVF DCWARFAEPW 200
GLRAYVTWIA LMVFVAPALG IAACQVLIFR EIHASLVPGP SERAGRRRRG 250
RRTGSPSEGA HVSAAMAKTV RMTLVIVIVY VLCWAPFFLV QLWAAWDPEA 300
PLERPPFVLL MLLASLNSCT NPWIYASFSS SVSSELRSLL CCAQRHTTHS 350
LGPQDESCAT ASSSLMKDTP SNSTVPRARD PPVATMVSKG EELFTGVVPI 400
LVELDGDVNG HKFSVSGEGE GDATYGKLTL KFICTTGKLP VPWPTLVTTL 450
TYGVQCFSRY PDHMKQHDFF KSAMPEGYVQ ERTIFFKDDG NYKTRAEVKF 500
EGDTLVNRIE LKGIDFKEDG NILGHKLEYN YNSHNVYIMA DKQKNGIKVN 550
FKIRHNIEDG SVQLADHYQQ NTPIGDGPVL LPDNHYLSTQ SALSKDPNEK 600
RDHMVLLEFV TAAGITLGMD ELYK 650
Figura 3B: Secuencia aminoacídica y predicción de N-glicosilación de la mutante V2a
N22QN185Q NXT diseñada como proteínas de fusión a YFP. En la parte superior, se destaca
en azul la secuencia aminoacídica de V2aN22QN185Q y en amarillo la que corresponde a YFP.
En los cuadros blancos se muestran las mutaciones puntuales de las Asparraginas 22 y 185,
ambas sustituidas por glutamina. En verde se denota la secuencia de residuos que enlaza la
secuencia de V2aN22QN185Q con la de YFP. En esta región, se incorporó la secuencia consenso
de N-glicosilación, (residuo de Asn marcado en rojo y en azul los de Ser y Thr). En la parte
inferior, se muestra la gráfica de predicción de N-glicosilación, realizada en el servidor NetNGlyc
1.0, y se observa que el sitio añadido posee un potencial de N-glicosilación sobre el umbral, de
modo que puede ser modificado por la maquinaria de N-glicosilación del RE.
40
4.2. Tratamiento con tunicamicina de las isoformas V2b-YFP, V2a-YFP y de las mutantes
V2aN22QN185QNXT-YFP y V2bN22QN185QNXT-YFP expresadas de forma heteróloga
en el modelo celular COS-7.
Células COS-7 se cultivaron y se transfectaron de forma pasajera durante 24 horas con
V2a-YFP, V2b-YFP y las mutantes V2aN22QN185QNXT-YFP y V2bN22QN185QNXT-YFP.
El cultivo celular se trató con tunicamicina 5 ug/ml, que es un inhibidor de la N-glicosilación de
proteínas, durante el mismo tiempo que fueron transfectadas y posterior a ésto se realizaron
extracciones de proteínas totales solubilizadas con detergentes. Se evaluó la expresión y la
adición de cadenas de oligosacaridos a los sitios aceptores, tanto de las isoformas nativas como
de las mutantes, mediante SDS-PAGE e inmunodetección por Western blotting con anticuerpo
dirigido contra la proteína YFP. La N-glicosilación de una sola secuencia Asn-X-Thr produce un
incremento en la masa molecular aparente, aproximadamente de 2,5 kDa, en este tipo se
separación electroforética.
Para la isoforma V2a nativa fusionada YFP los resultados muestran que posee un perfil
electroforético, con bandas de alta y baja masa molecular aparente, cercana a los 75kDa y 55 kDa
respectivamente. Ambas especies moleculares son sensibles al tratamiento con tunicamicina,
como se observa en el cambio en la migración electroforética (Fig. 4A, carriles 1 y 2). La banda
de mayor masa molecular aparente corresponde a estados de N-glicosilación maduros, producto
del procesamiento del árbol de oligosacáridos en vía secretora y la banda de menor masa
corresponde a estados más tempranos en la dicha vía, en que el árbol de oligosacáridos aún se
encuentra inmaduro. Al contrario de V2a, para la isoforma V2b fusionada al extremo N-terminal
de YFP, solo se observa una banda, la cual es sensible a tratamiento con tunicamicina, debido al
cambio en la movilidad electroforética que se muestra en la figura 4B, carriles 1 y 2.
41
Figura 4. Inmunodetección de las isoformas V2a, V2b y de las mutantes
V2aN22QN185QNXT y V2bN22QN185QNXT generadas como proteína de fusión a YFP,
posterior al tratamiento con tunicamicina. Se realizaron transfecciones pasajeras en células
COS-7 por 24 horas. Posteriormente se aislaron extractos proteicos totales, los que se sometieron
a SDS-PAGE. La inmunodetección en Western blot se realizó con anticuerpo policlonal dirigido
contra GFP (anti-GFP, 1:10.000). (A) Carril 1: V2a-YFP sin tratamiento con tunicamicina. Carril
2: V2a-YFP tratado con tunicamicina 5ug/ml. Carril 3: V2aN22QN185QNXT-YFP sin
tratamiento con tunicamicina. Carril 4: V2aN22QN185QNXT-YFP tratado con tunicamicina.
(B.) Carril 1: V2b-YFP sin tratamiento con tunicamicina. Carril 2: V2b-YFP tratado con
tunicamicina 5ug/ml. Carril 3: V2bN22QN185QNXT-YFP sin tratamiento con tunicamicina.
Carril 4: V2bN22QN185QNXT-YFP tratado con tunicamicina. Las flecha rojas indica especies
moleculares N-glicosiladas, las negras indican las que no se encuentran N-glicosiladas.
117
90
49
117
90
49
kDa kDa
A B
Tun. - + - + Tun. - + - +
1 2 3 4 1 2 3 4
42
Con respecto a la mutante V2bN22QN185QNXT-YFP, diseñada con el fin de obtener
datos de la topología del extremo carboxilo terminal de V2b y que carece de las secuencias
consenso de N-glicosilación nativas, en las posiciones 22 y 185, muestra un cambio en la
movilidad electroforética debido al tratamiento con tunicamicina, por lo tanto la secuencia Asn-
X-Thr incorporada después del último residuo de la proteína está siendo modificada. Sin
embargo, también se observa una banda que corresponde a una especie molecular que no se N-
glicosila (Fig 4B, carriles 3 y 4). En tanto la construcción V2aN22QN185QNXT-YFP, no es
sensible al tratamiento con tunicamicina debido a que no se observa cambio alguno en la
movilidad electroforética. Esto indica que el sitio de N-glicosilación añadido no es modificado,
que era lo que se esperaba debido a que V2a posee un extremo carboxilo terminal orientado hacia
el citosol (Fig 4A, carriles 3 y 4).
Los resultados obtenidos a partir de la mutante V2bN22QN185QNXT-YFP indican la
existencia de una especie molecular de V2b cuyo extremo carboxilo terminal se orienta hacia el
lumen del ER lo que se infiere a partir de la N-glicosilación de la secuencia Asn-X-Thr
incorporada después del último residuo de la proteína. Esto implica que esta isoforma, en un
primer análisis, solo posee seis segmentos transmembrana, cuya estructura se representa en la
figura 5A. Sin embargo, en este experimento, no se puede descartar la posibilidad de que también
exista una especie molecular que si posea un segmento transmembrana VII, con el carboxilo
terminal orientado hacia el citosol, debido a que aparece una banda que corresponde a la especie
no glicosilada del V2bN22QN185QNXT-YFP. La estructura correspondiente a este caso se
representa en la figura 5B.
Además, estos experimentos sugieren que de los dos sitios putativos de N-glicosilación
que posee V2b nativo, solo uno es modificado, debido a que su migración electroforética es
43
B
C
I II III IV VI VII V
N
c c
YFP
N185Q
NXT
N22Q
A
I II III IV VI V
N
c
c
C YFP
N185Q
NXT
N22Q Figura 5. Representación gráfica de la topología de las dos especies moleculares deducidas
del análisis de N-glicosilación de V2bN22QN185QNXT-YFP.
En rojo se muestran las mutaciones puntuales, en que se sustituyen las Asparragina por glutamina
de modo de eliminar las secuencias consenso de N-glicosilación nativas de V2b. En azul se
muestra la secuencia Asn-X-Thr incorporada después del último residuo de V2b, continuándose
con YFP. (A) Especie molecular de V2b que orienta su extremo carboxilo hacia el lumen del RE
ya que el sitio Asn-X-Thr remarcado en azul se N-glicosila. (B) Especie molecular que posee un
segmento transmembrana VII putativo, que se explica porque existe parte de
V2bN22QN185QNXT-YFP sin un árbol glicosidico.
Citosol
Lumen
Lumen
Citosol
44
similar con la de la mutante V2bN22QN185QNXT-YFP, que tiene una sola secuencia de N-
glicosilación. Datos en la bibliografía, indican que la Asn 22 es la que se modifica (Innamorati y
col., 1996) y por lo tanto la que se encuentra en la posición 185 no está siendo N-glicosilada. Lo
mismo estaría ocurriendo para la isoforma V2a ya que ambas isoformas poseen igual secuencia
aminoacídica en esta región.
45
A fin de continuar la determinación de la orientación del extremo carboxilo terminal de
V2b y poder definir su topología, se diseñó una construcción que comprende solo el dominio C-
terminal de V2b, desde el residuo 242 al 339, que involucra el segmento de transmembrana VI y
el VII putativo. Del mismo modo, se generó el dominio C-terminal de V2a, que va desde el
residuo 242 al 371 de V2a. A ambas, se les incorporó las secuencia Asn-X-Thr después del
último residuo, al lado carboxiterminal y luego se fusionaron al extremo N-terminal de YFP y se
procedió a analizar si se N-glicosila o no dicho sitio, tal como se hizo para las isoformas V2a y
V2b enteras. Las construcciones se denominaron V2a 242 tail NXT-YFP y V2b 242 tail NXT-
YFP.
Los resultados de la figura 6, (carriles 1 y 2), indican que V2b 242 tail NXT-YFP posee
una sola especie molecular, la cual se encuentra N-glicosilada y por ende el extremo carboxilo
terminal se orienta netamente hacia el lumen del RE, lo que sugiere que no se formaría un
segmento TM VII, lo que se representa gráficamente en la figura 7A. V2a 242 tail NXT-YFP se
compone de los segmentos de transmembrana VI y VII de V2, y se utilizó como control de no N-
glicosilación ya que el modelo topológico descrito para V2 indica que el extremo carboxilo
terminal se orienta hacia el citosol. Sin embargo los resultados para esta construcción muestran
dos especies moleculares (Fig. 6, carriles 3 y 4), una que no se N-glicosila y que por lo tanto
supone la formación de los segmentos transmembrana VI y VII y otra que si es modificada en la
secuencia Asn-X-Thr, y que indica la no formación del segmento transmembrana VII, lo que se
representa gráficamente en la figura 7B. Estos últimos datos muestran que la formación del
segmento transmembrana VII de V2a requiere, en parte, del extremo N-terminal de V2. En el
caso de V2b, el extremo N-terminal del receptor también esta influenciando la formación del
segmento TM VII, que se propuso en el experimento anterior, que se muestra en la figura 4 y 5.
46
Figura 6. Inmunodetección de las construcciones V2a 242 tail NXT y V2b 242 tail NXT
generadas como proteína de fusión a YFP, posterior al tratamiento con tunicamicina.
Se realizaron transfecciones pasajeras en el modelo celular COS-7 durante 24 horas, y se
trataron las construcciones con tunicamicina durante el mismo tiempo. Posteriormente se aislaron
extractos proteicos totales, los que se sometieron a SDS-PAGE. La inmunodetección en Western
blot se realizó con anticuerpo policlonal dirigido contra GFP (antiGFP, 1:10.000). Carril 1: V2b
242 tail NXT-YFP sin tratamiento con tunicamicina. Carril 2: V2b 242 tail NXT-YFP tratado con
tunicamicina 5ug/ml. Carril 3: V2b 242 tail-YFP sin tratamiento con tunicamicina. Carril 4: V2a
242 tail NXT-YFP tratado con tunicamicina. Carril 5: V2a 242 tail NXT-YFP sin tratamiento con
tunicamicina. Carril 6: V2a 242 tail-YFP tratado con tunicamicina 5ug/ml. Las flecha rojas indica
especies moleculares N-glicosiladas, las negras indican las que no se encuentran N-glicosiladas.
1 2 3 4 5 6
Tunicamicina 5 ug/ml - + - - + -
117
90
49
35
26
kDa
47
I
II IV VI V
C YFP
NXT
N
NXT YFP
A
B
YFP NXT
Figura 7. Representación gráfica de la topología de las construcciones (A.) V2b 242 tail
NXT-YFP y (B.)V2a 242 tail NXT-YFP. (A.) Topología del dominio C-terminal de V2b-YFP,
deducida a partir de la N-glicosilación del sitio Asn-X-Thr incorporado en la posición 340 de la
proteína de fusión, el cual se indica en azul. Se observó que el extremo carboxilo terminal se
orienta netamente hacia el lumen del RE (B.) Topología del dominio C-terminal de V2a-YFP
deducida a partir de la N-glicosilación del sitio Asn-X-Thr en la posición 372 de la proteína de
fusión, el cual se denota en azul. Se observaron dos especies moleculares, una que se N-glicosila,
lo que indica una orientación del extremo C-terminal hacia el lumen del RE y otra que no se N-
glicosila, lo que implica la formación de los segmentos de transmembrana VI y VII, con una
orientación del extremo carboxilo terminal hacia el citosol.
VI VII
c c
N
C
VI
VII c c
N
C
Lumen
Lumen Lumen
Citosol Citosol
242
242 242
340
372
372
48
4.3. Determinación de la orientación del extremo carboxilo terminal de V2b mediante
ensayos de accesibilidad de anticuerpos a epítopes en células semipermeabilizadas con
digitonina.
Los experimentos anteriores muestran que la isoforma V2b orienta su extremo carboxilo
terminal hacia el lumen del RE, lo que implica que posee sólo seis segmentos transmembrana.
Sin embargo no es posible aún, descartar la posibilidad de la formación de un segmento
transmembrana VII. Es por ello que se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI)
que permitió visualizar la accesibilidad de anticuerpo a su respectivo epítope, localizado en el
extremo carboxilo terminal de V2b, en células fijadas en paraformaldehído (PFA) 4% y
semipermeabilizadas con bajas concentraciones de digitonina. Este reactivo se intercala en
membranas ricas en colesterol lo que provoca que se formen perforaciones en estas estructuras.
Es así que el efecto permeabilizante de la digitonina se limita a la membrana plasmática ya que
esta posee mayor concentración de colesterol que las membranas de los organelos intracelulares,
de modo que estos no son afectados, si son usadas concentraciones apropiadas de digitonina. De
modo que en una proteína de membrana, que se encuentre en el intracelular, las regiones de ella
que se orienten hacia el citosol serán detectadas por microscopía de fluorescencia en células
selectivamente permeabilizadas con digitonina y por el contrario la detección de dominios que
están hacia el lumen de organelos intracelulares no serán detectados de esta forma y requerirán
que las células sean tratadas con Tritón X-100 o metanol, tal como se hizo en esta ocasión.
Se diseñó para el ensayo, la construcción HAV2b-CFP, en donde el epítope HA se
encuentra en el extremo amino terminal y la proteína fluorescente cian (CFP), en el extremo
carboxilo terminal. Se expresó HAV2b-CFP en el modelo celular COS-7 durante 24 horas,
posteriormente las células transfectadas fueron tratadas con digitonina seguido de la fijación con
49
PFA 4%. Se prosiguió con la inmunofluorescencia, para lo cual se incubaron las preparaciones
con ambos anticuerpos, tanto anti-CFP como anti-HA, siendo estos detectados con Alexa Fluor
633 y Alexa Fluor 488 respectivamente. Hay que notar que CFP es utilizada como molécula
reportera de expresión de la proteína de interés y además, que en función de la accesibilidad del
anticuerpo dirigido contra ella, se definirá la orientación del extremo C-terminal de la isoforma
V2b. Las configuraciones del camino óptico utilizado en el microscopio confocal para CFP,
Alexa 488 y Alexa 633 se detallan en métodos 3.2.3.2.2., los cuales se establecieron de tal modo
que no existan contaminaciones entre los canales de registro de los fluoróforos empleados.
Los resultados obtenidos se muestran en la figura 8A. A través de microscopía confocal
se reveló que CFP no es detectado, mediante inmunofluorescencia, en células fijadas con PFA
4% sin permeabilizar, pero al tratarlas con digitonina, CFP es accesible a su anticuerpo y se
observa señal. Esto último no ocurre con el epítope HA y sólo se detecta cuando las células son
fijadas con metanol, lo cual expone ambos epítopes, HA y CFP, independientemente de su
orientación en la membrana de los compartimientos intracelulares. Esto indica que el extremo
amino terminal de V2b se encuentra en el lumen del ER, tal como se esperaba, y lo más
importante, es que estos experimentos muestran que el extremo carboxilo terminal, de esta
isoforma, esta expuesto al citosol, lo que implica la formación de un nuevo segmento
transmembrana VII.
Como control de este experimento se usó la construcción HAV2a-CFP, en donde el
epítope HA se encuentra en el extremo amino terminal y CFP en el extremo carboxilo terminal.
Para la isoforma V2a es conocida su topología, la cual indica que su extremo amino terminal se
orienta hacia el extracelular y su carboxilo terminal al intracelular. El análisis de las imágenes
obtenidas por microscopía confocal, (Figura 8B), muestran que CFP es detectado a través de
50
Figura 8A. Determinación de la topología del extremo carboxilo terminal de V2b mediante
ensayos de accesibilidad de anticuerpos a epítopes. Células COS-7 expresando por 24 horas la
construcción HAV2b-CFP. En la fila 1 se muestra una preparación fijada en metanol, En la fila 2,
las células transfectadas fueron fijadas en PFA 4%, y no se permeabilizaron con digitonina. En la
fila 3 se fijó la preparación con PFA 4% y semipermeabilizó con digitonina 20 ug/ml, por un
minuto. La IFI, implicó la incubación con ambos anticuerpos, tanto anti-CFP como anti-HA,
siendo estos detectados con Alexa Fluor 633 y Alexa Fluor 488 respectivamente. En la columna 1
se muestra la expresión de la construcción generada como proteína de fusión a CFP. En las
columnas 2 y 3 se muestran las señales registradas de las IFI contra el epítope HA y CFP,
respectivamente. Las imágenes son de microscopio confocal. La barra representa 30 um.
CFP αHA αCFP
1 2 3
1
3
2
51
1
Figura 8B. Determinación de la topología de la isoforma V2a mediante ensayos de
accesibilidad de anticuerpos a epítopes. Células COS-7 expresando por 24 horas la
construcción HAV2a-CFP. En la fila 1 se muestra una preparación fijada en metanol, En la fila 2,
las células transfectadas fueron fijadas en PFA 4%, y no se permeabilizaron con digitonina. En la
fila 3 se fijó la preparación con PFA 4% y semipermeabilizó con digitonina 20 ug/ml, por un
minuto. La IFI, implicó la incubación con ambos anticuerpos, tanto anti-CFP como anti-HA,
siendo estos detectados con Alexa Fluor 633 y Alexa Fluor 488 respectivamente. En la columna 1
se muestra la expresión de la construcción generada como proteína de fusión a CFP. En las
columnas 2 y 3 se muestran las señales registradas de las IFI contra el epítope HA y CFP,
respectivamente. Las imágenes son de microscopio confocal. La barra representa 30 um.
CFP αHA αCFP
1 2 3
1
2
3
52
inmunofluorescencia en células fijadas con PFA 4% y permeabilizadas con digitonina, lo que no
acontece, en las células que no fueron permeabilizadas. Al contrario de lo que se observa para
HAV2b-CFP, el epítope HA se detecta tanto en células sin permeabilizar como en aquellas que si
fueron tratadas con digitonina. Esto se debe a que la isoforma V2a alcanza la superficie celular,
de modo que expone su extremo amino terminal hacia el medio extracelular. Por lo tanto, la señal
que se observa, es exclusivamente proveniente del borde celular y no de las estructuras que se
encuentran en el intracelular.
53
4.4. Inmunocolocalización de la proteína de fusión V2b-CFP con el marcador de Golgi 58K,
en células COS-7 semipermeabilizadas con digitonina.
Se presentó en el ensayo anterior, evidencia de que el extremo carboxilo terminal de la
isoforma V2b se orienta hacia el citosol, lo que explicaría la formación de un segmento
transmembrana VII. En vista de esto, se analizó si dicha proteína logra sortear el control de
calidad del RE y alcanzar el aparato de Golgi. Para este objetivo se transfectaron células COS-7
de forma pasajera durante 48 horas, con la construcción HAV2b-CFP. En las últimas 24 horas de
expresión el cultivo celular fue privado de suero con la finalidad de sincronizar y estabilizar el
ciclo celular dentro de la población, en un estado que permita una mejor diferenciación
morfológica de los organelos intracelulares, entre ellos el aparato de Golgi, que es el que interesa
en este caso. Posteriormente, las células transfectadas fueron tratadas con digitonina, fijadas con
PFA 4%, seguido de la realización de una IFI, que consistió en la incubación simultánea de los
primeros anticuerpos dirigidos contra CFP y la proteína marcadora de Golgi 58K, los que fueron
detectados mediante Alexa Fluor 633 y Alexa Fluor 488, respectivamente.
A través de microscopía confocal se registró el plano focal de la organela en estudio y este
fue usado para registrar la señal de la IFI que marca el epítope CFP, ubicado en el C-terminal de
V2b. Luego ambas imágenes fueron sometidas al análisis de co-localización a través del
algoritmo ICA (Intensity Correlation Analysis).
La figura 9 muestra la co-localización entre la IFI contra CFP y el marcador de Golgi
58K. Este resultado indica que la isoforma V2b que posee el extremo carboxilo terminal
orientado hacia el citosol alcanza el aparato de Golgi, lo que indica que esta proteína adquiere un
plegamiento tal que le permite pasar el control de calidad que se impone en el RE.
54
α58K
Figura 9: Inmunocolocalización del extremo carboxilo terminal de V2bCFP con el
marcador de Aparato de Golgi, 58K, en células COS-7 semipermeabilizadas con digitonina.
Células COS-7 se transfectaron con la construcción HAV2bCFP durante 48 horas (Panel 1). Las
últimas 24 horas de expresión, el cultivo celular fue privado de suero. Luego, el cultivo celular
fue tratado con digitonina 20 ug/ml por 1 minuto, fijada en PFA 4% y se incubaron las
preparaciones con los anticuerpos primarios, anti-CFP y anti-58K, siendo estos detectados con
Alexa Fluor 633 (Panel 3) y Alexa Fluor 488 (Panel 2) respectivamente. Se tomaron los registros
de las IFI realizadas a CFP y al marcador de Golgi 58K y se procedió a realizar un análisis de co-
localización, para lo cual se utilizó el método ICA (Panel 4). En panel 1 se observa la
fluorescencia emitida por CFP, la cual se utilizó para verificar células transfectadas con la
construcción en estudio. Las imágenes fueron tomadas a través de microscopía confocal. La
barra representa 30 um.
CFP α58K αCFP ICA
1 2 3 4
55
4.5. Predicción de la Topología de la isoforma V2b.
El conocimiento de la estructura de proteínas integrales de membrana es crucial para
entender su función. Sin embargo ha sido difícil obtener estructuras tridimensionales de alta
resolución de este tipo de proteínas, por lo que aspectos importantes, tales como su topología han
tenido que ser investigados a través de métodos bioquímicos y predictivos. Es en estos últimos
que la bioinformática se ha convertido en una herramienta muy útil, ya que al ir lográndose un
mayor entendimiento de la complejidad de la biosíntesis de las proteínas de membrana, se han
diseñado algoritmos que pueden predecir su topología. En la internet se encuentran disponibles
una gran variedad de métodos de predicción de topología, que sólo requieren la secuencia
aminoacídica de la proteína de interés. Por lo tanto, con el fin de obtener información topológica
acerca del extremo carboxilo terminal de la isoforma V2b, se utilizaron algunos de los métodos
disponibles y se compararon los resultados obtenidos con cada uno de ellos (Figura 10).
Una primera aproximación de la posición relativa de los segmentos TM de la isoforma
V2b de rata fue estimada desde el perfil de hidrofobicidad con el algoritmo de Kyte-Doolittle,
utilizando una ventana de 19 residuos de aminoácidos. Los resultados indican que la nueva
secuencia en V2b, generada por el corrimiento en el marco de lectura que implica el empalme
alternativo, posee una hidrofobicidad promedio y extensión del segmento que la alberga, similar
al que constituye el segmento de transmembrana VII de V2a (Fig. 10A, comparar línea en rojo
para V2b con la correspondiente línea en negro de V2a).
Otro predictor bastante usado es el llamado TMHMM 2.0, cuyas siglas en inglés
corresponden a transmembrane hidden Markov models, el cual es un algoritmo capaz de analizar
residuos que tienden a ocupar definidas regiones en proteínas integrales de membrana, ya sea
límites del segmento transmembrana o en dominios citosólicos o luminales. El análisis de la
56
50 100 150 200 250 300 350
2.0
1.0
0.0
-1.0
-2.0
I II III IV V VI VII I II III IV V VI
V2a V2b
Transmembrana Extracelular Intracelular
Figura 10A: Algoritmo de Kyte-Doolittle: Se empleó una ventana de 19 residuos de
aminoácidos. La línea en negro indica el perfil obtenido para la secuencia del receptor V2a de
vasopresina. La línea en rojo indica el perfil obtenido para la secuencia diferente en la variante
V2b. Los números romanos sobre cada uno de los esquemas indican los putativos segmentos de
TM I a VII.
Figura 10B: Predicción de la topología de V2a y V2b mediante el servidor TMHMM v2.0.
Los dominios de transmembrana predichos se destacan en rojo. En líneas rosadas se muestran las
regiones extracelulares y en azul, las que se orientan hacia el intracelular. Los números romanos
sobre cada uno de los esquemas indican los putativos segmentos de TM I a VII.
57
V2a
V2b
V2a V2b
Figura 10C: Método de predicción MemBrain. En azul se muestra la curva que representa los
segmentos transmembrana tanto de V2a como de V2b. Los números romanos sobre cada uno de
los esquemas indican los putativos segmentos de TM I a VII.
Figura 10D: Predicción de los dominios de TM de las isoformas V2a y V2b mediante el
método OCTOPUS. Las líneas café representan regiones extracelulares, las verdes aquellas que
son intracelulares y en rectángulos rojos se muestran los segmentos de transmembrana predichos.
Los números romanos sobre cada uno de los esquemas indican los putativos segmentos de TM I a
VII.
I II III IV V VI VII
I II III IV V VI VII
I II III IV V VI VII I II III IV V VI VII
58
secuencia de V2b muestra que esta proteína posee una topología de solo seis segmentos
transmembrana siendo la probabilidad de la formación del segmento transmembrana VII casi
nula. Como comparación se observa la topología predicha, de siete dominios transmembrana,
para la isoforma V2a (Figura 10B).
En este último tiempo más estructuras de alta resolución de proteínas integrales de
membrana se encuentran disponibles y es por este hecho que se han diseñado nuevos predictores
de hélices transmembrana, que utilizan nuevos algoritmos que permiten mejorar la exactitud de la
predicción. Uno de ellos es el que se denomina MemBrain, que tiene la capacidad de predecir la
región terminal de una hélice de transmembrana y por lo tanto detectar tamaños irregulares de
estas estructuras, inclusive aquellas que poseen menos de 15 residuos aminoacídicos. Para la
isoforma V2b, el análisis mediante MemBrain, muestra la posible formación de una hélice
transmembrana corta en el extremo carboxilo terminal, lo que implicaría que esta región se
oriente hacia el citosol de la célula y por ende que V2b tenga una topología de siete segmentos
transmembrana (Figura 10C).
OCTOPUS son las siglas con se denomina a otro predictor que trata de mejorar las
predicciones de topología con respecto a algoritmos antecesores. Este método incluye la
predicción de regiones de proteínas integrales que se insertan a diferentes profundidades de la
membrana y que no necesariamente la atraviesan. Además este algoritmo esta diseñado de
manera de evitar la sobre predicción de hélices de transmembrana, asegurando una mayor
exactitud y junto a esto, definir la correcta orientación en la membrana de los dominios
predichos. De esta manera, la estructura de V2b, fue analizada a través de este algoritmo. La
predicción muestra una topología de siete dominios transmembrana, lo que sugiere que el
extremo carboxilo terminal se encuentra expuesto hacia el citosol (Figura 10D).
59
5. Discusión
Los receptores acoplados a proteína G son producto de la expresión de una gran
superfamilia de genes, lo que es reflejado por los numerosos ligandos que pueden ser
específicamente reconocidos en la superficie de cada tipo celular. Esta diversidad de expresión,
se vio que era aun mayor con el descubrimiento de eventos de empalme alternativo del mRNA de
este tipo de genes (Minneman, 2001). De esta manera se comenzaron a investigar estos procesos
tanto a nivel transcripcional como traduccional y es así que, a través de los últimos años, se han
descrito los tipos de eventos de empalme alternativo que generan múltiples mRNA maduros, a
partir de un solo gen, y además se ha analizado la expresión de dichos transcritos (Markovic y
Challis, 2009). A su vez, estas proteínas denominadas variantes de empalme, han sido estudiadas
y se han revelado importantes aspectos acerca de los cambios estructurales que sufren en relación
a la estructura típica de un GPCR y de sus potenciales funciones a nivel fisiológico.
El cambio en el marco de lectura que se produce en la variante de empalme V2b
(Sarmiento y col., 2004) genera cambios estructurales con respecto a la isoforma V2a, la cual
representa la estructura común de un GPCR. De modo que este trabajo se orientó a definir la
topología de esta proteína, especialmente en el extremo C-terminal, que es la región que difiere
en la secuencia, con respecto a V2a.
Mediante mutagénesis sitio dirigida se incorporó una secuencia consenso de N-
glicosilación, Asp-X-Thr después del último residuo de la mutante V2bN22QN185Q, la cual se
fusionó al extremo N-terminal de YFP (Figura 2, carril 3; Figura 3A). Esta proteína de fusión
permitió obtener una primera aproximación de la topología del extremo carboxilo terminal de
V2b. Esto, debido a que la N-glicosilación es una modificación co-traduccional, que ocurre solo
60
en el lumen del RE (Van Geest y Lolkema, 2000), por lo tanto, el sitio añadido se utilizó como
reportero de la orientación de la región de V2b en estudio. Los resultados se obtuvieron a través
de la comparación del perfil electroforético de extractos de células con y sin tratamiento con
tunicamicina. Estos análisis indican que V2b es una proteína que contendría 6 segmentos de
transmembrana, con ambos extremos dirigidos hacia el lumen del RE, como también habría una
proporción de la isoforma V2b que contendría 7 dominios de transmembrana (Figura 4B, carril 3
y 4; Figura 5). Una topología con 6 dominios ha sido ya observada en otros casos, como lo son
algunas variantes de empalme del α1 adrenoceptor (α1-AR) (Cogé y col., 1999) y la variante
CTRΔe13 del receptor de calcitonina de conejo (Seck y col, 2005). Es importante destacar que la
topología de CTRΔe13 fue determinada experimentalmente y no mediante el uso de algoritmos
de predicción. Ahora bien, para determinar de manera clara, si la isoforma V2b adquiere una
conformación de 7 dominios transmembrana y que el extremo carboxilo terminal se encuentre
dispuesto hacia el citosol, se realizó el ensayo de accesibilidad de anticuerpos en células
permeabilizadas con digitonina. A través de este tipo de experimentos se ha podido estudiar la
topología de una variedad de proteínas de membrana que quedan retenidas en el intracelular, ya
que la digitonina tiene la propiedad de permeabilizar solo la membrana plasmática al ser usada en
concentraciones y tiempos de tratamiento adecuados (Diaz y Stahl 1989; Eckhardt y col., 1999;
Harano y col., 1999). De modo que por medio de IFI, se detectan solo los epítopes que se
dispongan hacia el citosol puesto que los que se orientan hacia el lumen de compartimientos
intracelulares no son accesibles a los anticuerpos. V2b se etiquetó con los epítopes HA y CFP, en
el amino y carboxilo terminal respectivamente, de los cuales sólo CFP fue detectado mediante
IFI, en células permeabilizadas con digitonina, resultados que indicaron que el carboxilo terminal
de V2b está hacia el citosol (Fig.8A), y que por ende la nueva secuencia de residuos
61
aminoacídicos en V2b, generada por el empalme alternativo, forma un nuevo segmento TM VII,
completamente distinto al de V2a.
Es importante señalar que YFP no entorpece en los resultados obtenidos de la topología
de V2b. Esta afirmación se apoya en que existen varias técnicas destinadas a estudiar la topología
de proteínas de membrana que involucran la generación de proteínas de fusión, tales como las
que utilizan enzimas (Boyd, 1994; Silhavy y col., 1977) o aquella en la cual se usa GFP,
denominada FPP (cuyas siglas en inglés son fluorescence protease protection) (Lorenz y col.,
2006).
Una vez obtenidos datos experimentales acerca de la topología de la isoforma V2b, estos
se compararon con los que entregan los algoritmos de predicción disponibles en la red (Figura
10). Los resultados obtenidos de esta ultima forma fueron variables con respecto a la formación
de la putativa hélice transmembrana VII de la isoforma V2b. TMHMM (Tusnady y Simon, 1998;
Tusnady y Simon, 2001; Krogh y col., 2001) (Figura 10B) y el algoritmo OCTOPUS (Viklund y
col., 2008) (Figura 10D) mostraron resultados contrarios, el primero predijo una topología de
sólo seis dominios transmembrana mientras que el segundo si identificó una VII hélice que
atraviesa la membrana y que expone el extremo carboxilo terminal hacia el citosol. Esta
disparidad entre diferentes predictores ha sido observada para otras proteínas integrales de
membrana, como es el caso del intercambiador aniónico 1 (AE1), para el que, la predicción del
número, orientación y límites de los dominios de TM depende del algoritmo utilizado (Ott y col.,
2002). Se plantea que motivos comunes de error en la predicción son la existencia de dominios de
TM más cortos que lo usualmente observado o bien que estos presentan residuos cargados (Ott y
col., 2002). Precisamente, esta última situación se observa en la secuencia aminoacídica que
forma la hélice VII de V2b, en la que se evidencian dos residuos de arginina, que en condiciones
62
fisiológicas, su cadena lateral está cargada positivamente. Junto a esto, el algoritmo de predicción
MemBrain (Shen y Chou, 2008) (Figura 10C), que tiene la capacidad de predecir tamaños
irregulares de hélices de TM, muestra la posible formación de una hélice VII corta en V2b,
compuesta de menos de 15 residuos aminoacídicos, lo que no puede hacer TMHMM ya que no
detecta hélices de TM que posean menos de 16 residuos (Shen y Chou, 2008) y, además, no
permite identificar características de los límites de las secuencias en estudio, lo cual es una de las
razones de la elaboración de nuevos y mejores algoritmos predictivos, para los modelos ocultos
de Markov (HMM) (Brown y Truszkowski, 2010). De esta forma los puntos mencionados
anteriormente explican porque TMHMM no predice un dominio de TM VII en V2b al contrario
que los demás algoritmos utilizados en este trabajo. De modo que, tomando en cuenta tanto los
datos de predicción como los experimentales, es posible demostrar que V2b tiene un segmento de
transmembrana VII, pero que la inserción de este segmento en la membrana no ocurre de manera
eficiente.
La dificultad para determinar la topología de proteínas politópicas, como lo es V2b, ya sea
mediante métodos predictivos o experimentales radica en que son muchos los factores que
regulan su biosíntesis, el reconocimiento, orientación e integración en la bicapa lipídica de cada
dominio transmembrana, y que por lo tanto estos procesos son muy complejos y no implican solo
la composición aminoacídica. Entre otros importantes factores que permiten el correcto
plegamiento, se ha descrito que las interacciones entre los múltiples dominios de TM que
conforman este tipo de proteínas, son fundamentales para su eficiente integración en la
membrana al momento de la síntesis en el RE, lo cual ha sido reportado en un número importante
de casos en la literatura, entre los que destacan estudios acerca de la biogénesis del regulador de
la conductancia de transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) (Sadlish y Skach, 2004) , la
63
glicoproteína-P (Enquist y col., 2009) y del receptor de adenosina A2A (Thévenin y col., 2005;
Thévenin y Lazarova, 2008) que es miembro de la superfamilia de los GPCRs. El aspecto
señalado anteriormente ha sido blanco de varios estudios, debido a que muchos dominios de TM
que conforman proteínas politópicas no se prevé que sean suficientemente hidrofóbicos para
insertarse en la membrana del RE por si solos (Hessa y col., 2007; White y von Heijne 2008) , lo
cual sólo se lograría de manera correcta, en el contexto de la proteína entera, siendo
trascendentales los segmentos intracelulares y extracelulares flanqueantes, así como también
dominios de TM adyacentes en la estructura proteica final. Estos detalles se han obtenido a partir
de proteínas de múltiples segmentos de TM con estructura tridimensional conocida, de las cuales
se han analizado los segmentos hidrofóbicos y posteriormente estudiado su eficiencia de
inserción en la membrana a través de ensayos que permiten cuantificar dicho proceso (Hessa y
col., 2005; Hedin y col., 2009). Además se ha planteado la posibilidad de que re-arreglos post-
inserción estén implicados en el plegamiento (Hedin y col., 2009).
Dados los antecedentes anteriores es posible explicar los resultados obtenidos con la
construcción correspondiente al dominio C-terminal de V2b, que comprende el TM VI y TM VII.
En esta construcción, el TM VII de la isoforma V2b, es incapaz de integrarse en la membrana en
la ausencia del dominio N-terminal, que está compuesto por los segmentos TM I al TM V (Figura
6, carril 1 y 2). Similar resultado se aprecia en la mutante truncada del dominio C-terminal de
V2a, en que el TM VII se inserta sólo parcialmente en la membrana (Figura 6, carril 4 y 5), al
contrario de lo que ocurre con la proteína entera, en donde este dominio se inserta eficientemente
(Figura 4A, carril 3 y 4). Además, estos datos se correlacionan con la baja hidrofobicidad
promedio de los TM VII, tanto de V2b como de V2a, que se observa con el algoritmo de Kyte-
Doolittle (Kyte y Doolittle, 1982) (Figura 10A). Estos datos llevan a proponer que en V2a y V2b,
64
la inserción del TM VII puede estar influida por otros dominios de TM, de modo que la
interacción entre ellos es fundamental para el plegamiento en un ambiente hidrofóbico.
Estudios acerca del mecanismo de la biogénesis de proteínas integrales de membrana
apoyan la idea planteada en los párrafos anteriores. En este complicado proceso participan el
ribosoma, que se encarga de la síntesis de la cadena polipeptídica y el complejo proteico
denominado translocón, que dirige de manera ordenada, la orientación y la integración de los
dominios de transmembrana en la bicapa lipídica del RE (Crowley, Reinhart & Johnson, 1993;
Crowley et al., 1994). Para proteínas de múltiples dominios de TM, como las isoformas V2a y
V2b, aún no son suficientes los estudios que clarifiquen como el complejo ribosoma-translocón
establece la topología, ya que los mecanismos que se han establecido para proteínas de un único
segmento transmembrana y aquellas que son de secreción, no todos son contundentes para
explicar cómo se forman ciertas características de esta clase de proteínas (Ott y col., 2002). Sin
embargo, recientes observaciones acerca de biosíntesis de la proteína integral de membrana,
aquaporina 4, han revelado ciertos detalles interesantes. En general, los segmentos de TM se van
sintetizando en la membrana de forma ordenada, desde el N- al C-terminal de la proteína. No
obstante, ciertos dominios de TM son capaces, una vez sintetizados de abandonar completamente
el translocón y en una etapa posterior volver a este complejo proteico, en el momento justo
cuando un dominio de TM río abajo en la secuencia aminoacídica, está entrando en el canal del
translocón (Sadlish y col., 2005). Estos análisis llevaron a los autores de este trabajo indicar que
el translocón es un complejo proteico dinámico que permite la interacción entre sí, de las
múltiples hélices de transmembrana, a medida que se van plegando durante las etapas tempranas
de la integración en la bicapa lipídica.
65
Otro aspecto del plegamiento de proteínas de membrana es la orientación de los dominios
de TM, lo cual está referido a que una secuencia hidrofóbica puede estar en equilibrio, entre un
estado en el cual atraviesa la membrana (estado TM) y uno en que no lo hace (estado no TM),
significando esto último que la secuencia en cuestión se encuentra sólo en contacto con la
superficie de la membrana, más precisamente en una zona conocida como la interfase de la
bicapa lipídica (London y col., 2009). Se ha reportado que el equilibrio entre estos dos estados y
por ende la orientación, es regulada por la relación entre la longitud del dominio de TM y el
espesor de la bicapa, lo que a su vez varía de acuerdo a la concentración de colesterol que esta
posea. Cuando el espesor de la bicapa excede la longitud del dominio de TM se induce el estado
no TM, lo cual también es favorecido por el colesterol ya que tiende a aumentar el grosor de la
bicapa lipídica (Ren y col., 1997). Esto es importante tener en cuenta para los resultados
obtenidos de la orientación del TM VII de V2b, debido a que estos indicaron que este segmento
está orientado tanto en estado TM como en uno, no TM, tal como se esquematiza en la figura 5A
y 5B. Además cabe recordar que el algoritmo Membrain predijo en la isoforma V2b, un TM VII
de longitud corta (Fig. 10C), por lo tanto estos datos podrían explicar mejor los resultados
obtenidos en este trabajo. Se ha observado que hélices de TM de longitud corta, que poseen
menos de 15 residuos son eficientemente insertadas en la membrana, siendo el proceso mediado
por el translocón (Jaud y col., 2009). A su vez esto también ha sido comprobado en diseños de
bicapas de fosfolípidos, en las cuales se ha evaluado la incorporación de péptidos sintéticos
correspondientes a hélices de TM cortas, observándose que son capaces de adquirir una
configuración de transmembrana estable (Jaud y col., 2009; Krishnakumar y London, 2007).
Ahora bien, siendo que se ha descrito que es necesario alrededor de 20 residuos para cruzar el
centro hidrofóbico de la membrana, se ha postulado en estos trabajos que es el propio dominio de
66
TM corto el que induce cambios en la estructura de la bicapa, ajustando esta su espesor de modo
que coincida con la longitud del segmento hidrofóbico de la proteína. Además esto, a su vez
apoya la idea que las interacciones proteína-lípido son centrales en el reconocimiento de un
dominio de TM, por parte del translocón.
Por otro lado, se estudió la relación entre la topología de V2b descrita en este trabajo y el
transporte de esta isoforma a través de las etapas tempranas de la vía secretora. Para ello se
realizó una co-localización, en células semi-permeabilizadas con digitonina, entre la IFI contra
CFP, la cual está fusionada al extremo carboxilo terminal de V2b, y el marcador de Golgi 58K,
proteína periférica de membrana localizada en el lado citoplasmático del aparato de Golgi
(Bloom y Brashear, 1989). Ambos anticuerpos accedieron a sus respectivos epítopes, ya que
estos se exponen al citosol. Los resultados muestran que hay inmunocolocalización, por lo tanto
V2b es transportado hasta el aparato de Golgi (Fig. 9), lo que es corroborado por experimentos de
fraccionamiento subcelular realizado por Sarmiento y col (2004). Nuestros resultados indican que
el isómero topológico del V2b que orienta su extremo carboxilo terminal hacia el citosol es el que
se co-localiza con el aparato de Golgi. Esto sugiere que la isoforma del V2b cuya topología
contiene siete segmentos de transmembrana adquiere un correcto plegamiento y que logra pasar
el sistema de control de calidad (QCS) del RE y ser transportada a los siguientes compartimientos
subcelulares, como lo es, el aparato de Golgi. El QCS está referido a la habilidad del RE de
reconocer proteínas mal plegadas, lo que previene su exportación a otros organelos. Este proceso
es llevado a cabo por chaperonas residentes del RE y factores de plegamiento, los cuales son
capaces de unirse, por ejemplo, a oligosacáridos inmaduros y dominios hidrofóbicos expuestos,
evitando la formación de agregados moleculares y facilitando el correcto plegamiento de la
proteína (Conn y col., 2007; Dong y col 2007). Formas moleculares plegadas de manera
67
incorrecta son retenidas y finalmente sometidas a degradación asociada a RE (ERAD), proceso
que implica la retranslocación al citosol, ubiquitinación y degradación por parte del proteosoma
(Shulein, 2004).
En resumen, hemos demostrado que la isoforma V2b puede adquirir dos isoformas
topologicas, una de seis dominios de transmembrana y otra de siete dominios. Además, que es
aquella de siete dominios de transmembrana la que alcanza el aparato de Golgi.
68
6. Conclusiones.
1. La nueva secuencia en V2b, generada por el corrimiento en el marco de lectura que
implica el empalme alternativo, es capaz de formar un nuevo segmento transmembrana
VII, exponiendo el carboxilo terminal hacia el citosol.
2. Es posible detectar, durante su biosíntesis, una especie molecular de V2b que solo posee
seis dominios de transmembrana, orientando su extremo carboxilo terminal hacia el
lumen del RE.
3. La especie molecular de siete dominios transmembrana de V2b alcanza el aparato de
Golgi, lo que sugiere que adquiere un correcto plegamiento y que logra pasar el sistema
de control de calidad (QCS) del RE.
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