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18
DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD
PRODUCTORA DE TRIMETILAMINA
DE BACTERIAS AISLADAS DE
MUESTRAS CLÍNICAS
Cristina Cabrera Fornés
Máster en Nuevos Alimentos
Directoras: Virginia García Cañas y Carolina Simó
Tutora: Mónica Rodríguez García-Risco
Lugar de realización: CIAL-CSIC / Bioactividad y análisis de
alimentos
2
3
RESUMEN
Estudios recientes han demostrado que determinadas bacterias de la microbiota
intestinal humana son capaces de convertir determinados componentes de la dieta
(fosfatidilcolina, colina, betaina y L-carnitina) en trimetilamina (TMA), que es
absorbida por el hospedador y oxidada por los enzimas hepáticos en óxido de
trimetilamina (TMAO), un metabolito asociado con la arteriosclerosis.
El objetivo de este trabajo fue identificar bacterias capaces de transformar in vitro la L-
carnitina en TMA. Para lograr este objetivo, se extrajo el ADN de las bacterias,
permitiendo amplificar mediante PCR secuencias homólogas del gen cntA y cutC,
asociadas a la producción microbiana de TMA. Además, para comprobar la capacidad
productora de TMA in vitro, las bacterias se incubaron en un medio definido con L-
carnitina como única fuente de carbono. Mediante PCR y electroforesis en gel de
agarosa se pudo comprobar que de las 14 bacterias estudiadas, Serratia marcescens,
Acinetobacter baumannii, Citrobacter youngae, Morganella morgani, dos cepas de
Klebsiella pneumoniae y dos cepas de Escherichia coli presentaban el fragmento de
interés del gen cntA. Sin embargo, mediante electroforesis capilar se observó que
únicamente A. baumannii y las dos cepas de K. pneumoniae transformaron L-carnitina
en TMA.
4
ABSTRACT
Recently, studies have demonstrated that certain bacteria of the human intestinal
microbiota are able to convert some dietary components (phosphatidylcholine, choline,
betaine y L-carnitine) into trimethylamine (TMA), which is absorbed by the host and
oxidized by the liver enzymes in trimethylamine oxide (TMAO), a metabolite
associated with arteriosclerosis.
The aim of this work was to identify bacteria capable of transforming in vitro L-
carnitine into TMA. To achieve this goal, amplification of homologous sequences of the
cntA and cutC genes from bacterial DNA by PCR allowed us to determine the potential
for TMA production in bacterial isolated from clinical samples. In addition, in order to
verify the TMA production capacity in vitro, bacteria were cultured in a defined
medium with L-carnitine as carbon source. Among the 14 bacteria studied, Serratia
marcescens, Acinetobacter baumannii, Citrobacter youngae, Morganella morgani, two
strains of Klebsiella pneumonia and two strains of Escherichia coli presented the DNA
fragment of interest of the cntA gene. However, capillary electrophoresis analysis
revealed that only A. baumannii and two strains of K. pneumoniae transformed L-
carnitine into TMA.
5
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 7
1.1. LAS ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES ................................................................................. 7
1.2. FACTORES DE RIESGO EN LA ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR .................................................. 9
1.3. LA MICROBIOTA INTESTINAL ....................................................................................................... 9
1.3.1. Función de la microbiota intestinal .................................................................................. 10
1.3.2. La microbiota intestinal y la enfermedad cardiovascular ................................................ 11
1.3.3. Factores determinantes en la producción de TMA y TMAO ............................................. 11
1.3.4. Rutas metabólicas microbianas involucradas en la producción de TMA en el intestino y
microorganismos productores ........................................................................................................... 13
2. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO .......................................................................... 15
3. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO .................................................................................................. 16
4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................ 17
4.1. CEPAS BACTERIANAS ................................................................................................................. 17
4.2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO ....................................................................................... 17
4.3. EXTRACCIÓN DEL ADN GENÓMICO DE CULTIVOS BACTERIANOS .............................................. 18
4.4. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS EXTRACTOS DE ADN ........................................................ 19
4.5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERAS (PCR) ....................................................................... 20
4.5.1. Mezcla de reacción ........................................................................................................... 20
4.5.2. Programas de termociclado ............................................................................................. 21
4.6. ELECTROFORÉSIS EN GEL DE AGAROSA ..................................................................................... 22
4.7. ELECTROFORESIS CAPILAR ........................................................................................................ 23
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................................... 24
5.1. DETECCIÓN DE LOS DETERMINANTES GENÉTICOS PARA LA PRODUCCIÓN DE TMA EN LAS
BACTERIAS OBJETO DE ESTUDIO ............................................................................................................ 24
5.2. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD PARA UTILIZAR L-CARNITINA COMO ÚNICA FUENTE DE
CARBONO EN LAS BACTERIAS OBJETO DE ESTUDIO ............................................................................... 29
5.3. DETECCIÓN DE TMA EN LAS BACTERIAS OBJETO DE ESTUDIO MEDIANTE CE-UV ...................... 31
6. CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 36
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................... 37
6
7
1. INTRODUCCIÓN
1.1. LAS ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades cardiovasculares
(ECVs) son un grupo de desórdenes del corazón y de los vasos sanguíneos, en los que
se incluye la cardiopatía coronaria, las enfermedades cerebrovasculares, las arteriopatías
periféricas, la cardiopatía reumática, las cardiopatías congénitas, las trombosis venosas
profundas y las embolias pulmonares (Enfermedades cardiovasculares, OMS, 2017).
La patología de base de las ECVs es la arteriosclerosis. Más concretamente, la
arteriosclerosis es una enfermedad inflamatoria que se caracteriza por la deposición de
placa de ateroma dentro de las arterias. La placa está compuesta por lípidos, células
inflamatorias y tejidos fibrosos en las arterias. Con el tiempo, la placa se endurece y
estrecha las arterias, con lo que se limita el flujo de sangre rica en oxígeno a los órganos
y a otras partes del cuerpo (Figura 1) (Stary et al., 1995).
Figura 1. Dibujo ilustrativo de las diferencias entre una arteria normal con flujo
normal de sangre (A) y una arteria con depósito de placa (B). Imagen tomada de
Aterosclerosis (National Heart, Lung and Blood Institute (NIH)).
Las ECVs suponen la principal causa de muerte, representando más de un 30% en
España (Figura 2).
8
Figura 2. Porcentaje de las principales causas de muerte en España, 2004. Tomada
de Las enfermedades cardiovasculares y sus factores de riesgo en España (Sociedad
Española de Arterioesclerosis (SEA)).
Además, en Europa este dato es mucho más preocupante, ya que más del 50% de las
muertes están producidas por la ECV (Tabla 1).
Tabla 1. Causas de muerte en Europa por cada 100.000 habitantes, 2014.
Adaptada de causes of death statistics (Oficina Europea de Estadísticas
(Eurostat)).
Sistema
circulatorio
Enfermedad
del corazón Cáncer
Cáncer
pulmón
Cáncer
colono
rectal
Sistema
respiratorio
Sistema
nervioso
Accidentes
de tráfico Suicidio
373,6 126,3 261,5 54,4 30,5 78,3 38,6 5,8 11,3
Además de por el número de fallecimientos que ocasiona, la ECV es un problema de
salud pública muy importante dado el coste socioeconómico que supone anualmente.
Concretamente, el coste total que supone la ECV en la Unión Europea en 2003 fue de
168,757 millones de euros, situandose España en quinto lugar con 6,997 millones de
euros (Sociedad Española de Arterioesclerosis, 2007).
Tabla 2. Costes de las Enfermedades Cardiovasculares en millones de euros, 2003.
Adaptada de Las enfermedades cardiovasculares y sus factores de riesgo en España
(Sociedad Española de Arterioesclerosis).
Atención
primaria
Consulta
especialista Urgencias Hospitalización Medicamentos Otros
España 161 466 194 1625 1570 2981
UE 9182 5108 2033 59814 28418 64202
ENF. S. CIRCULATORIO
33%
TUMORES27%
ENF. S. RESPIRATORIO
11%
ENF. S. DIGESTIVO
5%
CAUSAS EXTERNAS
5%
RESTO19%
9
1.2. FACTORES DE RIESGO EN LA ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR
La etiología de las ECVs es multifactorial y compleja, interviniendo tanto factores
genéticos como ambientales (tabaquismo, las dietas poco saludables, la obesidad, la
inactividad física, el consumo de alcohol, la hipertensión arterial, la diabetes y la
hiperlipidemia (OMS, 2017)). Estos factores de riesgo suelen presentarse combinados,
potenciando así el riesgo cardiovascular.
De acuerdo a un informe emitido por la Sociedad Europea de Cardiología el elevado
coste asociado con las ECVs se podría reducir significativamente mediante la
prevención, considerándose la dieta la piedra angular de tal prevención (Piepoli et al.,
2016). Se ha indicado que reducir la ingesta de grasas saturadas ayuda a reducir el
colesterol total y las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Además, las dietas pobres en
sal ayudan a controlar la presión arterial, y el consumo de frutas y verduras ricas en
micronutrientes y fibra tiene un papel protector frente a las ECVs (Rondanelli y
Rondanelli, 2014).
Además, como se detallará en el próximo apartado, algunos estudios recientes han
demostrado que hay una relación entre la función que tiene la microbiota intestinal
sobre algunos alimentos de la dieta y las enfermedades cardiovasculares.
1.3. LA MICROBIOTA INTESTINAL
El término microflora o microbiota se define como la comunidad de microorganismos
vivos residentes en un nicho ecológico determinado. La microbiota residente en el
intestino humano es una de las comunidades más densamente pobladas, estimándose en
trillones de microorganismos, un número diez veces superior al de células somáticas
que forman el cuerpo (Zhu, Wang y Li, 2010; Conlon y Bird, 2014; Cani, y Everard,
2015). Estudios metagenómicos estiman que aproximadamente 1000 especies diferentes
de bacterias coexisten en el intestino humano, y además, comprenden cerca de 3
millones de genes, 150 veces más que el genoma humano (Gálvez, 2011). Al conjunto
formado por los microorganismos, sus genes y sus metabolitos se le denomina
microbioma (Petrosino, Highlander, Luna, Gibbs y Versalovic, 2009). Al margen de las
diferencias interindividuales, se ha demostrado que existe un conjunto de bacterias que
son comunes en un porcentaje elevado de individuos (Tap et al., 2009).
10
1.3.1. Función de la microbiota intestinal
La microbiota intestinal y el hospedador mantienen una relación de simbiosis, en la que
ambas partes se benefician (Chow et al., 2010; Gibson et al., 2014). A continuación, se
describen las funciones más conocidas de la microbiota intestinal:
a. Función metabólica
Como se ha mencionado la gran diversidad de genomas microbianos en el intestino
permite la síntesis de una gran variedad de enzimas y la disponibilidad de rutas
bioquímicas que son distintas a las producidas por el hospedador y que permite ampliar
enormemente su capacidad de metabolización de sustancias ingeridas en la dieta. Las
numerosas funciones metabólicas que confiere la microbiota intestinal ha dado lugar a
que se considere a ésta última como un órgano más del ser humano (O'Hara y
Shanahan, 2006; Liévin-Le Moal y Servin, 2006).
Muchos constituyentes de los alimentos que no pueden ser digeridos por los enzimas del
tracto digestivo, son metabolizados por los microorganismos del intestino a sustancias
que pueden ser absorbidas y utilizados por el hospedador (Hooper, Midtvedt y Gordon,
2002). Ejemplo de ello es la producción bacteriana de ácidos grasos de cadena corta
(principalmente los ácidos acético, propiónico y butírico), que constituyen la fuente de
energía principal de las células epiteliales del colon y participan en el control de varios
procesos metabólicos (Laparra y Sanz, 2010). Igualmente, el metabolismo bacteriano
contribuye a la producción de algunas vitaminas (K, B12, biotina, ácido fólico y
pantoténico) o en la síntesis de aminoácidos a partir de amoniaco o la urea. No obstante,
la actividad metabólica de la microbiota intestinal también puede ejercer efectos
nocivos mediante la producción de sustancias potencialmente tóxicas (amonio, aminas,
fenoles, tioles e índoles) a partir del metabolismo anaeróbico de péptidos y proteínas
(Hooper et al., 2002).
b. Función protectora
La microbiota humana regula y estabiliza el ecosistema intestinal evitando su
colonización por parte de microorganismos patógenos (Liévin-Le Moal y Servin, 2006).
La función protectora de la microbiota se produce por varios mecanismos, por ejemplo,
mediante la competición por los nutrientes y por el espacio, la producción de
11
compuestos que van a restringir el crecimiento de otros microorganismos, y de un modo
indirecto mediante la estimulación del sistema inmune favoreciendo la maduración del
tejido linfoide asociado al tejido intestinal (Hooper y Gordon, 2001).
1.3.2. La microbiota intestinal y la enfermedad cardiovascular
En los últimos años, una serie de estudios pioneros del laboratorio de Stanly L. Hazen
de la Clínica Cleaveland en, EE.UU., han indicado que el metabolito óxido de
trimetilamina (TMAO) podría estar implicado en el desarrollo y progresión de la
arteriosclerosis y otros eventos cardiovasculares adversos (Wang et al., 2011).
Concretamente, este grupo de investigación descubrió la existencia de una ruta
metabólica a nivel metaorganismo (microbiota y hospedador) que consiste en un primer
paso de conversión bacteriana de determinadas trimetilaminas de la dieta
(fosfatidilcolina, colina, betaina y L-carnitina) a trimetilamina (TMA), que se absorbe
por el hospedador y se oxida por los enzimas hepáticos a TMAO (Bennett et al., 2013;
Koeth et al., 2013).
Estudios posteriores han demostrado que la concentración plasmática de TMAO puede
ser útil como factor pronóstico en la ECV. Estudios más recientes han revelado una
asociación estrecha entre los niveles de TMAO plasmáticos y el riesgo cardiovascular,
así como una mayor probabilidad de empeoramiento o de agravamiento de la ECV,
como por ejemplo, el ataque cardiaco, infarto y la muerte (Tang et al, 2013.; Tang et al.,
2014; Mente et al., 2015). Además de su valor pronóstico, existen evidencias que
apuntan a que un nivel elevado de TMAO en plasma es un factor de riesgo para la ECV.
De hecho, se ha demostrado que el TMAO promueve la arteriosclerosis mediante varios
mecanismos. Entre ellos, se ha observado que el TMAO induce cambios en el
metabolismo del colesterol, promueve la formación de células espumosas mediante la
inducción de determinados receptores en macrófagos, y alteran el metabolismo de
ácidos biliares y el transporte de esteroles en el hígado y el intestino (Wang et al., 2011;
Koeth et al., 2013; Bennet et al., 2013). Además, un estudio reciente sugiere que el
TMAO induce activación plaquetaria elevando el riesgo de trombosis (Zhu et al., 2016).
1.3.3. Factores determinantes en la producción de TMA y TMAO
Varios estudios han demostrado la participación obligatoria de la microbiota intestinal
en la formación de TMAO a partir de trimetilaminas de la dieta. Ejemplos de ello son
12
los estudios de Koeth et al. (2013) y Tang et al. (2013) en los que se demostró que la
supresión de la microbiota intestinal en voluntarios sanos mediante antibióticos reduce
significativamente los niveles plasmáticos de TMAO tras la administración oral de L-
carnitina (Koeth et al., 2013) y fosfatidilcolina (Tang et al., 2013). Además, un estudio
posterior demostró que la eliminación de la microbiota intestinal en ratones mediante el
empleo de antibióticos prevenía el desarrollo de arteriosclerosis (Koeth et al., 2014).
Apoyando este nexo existente entre la microbiota y la arteriosclerosis, Gregoy et al.
(2015) demostraron que la susceptibilidad de padecer arteriosclerosis puede transmitirse
mediante el trasplante de microbiota intestinal en ratón.
Una generalidad que se observa en los estudios realizados en humanos es la elevada
variabilidad interindividual que se registra en la producción de TMAO a partir de los
precursores de la dieta. Se ha indicado que esta variabilidad podría estar determinada
principalmente por las diferencias en los hábitos dietéticos y en la diversidad de la
microbiota intestinal. En este caso, los factores genéticos parecen tener únicamente un
papel marginal, sugiriendo que las relaciones entre los precursores de la dieta y los
microorganismos del intestino son los mayores determinantes de la variación de los
niveles de TMAO plasmáticos (Hartiala et al., 2014).
En los últimos años, se han realizado varios estudios dirigidos a conocer los factores
nutricionales que influyen en la producción de TMAO. La mayor parte de los datos
experimentales se derivan de ensayos de intervención en los que se realiza una ingesta
puntual con diferentes trimetilaminas de la dieta en modelos animales (Wang et al.,
2014) y voluntarios sanos (Stella et al., 2006). Por otro lado, se han llevado a cabo
estudios para determinar la asociación entre la ingesta de alimentos ricos en las
trimetilaminas precursoras (huevo, carne roja, lácteos) y los niveles de TMAO en
plasma u orina. Estos estudios cortos de intervención han demostrado que la carne roja
eleva los niveles de TMAO en la orina (Stella et al. 2006), la dieta alta en grasa
aumenta los nieles de TMAO en plasma (Boutagy et al., 2015) y la ingesta de huevo
también incrementa la concentración plasmática de TMAO (Miller et al., 2014). Otros
estudios han tratado de asociar el consumo de alimentos específicos con las
concentraciones de TMAO en plasma. Por ejemplo, el consumo de leche, carne roja o
pescado se ha relacionado con niveles elevados de plasma en ayunas (Rohrmann,
Linseisen, Allenspach, von Eckardstein y Müller, 2016) y la ingesta elevada de pan
blanco, y baja de verduras, frutas, queso y otros lácteos fermentados se han asociado a
13
niveles de TMAO elevados (Malinowska, Szwengiel y Chmurzynska, 2017). Aunque
un mayor número de evidencias científicas apuntan a que existe una conexión entre los
niveles elevados de TMAO en plasma y la arteriosclerosis, existe un debate abierto en
cuanto a las implicaciones nutricionales. De hecho, la posibilidad de limitar el consumo
de alimentos ricos en trimetilaminas, como por ejemplo algunos alimentos de origen
animal, induce a pensar que podría ser una manera directa de intervenir la producción
de TMA; sin embargo, esta posible solución entraña consecuencias adversas ya que
tales alimentos contienen nutrientes que son necesarios para mantener una salud óptima.
Por ejemplo, la colina es un nutriente esencial para el organismo. Esta se fosforila a
fosfatidilcolina, que es el principal fosfolípido de las membranas. La deficiencia de
colina puede producir, entre otras alteraciones, esteatosis hepática, que produce la
acumulación de triglicéridos en el hígado (Clarie, 2010). Por otra parte, la L-carnitina es
esencial para la oxidación de ácidos grasos de cadena larga y el 75% de ella proviene de
la alimentación. La deficiencia de L-carnitina puede tener diferentes consecuencias
como nacimientos prematuros, malnutrición, insuficiencia hepática y lesión renal aguda
(Vardon et al., 2018).
1.3.4. Rutas metabólicas microbianas involucradas en la producción de TMA
en el intestino y microorganismos productores
En los últimos años se ha realizado un esfuerzo importante en la investigación del papel
del TMAO en la ECV, mientras que los estudios enfocados a elucidar las rutas
metabólicas y los microorganismos involucrados en la producción de TMA a partir de
trimetilaminas de la dieta han sido más escasos. La observación general es que los
microorganismos del intestino presentan capacidades distintas para producir TMA. Esto
se debe en parte a que existen varias rutas microbianas involucradas en la producción de
TMAO en el intestino (Figura 3). Existe un grupo de genes (cutC y cutD) que codifican
para un enzima multimérica, la colina TMA liasa, que es responsable de la degradación
anaeróbica de la colina (Craciun y Balskus, 2012). Otro tipo de liasa bacteriana,
codificada por los genes yeaW y yeaX, también puede convertir lecitina, colina, betaina,
L-carnitina y butirobetaina en TMA (Falony, Vieira-Silva y Raes, 2015). Otra ruta
metabólica importante es la que transforma L-carnitina en TMA mediante hidroxilación.
Esta vía está constituida por los productos de los genes cntA y cntB que conforman la
carnitina monooxigenasa (Zhu et al., 2014). Una cuarta ruta está relacionada con la
conversión de glicina-betaina en TMA mediante la actividad de la glicina betaina
14
reductasa (GrdH), un enzima cuya actividad requiere selenio. Además de estas
reacciones que producen TMA a partir de las trimetilaminas de la dieta, existe una ruta
adicional que genera TMA mediante la reducción de TMAO. Esta actividad se le ha
atribuido al producto del gen torA-like descrito en algunos miroorganismos del intestino
(McCrindle, Kappler y McEwan, 2005).
Hasta ahora, existe solo un estudio en el que se describen nueve cepas de dos phyla
deferentes (Firmicutes y Proteobacteria), aisladas del intestino humano, capaces de
producir TMA a partir de colina in vitro (Romano, Vivas, Amador-Noguez y Rey,
2015). Por otro lado, la aplicación de herramientas bioinformáticas para rastrear en
bases de datos especies bacterianas que porten genes que codifican para enzimas
productoras de TMA ha dado lugar a estudios que aportan información muy interesante
de la capacidad potencial de producción de TMA de la microbiota intestinal. Empleando
esta estrategia, ha sido posible detectar genes implicados en la producción de TMA en
102 genomas de referencia, correspondientes a 36 especies bacterianas distribuidas en
varios phyla (Firmicutes, Proteobacteria, y Actinobacteria) (Jameson et al., 2016).
Figura 3. Rutas metabólicas bacterianas implicadas en la formación de TMA en el
intestino humano. Adaptada de Jameson, Quareshy y Chen, 2018.
15
2. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO
La investigación de nuevas estrategias para modular el metabolismo bacteriano
intestinal implicado en la formación de TMA ha adquirido especial relevancia
recientemente dada su conexión con la ECV. Por ejemplo, la identificación de nuevos
inhibidores de los enzimas involucrados en la producción de TMA ha suscitado el
interés de varios grupos de investigación. En relación a esto, algunos estudios han
indicado que determinados constituyentes de los alimentos pueden reducir el
metabolismo y la producción de TMA, sin embargo, el único inhibidor de la colina
TMA liasa que se ha identificado hasta la fecha es el 3,3-dimetil-1-butanol, presente en
el aceite de semillas de uva y aceite de oliva (Wang et al. 2015). En lo que respecta a la
actividad de la carnitina monooxigenasa, no se ha descrito aún ningún compuesto en los
alimentos con capacidad inhibidora, aunque sí existen estudios de la actividad
antiaterogénica in vivo de extractos y compuestos obtenidos de los alimentos. Por ello,
en el laboratorio donde se ha realizado este Trabajo Fin de Máster resulta muy
interesante la búsqueda en alimentos y subproductos de la industria alimentaria de
compuestos con capacidad para inhibir la actividad de la carnitina monooxigenasa, un
aspecto prácticamente inexplorado hasta el momento actual. En base a esto, este Trabajo
Fin de Máster forma parte de una de las actividades del Proyecto de Investigación
AGL2017-89055-R titulado “Investigación de nuevos ingredientes alimentarios con
actividad moduladora del metabolismo microbiano intestinal relacionado con el
desarrollo de la arteriosclerosis”. En concreto, en esta actividad de Proyecto se pretende
realizar el cribado de un grupo de extractos procedentes de fuentes naturales para
identificar posibles inhibidores de la actividad de la carnitina monooxigenasa. Para ello,
se pretende desarrollar un método de cribado in vitro que consista en el cultivo de
bacterias que posean dicho enzima con el objetivo de evaluar la capacidad de los
extractos para inhibir la producción in vitro de TMA a partir de L-carnitina. Por tanto,
para poner a punto el método de cribado, será necesario disponer de bacterias
cultivables que expresen la carnitina monooxigenasa funcional. El presente Trabajo Fin
de Máster se centra en la caracterización molecular y metabólica de un grupo de
bacterias, que han sido donadas al laboratorio, con el objetivo de seleccionar las mejores
candidatas para poner a punto el método de cribado.
16
3. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
El objetivo general de este Trabajo Fin de Máster es la caracterización a nivel molecular
y metabólica de la capacidad de un grupo de bacterias, aisladas de muestras humanas de
orina y heces, de producir in vitro TMA a partir de L-carnitina.
Para ello se han establecido los siguientes objetivos específicos:
1. Determinar el potencial productor de TMA de las bacterias objeto de estudio
mediante la detección de secuencias homólogas de los genes cutC y cntA.
2. Determinar la capacidad de estas bacterias para utilizar L-carnitina in vitro como
única fuente de carbono y de producir TMA.
Para alcanzar estos objetivos se siguió el siguiente plan de trabajo:
1) Extracción del ADN de las bacterias objeto de estudio y evaluación de la calidad
del ADN extraído.
2) Amplificación y detección de secuencias homólogas de los genes cutC y cntA a
partir del ADN bacteriano mediante PCR convencional y electroforesis en gel de
agarosa.
3) Determinación de la capacidad de las bacterias para utilizar L-carnitina in vitro
como única fuente de carbono.
4) Análisis mediante electroforesis capilar de los sobrenadantes de los cultivos
bacterianos para determinar la capacidad de estas bacterias de producir TMA a
partir de L-carnitina.
17
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. CEPAS BACTERIANAS
La capacidad productora de TMA a partir de L-carnitina se ha estudiado en cepas
aisladas de muestras clínicas humanas (orina y heces), cedidas por el Dr. Esteban Aznar
(Laboratorio Clínico Central (LCC) del Hospital Infanta Sofía, San Sebastián de los
Reyes), y cepas comerciales cedidas por el Dr. Héctor Rodríguez (CIC Biogune, Bilbao)
y la Dra. Rosario Muñoz (ICTAN, CSIC, Madrid). En la Tabla 3 se detalla la especie,
el origen de cada una de ellas y el laboratorio que realizó la donación.
Aunque la cepa utilizada de Serratia marcescens no es un aislado clínico, se decidió
incluirla como control positivo en el presente estudio ya que se ha descrito
recientemente en la bibliografía como portadora de la secuencia cntA (Rath, Heidrich,
Pieper, y Vital, 2017).
Tabla 3. Bacterias utilizadas en el presente estudio
Bacteria Aislado
Clínico Referencia comercial
Entidad
donante
Proteus mirabilis Orina LCC
Escherichia coli #1 Orina LCC
Klebsiella pneumoniae #1 Orina LCC
Enterobacter cloacae Orina LCC
Salmonella sp. #1 Orina LCC
Serratia marcescens Charca ATCC® 13880™ ICTAN
Acinetobacter baumannii Orina ATCC® 19606™ CIC Biogune
Klebsiella pneumoniae #2 Heces LCC
Citrobacter youngae Heces LCC
Morganellla morgani Heces LCC
Escherichia coli #2 Heces LCC
Escherichia coli #3 Heces LCC
Escherichia coli #4 Heces LCC
Salmonella sp. #2 Heces LCC
4.2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
Las cepas se recibieron en placas de agar MacConkey (BD Difco™, Becton, Dickinson
Co.) y se cultivaron en medio Infusión Cerebro-Corazón (BHI, de brain-heart infusion;
Pronadisa, España) a 37 ºC en agitación (120 rpm) durante 12 horas. Una vez crecidos
los microorganismos, se conservaron congelados a -80 ºC en el caldo de cultivo al que
se le añadió en proporción 1:2 una solución estéril de glicerol al 40% (p/v). En el
18
momento de su uso, se descongelaron y se cultivaron en caldo BHI a 37 ºC y con
agitación de 90 rpm.
Para los ensayos de determinación de la capacidad productora de TMA a partir de L-
carnitina, se preparó un medio denominado medio Definido (D), descrito por Zhu et al.
(2015) con modificaciones y suplementado con 20 mM L-carnitina como única fuente
de carbono. Su composición se detalla a continuación:
1 g/L NH4Cl, 0,5 g/L NaCl, 3 g/L KH2PO4, 17,1 g/L Na2HPO4 · 12H2O, 0,6 mg/L
Na2MoO4 · 2H2O, 0,22 g/L CaCl2 · 6H2O, 50 µM FeCl3 , 0,24 g/L MgSO4, 0,02 mg/L
biotina, 0,02 mg/L ácido fólico, 0,1 mg/L hidrocloruro de piridoxina, 0,05 mg/L
hidrocloruro de tiamina, 0,05 mg/L riboflavina, 0,05 mg/L ácido nicotínico, 0,05 mg/L
ácido pantoténico, 0,001 mg/L vitamina B12, 0,05 mg/L ácido 4-aminobenzoico y 0,05
mg/L ácido lipoico.
Este medio se preparó inmediatamente antes de su inoculación, y una vez inoculado con
los microorganismos objeto de estudio (Tabla 3), se mantuvo a 120 rpm y 37 ºC
durante 24 horas. El seguimiento de la evolución de los cultivos se llevó a cabo
mediante la medida de la densidad óptica a 600 nm empleando un lector de placas
Synergy (Biotek, Estados Unidos). Transcurrido el tiempo de incubación y con el
objetivo de llevar a cabo la detección de TMA en el medio, los sobrenadantes se
filtraron empleando un filtro de nylon con un tamaño de poro 0,45 µm (Membrane
Solutions, EE.UU.) y se almacenaron a -20 ºC hasta su análisis por electroforesis
capilar.
4.3. EXTRACCIÓN DEL ADN GENÓMICO DE CULTIVOS
BACTERIANOS
Para llevar a cabo la extracción de ADN bacteriano, las cepas se descongelaron y se
cultivaron en 2,5 mL de medio BHI a 37 ºC en agitación (120 rpm) durante 12 horas.
Las células se recogieron directamente del cultivo puro y la extracción del ADN
genómico se efectuó empleado el kit DNeasy PowerLyzer Microbial (Qiagen, España).
Este kit está diseñado para aislar el ADN genómico bacteriano mediante un proceso de
lisis enzimática y mecánica con microesferas de sílice con un diámetro de 100 µm. A
continuación, se detalla el protocolo:
19
1. Las células se recogieron de un cultivo en caldo BHI (1,8 mL) y se recuperaron
mediante centrifugación a 10.000 xg durante 30 segundos a temperatura
ambiente.
2. El pellet se resuspendió con 300 µL de solución PowerBead del kit y se mezcló
con un vortex. La suspensión se transfirió a un tubo con esferas de vidrio de 100
µm y se añadieron 50 µL de la solución SL del kit.
3. El tubo se agitó a 30 Hz en un molino de bolas Restch (Biometa Tecnologías y
Sistemas, España) durante 5 minutos y se dejó reposar durante 10 min. A
continuación, se volvió a agitar a 30 Hz durante 5 min.
4. El tubo se centrifugó a 10.000 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente y
el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo, se añadieron 100 µL de la solución
IRS del kit y se incubó en hielo durante 5 min.
5. A continuación, el tubo se centrifugó a 10.000 xg durante 1 min a temperatura
ambiente y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo, se añadieron 900 µL
de la solución SB y se agitó con vortex durante 5 segundos.
6. El lisado se cargó en columnas MB que contienen sílice y se centrifugó a
10.000 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. En este paso, el ADN
queda retenido en la columna.
7. A continuación, se llevó a cabo un lavado de la membrana de sílice de la
columna con la solución CB del kit. Finalmente, la columna se transfirió a un
tubo limpio y el ADN se eluyó mediante la solución EB del kit.
8. El ADN obtenido se almacenó a -20 ºC hasta su utilización.
4.4. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS EXTRACTOS DE ADN
Una vez extraído el ADN se cuantificó su concentración mediante fluorimetría (Qubit
4®, ThermoFisher Sci, España) empleando el kit Qubit dsDNA BR Assay
(ThermoFisher Sci.), que incluye un fluoróforo que interacciona con el ADN de doble
hebra y emite fluorescencia, un tampón de dilución, y las disoluciones patrón de ADN
para poder realizar una recta de calibración. Además, la pureza de los extractos de ADN
se evaluó mediante el cálculo de la relación A260/A280 y A260/230 de las lecturas de
absorbancia de los extractos obtenidas mediante espectrofotometría (NanoDrop®,
ThermoFisher Sci.). Adicionalmente, la integridad del ADN extraído se verificó
20
mediante electroforesis en gel de agarosa como se describe más adelante en la sección
4.6. (Electroforesis en Gel de Agarosa).
4.5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
La PCR es un método bien establecido, descrito inicialmente por Mullis y Faloona
(1987), que permite la amplificación in vitro de secuencias específicas de ADN
mediante una serie de incubaciones a distintas temperaturas. En el presente trabajo, se
llevó a cabo la amplificación de un fragmento del gen cntA que codifica para la
carnitina monooxigenasa y otro fragmento del gen cutC que codifica para el enzima
colina TMA liasa en las bacterias en estudio. Para ello, se emplearon los cebadores
degenerados diseñados por Rath et al. (2017) que se recogen en la Tabla 4.
Tabla 4. Cebadores empleados en el presente trabajo
Gen
Tamaño
amplicón
(pb)
Secuencia (5’-3’)1
cntA 249 Directo (F) TAYCAYGCITGGRCITTYAARCT
Reverso (R) RCAGTGRTARCAYTCSAKRTAGTTRTCRAC
cutC 275 Directo (F) TTYGCIGGITAYCARCCNTT
Reverso (R) TGNGGYTCIACRCAICCCAT
1 Nomenclatura de las bases nucleotídicas de los cebadores: A, Adenina; C, Citosina; G, Guanina; I,
Isoleucina; K, Guanina o Timina; N, Cualquier base; R, Adenina o Guanina;S, Guanina o Citosina; T,
Timina; Y, Citosina o Timina.
4.5.1. Mezcla de reacción
Con el fin de asegurar un ambiente estéril y libre de contaminantes, las mezclas de
reacción se prepararon en una cabina de flujo laminar (BIO II, Telstar, España). Los
reactivos utilizados en la reacción de amplificación fueron de Biotools (España) a
excepción de los cebadores que fueron sintetizados por Metabion (Alemania) y
suministrados por Condalab (España). Todas las reacciones se prepararon para un
volumen final de 20 μl. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador
modelo MiniAmp TM
Plus Thermal Cycler (Applied Biosystems, España). Cada mezcla
de reacción se preparó con los siguientes reactivos:
21
Tabla 5. Composición de las mezclas de reacción para la detección de los genes
cntA y cutC
cntA cutC
Tampón PCR
75 mM Tris-HCl (pH 9),
50 mM KCl y 20 mM
(NH4)2SO4
75 mM Tris-HCl (pH 9),
50 mM KCl y 20 mM
(NH4)2SO4
Cl₂Mg 2,5 mM 2,5 mM
Deoxinucleótidos (A, G,
C, T) 0,25 mM 0,25 mM
Cebador directo 0,75 μM 2,5 μM
Cebador reverso 0,75 μM 2,5 μM
Levatools ADN
polimerasa 0,025 U/μL 0,025 U/μL
ADN bacteriano 30 ng/reacción 30 ng/reacción
4.5.2. Programas de termociclado
Las mezclas de reacción se incubaron siguiendo los programas de tiempo-temperatura
que se recogen en la Tablas 6 y 7.
Tabla 6. Programa de termociclado empleado para amplificar un fragmento de la
secuencia cntA
Programa Nº ciclos Etapa Temperatura Tiempo
Pre-incubación 1 Desnaturalización
inicial 94 3 min
Amplificación 40
Desnaturalización 94 45 s
Hibridación 53 45 s
Extensión 72 45 s
Finalización 1 Extensión final 72 7 min
22
Tabla 7. Programa de termociclado empleado para amplificar un fragmento de la
secuencia cutC
Programa Nº ciclos Etapa Temperatura Tiempo
Pre-incubación 1 Desnaturalización
inicial 94 3 min
Amplificación 40
Desnaturalización 94 45 s
Hibridación 57 45 s
Extensión 72 45 s
Finalización 1 Extensión final 72 7 min
4.6. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Tanto los extractos de ADN genómico bacteriano como los productos de las reacciones
de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Para la
preparación de los geles, se empleó agarosa grado Biología Molecular (Pronadisa,
España) a diferentes porcentajes. Se empleó al 0,7% (p/v) para el análisis de ADN
genómico y al 2% (p/v) para el análisis de los productos amplificados en tampón TAE
(40 mM Tris, 20 mM ácido acético, 1 mM EDTA, pH 7,4). Una vez disuelta la agarosa
y previo a su vertido en el soporte específico y solidificación, se añadió el fluoróforo
GelRed (Biotium, Estados Unidos) a una concentración final de 0,003% (v/v).
La preparación de las muestras amplificadas consistió en diluir 1 μL de reacción en 4
μL de agua y 1 μL de tampón de carga DNA Gel Loading Dye (Thermo Fisher
Scientific, España). En el caso de los extractos de ADN genómico, se utilizó la misma
proporción de tampón de carga, pero se normalizó la concentración de ADN con el fin
de cargar la misma concentración de ADN (10 ng) en todos los carriles. Una vez
cargado el gel con las muestras, se aplicó un campo eléctrico de 7 V/cm durante 1-1,5 h.
Tras la separación electroforética, los geles se digitalizaron mediante el sistema
GelDoc™ EZ (Bio-Rad, España). El tamaño aproximado de los fragmentos de ADN se
estimó por comparación con el marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder
(Biotools) en el análisis de los productos de PCR y el marcador Lambda DNA/HindIII
(Biotools) en el caso del análisis del ADN genómico.
23
4.7. ELECTROFORESIS CAPILAR
Los sobrenadantes de cada uno de los cultivos bacterianos indicados en la Tabla 3 se
analizaron mediante electroforesis capilar (CE) para la detección de TMA. Los análisis
mediante CE se llevaron a cabo utilizando un equipo modelo P/ACE 5010 (Beckman
Coulter, EE.UU.) provisto de un detector ultravioleta (UV) de filtros y controlado por el
programa informático System Gold de Beckman. Se utilizaron capilares de sílice
fundida de 50 µm de diámetro interno y 360 m de diámetro externo (Composite Metal
Services, Reino Unido). La longitud total del capilar fue de 57 cm y la longitud de
detección de 50 cm. Antes de utilizar un capilar nuevo, se sometió a un proceso de
acondicionamiento consistente en un lavado durante 10 minutos con una disolución
0,1M NaOH, seguido de un lavado de 20 minutos con agua destilada. La separación se
llevó a cabo empleando una disolución 1M de ácido fórmico a pH 2 (ajustado con
NaOH). Las disoluciones se prepararon con agua destilada MilliQ (Millipore, EE.UU.)
y se filtraron con filtros de nylon de 0,45 µm de Membrane Solutions. Entre inyecciones
el capilar se lavó con agua durante 1 min y con el electrolito de separación durante 3
min. La inyección de las muestras se llevó a cabo por presión de nitrógeno a 0,5 psi
durante 11 segundos (11,5 nL de muestra). El voltaje aplicado para la separación fue de
+30 kV. La temperatura del capilar se mantuvo a 25º C. La longitud de onda de
detección fue de 254 nm.
La molécula de interés TMA carece de grupos cromóforos, por lo que no presenta
absorción útil en las regiones del visible o UV para su detección. Por consiguiente, fue
necesario someter a las muestras a un proceso de derivatización previo a su análisis
mediante CE-UV. Para la reacción de derivatización se empleó el reactivo 2,4’-
dibromoacetofenona (DBA), de manera similar al procedimiento publicado por
Mohamed et al. (2014). En la Figura 4 se muestra la reacción entre el TMA y el DBA.
Figura 4. Reacción entre TMA y 2,4’dibromoacetofenona (DBA)
TMA 2,4’-dibromoacetofenona
24
En primer lugar se llevó a cabo la optimización de la cantidad de reactivo derivatizante
(20-200 mM) necesario para la reacción de derivatización. Una vez optimizada la
cantidad de DBA, se siguió el siguiente procedimiento para la reacción de
derivatización: en un tubo de ensayo con tapa de rosca de 2mL, se añadieron 50 L de
una mezcla KH2PO4-agua-acetonitrilo (1:1:4, v/v/v), una alícuota de 100 µL de
sobrenadante del medio de cultivo bacteriano y 300 µL de 80 mM DBA disuelto en
acetonitrilo. La reacción de derivatización se llevó a cabo en un incubador de bloque
seco ThermoMixer™ (Eppendorf, Alemania) durante 90 minutos a 90ºC con agitación
continua. Pasado este tiempo, las muestras se secaron en un concentrador a vacío
SpeedVac (Savant Instruments Inc., EE.UU.). Antes de su análisis mediante CE-UV las
muestras se redisolvieron en 300 L de agua y se centrifugaron a 14.000 xg y 20ºC
durante 20 min para separar los restos de derivatizante precipitado del TMA
derivatizado. Los sobrenadantes derivatizados se almacenaron a -20ºC hasta su análisis
mediante CE-UV. Las muestras se analizaron por duplicado.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. DETECCIÓN DE LOS DETERMINANTES GENÉTICOS PARA LA
PRODUCCIÓN DE TMA EN LAS BACTERIAS OBJETO DE ESTUDIO
Con el fin de investigar el potencial de las bacterias del presente estudio (Tabla 3) para
producir TMA a partir de L-carnitina y colina, se llevó a cabo su caracterización
molecular empleando la técnica PCR convencional. Para ello, se efectuó la extracción
del ADN genómico de cada una de las bacterias y se amplificaron las secuencias
homólogas de los genes cntA y cutC, que como se ha mencionado anteriormente,
codifican para la carnitina monooxigenasa y la colina TMA liasa, respectivamente, dos
enzimas relevantes en el metabolismo microbiano de producción de TMA a partir de
trimetilaminas de la dieta.
La PCR es una técnica extremadamente sensible a los contaminantes (fenoles,
carbohidratos, ARN, etc.), de modo que si la concentración de contaminantes es
elevada, la reacción enzimática (polimerización de ADN) puede verse inhibida.
Además, para llevar a cabo la amplificación de secuencias y obtener niveles detectables
de fragmento amplificado es necesario que haya un número suficiente de secuencias de
ADN molde de partida. Por ello, la fragmentación (degradación) del ADN puede afectar
25
enormemente el rendimiento de la amplificación. Para evitar el fenómeno de inhibición
de la amplificación y asegurar que el ADN de las muestras presentaba unas
características óptimas para su amplificación por PCR, se llevó a cabo la evaluación de
la calidad de los extractos de ADN. La Tabla 8 y la Figura 5 muestran los resultados
obtenidos de dicha evaluación. Como se puede observar en la Tabla 8, se obtuvieron
rendimientos superiores a 50 ng/µL en todos los casos. La relación de absorbancias a
260 y 280 nm y a 260 y 230 nm se utiliza para evaluar la pureza de las muestras. En este
caso, se observaron valores de A260/280 entre 1,87 y 1,93 indicando que el ADN tiene
una pureza óptima en cuanto a la presencia de contaminantes de tipo proteico y
compuestos aromáticos, fundamentalmente fenoles. La relación A260/230 también
indicó que los extractos estaban libres de sales caotrópicas, fenoles o carbohidratos, ya
que los valores obtenidos están dentro del intervalo 1,5-2,3.
Tabla 8. Determinación fluorimétrica de la concentración de ADN en los extractos
y determinación espectrofotométrica de las relaciones de las absorbancias a 260 y
280 nm y a 260 y 230 nm.
Especie ADN(ng/µL) A260/A280 A260/A230
P. mirabilis 254 1,87 2,16
E. coli #1 235 1,89 2,15
K. pneumoniae #1 162 1,89 1,86
E. cloacae 322 1,90 2,12
Salmonella sp. #1 92 1,90 2,03
S. marcescens 121 1,93 2,12
A. baumannii 128 1,89 2,18
K. pneumoniae #2 68 1,89 1,66
C. youngae 226 1,90 2,24
M. morgani 78 1,92 2,04
E. coli #2 347 1,89 2,06
E. coli #3 449 1,90 2,29
E. coli #4 243 1,90 2,23
Salmonella sp. #2 164 1,91 1,87
Además del rendimiento de la extracción y la pureza de los extractos, se evaluó la
integridad del ADN extraído. Para ello se llevó a cabo el análisis electroforético en
26
geles de agarosa de una alícuota (10 ng ADN) de los extractos de ADN (Figura 5). Este
método permite valorar la integridad del ADN de la muestra mediante la visualización
de la banda de ADN genómico. Se considera que el ADN de la muestra es íntegro
cuando su perfil electroforético se corresponde a una banda discreta y de elevado peso
molecular. El nivel de degradación de una muestra está determinado por la pérdida de
definición de la banda predominante (más intensa) y el acompañamiento de una estela a
lo largo del gel. Como se puede observar en la Figura 5, todos los extractos produjeron
una banda de ADN discreta, intensa y con peso molecular elevado, indicando que el
ADN de las muestras no estaba degradado.
Figura 5. Análisis electroforético en geles de agarosa al 0,7% (p/v) de los extractos
de ADN obtenidos a partir de las bacterias. Gel A, (1) P. mirabilis, (2) E. coli #1, (3)
K. pneumoniae #1, (4) E. cloacae, (5) Salmonella sp. #1, (6) S. marcescens, (7) A.
baumannii; Gel B, (8) K. pneumoniae #2, (9) C. youngae, (10) M. morgani, (11) E.
coli #2, (12) E. coli #3, (13) E. coli #4, (14) Salmonella sp. #2. (M) Marcador
Lambda DNA/HindIII DNA.
Una vez que se verificó que la calidad de los extractos era óptima para su amplificación,
se realizaron amplificaciones por PCR de un fragmento del gen cntA y del gen cutC
empleando cebadores degenerados (Tabla 4). Los cebadores degenerados son una
mezcla de varios oligonucleótidos que tienen una secuencia básica común, pero difieren
en ciertas posiciones. Normalmente, estas mezclas se pueden emplear para la
amplificación de secuencias homólogas que difieren en pocos nucleótidos. En el
presente estudio, se han empleado cebadores degenerados con el objeto de poder
27
detectar secuencias homólogas de los genes que codifican para la colina TMA liasa y la
carnitina monooxigenasa en diversas especies bacterianas. Para ello, se amplificó el
ADN extraído de las 14 bacterias empleando los programas de termociclado
especificados en las Tablas 6 y 7. En ambos sistemas de amplificación (cntA y cutC) se
incluyó una reacción de amplificación en blanco, en la que la mezcla de reacción
contiene todos los reactivos necesarios para la amplificación de ADN excepto el ADN
molde. Las Figuras 6 y 7 muestran las separaciones que se obtuvieron de los análisis de
las reacciones de amplificación del gen cntA y cutC, respectivamente. Como se puede
observar en ambos geles de agarosa, las líneas correspondientes a las amplificaciones en
blanco (B) indican que no se produce ninguna contaminación o interferencia derivada
de la mezcla de reacción en la región donde cabría esperar la detección de los productos
de PCR (amplicones; 249 pb y 275 pb).
Figura 6. Análisis electroforético en geles de agarosa al 2% (p/v) del fragmento de
249 pb amplificado del gen cntA a partir de los extractos de ADN genómico
obtenidos de los siguientes microorganismos: Gel A, (1) P. mirabilis, (2) E. coli #1,
(3) K. pneumoniae #1, (4) E. cloacae, (5) Salmonella sp. #1, (6) S. marcescens, (7) A.
baumannii; Gel B, (8) K. pneumoniae #2, (9) C. youngae, (10) M. morgani, (11) E.
coli #2, (12) E. coli #3, (13) E. coli #4, (14) Salmonella sp. #2, (15) K. pneumoniae #1.
(M) Marcador de ADN de 100 bp. (B) Muestra de PCR en blanco (sin extracto de
ADN). La flecha indica el fragmento amplificado.
28
Figura 7. Análisis electroforético en geles de agarosa al 2% (p/v) del fragmento de
275 pb amplificado del gen cutC a partir de los extractos de ADN genómico
obtenidos de los siguientes microorganismos: Gel A, (1) P. mirabilis, (2) E. coli #1,
(3) K. pneumoniae #1, (4) E. cloacae, (5) Salmonella sp. #1, (6) S. marcescens, (7) A.
baumannii; Gel B, (8) K. pneumoniae #2, (9) C. youngae, (10) M. morgani, (11) E.
coli #2, (12) E. coli #3, (13) E. coli #4, (14) Salmonella sp. #2 (15) K. pneumoniae #1.
(M) Marcador de ADN de 100 bp. (B) Muestra de PCR en blanco (sin extracto de
ADN). La flecha indica el fragmento amplificado. “*”, se trata de una banda
inespecífica, ya que el tamaño del fragmento es ligeramente superior al tamaño de
los otros fragmentos.
Empleando esta metodología, se pudo observar que en las amplificaciones del gen cntA,
se obtiene un fragmento de tamaño próximo a 300 pb en las reacciones realizadas a
partir del ADN de K. pneumoniae #1, S. marcescens, A. baumannii, K. pneumoniae #2,
C. youngae, M. morgani, E. coli #2 y E. coli #3 (Figura 6). En el caso de las
amplificaciones del gen cutC, se detectó una banda correspondiente a un fragmento de
un tamaño próximo a 300 pb en las reacciones de PCR de los extractos de ADN de P.
mirabilis, K. pneumoniae #1, E. coli #2 y E. coli #4 (Figura 7). Aunque la estimación
del tamaño de los fragmentos de ADN en geles de agarosa es aproximada, 300 pb es
sustancialmente superior al tamaño de los fragmentos esperados (249 pb y 275 pb). Con
el fin de elucidar si los fragmentos obtenidos se corresponden a las secuencias esperadas
se consultó el trabajo de Rath et al. (2017) del cual se ha extraído la información
relativa a los cebadores utilizados en el presente estudio. En esta consulta se pudo
verificar que Rath et al. (2017) en su estudio también obtuvieron fragmentos con un
tamaño próximo a 300 pb en ambos sistemas de amplificación, por tanto, se asume que
los fragmentos obtenidos en este Trabajo Fin de Máster se corresponden con los
29
fragmentos esperados. Una posible explicación a este fenómeno puede ser el empleo de
geles pre-teñidos con GelRed. Según el fabricante de este reactivo, se ha observado que
GelRed puede afectar la migración de algunos fragmentos de ADN en geles pre-teñidos
con un porcentaje de agarosa elevado, como es el caso del presente estudio.
Lamentablemente, no se puede establecer una comparación de este aspecto con en el
trabajo de Rath et al. (2017), ya que no se indica el método de tinción ni el fluoróforo
que se empleó para elaborar los geles de agarosa. No obstante, en el momento actual, en
el laboratorio se está llevando a cabo la clonación de estos fragmentos en el vector
pGEM-T para efectuar su secuenciación y poder corroborar su identidad de manera
inequívoca.
En resumen, los resultados de la caracterización molecular de la capacidad productora
de TMA en las bacterias del presente estudio indican que K. pneumoniae #1 y #2, S.
marcescens, A. baumannii, C. youngae, M. morgani, E. coli #2 y #3 portan la
información genética necesaria para expresar el gen cntA, y por tanto, de ser así y si el
producto génico fuese el enzima activo, potencialmente podrían transformar
enzimáticamente L-carnitina en TMA. De forma similar, P. mirabilis, K. pneumoniae
#1, E. coli #2 y #4, portan el gen cutC, que podría codificar para una colina TMA liasa
activa, que potencialmente permitiera a estos microorganismos transformar la colina en
TMA.
Dado que el objetivo del presente Trabajo Fin de Máster se centra en la carnitina
monooxigenasa, a continuación se llevaron a cabo los experimentos para determinar la
capacidad de las bacterias para utilizar L-carnitina como única fuente de carbono y
producir TMA in vitro.
5.2. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD PARA UTILIZAR L-CARNITINA
COMO ÚNICA FUENTE DE CARBONO EN LAS BACTERIAS
OBJETO DE ESTUDIO
En un estudio previo, se ha demostrado que el producto funcional de la carnitina
monooxigenasa confiere a A. baumannii la capacidad para utilizar in vitro L-carnitina
como única fuente de carbono (Zhu et al., 2014). Para determinar la capacidad de las
bacterias del presente trabajo para utilizar L-carnitina como única fuente de carbono y
30
producir TMA in vitro, se cultivaron las bacterias en caldo BHI y posteriormente, se
inoculó una alícuota de 10 µL del cultivo en 2,5 mL de medio D, suplementado con 20
mM de L-carnitina y se cultivaron durante 24 h como se describe en el apartado 4.2.
Transcurrido el tiempo de incubación se llevó a cabo la medida de la densidad óptica a
600 nm mediante espectrofotometría para determinar de manera objetiva que especies
bacterianas habían sido capaces de crecer en presencia de L-carnitina como única fuente
de carbono. Como se puede deducir de los valores de densidad óptica corregida
(sustrayendo la densidad óptica obtenida para el cultivo control sin microorganismos)
de la Tabla 9, en los medios inoculados con K. pneumoniae #1 y #2 y A. baumanii se
produjo un aumento importante de la densidad óptica después de 24 horas de
incubación, indicando que estos microorganismos pueden utilizar la L-carnitina como
única fuente de carbono para su crecimiento y que por tanto, en las condiciones
ensayadas expresan el enzima funcional.
Tabla 9. Determinación espectrofotométrica de la turbidez de los cultivos
bacterianos en medio D suplementado con L-carnitina tras 24 horas de incubación.
Especie D.O.
(600 nm)
Desviación
estándar Especie
D.O.
(600 nm)
Desviación
estándar
P. mirabilis 0,001 0,002 K. pneumoniae #2 0,044 0,001
E. coli #1 0,003 0,001 C. youngae 0,003 0,002
K. pneumoniae #1 0,039 <0,001 M. morgani 0,021 0,001
E. cloacae 0,031 0,001 E. coli #2 0,003 0,001
Salmonella sp. #1 0,015 0,001 E. coli #3 0,002 0,001
S. marcescens 0,008 0,004 E. coli #4 0,005 0,001
A. baumannii 0,097 <0,001 Salmonella sp. #2 0,002 <0,001
Estos resultados están parcialmente en consonancia con los resultados obtenidos en el
estudio de caracterización molecular, ya que las tres bacterias cuyo crecimiento in vitro
en presencia de L-carnitina ha sido positivo, portan la secuencia génica de la carnitina
monooxigensa. Por otro lado, S. marcescens, C. youngae, M. morgani y E. coli #2 y #3
también poseen el gen cntA, y sin embargo, no se observó un crecimiento significativo
en presencia de L-carnitina en las condiciones empleadas.
31
A continuación, para determinar la capacidad productora in vitro de TMA a partir de L-
carnitina de las bacterias, se llevó a cabo el análisis de TMA en los sobrenadantes de los
cultivos mediante CE-UV.
5.3. DETECCIÓN DE TMA EN LAS BACTERIAS OBJETO DE ESTUDIO
MEDIANTE CE-UV
Antes de llevar a cabo la derivatización de los sobrenadantes de los cultivos bacterianos,
se optimizó la cantidad del reactivo derivatizante DBA necesario. Para ello se
emplearon las siguientes concentraciones: 10, 40, 80, 120, 160 y 200 mM DBA. En la
Figura 8 se muestran los electroferogramas obtenidos para cada una de las
concentraciones de derivatizante.
Figura 8. Electroferogramas correspondientes a una muestra de cultivo bacteriano
(Klebsiella pneumoniae #2) derivatizada con diferentes cantidades de DBA. Las
condiciones de análisis mediante CE-UV se indican en la sección 3.7. El pico
indicado con una flecha es el correspondientes al TMA derivatizado.
32
Posteriormente, a partir de estos electroferogramas se calculó el área y la altura del pico
correspondiente al TMA derivatizado en función de la cantidad de reactivo derivatizante
DBA (Figura 9).
Figura 9. (A) Área del pico y (B) altura del pico correspondiente al TMA
derivatizado con diferentes concentraciones de DBA. Las barras indican la
desviación estándar de la media (n=2).
Mientras que al área del pico no cambiaba significativamente a lo largo del intervalo de
concentraciones estudiado, se observó una clara mejora en la altura del pico empleando
una concentración de derivatizante igual o superior a 80 mM, por lo que se decidió
escoger una concentración de 80 mM para derivatizar todos los sobrenadantes de los
cultivos bacterianos en estudio. Una vez derivatizados, se llevó a cabo el análisis
mediante CE-UV. En la Figura 10 se muestran los electroferogramas obtenidos para
cada uno de ellos.
33
Figura 10. Electroferogramas correspondientes a los 14 sobrenadantes de os 14
cultivos bacterianos en estudio. Las condiciones de análisis mediante CE-UV se
indican en la sección 3.7. El pico indicado con una flecha es el correspondientes al
TMA derivatizado.
Una vez analizadas las muestras, se determinó el área del pico correspondiente al TMA
en cada uno de los sobrenadantes de los cultivos. En la Figura 11 se muestran los
resultados obtenidos.
34
Figura 11. Área de pico correspondiente a TMA en los sobrenadantes de los 14
cultivos bacterianos. Las barras indican la desviación estándar de la media (n=2).
Como se puede observar, después de 24 horas de incubación y en las condiciones de
cultivo indicadas en la Sección 4.2 únicamente las bacterias K. pneumoniae #1, A.
baumannii y K. pneumoniae #2 produjeron TMA a partir de L-carnitina. Estos
resultados están totalmente en línea con los valores obtenidos de densidad óptica
determinados en el apartado anterior, los cuales indicaban que en estas condiciones de
cultivo, solamente estas tres bacterias eran capaces de crecer en presencia de L-carnitina
como única fuente de carbono.
Sin embargo, los resultados obtenidos en el apartado 5.1 indicaban que S. marcescens,
M. morgani y E. coli #2 y #3 también eran portadoras de información genética necesaria
para expresar el gen cntA. Se pueden formular varias hipótesis para explicar estos
resultados. Por un lado, es posible que las condiciones de cultivo elegidas no sean las
óptimas para mantener el cultivo de estos microorganismos en presencia de L-carnitina
o para inducir la expresión génica de la carnitina monooxigenasa. Por ejemplo, aunque
S. marcescens puede crecer en medios enriquecidos a 37 ºC, su temperatura óptima de
crecimiento, así como la de producción de su característico pigmento rojo se encuentra
por debajo de los 30 ºC. Por otro lado, no se puede descartar que estos microorganismos
35
presenten secuencias génicas defectivas que den lugar a proteínas no funcionales que
sean incapaces de transformar la L-carnitina en TMA.
En resumen, en base a los resultados obtenidos en este estudio se puede concluir que
ambas cepas de K. pneumoniae y A. baumannii presentan la capacidad de transformar la
L-carnitina en TMA in vitro y por tanto, las tres cepas podrían emplearse para poner a
punto el método de cribado que permitiera ensayar la capacidad de un grupo de
extractos para inhibir la producción in vitro de TMA a partir de L-carnitina.
36
6. CONCLUSIONES
1. Las bacterias K. pneumoniae #1 y #2, S. marcescens, A. baumannii, C. youngae, M.
morgani, E. coli #2 y #3 presentan secuencias homólogas al gen cntA, mientras que P.
mirabilis, K. pneumoniae #1, E. coli #2 y #4 portan secuencias homólogas al gen cutC.
2. Ambas cepas de K. pneumoniae y A. baumannii pueden utilizar L-carnitina in vitro
como única fuente de carbono para su crecimiento, y además, tienen la capacidad de
producir TMA.
3. Estos resultados permiten seleccionar estas tres bacterias para la puesta en marcha de
un método de cribado in vitro que permita identificar nuevos extractos de origen natural
con capacidad para inhibir la producción bacteriana de TMA a partir de L-carnitina.
37
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bennett, B.J., Aguiar, T., Wang, Z., Shih, D.M., Meng, Y., Gregory, J., Allayee, H.,
Lee, R., Graham, M., Crooke, R., Edwards P.A., Hazen, S.L. y Lusis, A.J.
(2013). Trimethylamine-N-Oxide, a metabolite associated with atherosclerosis,
exhibits complex genetic and dietary regulation. Elsevier, 17, 49-60.
Boutagy, N., Neilson, A., Osterberg, K., Smithson, A., Englund, T., Davy, B., Hulver,
M. y Davy, K. (2015). Short-term high-fat diet increase postprandial
trimethylamine-N-oxide in humans. Nutrition Research, 35, 858-864.
Cani, P. y Everard, A. (2015). Talking microbes: When gut bacteria interact with diet
and host organs. Molecular Nutrition and Food Research, 60, 58-66.
Clarie, H. (2010). The importance of being choline. Journal of American Dietetic
Association, 1162-1165.
Conlon, M. y Bird, A. (2014). The impact of diet and lifestyle on gut microbiota and
human health. Nutrients, 7, 17-44.
Craciun, S. y Balskus, E. (2012). Microbial conversión of choline to trimethylamine
requires a glycyl radical enzyme. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 109, 21307-21312.
Eurostat statistics explained (2017). Causes of death statistics. Recuperado el 20 de
Junio de 2018 de http://ec.europa.eu/eurostat/statistics-
explained/index.php?title=Causes_of_death_statistics.
Falony, G., Vieira-Silva, S. y Raes, J. (2015). Microbiology meets big data: The case of
gut microbiota-derived trimethylamine. Annual Review of Microbiology, 69,
305-321.
Fundación Gaspar Casal (2017). Análisis de costes de la insuficiencia cardiaca y la
cardiopatía isquémica. Recuperado de
http://www.fgcasal.org/publicaciones/Libro_analisis_de_costes_de_la_Insuficie
ncia_Cardiaca_y_la_Cardiopatia_Isquemica.pdf.
Gálvez, A. (2011). La complejidad de las relaciones de los microorganismos con
organismos superiores. Anales, 24, 33-43.
38
Gregory, J., Buffa, J., Org, E., Wang, Z., Levison, B., Zhu, W., Wagner, M., Bennett,
B., Li, L., DiDonato, J., Lusis, A. y Hazen, S. (2015). Transmission of
atherosclerosis susceptibility with gut microbial transplantation. The Journal of
Biological Chemestry, 290, 5647-5660.
Hartiala, J., Bennett, B., Tang, W., Wang, Z., Stewart, A., Roberts, R., McPherson, R.,
Lusis, A., Hazen, S. y Allayee, H. (2014). Comparative genome-wide
association studies in mice and humans for trimethylamine N-oxide, a
proatherogenic metabolite of choline and L-carnitine. Arteriosclerosis,
Thromobosis, and Vascular Biology, 34, 1307-1313.
Hooper, L. y Gordon, J. (2001). Commensal host-bacterial relationships in the gut.
Science, 292, 1115-1118.
Hooper, L., Midtvedt, T. y Gordon, J. (2002). How host-microbial interactions shape
the nutrient environment of the mammalian intestine. Annual Review of
Nutrition, 22, 283-307.
Jameson, E., Doxey, A., Airs, R., Purdy, K., Murrell, J. y Chen, Y. (2016).
Metagenomic data-mining reveals contrasting microbial population responsible
for trimethylamine formation in human gut and marine ecosystems. Microbial
Genomics, doi: 10.1099/mgen.0.000080.
Jameson, E., Quareshy, M. y Chen, Y. (2018). Methodological considerations for the
identification of choline and carnitine-degrading bacteria in the gut. Methods,
doi: 10.1016/j.ymeth.2018.03.0.
Koeth, R., Levison, B., Culley, M., Buffa, J., Wang, Z., Gregory, J., Org, E., Wu, Y., Li,
L., Smith, J., Tang, W., DiDonato, J., Lusis, A. y Hazen, S. (2014). ᴕ-
Butyrobetaine is a proatherogenic intermediate in gut microbial metabolism of
L-carnitine to TMAO. Cell Metabolism, 20, 799-812.
Koeth, R.A., Wang, Z., Levison, B.S., Buffa, J.A., Org, E., Sheehy, B.T., Brit, E.B., Fu,
X., Wu, Y., Li, L., Smith, J.D., DiDonato J.A., Chen, J., Li, H., Wu, G.D.,
Lewis, J.D., Warrier, M., Brown, J.M., Krauss, R.M., Wilson Tang, W.H.,
Bushman, F.D., Lusis, A. y Hazen, S.L. (2013) Intestinal microbiota metabolism
39
of l-carnitine, a nutrient in red meat, promotes atherosclerosis. Nature Medicine,
19, 576-587.
Laparra, J. y Sanz, Y. (2010). Interactions of gut microbiota with functional food
components and nutraceuticals. Pharmacological Research, 61, 219-225.
Liévin-Le Moal, V. y Servin, A. (2006). The front line of enteric host defense against
unwelcome intrusion of harmful microorganisms: mucins, antimicrobial
peptides, and microbiota. Clinical Microbiology Review, 19, 315-337.
Malinowska, A., Szwengiel, A. y Chmurzynska, A. (2017). Dietary, anthropometric,
and biochemical factors influencing plasma choline, carnitine, trimethylamine-
N-oxide concentrations. International Journal of Food Sciences and Nutrition,
68, 488-495.
Martínez-del Campo, A., Bodea, S., Hamer, H.A., Marks, J.A., Haiser, H.J., Turnbaugh,
P.J., Balskus, E.P. (2015). Characterization and detection of a widely distributed
gene cluster that predicts anaerobic choline utilization by human gut bacteria.
mBio, 6, 1-12.
McCrindle, S., Kappler, U. y McEwan, A. (2005). Microbial dimethylsulfoxide and
trimethylamine-N-oxide respiration. Advance in Microbial Physiology, 50, 147-
198.
Mente, A., Chalcraft, K., Ak, H., Davis, A., Lonn, E., Miller, R., Potter, M., Yusuf, S.,
Anand, S. y McQueen, M. (2015). The relationship between trimethylamine-N-
oxide and prevalent cardiovascular disease in a multiethnic population living in
Canada. Canadiona Journal of Cardiology, 31, 1189-1194.
Miller, C., Corbin, K., da Costa, K., Zhang, S., Zhao, X., Galanko, J., Blevins, T.,
O’Connor, A. y Zeisel, S. (2014). Effect of egg ingestion on trimethylamine-N-
oxide production in humans: a randomized, controlled, dose-response study. The
American Journal of Clinical Nutrition, 100, 778-786.
Mohamed, I., Maimaiti, A., Mori, N., Yamanaka, N. y Taniguchi, T. (2014).
Simultaneous determination of β-alanine betaine and trimethylamine in bacterial
culture and plant samples by capillary electrophoresis. Journal of Analytical
Science and Technology, 5:38.
40
National Heart, Lung, and Blood Institute. Aterosclerosis. Recuperado el 17 de Julio de
2018 de https://www.nhlbi.nih.gov/health-topics/aterosclerosis.
O’Hara, A. y Shanahan, F. (2006). The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports, 7,
688-693.
Organización Mundial de la Salud (OMS) (2017). Enfermedades cardiovasculares.
Recuperado el 30 de Abril de 2018 de http://www.who.int/es/news-room/fact-
sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds).
Petrosino, J., Highlander, S., Luna, R., Gibbs, R. y Versalovic, J. (2009). Metagenomic
pyrosequencing and microbial identification. Clinical Chemistry, 55, 856-866.
Piepoli, M., Hoes, A., Agewall, S., Albus, C., Brotons, C., Catapano, A., Cooney, M.,
Corrà, U., Cosyns, B., Graham, I., Hall, M., Hobbs, F., Lochen, H.,
Marques.Vidal, P., Perk, J., Prescott, E., Redon, J., Richer, D., Sattar, N.,
Smulders, Y., Tiberi, M., Van der Worp, H., van Dis, I., Verschuren, W. y
Binno, S. (2016). 2016 European Guidelines on cardiovascular disease
prevention in clinical practice: The Sixth Joint Task Force of the European
Society of Cardiology and Other Societies on Cardiovascular Disease Prevention
in Clinical Practice (constituted by representatives of 10 societies and by invited
experts) Developed with the special contribution of the European Association
for Cardiovascular Prevention and Rehabilitation (EACPR). European Heart
Journal, 37, 2315-2381.
Rath, S., Heidrich, B., Pieper, D.H. y Vital, M. (2017). Uncovering the trimethylamine-
producing bacteria of the human gut microbiota. Microbiome Journal,5, 1-14.
Rohrmann, S., Linseisen, J., Allenspach, M., von Eckardstein, A. y Müller, D. (2016).
Plasma concentration of trimethylamine-N-oxide are directly associated with
dairy food consumption and low-grade inflammation in a german adult
population. The Journal of Nutrition, 146, 283-289.
Romano, K., Vivas, E., Amador-Noguez, D. y Rey, F. (2015). Intestinal microbiota
composition modulates choline bioavailability from diet and accumulation of the
proatherogenic metabolite trimethylamine-N-oxide. mBio, 6, doi:
10.1128/mBio.02481-14.
41
Romano, K.A., Vivas, E.I., Amador-Noguez, D.A. y Rey, F.E. (2015). Intestinal
microbiota composition modulates choline bioavailability from diet and
accumulation of the proatherogenic metabolite trimethylamine-N-Oxide. mBio,
6, 1-8.
Rondanelli, R. y Rondanelli S., R. (2014). Estilo de vida y enfermedad cardiovascular
en el hombre. Revista Médica Clínica Las Condes, 25, 69-77.
Sociedad Española de Arteriosclerosis (SEA) (2007). Las enfermedades
cardiovasculares y sus factores de riesgo en España: hechos y cifras. Recuperado
de www.se-arteriosclerosis.org/assets/informe-sea-2007.pdf.
Stary, H., Chandler A., Dinsmore, R., Fuster, V., Glagov, S. y Insull, W. (1995). A
definition of advanced types of atherosclerotic lesions and a histolofical
classification of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular
Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association.
Circulation, 92, 1355-1374.
Stella, C., Beckwith-Hall, B., Cloarec, O., Holmes, E., Lindon, J., Powell, J., van der
Ouderaa, F. Bingham, S., Cross, A. y Nicholson, J. (2006). Susceptibility of
human metabolic phenotypes to dietary modulation. Journal of Proteome
Research, 5, 2780-2788.
Tang, W.H., Wang, M.D., Levison, B.S., Koeth, R.A., Britt, E.B., Fu, X., Wu, Y. y
Hazen, S.L. (2013). Intestinal microbial metabolism of phosphotidylcholine and
cardiovascular risk. The new England Journal of Medicine, 368, 1575-1584.
Tang, W.H., Wang, Z., Fan, Y., Levison, B., Hazen, J., Donahue, L., Wu, Y. y Hazen,
S. (2014). Prognostic value of elevated levels of intestinal microbe-generated
metabolite trimethylamine-N-oxide in patients with heart failure: refining the gut
hypothesis. Journal of the American College of Cardiology, 64, 1908-1914.
Tap, J., Mondot, S., Levenez, F., Pelletier, E., Caron, C., Furet, J., Ugarte, E., Muñoz-
Tamayo, R., Paslier, D., Nalin, R., Dore, J. y Leclerc, M. (2009). Towards the
human intestinal microbiota phylogenetic core. Environmental Microbiology,
11, 2574-2584.
42
The Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) (2017). State
of Health in the EU: España. Recuperado de http://www.oecd.org/spain/espana-
perfil-sanitario-del-pais-2017-9789264285446-es.htm.
Thomas, P., Sekhar, A., Upreti, R., Mujawar, M. y Pasha, S. (2015). Optimization of
single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with simple anchoring as an
assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony
isolation from diverse samples. Biotechnology Reports, 8, 45-55.
Wang, Z., Klipfell, E., Bennett, B. J., Koeth, R., Levison, B.S., DuGar, B., Feldstein,
A.E., Britt, E. B., Fu, X., Chung, Y., Wu, Y., Schauer, P., Smith, J.D., Allayee,
H., Tang, W.H., DiDonato, J.A., Lusis, A.J. y Hazen, S.L. (2011). Gut
metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature,
472, 53-64.
Wang, Z., Roberts, A.B., Buffa, J.A., DiDonato, J.A., Lusis, A.J. y Hazen, S.L. (2015).
Non-lethal inhibition of gut microbial trimethylamine production for the
treatment of atherosclerosis. Cell, 163, 1585-1595.
Wang, Z., Tang, W., Buffa, J., Fu, X., Britt, E., Koeth, R., Levison, B., Fan, Y., Wu, Y.
y Hazen , S. (2014). Prognostic value of choline and betaine depends on
instestinal microbiota-generated metabolite trimethylamine-N-oxide. European
Heart Journal, 35, 904-910.
Zhu, B., Wang, X. y Li, L. (2010). Human gut microbiome: the second genome of
human body. Protein Cell, 8, 718-725.
Zhu, W., Gregory, J., Org, E., Gupta, N., Wang, Z., Li, L., Fu, X., Wu, Y., Mehrabian,
M., Sartor, R., Mclntyre, T., Silvesrstein, R., Tang, W., DiDonato, J., Brown, J.,
Lusis, A. y Hazen, S. (2016). Gut microbial metabolite TMAO enhance platelet
hyperreactivity and thrombosis risk. Cell, 161, 11-124.
Zhu, Y., Jameson, E., Crosatti, M., Schäfer, H., Rajakumar, K., Bugg, T. y Chen, Y.
(2014). Carnitine metabolism to trimethylamine by an unusual Rieske-type
oxygenase from human microbiota. PNAS, 111, 4268-4273.