detecciÓn molecular de las translocaciones

DETECCIÓN MOLECULAR DE LAS TRANSLOCACIONES MÁS COMUNES EN 117 CASOS DE LEUCEMIA AGUDA

MEDIANTE RT-PCR

LILIANA MARGARITA GARCIA ESCORCIA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAFACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE POSGRADOBOGOTÁ , D.C.

2000


MEDIANTE RT-PCR


Trabajo presentado como requisito parcial para optar al título de:Magister en Biología

Dierctor:Gonzálo Guevara Pardo

MD, M.Sc



2000


MEDIANTE RT-PCR


Trabajo presentado como requisito parcial para optar al título de:Magister en Biología

Dr. Carlos Corredor Ph. D Dr. Gonzálo Guevara P. Decano Académico Jefe Lab. Genética, INC Director de Tesis M.D.Genetista

Dr. Luis Alejandro Barrera Ph.D Director Postgrado Jurado De Tesis Maria Amparo Buendia M.D. Oncologa Pediatrico

Jurado De Tesis Jurado De TesisMyriam Rodriguez Juan Carlos Prieto M.D. Hematologo M.D. Genetista



2000

“Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y las conclusiones anotadas son de responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la Pontificia Universidad Javeriana”. (Articulo 918 del reglamento de los trabajos de grado e investigación. Agosto de 1989)

AGRADECIMIENTOS

Al doctor Gonzalo Guevara, Médico genetista, Director del Laboratorio de Genética del Instituto Nacional de Cancerología, por la colaboración y el aporte científico en el desarrollo de este proyecto.

Al doctor Andrea Biondi y su grupo de investigación en el Centro di Ricerca Matilde Tettamanti, por su colaboración y apoyo incondicional.

Al grupo de trabajo del Laboratorio de Hematología especial del Instituto Nacional de Cancerología, por su gran aporte en el proceso de desarrollo de esta investigación.

A la doctora Amparo Buendía, Médico oncopediatra del Instituto Nacional de Cancerología por su constante apoyo y colaboración en la culminación de este trabajo.

Al doctor Carlos Saavedra, Medico Hematopatólogo del Instituto Nacional de Cancerología, por su colaboración en el diagnóstico de las leucemias y su gran interés.

A todas mis compañeras , en quienes siempre encontré un apoyo, guía y colaboración incondicional.

A mi familia por su fuerza , amor y lucha.

A todas aquellas personas que de una u otra forma permitieron la realización de este proyecto.

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCION

OBJETIVOS

1. HISTORIA Y DEFINICIÓN 1

2. EPIDEMIOLOGÍA 3

2.1 FACTORES GENÉTICOS 4

2.2 FACTORES AMBIENTALES 4

2.1FACTORES GENÉTICOS 4

2.2 FACTORES AMBIENTALES 4

2.2.1 Radiación 4

2.2.2 Campos electromagnéticos 5

2.2.3 Químicos 5

2.3 FACTORES VIRALES 6

2.4 OTROS FACTORES 6

3. DIAGNÓSTICO 7

3.1 SINTOMATOLOGÍA 7

3.2 HALLAZGOS DE LABORATORIO Y PATOLOGÍA 7

3.3 CITOQUÍMICA 8

3.3.1 Coloración de PAS 8

3.3.2 Fosfatasa ácida 9

3.3.3 ANAE 9

3.3.4 Mieloperoxidasa 9

3.3.5 Sudan Negro B 9

4. PRONÓSTICO 10

5. TRATAMIENTO 12

5.1 INDUCCIÓN A REMISIÓN 12

5.2 TERAPIA PREVENTIVA PARA SNC 13

5.3 CONSOLIDACIÓN 13

5.4 MANTENIMIENTO DE LA TERAPIA 13

6. LEUCEMIA LINFOIDE AGUDA 14

6.1 MORFOLOGÍA 14

6.1.1 LLA-L1 14

6.1.2 LL-L2 14

6.1.3 LLA-L3 15

6.2 INMUNOLOGÍA 15

6.2.1 Stem cell pluripotente 16

6.2.2 Linaje B 16

6.2.2.1 Temprana Pre-B 16

6.2.2.2 Pre-B 16

6.2.2.3 B Madura 16

6.2.3 Linaje T 16

6.2.3.1 Pre-T 16

6.2.3.2 Intratímicas 16

6.2.3.3 T Periféricas 17

6.2.4 Bifenotípicas 17

6.3 GENÉTICA 19

6.3.1 Hiperdiploidías 19

6.3.2 t(12;21)(p13;q28) 20

6.3.3 t(1;19)(q23;q13) 21

6.3.4 t(9;22)(q34;q11) 21

6.3.5 t(4;11)(q21;q23) 21

6.3.6 t(8;14) 22

6.3.7 Otras 22

7. LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA 24

7.1 MORFOLOGÍA 24

7.1.1 LMA-M0 24

7.1.2 LMA-M1 24

7.1.3 LMA-M2 25

7.1.4 LMA-M3 25

7.1.5 LMA-M4 26

7.1.6 LMA-M5 26

7.1.7 LMA-M6 26

7.1.8 LMA-M7 27

7.2 INMUNOLOGÍA 27

7.3 CITOGENÉTICA 28

7.3.1 t(15;17)(q22;q21) 28

7.3.2 t(8;21)(q22;q22) 29

7.3.3 Inv,(16)(p13;q22) 30

7.3.4 Alteraciones del 11q23 30

7.3.5 Trisomías, monosomías y deleciones 31

8. DESCRIPCIÓN MOLECULAR DE LAS TRANSLOCACIONES 32

8.1 t(1;19)(q23;p13) 32

8.2 t(4;11)(q21;q23) 33

8.3 t(12;21)(p13;q22) 39

8.4 t(9;22)(q34;q11) 39

8.5 t(8;21)(q22;q22) 42

8.6 t(15;17)(q22;q21) 48

8.7Inv.(16)(p13;q22) 49

9. MATERIALES Y MÉTODOS 56

9.1PACIENTES 56

9.2 DIAGNÓSTICO MORFOLÓGICO 56

9.3 DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO 57

9.4 DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO 57

9.5 DIAGNÓSTICO MOLECULAR 58

9.5.1 Extracción RNA 58

9.5.1.1 Protocolo del TRIZOL 58

9.5.1.2 Protocolo del GITC 59

9.5.2 Transcripción Reversa 60

9.5.3 Reacción en cadena de la polimeras (PCR) 60

10. RESULTADOS 63

11. DISCUSIÓN 85

11.1 LEUCEMIA LINFOIDE AGUDA 87

11.1.1 Alteraciones genéticas 88

11.2 LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA 93

11.2.1 Alteraciones genéticas 94

CONCLUSIONES Y PROPUESTA 98

PERSPECTIVAS 101

BIBLIOGRAFIA 102

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 MARCADORES INMUNOLÓGICOS 18

FIGURA 2 TRANSLOCACIÓN t(1;19) 35






FIGURA 8 INVERSIÓN (16) 54

FIGURA 9 RESULTADO LEUCEMIAS AGUDAS NIÑOS Vs. ADULTOS 65

FIGURA 10 RESULTADO DISTRUBICIÓN POR SEXO EN LLA 65

FIGURA 11 RESULTADO VIVOS Vs MUERTOS EN LLA 66

FIGURA 12 RESULTADO CLASIFICACIÓN FAB EN LLA 66

FIGURA 13 RESULTADO INMUNOFENOTIPO EN LLA 67

FIGURA 14 RESULTADO ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LLA 67

FIGURA 15 RESULTADO ALTERACIONES

MOLECULARES EN LLA 68

FIGURA 16 RESULTADO TOTAL DE ALTERACIONES 69 NIÑOS EN LLA

FIGURA 17 RESULTADO DISTRIBUCIÓN POR SEXO EN LMA 70

FIGURA 18 RESULTADO VIVOS Vs MUERTOS EN LMA 70

FIGURA 19 RESULTADO CLASIFICACION FAB EN LMA 71

FIGURA 20 RESULTADO ALTERACIONES CROMOSÓMICAS EN LMA 71

FIGURA 21 RESULTADO ALTERACIONES MOLECULARES EN LMA 72

FIGURA 22 RESULTADO ALTERACIONES EN LMA M2 Y LMA M3 72

FIGURA 23 LINEAS CELULARES 62

FIGURA 24 RNA 73

FIGURA 25 EVALUACION DNAc 73

FIGURA 26 EVALUACION t(12;21) 74

FIGURA 27 EVALUACION t(9;22)p210 74

FIGURA 28 EVALUACION t(9;22)p190 75



FIGURA 31 EVALUACION InV.(16) 76



FIGURA 34 COMPARACIÓN CASOS EN LLA Y LMA RT-PCR Vs. CITOGENÉTICA 78

LISTA DE TABLAS

TABLA 1 LLA EN NIÑOS 79

TABLA 2 LLA EN ADULTOS 79

TABLA 3 LMA EN NIÑOS 81

TABLA 4 LMA EN ADULTOS 81

TABLA 5 ALTERACIONES MOLECULARES LLA EN NIÑOS 82

TABLA 6 ALTERACIONES MOLECULARES LLA EN ADULTOS 83

TABLA 7 ALTERACIONES MOLECULARES LMA EN NIÑOS 84

TABLA 8 ALTERACIONES MOLECULARES LMA EN ADULTOS 84

INTRODUCCIÓN

Las leucemias son un grupo de neoplasias que afectan a niños y adultos produciendo gran mortalidad y morbilidad. Esta patología se ha agrupado de forma general en leucemias crónicas y agudas. La leucemia crónica se caracteriza por una proliferación no regulada con expansión de células en diferentes estados de maduración porque logran diferenciarse. La leucemia aguda se caracteriza por un bloqueo en la diferenciación celular que conserva su capacidad de dividirse, lo que se traduce en una acumulación de células inmaduras o blásticas en médula ósea. Esta división celular se presenta a gran velocidad lo cual conlleva al incremento rápido de la neoplasia.Una clasificación correcta de las células leucémicas por morfología, inmunología y citogenética tiene gran impacto en el manejo de los pacientes que sufren de esta neoplasia especialmente en niños, esto ha permitido clasificar el riesgo y adecuar la terapia al pronóstico evitando la toxicidad en pacientes de muy buen pronóstico o de intensificarla en caso de mal pronóstico.En estos tumores son bien conocidos sus defectos genéticos a nivel cromosómico y a nivel molecular. La técnica más utilizada para diagnosticar estas alteraciones ha sido la citogenética convencional donde desgraciadamente este procedimiento es difícil, dispendioso, laborioso y largo en el tiempo y requiere de gran experiencia para su lectura. La mala calidad de las metafases, la ausencia de mitosis o presencia de translocaciones crípticas, hacen imposible en muchos casos el diagnóstico genético, es aquí donde entra a jugar un papel importante el diagnóstico mediante RT-PCR que no posee estas dificultades.Se busca con este estudio determinar la frecuencia de los transcritos BCR-ABL, TEL-AML1, MLL-AF4, E2A-PBX, PML-RARα, ETO-AML1, y CBFβ-MYH11 en 117 pacientes con leucemia aguda, correlacionando los resultados obtenidos en nuestra población con la morfología, inmunología y citogenética.La implementación de esta técnica tendrá repercusión directa en el campo clínico y podrá abrir nuevas proyecciones en la investigación básica de las leucemias

OBJETIVOS

1. Definir las condiciones óptimas de la PCR para la detección de cada una de las translocaciones.

2. Correlacionar estos resultados con los obtenidos por citogenética, morfología celular e inmunofenotipo y evaluar su influencia en el diagnóstico de la leucemia aguda.


MEDIANTE RT-PCR

1. HISTORIA Y DEFINICIÓN

Desde los tiempos de Hipócrates se describieron pacientes con signos y síntomas clínicos que sugerían un cuadro de leucemia aguda, la primera descripción fue hecha por Valpeau en 1827 y Donné realizó la primera observación microscópica de la enfermedad (76). Sin embargo fue Rudolf Virchow 1845 (Berlín) y en 1885 Jhon Bennet (Edimburgo) quienes reconocieron la leucemia como entidad. Ambos describieron independientemente pacientes que presentaban síntomas como: debilidad creciente, hinchazón del abdomen y epixtasis severas. En las autopsias los hallazgos más destacados fueron la esplenomegalia y variación en color y consistencia de la sangre. Bennet describía que la sangre parecía mezclada con pus, al analizarla al microscopio confirmó la presencia de corpúsculos grandes semejantes a los encontrados en pus, sin embargo recalcó que a pesar de esto no encontraba signos manifiestos de inflamación que generalmente estaban acompañan la presencia de pus. Virchow usó el termino “Weissus blut” que significa “sangre blanca” para referirse al color blanquecino de ésta y dos años más tarde se tradujo al griego adoptando el termino de “leucemia”.Virchow observando al microscopio la sangre de los pacientes con leucemia, encontró que no todos mostraban compromiso del mismo tipo de célula blanca (leucocito), algunas de estas eran granulares con núcleos irregulares y divididos, otras eran agranulares con núcleos redondos. Es posible que estas diferencias correspondan a lo que hoy en día conocemos como leucemia mieloide y leucemia linfoide respectivamente. Estas dos formas fueron confirmadas posteriormente por Erlich al introducir su método de tinción diferencial para las células sanguíneas(54, 30)En 1889 Ebstein propuso una clasificación adicional diciendo que un tipo de leucemia parecía tener pronóstico sombrío y no respondía al tratamiento denominándola leucemia aguda y el segundo grupo

recibió el nombre de crónica porque los pacientes podían recibir un alivio temporal de sus síntomas.(54)

La definición de leucemia concebida por Virchow es valida hoy día:“ Esto es lo que nosotros conocemos acerca de la leucemia: durante la producción normal de células sanguíneas, las células se diferencian a tipos específicos. En una situación patológica, la diferenciación a células específicas es bloqueada. Este disturbio en la diferenciación normal (llamado leucemia)es una enfermedad sui generis. Nosotros conocemos la secuela de la enfermedad pero no conocemos su origen”.Las leucemias son neoplasias derivadas en su mayoría, de progenitores hematopoyéticos que inicialmente proliferan en médula ósea (MO) y posteriormente se diseminan a sangre periférica(SP), bazo, nódulos linfáticos y otros tejidos. (30)La leucemia aguda esta caracterizada por una proliferación clonal que proviene de la replicación y expansión del clon transformado, con predominio de precursores inmaduros mieloides o linfoides (blastos). Los blastos sustituyen poco a poco la médula ósea (MO) normal, reflejándose en una disminución de eritocitos, leucocitos y plaquetas produciendo complicaciones como anemia, infecciones y hemorragias. La leucemia aguda se caracteriza principalmente por una alteración en la maduración celular y en consecuencia pérdida de la capacidad funcional (85,90). El curso de la enfermedad es relativamente corto y por lo general la muerte ocurre en los siguientes meses al diagnóstico a no ser que se logre pronto la remisión(54). El termino leucemia agrupa un conjunto de enfermedades clínicas y morfológicamente diferentes que dependen del tipo de progenitor hematopoyético involucrado, linfoide o mieloide y de acuerdo a su conducta clinicopatológica: crónicas o agudas.

2. EPIDEMIOLOGÍA

Dentro de las leucemias agudas nivel mundial las mas altas incidencias se han reportado para LLA en China, Japón, EE.UU, Inglaterra y Europa, para LMA en Shanghai, Japón y Nueva Zelanda(78). Durante el año de 1995 en los Estados Unidos de Norteamérica las leucemias agudas ocuparon el puesto doce en incidencia correspondiendo al 2.1% de todos los cánceres diagnosticados y el séptimo puesto en mortalidad. En Colombia, según Globocan, para el año de 1998 se diagnosticaron 912 casos nuevos en hombres y 811 en mujeres (total 1723 casos), ocupando el sexto y octavo puesto respectivamente, murieron por esta causa 674 en hombres y 571 mujeres (total 1245 casos), ocupando los puestos sexto y noveno. La LLA es la neoplasia maligna más frecuente en le edad pediatrica con una incidencia aproximada de 3,5 casos nuevos por año y es una de las principales causas de mortalidad infantil, el pico de incidencia se encuentra entre el tercero y el quinto año de vida pudiéndose calcular su incidencia de 50 por un millón de habitantes, la cual disminuye a 10 por millón de habitantes en la pubertad, observándose un incremento alrededor de los 65 a 75 años a 15 por un millón de habitantes. La incidencia de la LMA es relativamente constante de 10 por un millón de habitantes durante los 10 primeros años de vida llegando a 15 por millón en la pubertad, pero contrario a la LLA, el pico de incidencia es en la edad adulta alrededor de los 75 años llegando a 50 por un millón de habitantes. Aproximadamente el 80% de las LLAs corresponden a niños mientras el 80 % de las LMAs a adultos. De acuerdo con los estudios epidemiológicos la leucemia aguda es más común en la raza blanca que en la negra, pero se desconoce si esta diferencia refleja el impacto de factores ambientales o de factores genéticos, también se encuentra que la relación entre sexo masculino y femenino es de 1.3 : 1.No se sabe con exactitud el origen de la leucemia, sin embargo existen una serie de factores intrínsecos y extrínsecos que están involucrados en su génesis como:

2.1 Factores genéticos: Existen muchas pruebas que indican que los factores hereditarios juegan un papel importante en los procesos de leucemogénesis, por ejemplo, patologías que involucran inestabilidad genética, anomalías cromosómicas o mutaciones puntuales, presentan mayor incidencia de leucemia como la anemia de Fanconi, síndrome de Bloom, síndrome de Wiskott-Aldrich, Diamond-Blackfan y ataxia telangiectasia. En el síndrome de Down, que posee un cromosoma 21 adicional, se observa una incidencia 20 veces mayor de leucemia respecto a la población general. Algunos estudios demuestran que el riesgo entre gemelos idénticos cuando uno de ellos ha padecido la enfermedad es 40 veces mayor para el otro; también se ha observado mayor frecuencia de leucemia entre familiares de primer grado de pacientes que padecen esta patología, todo lo anterior apoya la asociación entre factores genéticos y la leucemia.

2.2 Factores ambientales

Existen diversos factores ambientales que se han asociado con la leucemogénesis, entre los que se encuentran:

2.2.1Radiación:

Es bien conocida la relación causal entre la radiación ionizante y la producción de leucemia, antiguamente se observó un riesgo aumentado (1.7 veces mayor) de leucemia entre los radiólogos respecto a la población general cuando no existían normas de protección. De igual forma los pacientes que reciben radiación ionizante terapéutica como en la espondilitis anquilosante, enfermedad de Hodgkin, policitemia vera etc. poseen mayor riesgo de desarrollar una leucemia, soportando la hipótesis que bajas dosis de radiación por tiempos prolongados son leucemogénicos. Pruebas adicionales del papel de la radiación ionizante se originaron en la observación del incremento de leucemias agudas en los sobrevivientes a las explosiones nucleares ocurridas en Hiroshima y Nagasaki (1945), que se relacionó linealmente con la dosis recibida a partir de 100 cGy. En un estudio sobre 98 sobrevivientes con leucemia se encontró que 37

desarrollaron LMC, 61 LMA y SMD.(32). Actualmente se siguen realizando experimentos in vitro sobre líneas celulares para investigar la acción de la radiación ionizante(14) 2.2.2 Campos electromagnéticos(Electromagnetic fields EMF)

Existen estudios contradictorios sobre el papel de EMF en procesos leucemogénicos, investigaciones hechas sobre una población de niños que habitaban cerca de líneas de alto voltaje en Denver- EE.UU, mostró incidencias dos o tres veces de cáncer más altas incluyendo LLA, resultados similares se obtuvieron en Suecia, sin embargo otros trabajos realizados en Road-Island y York Shied no encontraron ninguna asociación entre EMF y LLA en niños. Actualmente existen varias investigaciones en curso tendientes a aclarar el papel de los campos electromagnéticos y el cáncer.

2.2.3 Químicos

se encuentra bien establecido la aparición de leucemias agudas no linfoides con la exposición crónica a aromáticos cíclicos hidrocarbonados especialmente el benceno entre personas que manejan estos compuestos cómo zapateros y pintores. Otros compuestos como los herbicidas, pesticidas, cigarrillo, anticonceptivos y alcohol también se han vinculado con las leucemias agudas(90). Más recientemente la aparición de leucemias secundarias al tratamiento con agentes alquilantes o inhibidores de topoisomerasa sugiere que compuestos naturales más ubicuos con la misma acción pueden estar involucrados en la aparición de las leucemias primarias como el caso de algunos bioflavonoides, elementos encontrados en frutas y otros alimentos de la dieta, recientes estudios indican que los bioflavonoides son capaces de actuar a nivel del gen MLL (92), involucrado en leucemias agudas de novo infantiles con t(4;11).Estudios recientes realizados en 9000 niños previamente tratados con agentes alquilantes o inhibidores de la topoisomerasa que presentaban otro tipo de cáncer, manifestaron leucemia como segunda neoplasia 14 veces más frecuente respecto a la población general (3). 2.3 Factores virales

Desde 1911 cuando Peyton Rous describió un retrovirus que producía

un sarcoma en gallinas(sarcoma de Rous) se han venido describiendo otros retrovirus asociados a leucemias en animales como: el de la leucemia murina, Virus de Gross, de Friend, de Moloney y Rauscher, productores de leucemias en ratones. La forma como estos virus inducen cáncer radica en el hecho de ser portadores de oncogenes o de insertarse en sitios del DNA, desrregulando genes cercanos generalmente involucrados en la proliferación y diferenciación celular. En humanos se han descrito retrovirus linfotrópico del tipo HTLV I y II aislados de líneas celulares de pacientes con linfómas de células T, leucemia de células peludas y leucemias T, entidades que tienen su mayor incidencia en ciertas áreas geográficas como: Japón, Caribe y Sur de los Estados unidos. Mejor conocida es la asociación entre el virus Epstein-Barr (EBV) y linfóma de Burkitt (LLA-L3), pero también con enfermedad de Hodgkin, linfóma de células T y adenocarcinomas. El EBV es capaz de transformar los linfocitos B en células linfoblastoides las cuales pueden proliferar indefinidamente in vitro(13,15,41).

2.4 Otros factores

Las leucemias igualmente se ven asociadas con trastornos congénitos o adquiridos del sistema inmune como el síndrome de Wiscott- Aldrich, agamaglobulinemia, uso de inmunosupresores que alteran la vigilancia inmunológica humoral y celular permitiendo la sobrevida de células malignas. Algunas leucemias agudas tienen antecedentes de trastornos mielodisplásicos o mieloproliferativos crónicos, anemias aplásicas, hemoglobinuria paroxística y otras entidades que alteran las células precursoras de la médula ósea. Lo más probable es que la leucemia se produzca por el concurso de múltiples de estos factores, pero uno de ellos puede ser el predominante.

3. DIAGNÓSTICO

3.1 SINTOMATOLOGÍA

Un paciente con leucemia aguda presenta una serie de síntomas y signos generales como: palidez, fatiga, malestar general, anemia, disnea, petequias, equimosis, fiebre sin origen aparente, infecciones recurrentes, dolor óseo, linfoadenopatías y hepatoesplenomegalia, estos dos últimos signos son de diseminación extramedular, otros menos frecuentes son las artralgias, compromiso del sistema nervioso central (SNC), compromiso de ovarios, compromiso de piel, compromiso ocular o masa mediastinal etc. La palidez y anemia es el síntoma y signo más evidentes y frecuentes al momento del diagnóstico asociado a taquicardia que es proporcional al grado de anemia. Mientras en LLA puede existir compromiso ganglionar y de sistema nervioso central en LMA es raro, pero la infiltración extramedular en forma de granulomas o cloromas es frecuente. Es importante destacar el cuadro de presentación de coagulación intravascular diseminada (CID) en LMA-M3(54).

3.2 HALLAZGOS DE LABORATORIO Y PATOLOGÍA

El diagnóstico de una leucemia aguda se basa en la demostración de más de un 25% de células blásticas en médula ósea pudiéndose además encontrar células leucemicas en la sangre periférica o en tejidos extramedulares. En el frotis de sangre periférica (SP) se observan los siguientes hallazgos: anisocitosis, poiquilocitosis policromatofília en la línea eritroide, las plaquetas presentan anomalías en número (trombocitopenia), morfología (macroplaquetas e hipergranulares) y función que se relacionan con las petequias y equimosis. Los leucocitos pueden estar disminuidos, normales o aumentados aunque lo más frecuente es lo primero, sin embargo, en la mayoría serán evidentes los blastos con características linfoides o mieloides según el caso. Los análisis de la química sanguínea muestran altos niveles de ácido úrico, producto del metabolismo incrementado de los ácidos nucleicos e incremento de la

concentración de la deshidrogenasa láctica correlacionado con el número de células leucémicas. El tiempo parcial de tromboplastina y protrombina se encuentran incrementados en el caso de la LMA -M3 con CID. Los estudios definitivos para el diagnóstico de una leucemia aguda son la biopsia de médula ósea y el mielograma o aspirado de la MO, dónde generalmente se observa el reemplazo de los componentes normales de la médula ósea por las células blásticas. En ocasiones esta infiltración no es total e incluso la médula ósea puede aparecer hipocelular, pero un recuento mayor del 25% de blastos es suficiente para el diagnóstico de una leucemia aguda. En estos extendidos el hematopatólogo puede distinguir con claridad la morfología, maduración y porcentaje de los diferentes estadios de cada una de las lineas celulares que le permiten hacer el diagnóstico de LLA con morfología L1, L2 y L3 o LMA con morfologías de M0 a M7 siguiendo la clasificación FAB.

3.3 CITOQUIMICA

Estas técnicas ponen de manifiesto algunos componentes químicos celulares como enzimas, carbohidratos, lípidos y compuestos inorgánicos. 3.3.1. Coloración de PAS (ácido periodico de Shiff) Produce un color magenta o rojo rubí en forma de gránulos finos, burdos o como un único bloque que identifica el glicógeno intracelular. Es positiva principalmente en leucemias linfoides pero también en algunas leucemias de linaje mieloide como M5 y M6.

3.3.2 Fosfatasa Acida(FA)Es una reacción que se localiza paranuclearmente en el aparato de Golgi y lisozomas vecinos, es positiva en más del 70% de los blastos linfoides de linaje T.3.3.3 ANAE (alfa-naftil acetato estearasa)Es una esterasa que produce un precipitado ocre amarronado en el citoplasma, se emplea como marcador de monocitos y por tanto es

positiva en leucemias agudas con este componente (M4 y M5), mientras M1 y M2 serán negativas o débilmente positivas, algunos linfocitos T pueden dar reacción positiva.3.3.3 Mieloperoxidasa(MPO)La mieloperoxidasa se almacena en los gránulos primarios de las células mieloides como neutrófilos, eosinófilos y monocitos, en linfocitos está ausente, por este motivo sirve para diferencia entre LLA y LMA constituyéndose en la forma más segura de identificar blastos de linaje mieloides. 3.3.4 Sudan Negro BIdentifica lípidos celulares como grasas neutras, fosfolípidos y esteroides, es positivo en células mieloides como: granulocitos y monocitos pero negativo en linfocitos, en ocasiones los linfoblastos de la LLA L3 pueden ser positivos. (8,54,97)

Los linfoblastos son negativos para las reacciones citoquímicas de las células mieloides, mieloperoxidasa y sudan negro, típicas de los mieloblastos y la alfa- naftil acetato estearasa (ANAE) característica de los monoblastos.Las coloraciones más ampliamente usadas en LLA son MPO, PAS y fosfatasa ácida, solo en algunos casos donde se presenta bifenotipia es posible encontrar la coexistencia de linfoblastos con precursores de linaje mieloide o monocítico produciendo mieloperoxidasa o ANAE positivos(85). Como se dijo anteriormente LLA y LMA son un grupo heterogéneo de entidades que varían en su historia natural por este motivo se hace necesario una subclasificación empleando herramientas adicionales a la morfología y citoquímica como el inmunofenotipo, citogenética y técnicas moleculares, de esta manera se puede alcanzar una mayor precisión del comportamiento de la célula tumoral(85), como ya se ha definido a nivel internacional con el uso de la clasificación MIC.

4. PRONOSTICO

La identificación de factores pronósticos son un elemento esencial para el diseño y análisis de los ensayos de quimioterapia, ciertas características clínicas y de laboratorio que exhiben los pacientes al momento del diagnóstico tienen valor pronóstico. Las características pronósticas en LLA incluyen recuento de leucocitos, edad, sexo, raza, alteraciones citogenéticas, grado de organomegalia, linfoadenopatía, presencia de masa mediastinal, niveles de hemoglobina, recuento de plaquetas, expresión de antígenos mieloides, presencia de infiltración en SNC, duración del tiempo de remisión, respuesta a glucocorticoides, estado nutricional etc., no todos tienen la misma significancia, pero la edad, recuento leucocitario, inmunofenotipo, estado cromosómico, masa mediastinal e infiltración en SNC son los de mayor importancia. En el caso de LMA ha sido más difícil definir los elementos pronósticos distinguiéndose la LMA-M3 por el tipo de tratamiento utilizado que involucra el ácido trans- retinóico (ATRA) el cual ha mejorado significativamente la sobrevida en estos pacientes. Otros, al igual que en LLA, como la edad recuento leucocitario, respuesta al tratamiento y alteraciones cromosómicas también tienen valor pronóstico. En las décadas recientes se ha reconocido la citogenética y la biología molecular como factores pronóstico de importancia claramente establecidas por diferentes grupos de investigadores.Así en la LLA en niños la hiperdipliodía entre 56 a 67 cromosomas es un factor de excelente respuesta a largo plazo, al igual que la reciente detección de l t(12;21) por biología molecular. La identificación de la t(1;19) se considera de pronóstico intermedio con la aplicación de los esquemas actuales de quimioterapia intensiva.Finalmente se consideran de pronóstico desfavorable con mayor riesgo para recaída temprana la identificación de las translaciones t(4;11) y t(9;22) las que requieren modalidades de quimioterapia más intensiva incluyendo TMO.

5. TRATAMIENTO

En la década de los 60’s los pacientes con leucemia aguda sucumbían ante la enfermedad en pocos meses, pero con el avance en la terapéutica la sobrevida ha mejorado notablemente. La quimioterapia es el tratamiento de elección para la leucemia, su objetivo es erradicar todas las células malignas de médula ósea y permitir la repoblación con células hematopoyéticas normales.En general estos fármacos se pueden clasificar en tres grupos: antimetabolitos, agentes alquilantes y antibióticos. Los antimetabolitos son antagonistas de las purinas y pirimidinas inhibiendo la síntesis del DNA de las células en ciclo mitótico, actuando sobre las células en división activa.Los agentes alquilantes se adhieren al DNA interfiriendo con su síntesis, actúan tanto en células en proliferación como en reposo. Los antibióticos se unen a las moléculas del DNA y RNA alterando la replicación celular, su acción es semejante a los agentes alquilantes.

El tratamiento de la leucemia aguda presenta cuatro fases a saber:

5.1 Inducción a remisión Se refiere a la primera fase del tratamiento que intenta erradicar rápidamente las células tumorales, los signos y síntomas de la enfermedad deben desaparecer y los parámetros hematológicos a nivel de SP y MO deben normalizarse y donde las células blasticas no sobrepasen el 5%. En la remisión completa (RC) el paciente tampoco debe presentar enfermedad en el SNC ni extramedular. Para inducir una remisión completa, la quimioterapia debe reducir el número de células blásticas en un 99%. Combinación de solo 2 drogas pueden inducir RC, Vincristina y Prednisona en un 85% en niños con LLA. 5.2Terapia preventiva para sistema nervioso central (SNC)Se administra quimioterapia intratecal e irradiación craneana, es importante efectuarla ya que la quimioterapia sistémica no posee la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica protegiendo indirectamente los blastos que se encuentran a este nivel, que

posteriormente proliferarán originando finalmente una recaída.

5.3 ConsolidaciónSe ha demostrado ampliamente que una consolidación temprana permite prolongar el tiempo de remisión y ayuda a prevenir las recaídas, especialmente en niños con LLA de alto riesgo(37).

5.4 Mantenimiento de la terapiaTiene por objeto destruir cualquier célula que se active del estado G0 al mitótico, debe iniciarse una vez se obtenga la remisión completa. Tiene una duración aproximada de dos y media a tres años y permite obtener el objetivo final que es la “curación” del paciente o estado de remisión continua completa a largo plazo que en términos generales quiere decir mayor de 5 años de la fecha del diagnóstico.

6. LEUCEMIA LINFOIDE AGUDA

6.1 MORFOLOGÍA

Desde el punto de vista morfológico la clasificación más reconocida e internacionalmente utilizada en el diagnóstico de las leucemias fue enunciada por el Grupo Cooperativo Francés - Americano - Británico (FAB) en el año 1976, esta clasificación considera el tamaño celular, relación núcleo citoplasma, homogeneidad del núcleo y estructuras a nivel nuclear y citoplasmático(30). Según la FAB las LLAs se clasifican en tres subgrupos:

6.1.1 LLA - L1Presenta linfoblastos homogéneos, uniformes, de tamaño pequeño núcleo redondeado aunque puede presentar algunas irregularidades, cromatina semimadura sin nucleolos o uno poco visible. El citoplasma generalmente es escaso, agranular, con ligera basofilia y una relación núcleo : citoplasma (N:C) menor del 20%. Aproximadamente el 85% de los niños con LLA presentan esta morfología(8,15,77).

6.1.2 LLA - L2Los blastos son heterogéneos de tamaño variable, pero generalmente son el doble del tamaño de un linfocito pequeño normal, núcleo irregular clivado con uno o dos nucleolos fácilmente visibles, su citoplasma presenta inclusiones granulares que dificulta su diferenciación con LMA-M2, citoplasma abundante con basofilia variable y una relación N:C mayor del 20%, las vacuolas pueden estar o no presentes. Es más frecuente en adultos que en niños(15,54).

6.1.3 LLA L3 (Tipo Burkitt)Las células blásticas son uniformes, grandes y homogéneas, el núcleo tiene una cromatina fina, contorno regular y uno o varios nucleolos. En el citoplasma se destaca un basofilia muy intensa, la presencia de numerosas vacuolas y actividad mitótica elevada. Es la variedad menos frecuentev(1%), como evento primario de compromiso de la MO. Con excepción de la LLA L3 la clasificación FAB no se

correlaciona con la clasificación inmunológica(8,15,77).

6.2 INMUNOLOGÍA

Los estudios inmunológicos en LLA han confirmado que la transformación leucémica y expansión clonal pueden suceder en diferentes estados de maduración durante el proceso normal de diferenciación linfoide. A comienzos de los años70’s se comenzaron a usar los marcadores de superficie para caracterizar las LLA en términos de origen y estado de diferenciación como receptor para eritrocitos de carnero encontrado en el 20% de pacientes con LLA de linaje T, 1-2% con marcadores de origen B mientras la mayoría no tenían estos marcadores detectables en la superficie, estas leucemias se denominaron no-T, no-B o null. Posteriormente con el uso de antisueros heterólogos contra leucemia se detectó un antígeno que se encontraba aproximadamente en el 80% de los pacientes con LLA null el cual fue llamado antígeno común de LLA (CALLA), este subgrupo de leucemias se llamó LLA común (LLA-c). Hoy se han detectado más de cien antígenos de superficie en células hematopoyéticas asociados en grupos de diferenciación o CDs (cluster of differentiation) para los cuales existen anticuerpos monoclonales específicos. Estos anticuerpos pueden establecer con gran precisión el linaje y estado de maduración de las leucemias de esta manera se ha confirmado que aproximadamente entre el 80-85% de LLAs en niños y entre el 50-65% en adultos resultan de la proliferación monoclonal de precursores de células B correspondiendo el porcentaje restante al origen maduro B(12).Ninguno de los anticuerpos monoclonales utilizados durante la inmunotipificación son absolutamente específicos de linaje, por tal motivo se requiere de un panel múltiple de marcadores para clasificar los blastos leucémicos, la inmunobiología del sistema hematopoyético ha conducido a proponer una serie de estados de maduración para linaje B y linaje T.

6.2.1 Stem cell pluripotenteTodas las células hematopoyéticas derivan de este progenitor aunque su caracterización ha sido difícil por su baja concentración en médula ósea. El antígeno más temprano asociado a esta célula es el CD34, es una glicoproteína que desaparece con la maduración celular, también se encuentra medianamente expresado R c-Kit, R IL-6 y

débilmente CD45RA, pero no expresan ningún marcador de diferenciación celular(13).

6.2.2 Linaje B

6.2.2.1 Tempranas pre-BDurante este estado de diferenciación se expresan los antígenos CD19, TdT, HLA-DR y CD24, rearreglos Dh -Jh, la mayoría de leucemias que provienen de este estado expresan el antígeno común CD10, mientras aproximadamente un 10% no lo hace.

6.2.2.2 Pre-BEste estado se caracteriza por la presencia de cadenas pesadas de las inmunoglobulinas en citoplasma, expresa antígenos cómo CD19, HLA-DR, CD20, CD24 y rearreglo productivo V D J. Entre el 20-30% de las leucemias pertenecen a este grupo.

6.2.2.3 B-MaduraSe caracteriza por la expresión de inmunoglobulina de superficie λ o κ, expresa CD19, HLA-DR, CD20, CD24. Se encuentran en un 1-2%. (Ver figura 1)

6.2.3Linaje T

6.2.3.1 Pre-TEstas células se originan en la médula ósea y expresan antígenos tempranos como TdT, CD2 y CD7, se inicia el rearreglo del receptor T αβ y δγ.6.2.3.2 IntratímicasEl linfocito T madura desde la médula a la corteza tímica, expresan CD2, CD7; CD1, CD4/CD8; en corteza tímica pierden CD1 con CD8 o CD4 y expresan CD3.6.2.3.3 T PeriféricasAdemás de expresar los pan marcadores para células T expresan el receptor T maduro , o con CD4 o CD8 además de CD25.

6.2.4 Bifenotípicas o mixto

Un grupo importante de leucemias agudas expresan marcadores

linfoides y mieloides, recibiendo el nombre de mixtas, híbridas, bifenotípicas o bilineales. Las bilineales o biclonales son aquellas donde existen dos poblaciones diferentes linfoide y mieloide; las bifenotípicas son aquellas donde los dos marcadores se coexpresan sobre el mismo blasto. La mayoría de estas leucemias se consideran LLAs con expresión de antígenos mieloides pero en otras son LMAs con expresión de antígenos linfoides. Inicialmente este tipo de leucemias se consideró un artefacto por la falta de especificidad de la técnica fenotípica, sin embargo, con criterios de clasificación más estrictos y la detección de antígenos intracitoplasmaticos es claro que este grupo es más común de lo que antes se creía.

En niños con LLA aproximadamente el 19 % expresan marcadores mieloides, el valor pronóstico de este hallazgo no es muy claro aunque con tratamientos comunes parecen tener peor pronóstico, pero con regímenes de quimioterapias intensivas aparentemente no existe diferencia en la sobrevida con las LLAs sin expresión de antígenos mieloides. En adultos algunos trabajos reportan que hasta el 46% de LLAs pueden expresar antígenos mieloides La inmunotipificación en leucemias agudas se utiliza para:

•Asignación de linaje•Permitir el diagnóstico cuando la morfología y la citoquímica no son claros. •Identificar las leucemias bifenotípicas.•Caracterizar la expresión de antígenos aberrantes que puedan ser utilizados para identificar clones neoplásicos y enfermedad residual mínima (ERM) durante la remisión en remisión clínica.•En la clasificación dentro de grupos pronósticos.

6.3 GENÉTICA

Prácticamente el 100% de los tumores malignos demuestran aberraciones cromosómicas a través de las cuales ha sido posible identificar un gran número de genes implicados en la carcinogénesis, entre el 60 - 80% de las leucemias agudas adquieren alteraciones

cromosómicas identificables mediante el cariotipo convencional pero técnicas más recientes de citogenética molecular como el FISH, Multifish e hibridación genómica comparativa (CGH) han permitido identificar con mayor precisión estas aberraciones. Las anomalías cromosómicas observadas en leucemias están íntimamente relacionadas con la biología tumoral y la historia natural de la enfermedad, son marcadores tumorales específicos que han llegado a ser cruciales en el manejo terapéutico de las leucemias por su significado pronóstico, de respuesta a tratamiento y porque pueden ser blanco para el seguimiento de la enfermedad mediante la detección de enfermedad mínima residual. En leucemias agudas se han descrito más de 300 aberraciones citogenéticas diferentes entre translocaciónes, inversiones, deleciones y trisomías que se han relacionado con subgrupos de leucemias. Con el acumulo y seguimiento de pacientes con LLA que presentan idénticas alteraciones cromosómicas se ha logrado definir su relación con otros parámetros como los inmunológicos, respuesta a tratamiento, riesgo de recaída, exposición a tóxicos, edad etc. que ha permitido aclarar su perfil epidemiológico, su valor pronóstico y diagnóstico.En el caso de la LLA se han descrito diversos subgrupos citogenéticos entre los que encontramos:

6.3.1 Hiperdiploidías:Cuando el número cromosómico es mayor de 46 se define una hiperdiploidía, en LLA es frecuente encontrar cariotipos con más de 50 cromosomas. Los diferentes estudios poblacionales han demostrado que es la alteración más frecuente observándose hasta en el 30% de los niños y 9% en los adultos. Esta alteración se asocia con otros parámetros de buen pronóstico como fenotipo temprano pre-B, expresión de CALLA, recuento leucocitario normal y edad ente 1-10 años, los cromosomas más frecuentemente comprometidos son: 4, 6, 8, 10, 14, 17, y 21. La sobrevida alcanzada a 5 años por este grupo de pacientes supera el 80%. Se recomienda en estos casos el uso de terapias menos agresivas para disminuir la mortalidad por toxicidad, un método adecuado para medir la hiperdiploidía se hace calculando el contenido de DNA mediante citometría de flujo. Los pacientes con cariotipo hiperdiploide entre 51-55 cromosomas por célula leucémica parece que tienen una

sobrevida menos favorable a largo plazo que aquellos con 56 –67 cromosomas. En el primer subgrupo ese pobre pronóstico se debe en parte a la presencia del isocromosoma 17q.Los pacientes con más de 53 cromosomas y con trisomias de 4 y 10 tienen un mejor pronóstico.

6.3.2 t (12; 21) (p13;q28)Descrita por los grupos de Romana y col. y por Golub TR y col. en 1995, de difícil detección por el cariotipo convencional tan solo el 0.05% de los casos de LLA, necesitándose el uso de técnicas como PCR o FISH para su diagnóstico. Los diversos estudios realizados sobre esta translocación indican una frecuencia entre el 20-30% en niños con LLA entre 1-10 años, pero en adultos es infrecuente con un porcentaje menor al 3%. Esta translocación se ha asociado con otros parámetros de buen pronóstico como la edad, fenotipo temprano pre-B expresión del antígeno CALLA y buena respuesta a tratamiento en muchos pacientes tratados con diferentes protocolos de quimioterapia, por lo cual la mayoría de autores están de acuerdo en considerarla como un elemento de pronóstico favorable aunque todavía existe alguna controversia al respecto. Esta translocación involucra los genes TEL(translocation ets leukaemia) y AML1(acute myeloid leukaemia 1) ubicados en los cromosomas 12 y 21 respectivamente(20).(Ver figura 2)

6.3.3 t(1;19)(q23;q13 ): Reportada en 1984 por los grupos de Carroll AJ, Michael TM y William DL. asociada principalmente a casos con fenotipo pre-B, es la más común de todas las translocaciones detectadas citogenéticamente en niños. Los datos de la literatura indican que entre el 3-6% de los adultos y hasta un 6% de los niños con LLA portan esta alteración, pero se encuantra en un 25% cuando existen inmunoglobulinas (Ig) citoplasmática positiva (pre-B (66,75). El 25 % se observa como una translocación balanceada mientras el 75% restante como translocación desbalanceada(20). Esta alteración se relaciona con otras característica de mal pronóstico como elevado recuento de leucocitos, niveles altos de LDH, compromiso del SNC y pobre respuesta a tratamiento, en niños sin embargo con terapias más

intensivas el pronóstico de esta alteración ha mejorado ostensiblemente. La t(1;19) involucra los genes E2A y PBX localizados en cromosoma 19 y 1 respectivamente. ( Ver figura 3)

6.3.4 t(9;22) (q34;q11) o Cromosoma PhiladelphiaDescrito por primera vez por Nowell y Hungerford en 1960, en pacientes con LMC pero posteriormente Bloomfield la encontró en pacientes con LLA. Se estima que el 5% de los niños con LLA y entre el 20-30% de los adultos presentan esta alteración, se asocia con parámetros de mal pronóstico como leucocitosis, organomegalia, fenotipo mixto, morfología L2, ofreciendo mala respuesta a tratamiento y cortos periodos de sobrevida. Esta translocación involucra los genes ABL (Abelson) y BCR (breakpoint cluster region) localizados en los cromosomas 9 y 22 respectivamente. (Ver figura 4)

6.3.5 t(4;11)(q21;q23) Descrita por primera vez en 1977 por Oshimura y col. asociada en algunos casos con fenotipo linfoide-monocitico, hiperleucocitosis, organomegalia, infiltración a SNC y predominio en sexo femenino(73). Esta aberración se observa en el 80% de los niños menores de un año y entre el 2-7% de los casos de LLA en niños o adultos, esta translocación ha recibido gran atención por la alta incidencia, hasta un 85% de rupturas en 11q23, en leucemias secundarias por exposición a inhibidores de topoisomerasa II. Los pacientes portadores de esta anomalía generalmente presentan mal pronóstico y cortos períodos de sobrevida. Los genes comprometidos son el AF4 y MLL (mixed lineage leukemia, también denominado ALL1, HRX ó HTRX1) localizados en los cromosomas 4 y 11 respectivamente. (Ver figura 5)

6.3.6 t(8;14), t(2;8) y t(8;22) Presentes en el 100% de los linfomas de Burkitt o LLA-L3, t(8;14) 70% , t(2;8) 15% y t(8;22) 15%, se asocian con fenotipo B, son de mal pronóstico, los genes implicados son Myc (8q24) y IgH, Ig, Ig en los cromosomas 14, 2 y 22 respectivamente.

6.3.7 Otras

Otro grupo de translocaciones asociadas con fenotipo B se han descrito, sin embargo los grupos de pacientes acumulados son pequeños y por consiguiente su significado clínico en muchos casos es desconocido. Entre ellas tenemos t(5;14) asociado con eosinofilia, t(11;19), deleción 9p21 presente entre el 7 y12% de LLA en niños.

Las translocaciones asociadas con LLA T comprometen generalmente los genes del receptor T, TCR, TCR y TCR localizados en 14q11 7q32 y 7p15 respectivamente. La t(1;14) es más frecuente en hombres compromete el gen TAL 1 en 1p32 y TCR . Otra translocaciones que comprometen 14q11 son: la t(8;14)(q24;q11), t(10;14)(q2;4q11), t(11;14)(p15;q11) y t(11;14)(p13;q11) involucrando los genes Myc, Hox 11, RTBN1 , RBTN2 y respectivamente.Las deleciones del cromosoma 6 se observan entre el 4-6% de los niños y el 2% en adultos con predominio del fenotipo T.

7. LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA

7.1 MORFOLOGIA

De acuerdo con la clasificación FAB la LMA se clasifica en ocho subgrupos desde la M0 a la M7:

7.1.1LMA-M0(mínimamente diferenciada)Los blastos son grandes o medianos con alta relación nucleo:citoplasma, cromatina dispersa con uno o múltiples nucleolos. El citoplasma es escaso, claro o con ligera basofília sin presencia de gránulos azurófilos o cuerpos de Auer. El diagnóstico de este subtipo de leucemia es difícil por la inmadurez de los blastos ya que provienen de un stem cell leucémico, se debe recurrir a la inmunohistoquímica o características ultraestructurales para efectuar una diferenciación aceptable se deben utilizan los siguientes las características ultraestructurales, inmunofenotípicas y presencia de MPO.

7.1.2 LMA-M1(pobremente diferenciada)Se caracteriza por la presencia de mieloblastos con citoplasma escaso, ligeramente basófilo, agranular en los blastos tipo I o gránulos azurófilos escasos y finos en los tipo II, ocasionalmente se observa un único bastón de Auer y menos del 10% de las células muestran rasgos de maduración promielocítica o de neutrófilos maduros. El núcleo es redondo de contorno regular, cromatina finamente distribuida con uno o varios nucleolos. La MPO y el NSB son positivos mientras la CAE es negativa.

7.1.3 LMA- M2(diferenciada)Los blastos presentan características similares a los de la LMA-M1 aunque con mayor predominio de los blastos tipo II, la presencia de los cuerpos de Auer es frecuente con cantidades variables de gránulos azurófilos. El núcleo puede ser redondo, oval o reniforme semejante al observado en células monocíticas con cromatina fina y nucleolo. El componente monocítico es menor del 20% lo cual la distingue de la

M4, la mayoría de células son mieloblastos pero hasta un 30% pueden presentar maduración promielocítica y 10% células maduras, los blastos son MPO y NSB positivos.

7.1.4 LMA -M3(promielocítica)La médula ósea es marcadamente hipercelular con predominio de promielocitos que se caracterizan por tener tamaño variable, citoplasma con numerosos gránulos azurófilos que se agrupan de tal forma que pueden ocultar el núcleo, también hay células llenas de gránulos finos como areniscas. Es característico observar células con bastones de Auer unidas en haces o empalizadas denominadas células con gavillas o Faggot. El núcleo es de forma variable a menudo irregular que oscila de reniformes a dentado. Es importante distinguir entre M3 y M2 con alta proporción de promielocitos, en esta ultima la granulación no es masiva y no se acumulan en el citoplasma como en la M2. La Variante M3 microgranular contrario de lo que ocurre con la hipergranular las células Faggot son escasas pero pueden encontrase células con un solo cuerpo de Auer, la morfología semeja leucemia monocítica pero el hallazgo de unas cuantas células características de M3 hipergranular ayudará en el diagnóstico. El citoplasma se caracteriza por la presencia de una fina granulación que semeja partículas de polvo, poseen núcleo bilobular, reniforme o multilobular semejante a un monocito. Ambas formas son fuertemente positivas para MPO, NSB y CAE.

7.1.5 LMA -M4(mielomonocítica)Su nombre se deriva del hallazgo de formas de diferenciación monocíticas y mielocíticas en SP y MO, se distingue de los subgrupos anteriores por el incremento en la proporción de células monocitos leucémicas, más del 20% de las células deben ser monocíticas para diferenciarla de M1 y M2. Se diagnostican por la presencia de mieloblastos, monoblastos y promonocitos superior al 30%. Los monoblastos son en general grandes con abundante citoplasma azul grisáceo, el núcleo es redondo o contorneado con cromatina afiligranada con uno o dos nucleolos. El promonocito es ligeramente menor que el monoblasto con núcleo de contorno irregular, grados variables de lobulación y cromatina ligeramente condensada , el citoplasma es grisáceo, débilmente basófilo y puede contener gránulos azurófilos. La citoquímica muestra MPO, NSB y ANAE positivos.

7.1.6 LMA-M5(monocítica)Se encuentran dos formas: la M5a o monoblástica y la M5b o monocítica, la primera se caracteriza por la presencia de células blasticas de estirpe monocítico superior al 80%, el citoplasma es irregular con prolongaciones o pseudópodos, granulación azurófila escasa y algunas vacuolas de gran talla. Los blastos manifiestan grado variable de positividad para ANAE y ANBE mientras la MPO y NSB son negativas. La M5b se caracteriza por la presencia de promonocito y monocitos con núcleos lobulados y reniformes que le confieren un aspecto típico cerebriforme, el porcentaje de monoblastos es menor del 80% y las células son fuertemente positivas para ANAE y ANBE. 7.1.6 LMA- M6(eritroleucemia)Se caracteriza por una proliferación mixta de las series eritroblástica y granulocítica, su diagnóstico se hace por la presencia de más del 50% de eritroblastos y 30% de blastos no eritroides. La serie eritroide presenta marcadas alteraciones: gigantismo, multinuclearidad, bilobulaciones y cambios megaloblásticos. Otros rasgos incluyen gemación, fragmentación nuclear, vacuolas citoplasmática, cuerpos de Howel-Jolly y sideroblastos anillados. La dismegacariopoyesis es común con formas mononucleares o micromegacarioblastos, el PAS es positivo en la mayoría de eritroblastos inmaduros.

7.1.8 LMA-M7(megacarioblástica)Las células predominantes son el megacarioblasto y promegacariocito que son bastante pleomórficas y difíciles de identificar, de tamaños variables ocasionalmente de aspecto linfoide con amplio citoplasma y frecuentes protruciones citoplasmáticas. El diagnóstico definitivo se hace utilizando marcadores inmunológicos y morfología ultraestructural, la MPO y NSB son negativas, mientras la ANAE y la FA pueden ser positivas.

7.2 INMUNOLOGIA

La inmunología es supremamente útil para distinguir entre LLA y LMA utilizando marcadores específicos de linaje, sin embargo en LMA el perfil inmunológico no siempre corresponde con el subtipo morfológico excepto para la M6 y M7. La mayoría de LMAs expresan panmarcadores mieloides como CD13, CD33 y CD15, las leucemias

mielomonocíticas (M4,M5) adicionalmente expresan CD14 y CD11b. La leucemia promielocítica expresa CD33 pero generalmente es negativa para CD14, actualmente para este subtipo de leucemia se esta utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína de fusión PML-RAR. Las leucemias megacarioblasticas poseen marcadores específicos como CD42a, CD42b y CD61 correspondientes a glicoproteínas plaquetarias IX, Ib y IIIa respectivamente, en el caso de la LMA M6 hay expresión incrementada de CD71(receptor de transferrina), CD36, glicoproteína IV, glicoforina A y espectrina. La LMA M0 además de los marcadores mieloides expresa CD34. La clasificación inmunológica en LMA no define grupos pronósticos como en LLA por esta razón se han buscado otros marcadores que se asocien a la función biológica como por Ej. presencia de glicoproteína P que media la resistencia a fármacos. En general los marcadores mas comúnmente utilizados para las LMAs son:M0: CD34+, HLA DR+, CD13+/- y CD33+/- M1: CD34+, HLA DR +, CD13+, CD33+ y CD15+/-M2: CD34+/-, HLA DR +/-, CD13+, CD33+/- y CD15+/-M3: CD34-/+, HLA DR -/+, CD13+, CD33+ y CD15-/+M4: CD34-/+, HLA DR +, CD13+, CD33+, CD15+/-, CD11b+ y CD14+/-M5: CD34-/+, HLA DR +, CD13+, CD33+, CD15+/-, CD11b+ y CD14+/-M6: CD34+, HLA DR +, CD13-/+ y CD33+/- y glicoforina A+M7: CD34-/+, HLA DR -/+, CD13+, CD33+, CD41a + CD42b+ y CD61+

( +/- se expresa en la mayoría de los pacientes, -/+ se expresa en la minoría de los pacientes)

7.3 CITOGENETICA

Entre el 60-80% de las LMAs presentan rearreglos cromosómicos, estructurales y numéricos, algunos de los cuales se relacionan con el subtipo morfológico. Las translocaciones son los defectos más específicos las cuales fusionan dos genes de cromosomas diferentes conduciendo a la neoformación de un gen quimérico que generalmente desprograma los patrones normales de expresión genica afectando la proliferación y diferenciación celular. Es menos claro el papel de las trisomías pero se postula que actúan a través de efecto de dosis de los oncogenes que residen en estos cromosomas.

Dentro de los rearreglos cromosómicos más comunes tenemos:

7.3.1 t(15;17)(q22;q21)Descrita por Golomb, Rowley y col. en 1976 identifica específicamente la leucemia promielocítica hipergranular, microgranular (variante) y la rara hiperbasofílica, correspondiendo entre el 7-10% de las LMAs. Esta translocación fusiona los genes PML (promyelocytic leukaemia en el cromosoma 15) y el gen RAR( retinoic acid receptor en el cromosoma17) (43). No siempre el cromosoma 15 es el receptor observándose con menor frecuencia (6%) la t(11;17)(q23;q21) y t(5;17)(q35;q21), que fusionan los genes PLZF(promyelocytic leukaemia zinc finger) y NPM (nucleofosmina) con el RAR respectivamente(46). La significancia pronóstica de la t(15;17), que se ha considerado como intermedia, debe tomarse como de buen pronóstico a la luz de las recientes evidencias moleculares y clínicas de su excelente respuesta al ácido trans-retinoico y antraciclinas, por el contrario las translocaciones variantes son resistentes al diferenciador celular ofreciendo pobre respuesta a este tratamiento. (Ver figura 6)

7.3.2 t(8;21)(q22;q22)Descrita por Rowley y col. en 1973, se encuentra en el 10% de las LMAs de novo y entre el 20-40% de las LMAs M2 y en un menor porcentaje en los subtipos M1 y M4(42). Se describe con mayor frecuencia en niños y adultos jóvenes identificando un cuadro clínico y morfológico peculiar caracterizado por células con diferenciación a neutrófilos, severa neutropenia, blastos muy heterogéneos de tamaño variable y alta relación núcleo : citoplasma. El citoplasma es basófilo vacuolado y los cuerpos de Auer son comunes, inmunológicamente este subtipo leucémico además de los marcadores mieloides puede expresar marcadores linfoides B como CD19 o marcadores T como CD2 y CD56, existe controversia acerca del pronóstico de esta variante cromosómica . La translocación fusiona los genes AML1(acute myeloid leukaemia 1, también denominado CBFA2 core binding factor subunit A2 ó PEBP2a polyoma enhancer binding protein 2 subunit 2a - cromosoma 21) y ETO ( eight twenty one, también denominado CDR cyclin D related gene ó MTG8 myeloid translocation gene on chromosome 8 - cromosoma 8). Se ha descrito la variante t(3;21)(q26;q22) que fusiona el gen AML1 con 3 diferentes genes EAP(EBER- associates protein), MDS1 y EVI1(ecotropic viral

integration) localizados en 3q26(91). Usualmente es asociada a buena respuesta a quimioterapia con alta taza de remisión y un rango de supervivencia relativamente larga (67). (Ver figura7)

7.3.3 Inv.(16)(p13;q22)La Inv.(16)(p13;q22) fue descrita por primera vez en 1982 es un cambio citogenético sutil observado en el 8% de los LMAs de novo, se asocia con una variante de leucemia mielomonocítica con exceso de eosinófilos, pero también con M4 sin eosinofilia. La LMA-M4Eo se caracteriza por elevado recuento de monocitos en SP, infiltración mieloblastica y monoblastica de la MO con presencia de eosinófilos atípicos que pueden ser más del 10%, caracterizados por gránulos basófilos y eosinófilos grandes que pueden ser detectados fácilmente por morfólogos experimentados, FAB M4Eo tiende a aparecer en pacientes jóvenes asociada con un excelente pronóstico con tasas de remisión completa del 85%. La t(16;16)(p13;q22) involucra el reordenamiento del gen CBF ( core binding factor ) con MYH11 o SMMHC(smooth muscle myosin heavy chain) ubicados en 16p13 y 16q22 respectivamente inmunológicamente puede expresar CD2(96). En adultos presenta buena respuesta al tratamiento a diferencia de lo encontrado en LMA infantil, dónde se asocia a infiltración en SNC que la convierte en indicador de mal pronóstico. (Ver figura 8) 7.3.4 Alteraciones en 11q23Los defectos de esta banda se observan en un 10% de LLAs, 6% en LMAs y hasta en un 85% de LMAs secundarias a tratamiento con inhibidores de topoisomerasa (81). En 11q23 reside el gen MLL que puede translocarse o fusionarse con genes que residen en otros cromosomas: 1p32, 1q21, 1q32, 2p21, 2p27, 5q31, 6q27, 7p15, 9p22, 10p12, 15q15, 16p13, 17q11, 17q21, 17q25, 18q12, 19p13.1, 19p13.3, 21q21 y Xq13, sin embargo las translocaciones más frecuentes son: t(9;11)(p22;q23) presente en leucemias M5 y secundarias a tratamiento con inhibidores de topoisomerasa comprometiendo el gen AF9 en 9p22; t(4;11) ya descrita en LLA y t(11;19) que fusiona MLL con MEN/ELL. Las LMAs con compromiso en 11q23 se caracterizan por morfología M5, M4, hiperleucocitosis, infiltración extramedular frecuentemente en piel, coexpresión de marcadores como CD15, CD65 con CDl9. A pesar de la heterogeneidad de rearreglos en este punto se considera que rearreglos en 11q23 representan un mal pronóstico.

7.3.5 Trisomías, monosomías y delecionesNo es infrecuente encontrar en LMA alteraciones numéricas que comprometen principalmente a los cromosomas 8, 21, 5, 4, 7, 9, 11, 13, 14, X, Y, además de 5q- y 7q- (26). Estas alteraciones se pueden encontrar en cualquier subtipo de leucemia y en general no se relacionan con el subtipo morfológico. La trisomía 8 es la más frecuente y en ocasiones se asocia con antecedentes mielodisplásicos. La monosomía 5, 7, del 5q y del 7q son típicas de LMAs con antecedentes mielodisplásicos o secundarias a tratamiento por agentes alquilantes o radioterapia. En general estas anomalías representan mal pronóstico o intermedio.

8. DESCRIPCION MOLECULAR DE LAS TRANSLOCACIONES

8.1 t(1;19)(q23;p13)

Como se dijo anteriormente esta translocación involucra al gen E2A en el cromosoma 19 cuyos puntos de ruptura ocurren exclusivamente en un intron de 3.5 Kb entre los exones 13 y 14(20). El gen E2A codifica para dos proteínas por la vía del splicing alternativo del RNAm que se unen a elementos E-box del promotor de la inmunoglobulinas del gen Ig, estas proteínas se denominaron E12 y E47 que pertenecen a una gran familia de factores de transcripción con motivos similares a bHLH (basic helix-loop-helix) con capacidad para dimerizar y unirse al DNA, sugiriendo que juegan algún papel durante la organogénesis ( neurogénesis y miogénesis). La organización genómica del gen PBX1 no es bien conocida y los puntos de ruptura están dispersos en una amplia región de 50Kb entre los exones 1 y 2, codifica una proteína que contiene un homeodominio de 60 aminoácidos(aa), con un motivo de unión al DNA. PBX1 pertenece a un subgrupo de proteínas homeoticas junto con PBX2 y PBX3(20,57). No se tiene clara la función de las proteínas PBX pero es probable que actúen como factores de transcripción con un papel general en la mayoría de todos los tejidos. El transcrito de la t(1;19) muestra un fusión constante entre el exón 13 del gen E2A (1518 nucleótidos) y el segundo exón (388 nucleótidos) del gen PBX1. La proteína de fusión E2A-PBX1 contiene la porción carboxiterminal de PBX1 que incluye su homeodominio y la porción aminoterminal de E2A que contiene 2 dominios diferentes capaces de mediar activación transcripcional. Se sugiere que el papel leucemogénico de este nuevo factor de transcripción quimérico radica en la incorporación del motivo de unión al DNA de PBX1 y el dominio de activación de E2A alterandose la función los genes normalmente regulados por los miembros de la familia de los PBX. El producto de este RNAm es una proteína entre 77 y 85 kDa que contiene las dos terceras partes aminoterminales derivado de la proteína E2A y la tercera parte restante de PBX1(9). La alteración de PBX1 en la translocación

durante la diferenciación linfoide temprana puede inducir un arresto en la maduración de la células en estadío Pre-B contribuyendo así desarrollo de la LA. (Ver figura 3)Se ha descrito una fusión variante que se presenta aproximadamente entre 5-10% de las LLAs con t(1;19) caracterizada por un fragmento adicional de 27 nucleótidos en el punto de unión entre E2A y PBX1, posiblemente derivado por un splicing diferencial del gen quimérico(38). Este fragmento de inserción es idéntico en cada caso y se presenta por splicing diferencial de E2A o PBX1 pero no se conoce con exactitud de cual gen se deriva(20).

8.2 t(4;11) (q21;q23)

Involucra la fusión de los genes MLL y AF4 de los cromosomas 11 y 4 respectivamente . El gen MLL tiene una longitud de 90 Kb está compuesto por 37 exones que abarcan una región mayor de 1MB, codifica una proteína de 3968 aa con un peso molecular de 431kDa. Contiene 2 dominios centrales de dedos de zinc en la parte aminoterminal se encuentra un dominio metiltransferasa que puede metilar el DNA afectando la transcripción y tres dominios A-T hook mediante los cuales se une a regiones ricas en A y T en la curvatura menor del DNA de doble hélice permitiendo la interacción con los promotores de los genes(20,25,52). El exón 3 codifica para los motivos A-T hook, los exones 4b y 5 el dominio metiltransferasa, exones 3-7 dominio de transrepresión, exones 8-13 dominios de dedos de zinc, al igual que los exones 18-20, exón 25 región de transactivación y los exones 30-34 una región de homologa con el gen tritorax de Drosophila, esta similitud le puede dar un carácter de gen homeotico (23,25). Aunque su función no es totalmente clara parece actuar como un factor de transcripción regulando la diferenciación. La mayoría de rupturas en este gen ocurren en una región de 8.3 Kb entre los exones 5 y 11 siendo más frecuente para los infantes las rupturas en el intron 11 y para los adultos los intrones 9 y 10(20,31).El gen AF4 esta compuesto por 20 exones y los puntos de ruptura se extienden en una región de 40Kb involucrando principalmente lo exones 3, 4, 5, 6 y 7 y sus respectivos intrones, aunque en la mayoría de los casos se encuentra en el intron 3. AF4 codifica para una proteína rica en serina - prolina y la parte carboxiterminal rica en

glutamina aunque su función no se conoce(18,20). El gen MLL se ha visto involucrado en aproximadamente 30 translocaciones fusionándose por lo menos con 20 genes diferentes dentro de los que encontramos AF9(9p22), ENL (19p13.3), AF17 (17q), AF10 (10p12), AF6 (6q27), ELL (19p13.1), AF1P(1p32), AF1Q (1q21) entre otros(52,86). La gran mayoría de las t(4;11) expresan la fusión MLL-AF4 y su reciproco AF4-MLL en un 70%. Se han observado al menos 10 diferentes transcritos de la fusión MLL-AF4 consecuencia de la heterogeneidad de las rupturas en los diferentes intrones y del splicing diferencial de esta manera la proteína quimérica contiene la porción amino terminal proveniente del gen MLL que incluye los motivos A-T hook y metiltransferasa(perdiendo el carboxiterminal que contiene dominios dedos de zinc) y la porción carboxiterminal proveniente del AF4(20,23,52). Cabe notar que la presencia de los diferntes arearreglos en las leucemias agudas identifica un subgrupo de pacientes que puede ser candidatos para TMO u otras terapias un poco más agresivas. (Ver figura 5)

8.3 t(12;21)(p13;q22)

En esta translocación están involucrados los genes AML1(cromosoma 21) y el gen TEL (cromosoma 12). El gen TEL consta de ocho exones y codifica para una proteína que posee dominios de unión al DNA (ETS) en su carboxiterminal y dominios de hélice loop hélice (HLH) de dimerización en el amino terminal. Pertenece a la superfamilia ETS de factores de transcripción que funcionan como reguladores transcripcionales de unión al DNA, en su porción amino terminal se encuentra el dominio HLH denominado “pointed” presente solo en este subgrupo de proteínas y que al parecer tiene una función critica (82).En el gen AML1 la ruptura ocurre más frecuentemente en el intron 1 y algunas veces en el intron 2, en la mayoría de los casos se fusiona el exón 5 de TEL con el segundo exón del gen AML1, debido a splicing alternativo del exón 2 se puede observar un fragmento más corto simultaneo con el mayor. Rara vez se observa la pérdida del exón 2, fusionandose el exón 5 de TEL con exón 3 de AML1, manteniendo el marco de lectura. En la proteína quimérica se encuentra prácticamente todo el AML1 incluyendo los dominios de transactivación y de unión al DNA, mientras la porción amino terminal contiene el dominio HLH de TEL. Se plantea la hipótesis que la

proteína quimérica TEL/AML1 afecte la activación transcripcional normal del gen AML1(82,87). (Ver figura 2)

8.4 t(9;22)(q34;q11) Es el resultado de una translocación reciproca entre los cromosomas 9 y 22, posee un rasgo característico a nivel citogenético que consiste en un cromosoma 22 más pequeño de lo normal conocido como cromosoma Philadelphia, esta translocación se puede presentar tanto en LMC como en LLA, involucra los genes BCR- ABL, fusionando el extremo 3’ del proto-oncogén cABL en el cromosoma 9 con el extremo 5’ del gen BCR en el cromosoma 9(20). El gen ABL ocupa aproximadamente 200 Kb de la región 9q34, consta de 11 exones, el exón 1 esta formado por dos segmentos Ia y Ib separados por un intrón de aproximadamente 175Kb. Durante la transcripción se puede producir la unión del exón Ib con el exón 2, lo que implica la deleción del exón Ia y la generación de un RNAm de 7Kb, o la unión del exon Ia con el exón 2 produciendo un RNAm de 6Kb ambos transcritos dan lugar a proteínas de 145 kDa que difieren en su extremo amino terminal en la capacidad de miristilarse (adición de ácido mirístico), esta capacidad y la presencia de dominios SH (SRC homology domain)hace que las proteínas ABL sean homólogas a las tirosin-kinasas SRC. Se describen 3 dominios SH en ABL: SH1 que le confiere la actividad tirosin-kinasa, SH2 que capacita al ABL para unirse al producto codificado por el primer exón del gen BCR y SH3 que regula la actividad tirosin-kinasa de la proteína. La región carboxiterminal de ABL posee un dominio de unión al DNA y otros de unión a la actina lo que le confiere la capacidad de encontrarse tanto en citoplasma como en núcleo.El gen BCR ocupa 130 Kb de la región 22q11 y contiene 21 exones, los dos primeros están separados por un largo intrón de aproximadamente 60Kb. En esta misma región cromosómica se localizan otros 3 genes con regiones 5’ idénticas al BCR pero no son funcionales. El gen BCR se transcribe en dos RNAs mensajeros de 4.5 y 6.7 Kb que difieren en sus regiones no traducibles, se han descrito transcritos más cortos 4, 3, 2.5, 1.2 y 1 que se cree son el resultado de un procesamiento alternativo del RNAm . La proteína BCR en su extremo aminoterminal posee dos dominios, el dominio 1 le permite formar homo-oligómeros y potencia la actividad tirosin-kinasa y la capacidad de unirse a filamentos de actina. El dominio 2 le confiere la

actividad serin-treonin-kinasa y puede unirse al dominio SH2 de ABL y de otras proteínas. El extremo carboxiterminal posee actividad Gap sobre una proteína análoga de RAS, denominada P21 RAC, inactivandola. En el gen BCR existen diversos sitios de ruptura y en consecuencia se originan diferentes transcritos que codifican para diferentes proteínas: p190, p210 y p230. Uno se agrupa en una región de 5.8Kb denominada M-bcr (major breakpoint cluster region) y que se ha observado que el 100% de las LMCs y el 50% de las LLAs tipo B. Esta zona consta de 5 exones(b1, b2, b3, b4 y b5), que corresponden a los exones 12 a 16 del gen, están separados por cuatro intrones donde siempre se va a localizar la ruptura. Las zonas más frecuentemente comprometidas están entre los exones b2-b3 y b3-b4 (intron 13 o el intron 14), originando un gen híbrido BCR-ABL de 8.5 Kb ya sea por el exón b2 ó b3 que se une al exón a2 de ABL. En LMC se ha observado en un 55% b3-a2, b2-a2 en un 42% y un 5% presenta ambas como resultado de splicing alternativo. La fusión BCR-ABL codifica para una proteína de 210kDa donde sus primeros 927 aa están codificados por los exones del gen BCR y constituyen el extremo aminoterminal, conservando el dominio con actividad serin-treonin-kinasa, los últimos 1097 aa que constituyen el extremo carboxiterminal procedentes del gen ABL conservan todos los dominios funcionales de la proteína ABL(71). Esta conformación le confiere una actividad tirosina quinasa elevada la cual interfiere con las señales de transducción involucradas en el control de proliferación, muerte celular y adhesión célula-célula. Existe otro punto de ruptura denominado m-BCR minor breakpoint cluster regions localizado en el primer intrón del gen BCR que mide 10.8Kb. En esta fusión BCR-ABL el primer exón también llamado e-1 del gen BCR se une al exón 2 del gen ABL(e1-a2), codificando una proteína de 190kDa. Este transcrito de fusión esta principalmente asociado a LLA, esporádicamente se observa en LMC pero su significancia en este ultimo caso todavía se encuentra en estudio(20,71). También se han visto involucrados, aunque con menor frecuencia otros intrones (2, 5, 6, 8 y 10) del gen BCR(20,71). Como se dijo anteriormente el 5% se los niños con LLA y entre el 20-25% de los adultos con LLA presentan la t(9;22). El 40% de las LLA Ph+ muestran rupturas en M-BCR mientras el 60% en m-BCR. En algunos casos se ha encontrado que en la fusión BCR-ABL el exón fusionado del gen ABL es el exón 3 en vez del exón 2. La mayoría de estos mensajeros están en fase de

lectura y podrían ser traducidos a proteínas de fusión y aunque le falte un número variable de aminoácidos sigue siendo oncogénica. La diferente localización del punto de ruptura se traduce en una misma alteración citogenética, el cromosoma Philadelphia (ph1), pero tiene distintas consecuencias moleculares que parece influir en la génesis de los distintos subtipos leucemicos. Este gen de fusión se asocia con niños de mayor edad al momento del diagnóstico , recuento leucocitarios altos y mayor frecuencia de compromiso de SNC, hasta hace poco se creía que la única modalidad de tratamiento en LLA asociada a esta alteración era el TMO alogénico en primera remisión, sin embargo parece que un subgrupo de pacientes en especial aquellos con recuentos leucocitarios bajos, pueden ser curados con quimioterapia intensiva.(Ver figura 4)

8.5 t(8;21)(q22;q22)

Involucra los genes ETO y AML1 en los cromosomas 8 y 21 respectivamente. El gen AML1 está involucrado en otras translocaciones como la t(12;21), t(3;21), t(16;21) etc esta compuesto por 13 exones que se extienden en una región de 150Kb de DNA genomico (84) La región aminoterminal de la proteína AML1 tiene un dominio de unión al DNA homologo al de drosophila runt basados en la homología estructural se piensa que AML1 es un factor de transcripción con propiedades de unión al DNA y potencial para dimerizarse a otros factores, la región carboxiterminal es multifuncional responsable de transactivación, represión y blanco intranuclear (56,63). Esta proteína también tiene homología con la proteína 2 de unión al enhancer de poliomavirus DTP2 el cual es un factor de transcripción. El AML1 se une al DNA como heterodimero con la subunidad beta del core binding factor(CBF).ETO esta compuesto por 13 exones que abarcan una región de 87Kb, la estructura predicha de ETO se caracteriza por 2 dominios zinc finger y otro rico en prolina los cuales muestran propiedades de activación transcripcional, ETO puede actuar entonces como un factor de transcripción uniéndose al DNA y regulando la expresión de genes específicos. El AML1/ETO afecta el carboxiterminal de AML1 reemplazados por los 575 aa de ETO que contiene los dominios dedos de zinc y el aminoterminal derivado de AML1 que también

contiene motivos de unión al DNA, de esta manera la proteína quimérica puede interferir con la proteína silvestre AML1 actuando de una manera dominante negativa afectando el crecimiento y diferenciación de las células hematopoyéticas. El punto de ruptura en AML1 se encuentra entre los exones 5 y 6 y en ETO corriente arriba del exón 2(67).(Ver figura 7)

8.6 t(15;17)(q22;q21)

En esta translocación se encuentran involucrados los genes PML y RAR ubicados en los cromosomas 15 y 17 respectivamente.El gen PML contiene 9 exones que se expanden sobre 30 Kb, la proteína codificada tiene motivos ricos en prolina, en cisteína, dominios alfa hélice, una región homóloga a cremalleras de leucina y motivos ricos en serína principalmente en la región aminoterminal, esto hace pensar que PML es un factor de transcripción(64,69). El gen RAR codifica para un factor de transcripción que al igual que todos los elementos de la familia RAR, tras fijar el ácido retinóico, se une a secuencias de DNA específicas en los promotores de muchos genes regulando su expresión (sirviendo así el receptor nuclear del ácido retinóico para regular la expresión de genes) (69,77). Todas las proteínas predichas PML /RAR alfa conservan el dominio rico en cisteinas de PML y los dominios BAF de RAR alfa , lo que quiere decir que mantiene el domino C de unión al ligando con capacidad para unir el ácido retinóico.Sobre el gen PML se encuentran 3 puntos de ruptura denominados BCR3 ( exón 3, intron 3 , exon 4), BCR2 (exón 5, intron 5 exón 6) y BCR1 (intron 6 exón 7) siendo los más frecuentes BCR1 y BCR 3 , el punto de ruptura en RAR se encuentra localizado en el intron 2 que tiene una longitud de 15 Kb(64,72,77).(Ver figura 6)

8.7 Inv. (16)(p13; q22)

En esta inversión pericéntrica se encuentra involucrado el gen CBFB en 16p13 y el gen MYH11 en 16q22 que codifica para la cadena pesada de la miosina del músculo liso Lutterbach , B., Hon, Y. La proteína CBF beta es ubicua y forma heterodímeros con otras

fracciones como CBF1, CBF2 y CBF3 y como se dijo anteriormente con AML1. El gen MYH11 esta compuesto por 21 exones que abarcan 37 Kb, observándose una heterogeneidad en los sitios de ruptura entre los exones 6 y 12 , encontrándose la mayoría en el intrón 11 y en el intrón 5 para CBFb. La proteína quimérica resultante CBFb/ MYH11 se piensa que afecta la mielopoyesis normal actuando como un inhibidor dominante negativo de la función endógena de CBF beta y su heterodímero con AML1 alterando la expresión de los genes blanco(77)

Hasta el momento se han encontrado 10 diferentes transcritos de fusión, pero en el 85% de los casos se fusiona el exón 5 de CBFb y exón 12 de MYH11(52,67,77). En un 5% se fusionan los exones 5 y 8 como también de los exones 5 y 7, en menor proporción se entre los exones 5-11, 5-10, 4-8, 4-7, 4-12, 4-13 y 5-9 de los genes CBFb y MYH11 respectivamente. Como se citó anteriormente la heterogeneidad de los puntos de ruptura se dan más en el gen MYH11 así 7 diferentes exones (del exón 7 al exón 13) se han visto involucrados en la inversión.(Ver figura 8)

9. MATERIALES Y METODOS

9.1 PACIENTES

Se analizaron 117 pacientes, 73 niños y 54 adultos con diagnósticos nuevos de leucemia aguda y recaídas, remitidos al Laboratorio de Genética de los servicios de Oncopediatria y Hematooncología del Instituto Nacional de Cancerología. Los aspirados de médula ósea se dividieron para realizar los estudios de morfología, citoquímica, inmunología, citogenéticos y moleculares, los tres primeros se llevaron acabo en el laboratorio de Hematología Especial del INC y los dos últimos en el laboratorio de Genética. Se revisaron las historias clínicas y se tomaron datos como: edad, sexo, recuento de blancos, sobrevida, tipo de tratamiento, para los análisis de estadística descriptiva.

9.2 DIAGNOSTICO MORFOLOGICO Este se efectuó en el laboratorio de Hematología Especial por un hematopatólogo (Dr. Carlos Saavedra) siguiendo la clasificación FAB utilizando la coloración de Wright de los aspirados y biopsias de médula ósea, adicionalmente se emplearon coloraciones especiales como el PAS, fosfatasa ácida, Oil Red O y sudan negro B para LLA y de CAE, ANBE, MPO y ANAE, para LMA.

9.3 DIAGNOSTICO INMUNOLOGICO

Para el diagnóstico inmunológico se utilizaron anticuerpos monoclonales marcados con FITC y PE adquiridos de la casa comercial Becton- Dickinson y la lectura se realizó en un citometro de flujo FACScalibur de la misma casa comercial los marcadores utilizados fueron los siguientes:

La asignación de linaje se hizo por técnica de permeabilización de citoplasma para CD79a, CD3 Y MPO.

Linaje B: CD10, CD79a, CD19, CD22, IgMs e Ig M CyLinaje T: CD3, CD5, CD7, CD4 y CD8.Linaje mieloide: MPO, CD13, CD33, CD14 y CD15.Inmaduros: CD34, CD38, TdT y HLA-DR.

Se consideró positiva la lectura cuando la población marcada presenta un porcentaje mayor de 20%.

9.4 DIAGNOSTICO CITOGENETICO

Para este diagnóstico se siguieron los protocolos ya publicados(90), brevemente, la muestra fue lavada en solución salina y se sembró en RPMI al 10% de suero fetal bovino. Se tomaron 2 cc. de esta siembra y se les agregó colchicina 0.016% después de una hora se centrifugó y se adicionó una solución hipotónica de KCl 0.075M, luego de una hora se prefijo con 1cc de metanol:ácido acético 3:1 con tres lavados adicionales en la misma solución. El botón final se resuspendió adecuadamente y se extendió sobre portaobjeto previamente desengrasado. Las láminas fueron teñidas con quinacrina y la lectura se realizó en microscopio con fluorescencia.

9.5 DIAGNOSTICO MOLECULAR

Para el diagnóstico molecular se utilizaron como controles positivos líneas celulares portadoras de translocaciones específicas donadas amablemente por el Dr. Andrea Biondi del Centro de Ricerca M. Tettamanti, Ospedale San Gerardo. Monza, Italia.(Ver figura 23)De la fracción del aspirado de médula ósea utilizado para los estudios moleculares se separaron los mononucleares mediante un gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque, después de lavarlas en solución salina se guardaron en Trizol o en Isotiocianato de guanidio (GITC)para la posterior a extracción del RNA.A cada caso de leucemia se le realizó examen para cada uno de los tipos de translocaciones conocidas , siendo para las LLAs t(12;21), t(9;22), t(4;11) y t(1;19) y para las mieloides en igual forma t(8;21), t(15;17) e Inv. (16).

9.5.1 Extracción RNA

9.5.1.1 Protocolo del TrizolSe siguieron las recomendaciones del fabricante como sigue:

1. Adicionar 0.2 ml de cloroformo por 1 ml de reactivo de TRIZOL.2. Mezclar fuertemente durante 15 segundos. 3. Incubar por 2-3 minutos a una temperatura de 15-30C. 4. Centrifugar a una velocidad de 12000g por 15 minutos a una

temperatura de 2-8C. 5. La muestra se separa en una fase inferior roja (fenol-cloroformo),

una interfase y una fase acuosa superior menos coloreada donde se encuentra el RNA.

6. Tomar la fase acuosa y transferirla a otro tubo.7. Adicionar 0.5 ml de isopropanol por cada 1 ml de Trizol para

precipitar el RNA.8. Incubar por 10 minutos a una temperatura de 15-30C.9. Centrifugar a una velocidad de 12000g por 10 minutos a una

temperatura de 2-8°C. 10. Descartar sobrenadante. 11. Lavar el pellet una vez con 1 ml de etanol al 75%.12. Mezclar con vortex.13. Centrifugar a 7500g por 5 minutos a una temperatura de 2-8C. 14. Descartar sobrenadante. 15. Secar brevemente RNA al aire o al vacío y resuspender en SDS

0.5% o agua libre de Rnasa. 16. Incubar por 10 minutos a una temperatura de 55-60C.17. Cuantificar RNA en espectofotómetro.

9.5.1.2 Protocolo del GITCBasado en el descrito por Chirgwing y colaboradores, parte de la muestra conservada en GITC 4M el cual esta constituido por los siguientes reactivos: Isotiocianato de Guanidio 4M, N-Lauroilsacarosina 0.5 %, Citrato de sodio tribasico dihidratado 25mM pH7, 2- mercaptoetanol (2-ME 14.3 M) 0.1M y completar con agua destilada hasta 50 ml.1. Adicionar 1/10 volúmenes de acetato de sodio 2M pH 4.0,

dependiendo del volumen de GITC donde se guardó la muestra. 2. Adicionar igual volumen de fenol-ácido pH 4.0.3. Adicionar 1/5 volúmenes de cloroformo:alcohol isoamílico 49:1.4. Mezclar con vortex y colocar en hielo por 10 minutos.5. Centrifugar a 4°C por 15 minutos a 13.000 r.p.m.6. Recuperar la fase superior. 7. Precipitar adicionando igual volumen de isopropanol.8. Colocar en hielo a -80°C durante 30 minutos.9. Centrifugar a 13.000 r.p.m. durante 20 minutos. 10. Eliminar el sobrenadante y adicionar 500l de etanol frío al

pellet.11. Centrifugar a 4°C por 5 minutos.12. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50l de agua.13. Evaluar la concentración de RNA en un espectofotómetro a 260 y

280nm para lo cual se efectúa una dilución 1/100, el radio A260/A280

debe ser < 1.6. 14. Ajustar la concentración a 0.5g/l.15. Evaluar el RNA en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de

etidio, el gel se corre durante 35 minutos bajo las siguientes condiciones: 90V, 400mA y 400W.

(Ver figura 24)

9.5.2 Transcripción ReversaLa reacción se llevó acabo en un volumen final de 20l que contenía: 1x de buffer RT( 20mM Tris HCl, 50mM KCl, pH8.3), 5 mM de MgCl2, 10mM de DTT, 5mM de random hexameros, 25U de Rnasin, 20U de transcriptasa reversa (SupescriptII GIBCO), 1mM de cada dNTP y 1 g de RNA. La reacción se mantuvo a 42°C durante 45 minutos, posteriormente a 99°C durante 3 minutos para inactivar la ación de la enzima e inmediatamente se lleva a -20°C.El DNAc obtenido se evaluó detectando la presencia de un exón del ABL o del RAR en el caso de la LMA M3.(Ver figura 26)

9.5.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)Se llevó a cabo en un volumen final de 50l que contenía: 1X de buffer PCR 10X ( 20mM Tris HCl, 50mM KCl, pH8.3), 2.5mM de MgCl2, 1mM de cada dNTP, 400nM de cada uno de los primers, 1 U de Taq polimerasa y 2-3l de DNAc. La reacción se realizó en un

termociclador MJ Research PTC 200, durante 35 ciclos con el siguiente esquema: 95°C / 30s un ciclo; 94°C/30s, 60°C/30s y 72°C/ 60s por 35 ciclos, la reacción se detiene finalmente a 16°C o a temperatura ambiente.Todas las reacciones utilizan 5 primers A, B, C, D y E, la primera PCR se realiza con A y B en caso de ser positiva se confirma realizando un PCR con los primers C y E3’ o D y E5’ , primers reportados por los autoreslos autores Dongen van, J.J.M., Macintyre, J.A., Gabbert, J.A., Delabesse, E., Rossi, V., Saglio, G., Gottardi,. E., Rambaldi, A., Dotti, G. y col. Para el seguimiento de enfermedad residual mínima después de la primera reacción se realiza un segunda con los primer C y D lo cual aumenta la sensibilidad de la PCR. Si más de un cluster de puntos ruptura aparecen corriente abajo del gen de fusión, se emplean primers adicionales B y D, si el cluster esta corriente arriba nuevos primers A y C se pueden utilizar (como se esquematiza en la ubicación de los primers para cada una de las translocaciones). Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa 1% teñido con bromuro de etidio corrido a 90V, 400mA y 400W y posteriormente se tomaron fotografías como registro de los resultados.

697

RS 4;11

MV 4;11

KASUMI

TOM-1

LAMA

K562

REH

NB4

t(1;19)

t(4;11)

t(4;11)

t(8;21)

t(9;22)

t(9;22)

t(9;22)

t(12;21)

t(15;17)

E2A-PBX1

MLL-AF4

MLL-AF4

ETO-AML1

BCR-ABL

BCR-ABL

BCRABL

TEL-AML1

PML-RAR

LINEASCELULARES

TRANSLOCACION TRANSCRITOSDE FUSION

FIGURA 23

10. RESULTADOS

Se analizaron 117 pacientes, 92 casos con LLA (63 niños y 29 adultos) y 25 casos con LMA(10 niños y 15 adultos), para estudios moleculares en búsqueda de translocaciones específicas (Ver figura 9).Se observó un ligero predominio del sexo masculino sobre el femenino (48 vs. 52) en LLA en niños , mientras predominó el sexo femenino sobre el masculino (55 vs. 45) en LLA adultos (Ver figura 10).Entre el periodo de Julio de 1998 y Diciembre de 1999. Para LLA el 37% de los niños habían fallecido, 21% abandonaron el tratamiento y el 42% permanecen vivos, mientras en adultos el 56% falleció, 3% abandonaron el tratamiento y el 41% permanecen vivos(Ver figura 11)La morfología en LLA se distribuyó de la siguiente manera: niños 51% L1, 38% L2, 3% L3, 6% leucemia / linfoma y el 2% mixta. En adultos 26% L1, 67% L2 y 7% L3. (Ver figura 12)El inmunofenotipo predominante en niños fue el de LLAc ( CALLA +), con un 40% en niños seguidos por el Pre pre-B (CALLA-) 28%, Pre-B 13%, B madura 3% y de células T 10% y 6% no clasificable que corresponden a las recaídas. En adultos el 38% correspondieron a LLAc (CALLA +), 17% Pre pre-B (CALLA-), 7% Pre-B, 7% B madura, 3% de células T y 28% no clasificable. (Ver figura 13)Respecto a las alteraciones cromosómicas en niños se observó: 17% de hiperdiploidias, 6% t(8;14), 3% t(4;11), 8% otras alteraciones; 3% t(1;19), mientras el 63% mostraron cariotipo sin alteración cromosómica. En adultos el 6% presentaron t(8;14), 6% t(9;22) y el 88% mostró cariotipos normales.(Ver figura14)Los análisis moleculares en niños con LLA mostraron: 10% t(12;21) 5% t(1;19), 3% t(4;11) y 2% t(9;22), el 80% de los casos no mostraron presencia de estas translocaciones (Ver figuras 27-31). En adultos 7% t(4;11); 7% t(9;22); 3% t(1;19); ningún caso presentó t(12;21), mientras el 83% no presentó ninguna de las anteriores translocaciones.(Ver figura 15)En la en la figura16 se observa el total del porcentaje de las alteraciones genéticas (molecular más la citogenética) observadas en LLA en niños y adultos.En LMA se analizó un total de 25 casos, 10 correspondieron a niños y

15 a adultos de los cuales el 68 % correspondieron a sexo masculino y el 32% al sexo femenino.(Ver figura 17)El 50% de los niños y el 67% de los adultos habían fallecido(Ver figura 18) La distribución morfológica mediante la clasificación FAB fue la siguiente: para niños el 50%, correspondieron a M2; el 20% a M3; el 20% a M1 y el 10% a M4. Para adultos el 53% fueron M3; 20% M2; 7% M1 y el 20% M4.(Ver figura 19)El 43% de los casos de LMA en niños mostraron alteraciones cromosómicas: 29% t(15;17), 14% t(8;21) y un 57% no mostraron presencia de alteración. En adultos 10% presentaron t(15;17), el 10% t(8;21) y el 80% sin alteraciones.(Ver figura 21) Por RT-PCR se encontró en niño 40% t(8;21); 20% t(15;17) y 40% sin translocaciones. En adultos el 27% t(15;17); 13% t(8;21); 7% Inv.(16) y un 53% sin translocación.(Ver figuras 32-34)Es importante notar que solo se incluyeron las morfologías M1, M2, M3 y M4.(Ver tablas3,4).De 8 casos con morfología M2, 5 (62%) presentaron t(8;21); de 10 casos con morfología M3, 6 (60%) mostraron t(15;17). por técnicas de RT-PCR.(Ver figura 23)En la figura 34 se observa el número de casos detectados por molecular vs. Citogenética en valores absolutos, donde se puede observar la gran senibilidad del RT-PCR en la detección de estas alteraciones.

11. DISCUSION

Las leucemias constituyen el grupo de neoplasias donde mejor se conocen los defectos genéticos que conducen a su desarrollo y de los factores ambientales que pueden influir en la aparición de dichos daños. A pesar de los grandes avances que se han realizado en los esquemas de terapia y la introducción del transplante de médula ósea (TMO), las leucemias agudas siguen siendo neoplasias que producen una alta mortalidad y morbilidad especialmente entre los adultos donde menos de un 50% alcanzan sobrevida mayores de 5 años, en niños si bien se reportan remisiones completas de más del 90% a largo plazo más del 40% recaen y fallecen por la enfermedad .Actualmente se han identificado más de 78 rearreglos cromosómicos recurrentes en LA con 41 genes comprometidos. Para el año de 1983 se habían publicado más de 3.844 casos con alteración cromosómica, 10 años después este número aumentó a 22.000 y para el año de 1996 se habían reportado 26523 neoplasias citogenéticamente anormales asignándose 215 aberraciones balanceadas y 1588 no balanceadas. Esta información ha servido para la identificación precisa de los genes comprometidos en las diferentes alteraciones cromosómicas, para evaluar el pronóstico, precisar el diagnóstico y últimamente para diseñar drogas específicas para algunas de estas anomalías.Las alteraciones genéticas se pueden dividir en cromosómicas y moleculares entre las primeras las alteraciones numéricas como las hiperdiploidías (número > de 46 cromosomas), hipodiploidías (número < de 46 cromosomas), translocaciones, deleciones, duplicaciones, amplificaciones, inversiones y trisomías; todas ellas se pueden identificar por técnicas citogenéticas convencionales de cualquier manera todas tienen consecuencias moleculares. Las alteraciones moleculares principalmente involucran daños puntuales sobre los genes: transversiones, transiciones, inserciones y deleciones de pocas bases, inversiones, duplicaciones, metilaciones que no pueden observarse por técnicas citogenéticas necesitándose métodos moleculares específicos para su identificación.Especial referencia debemos hacer a las translocaciones cromosómicas que consisten en la recombinación somática entre dos cromosomas generando la aparición de cromosomas nuevos

rearreglados.A nivel molecular las translocaciones en leucemia generalmente fusionan dos genes importantes involucrados en los procesos de hematopoyesis, generando un gen híbrido que altera el programa normal de expresión celular, en otras ocasiones las translocaciones incrementan la expresión de un gen a expensas de los elementos reguladores de otro.Importante han sido las investigaciones tendientes a aislar, caracterizar y comprender la fisiología molecular de las translocaciones; por ejemplo hoy se conoce con gran precisión la estructura del daño de la t(9;22) y sus consecuencias bioquímicas, moleculares y fisiológicas, lo que ha permitido el diseño de drogas inhibidoras de quinazas de la proteína ABL-BCR con una aparente buena respuesta entre los pacientes con leucemia mieloide crónica. Si bien este es el primer caso, consideremos que en un tiempo relativamente corto aparecerán nuevas drogas que se relacionaren con el defecto genético específico, individualizando la terapia y haciendo del diagnóstico molecular un punto critico para el manejo de la enfermedad; hasta el momento la identificación de las aberraciones citogenéticas y moleculares en leucemias agudas ha tenido su mayor impacto en el diagnóstico revelando la gran heterogeneidad de estas neoplasias, la categorización en grupos de riesgos permitiendo un manejo clínico diferencial y últimamente en el seguimiento de la enfermedad.Desde hace tiempo se conoce que los niños responden mejor a la terapia que los adultos pero que entre ellos también existe variabilidad en la respuesta e historia de la enfermedad, a la luz de las investigaciones recientes estos comportamientos se deben a las diferencias genéticas de las células leucémicas entre los pacientes. Los trabajos clínicos, epidemiológicos y genéticos han establecido con buenas bases los siguientes subgrupos de riesgos desde el punto de vista genético en LLA y LMA : hiperdiploidías , buen pronóstico tanto en niños como en adultos con sobrevida mayores de 80 %; t(9;22): mal pronóstico; t(4;11): mal pronóstico; t(1;19): riesgo intermedio en niños y mal pronóstico en adultos; t(12;21): buen pronóstico en niños; t(15;17): buen pronóstico; t(8;21): buen pronostico; alteraciones de 11q23: de mal pronostico; Inv.(16): buen pronostico(24).Adicionalmente los defectos genéticos se asocian con parámetros inmunológicos, morfológicos y clínicos que permiten un mejor diagnostico, es bien conocida la relación entre la morfología y el daño

cromosómico en las LMAs: LMA M3 con t(15;17), la M2 con t(8;21) la M5 con t(9;11), la Inv.16 con M4.

11.1 Leucemia linfoide aguda

En esta investigación se analizaron 92 casos de LLA, 63 niños y 29 adultos, tal como es conocido, el sexo masculino predominó en el caso de los niños (52% Vs 48 %) contrario a lo ocurrido en los adultos (45% Vs. 55%) donde predominó el sexo femenino(Ver figuras 9,10) (Ver tabla 1,2). Esta misma distribución ha sido observada en otros trabajos. La LLA morfología L1 fue más frecuente en los niños seguido de la L2 y un bajo porcentaje de las L3. En adultos predominó la L2 y en un menor porcentaje las L1. Si bien anteriormente se consideraba la morfología L2 de mal pronóstico hoy en día este concepto ha cambiado y la morfología ha perdido su valor predictivo en el comportamiento de la enfermedad, así los elementos clínicos mas utilizados para la clasificar el riesgo de los pacientes son en orden de importancia el recuento de leucocitos, que de alguna manera informa sobre la carga tumoral y la edad siendo los menores de un año y mayores de diez de mal pronóstico y de bueno el grupo intermedio (1-10 años), los adultos constituyen un grupo de alto riesgo. Otros aspectos como el compromiso del SNC, niveles de LDH, masa mediastinal también son utilizados como factores pronósticos clínicos. Caso aparte lo constituye la L3 que se asocia directamente al linfóma de Burkitt considerado de mal pronostico tanto en niños como en adultos.En un trabajo realizado en el INC sobre pacientes se clasificaron de riesgo estándar: edad entre 2-10 años y recuentos leucocitarios menores de 20 x 109/L y de alto riesgo aquellos pacientes que no presentaban los anteriores parámetros, que adicionalmente mostraron compromiso extramedular, encontrando un 58%(6).Los estudios inmunológicos mostraron una distribución similar a la reportada por otros autores, en niños y adultos respectivamente 38% y 40% de LLAc (CALLA +), Pre pre-B 17% y 28%, Pre-B 7% y 13%, B maduras 7% y 3% y T 3% y 10% (ver grafica 13). En conjunto las de linaje B constituyeron el 95% en los adultos y 90% en niños. Las distribución anterior es comparable a los estudios realizados en otras partes del mundo. Tradicionalmente se ha considerado que las leucemias de células T, B maduras y Pre-B son de pronostico menos

favorables que las Pre pre-B que expresan CALLA +.

11.1.1Alteraciones GenéticasSumando los porcentajes de las alteraciones encontradas por técnicas citogenéticas y moleculares en niños con LLA se puede lograr un total de 51%, pero si estos mismos porcentajes los proyectamos al registro histórico del INC sobre 131 casos con LLA, podríamos encontrar anomalías hasta en un 70% de los casos, porcentaje que esta muy de acuerdo con lo reportado a nivel mundial, en adultos esperamos que sobrepase el 50%. Las alteraciones genéticas más frecuentes fueron las hiperdiploidías y la t(12;21) con 17% y 10% respectivamente, seguida de otras alteraciones cromosómicas 8%, t(8;14) 6%, t(1;19) 5%, t(4;11) 3%, t(9;22) 2%, para un total de 51% de alteraciones. En conclusión el uso de dos técnicas mejora el diagnóstico genético. Discutiremos a continuación alteración por alteración.

•t(12;21)Descrita en 1995 por Romana y col. en cuyo estudio encontró un 25% de positividad combinando las técnica de PCR, FISH, Northern blot y Sourthern blot contrastando con la positividad citogenética que solo detecta el 0.05%(79). Posteriores trabajos utilizando RT-PCR han establecido frecuencias entre el 16% - 32% de los pacientes pediátricos con LLA, mientras en adultos su frecuencia es menor del 2%(1,80). Existe controversia sobre el significado pronóstico de esta translocación sin embargo la mayoría de los autores están de acuerdo con su buen pronóstico(34,50,55). Por ejemplo Avigad,S. del Center for Pediatric Hematology Oncology Scheider Children’s Medical Center of Israel (2) analizaron 98 pacientes encontrando un 24% de positividad para TEL-AML1, sin observar diferencias en la edad, índice de ADN, recuento de leucocitos, fenotipo CALLA + Vs. CALLA- o respuesta a la terapia respecto a los TEL-AML1 negativos. El 84% de estos pacientes presentaron un recuento superior a 50.000 la mayoría ADN diploide y buena respuesta a terapia: 87%, Vs 65% de los niños TEL-AML1 negativos. La sobrevida libre de enfermedad (DFS) a 57 meses fue de 82% en pacientes TEL-AML1 positivos y 69% para los negativos. En el estudio realizado por Borkhard, A., Cazzniga, G. y Col.(5) sobre 334 pacientes pediátricos con LLA observaron un 18.9% de t(12;21) con edades entre 1-12 años. El 25 % coexpresaron al menos dos marcadores mieloides CD13, CD33 y Cdw65 en más del 20% de las células y la hiperdiplodía solo se observó en 4 pacientes

mientras de los casos 27 (11.1%) TEL/AML1 negativos solo 3 presentaron recaída. Este autor concluye que los pacientes que expresan TEL-AML1 parecen tener mejor sobrevida que los niños TEL-AML negativos.

En nuestro trabajo el porcentaje total se encontró por debajo a lo reportado por la literatura(Ver figura 15). De los seis casos tres pacientes estaban entre 3 y 4 años y los otros 3 eran mayores de cinco(Ver tabla 5) fueron diagnosticados como FAB L2 y 1 FAB L1, todos con recuentos leucocitarios por debajo de 50.000; el perfil inmunológico mostró tres casos Pre pre-B, 2 Pre-B y uno LLAc CALLA+ , dos coexpresaron marcadores mieloides 1 Pre-B y otro Pre pre-B, 3 pacientes permanecen vivos , uno abandonó y dos han fallecido.; el de mayor sobrevida con más de 27 meses, corresponde a un paciente con fenotipo LLAc CALLA positivo(Ver tabla 5). Aunque esta muestra es pequeña la t(12;21) se asoció con los dos factores clínicos pronósticos mas importantes: su presencia en niños, puesto que en adultos no se detectó y el bajo recuento de leucocitos; aunque dos casos se asociaron con fenotipo Pre-B y dos con antígenos mieloides, factores considerados de pronóstico desfavorable. Un caso se asocio con anomalía del brazo corto del cromosoma, 9p+, característica cromosómica asociada con t(12;21). Será necesario aumentar el número de casos en nuestra población con seguimientos clínicos para evaluar mejor el pronostico de esta translocación.

•t(1:19)Esta translocación en la población colombiana se ha encontrado en proporciones similares tanto en niños como en adultos 7% y 5% respectivamente mediante estudios citogenéticos en INC, comparable a lo reportado en otras latitudes. (33) Su valor pronóstico se ha considerado desfavorable pero en niños con quimioterapias más agresivas han mejorado la sobrevida(75). El Pediatric Oncology Group (POG) del Hospital St.Jude trató 34 casos con t(1;19) los cuales mostraron mala respuesta a la terapia 38% Vs. 10% que no poseían la translocación (10). La t(1;19) se asocia con otros parámetros de mal pronóstico como recuento elevado de leucocitos, índice de DNA menor de 1.16, elevado nivel de LDH. mayor frecuencia en raza no blanca y fenotipo Pre-B.

En adultos el Grupo Francés de Citogenética Hematológica encontró un 3% caracterizado por cariotipos pseudodiplode y bajo recuento de leucocitos, aunque todos alcanzaron remisión completa la media de DFS fue tan solo de 6 meses mientras a 3 años el DFS fue tan solo del 20%(10). En nuestra investigación encontramos tres casos en niños y uno en adultos, todos con morfología L1, uno con recuento mayor de 100.000 los restantes por debajo de 50.000; tres con fenotipo LLAc CALLA + y 1 Pre-B, tres permanecen vivos, el de mayor sobrevida con 15 meses(Ver tabla1,2,5,6). Las anteriores características difieren sustancialmente a lo reportado por otros autores como la asociación con alto recuento de leucocitos e inmunofenotipo Pre-B, en nuestra experiencia, para el caso de los niños, la t(1;19) es un factor de riesgo intermedio entre las hiperdiploidías y la t(9;22) mientras en adultos fue de mal pronóstico(33)

•t(4;11)Esta translocación ha recibido gran atención en los últimos años por su asociación con exposición a inhibidores de topoisomerasa, esta anomalía se reporta con una frecuencia que oscila entre 1.7% y 8%, tanto en adultos como en niños mayores de 2 años, sin embargo en niños menores de un año se encuentra hasta en un 70%, un consenso entre los autores dice que esta alteración es de mal pronóstico y que en ocasiones muestra fenotipo mixto linfoide monocitico. Uckun, F., Herman-Hatten, K., y col(95) analizaron 17 infantes y 127 niños encontrando 9 (53%) y 17(13.4%) positivos para MLL-AF4 respectivamente, mientras los primeros presentaron mal pronóstico el comportamiento de los segundos fueron similar a los MLL-AF4 negativos. En un artículo publicado por Behm, F.G., Raimondi, S.C. y Col (3) donde analizaron 45 niños con anomalías en 11q, encontraron 18 casos con t(4;11), t(9;11) o t(11;19), la presencia de rearreglos en el gen MLL se asoció significativamente con edad menor de un año, recuento leucocitario mayor de 50.000 y ausencia de expresión de CALLA, la sobrevida a 4 años fue del 10% contra 64% con los que no poseían defectos en este gen.En adultos el Grupo Francés de Citogenética Hematológica, sobre un total de 443 casos, la encontró en un 16(4%) todos con fenotipo B logrando remisiones completas del 75% y una media para DFS de 7 meses y una DFS a tres años de 0%. Los autores Wetzler, M., Dodge, R., Mrózek, K y Col(100) analizaron un total de 256 casos en

adultos encontrando 17(7%) con t(4;11), observaron una DFS media de 5 meses son probabilidad de sobrevida 5 años del 18%.Otro estudio realizado por Cimino,G ., Elia, M., Rapanotti, M.C y col(11) en 22 adultos y tres infantes tratados con altas dosis durante inducción y consolidación alcanzaron remisión hematológica completa, de estos 11(44%) mostraron remisión molecular, los 14 restantes PCR positivos presentaron recaída en un tiempo medio de 14 meses. Este estudio enfatiza en la importancia del monitorear EMR mediante la RT-PCR.En nuestra investigación se encontraron dos en niños y dos adultos con t(4;11), un niño era menor de un año con morfología L2 y recuento mayor de 50.000 (430.000) mientras el otro era un niño de 4 años con morfología L1 y con recuento mayor de 50.000 (535.000), los dos pacientes presentaron fenotipo Pre-B. Los adultos mostraron recuentos leucocitarios menores de 50.000 (2.400 y 4.100) con morfología L2. Tres de los casos con t(4;11) expresaron fenotipo Pre-B y uno Pre pre-B, dos pacientes abandonaron el tratamiento, uno falleció y el otro esta vivo, con una sobrevida de 8 meses, un caso coexpresó marcadores mieloides (CD13). De seis pacientes menores de un año incluidos en este trabajo 1 (16.6%) presentó t(4:11), el porcentaje se encuentra por debajo de lo reportado en la literatura mundial (Ver tabla 1,2,5, 6). Los casos de adultos mostraron cariotipos normales , en un niño coincidió el diagnostico molecular y citogenético mientras en el otro no, es infrecuente la ausencia de la translocación citogenética y la positividad molecular debido a translocaciones crípticas o al bajo nivel de clonalidad que impide el diagnóstico cromosómico.

•t(9;22) Esta translocación es la más conocida y estudiada se detecta en más del 90% en LMC, hasta en un 30% de LLA en adultos y un 5% en niños. En el caso de las leucemias agudas es un factor bien conocido de mal pronóstico,(94) por este motivo se ha propuesto que los pacientes con esta translocación deben recibir TMO, por ejemplo Fletcher, J.A., Lynch, E.A., Kimball, V.M. y Col. (27) analizaron 434 niños, 15 presentaron t(9;22)con una DFS a 4 años del 0% comparado con el 81% que no la poseían. Bellerman y col. analizaron un total de 170 niños encontrando 20 (12%) positivos para BCR-ABL por RT-PCR ( 3 veces más alto a lo reportado en la literatura), 11 (55%) recayeron durante la terapia Vs. 39/150 (26%) del grupo

negativo, para estos autores el pronóstico de los niños Philadelphia positivo es pobre con una DFS a 2 años del 8% vs. 50% para los Philadelphia negativos, la inducción de una segunda remisión fue del 60% para el primer grupo vs. 91% del segundo grupo.

En el estudio realizado por el INC sobre 203 casos de LLA la t(9;22) se encontró en un 5 % y 21% en niños y adultos respectivamente constituyendo los grupos de más alto riesgo de mortalidad (33).En esta investigación se observaron 3 casos con t(9:22) evaluados por RT-PCR, dos adultos y un niño; dos con p190 y uno con p210. Dos cursaron con recuento elevado de leucocitos , 2 con morfología L2 , 2 con morfología LLAc y un Pre pre-B CALLA-, todos expresaron antígenos mieloides (mayor del 30%), un paciente falleció, uno permanece vivo y otro de t(9;22) para adultos se encuentra en recaída (Ver tabla 5,6) . Los porcentajes encontrados en este grupo se encuentran muy por debajo de lo reportado en la literatura (20-30%) y del registro del Laboratorio de Genética del INC (21%), posiblemente por el sesgo de la muestra analizada.Este trabajo demuestra que la sensibilidad de las técnicas moleculares para detectar translocaciones específicas es mayor que la citogenética convencional, caso especial es la t(12;21) que no se puede detectar mediante técnicas de bandeo tradicional.Para este grupo de pacientes (92 casos) con LLA está por debajo del registro histórico de frecuencia de alteraciones cromosómicas, excepto en las hiperdiploidías en niños(Ver tabla 5), está muy por debajo de la encontrada en un grupo mayor del mismo laboratorio, la frecuencia encontrada por métodos moleculares es semejante a las reportadas, excepto para la t(12;21) en niños y t(9;22) en adultos(Ver figura 17)La frecuencia de la t(12;21) deja abierto 2 interrogantes:

1. Si la frecuencia de esa anomalía en nuestra población es baja y por consiguiente una mayor proporción de pacientes con pronósticos desfavorables.

2. Si este porcentaje corresponde a un sesgo en la muestra.

Consideramos necesario evaluar un numero mayor de pacientes para encontrar la real frecuencia de esta translocación en la población colombiana. En general si se combinan los estudios cromosómicos con los moleculares el 51% de los niños con LLA mostraron

alteraciones genéticas. (Ver figura16)

11.2 Leucemia mieloide agudaUn total de 25 casos se analizaron en esta investigación de los cuales 10 pertenecieron a niños y 15 a adultos persistiendo la tendencia de mayor frecuencia en adultos Vs niños. Aunque no se incluyeron todos los subtipos morfológicos para los análisis moleculares llama la atención el predominio de la M3 en adultos (53%) e incluso en niños (20%) respecto a lo reportado en la literatura (7-10%) esta misma frecuencia se observó en el trabajo realizado en el INC sobre 179 casos, dónde este subtipo inmunológico se diagnosticó en un 40%. Históricamente la LMA ha sido de más difícil manejo terapéutico que la LLA tanto en niños como en adultos, con sobrevidas a 5 años que no superan el 40%, sin embargo hay que reconocer que en este tipo de leucemia se han logrado avances importantes como la introducción del ácido trans-retinoico, tratamiento con trióxido de arsénico (Ar2O3) y transplante de médula ósea (16,59,65,93).Las LMAs presentan una mayor heterogeneidad morfológica que las LLAs permitiendo la subclasificación de M0 - M7, algunas de las cuales se han relacionado con aberraciones genéticas especificas como la t(8;21) con la M2 y en menor frecuencia con M4; t(15;17) con M3; inversión del 16 con M4Eo con exceso de eosinófilos; t(9;11) y t(10;11) con M5; otras como 5q-, 7q-, -5, -7 en LMAs secundarias a exposición a radiaciones o agentes alquilantes y las translocaciones t(9;11), t(4;11), t(3;21) asociadas con inhibidores de topoisomerasa.La LMA M2 es la morfología que con más frecuencia se diagnostica a nivel mundial (27-40%), en este trabajo se observó en un 50% en niños mientras en adultos predominó la LMA M3 (53%). A pesar de la gran heterogeneidad celular, la quimioterapia convencional de ARA-c con Daunorubicina, se utiliza ampliamente en el tratamiento de todos los subtipos de LMAs. La subclasificación inmunológica en LMA no tiene tanto impacto como en LLA pero pueden ayudar en el diagnóstico final, así las mieloblasticas (M1-M2) expresan más intensamente CD34 y HLA DR; las mielomonociticas (M5-M4) son positivas para CD14; la M6 para glicoforina A y estectrina, la M7 para CD41 y CD61, desafortunadamente estos marcadores no tienen un valor pronóstico reconocido. En los últimos años se ha logrado un gran avance en la descripción de los eventos genéticos moleculares que dan origen a estas neoplasias,

información que se ha utilizado de manera eficiente principalmente como ayuda diagnóstica y más recientemente en el seguimiento de los pacientes durante la quimioterapia en la detección de EMR (enfermedad mínima residual).Considerando que en un futuro cercano este conocimiento repercutirá directamente en el manejo de la enfermedad, tal y como esta ocurriendo con los inhibidores específicos del BCR-ABL (STI571) en fase I de experimentación clínica con aparente buenos resultados, se espera que más inhibidores específicos para cada translocación aparezcan pronto y así la quimioterapia de las LMAs estará acorde con el daño molecular de base.

11.2.1 Alteraciones genéticas•t(15;17)Esta translocación se ha descrito exclusivamente en LMA M3 tanto en la variante microgranular como granular el 10% muestran translocaciones variantes como t(11;17) y t(5;17) resistentes al tratamiento con ácido retinóico (ARA-c) y todavía existe un subgrupo de LMA M3 donde no se puede diagnosticar ninguna de estas translocaciones(47,48).Mendelli y col (60) analizaron 253 pacientes con LMA promielocítica con t(15;17) por citogenética o RT-PCR a quien se les hizo un tratamiento de inducción con ATRA 45 mg/m2 diario junto con Idaurubicina 12 mg/m2 diarios, 240 pacientes fueron posteriormente evaluables, 11(5%) murieron por complicaciones tempranas y 229 (95%) alcanzaron remisión hematológica, no se observó ningún caso de recaída. De 139 casos estudiados por RT-PCR después de la inducción 84 (60%) fueron negativos y 55 (39.5%) positivos. Después de la consolidación 162 pacientes fueron evaluables por RT-PCR, 159 (98%) fueron PCR negativo y 3(2%) fueron PCR positivos, después de 12 meses de seguimiento medio (rango entre 0-33) la sobrevida libre de evento fue del 83% y a 2 años del 79%. Este trabajo indica que la mayoría de pacientes con este tratamiento alcanzan remisión molecular completa. Los diferentes estudios de seguimiento durante el tratamiento mediante la técnica de RT-PCR investigando enfermedad mínima residual (ERM) concluyen de manera general que después de la consolidación PML-RAR α positivo es un fuerte predictor de la subsiguiente recaída hematológica mientras un resultado negativo es asociado con un larga sobrevida(7,17,49).

La distribución morfológica de LMAs reportadas en este grupo de pacientes tiene algunas diferencias a las reportadas en otras latitudes, la más importante es la frecuencia de la LMA -M3 en adultos que fue del 53% diferente a lo reportado entre un 5-10%. Recientes trabajos demuestran que la LMA M3 es más frecuente en latinos que en no-latinos: 24% Vs. 15% respectivamente. De los 25 pacientes con diagnóstico de LMA 10 (40%) presentaron morfología M3, solo 3 de ellos (30%) tuvieron diagnóstico citogenético de t(15;17) mientras 6(60%) fueron positivos mediante la técnica molecular, lo cual demuestra la mayor sensibilidad del método molecular sobre la citogenética.(Ver tabla 3,4) Sin embargo no es raro encontrar alteraciones cromosómicas adicionales cuyo significado en el curso de la enfermedad y respuesta al tratamiento es necesario investigar, luego el uso de ambos métodos es necesario para el diagnostico inicial de estos pacientes. Dos niños con t(15;17) permanecen vivos con 10 y 11 meses; de los 8 adultos 6 han fallecido y 2 permanecen vivos a los 9.4 y 9.0 meses de seguimiento )Ver tabla 7,8). Es importante resaltar que el 40%, a pesar del diagnóstico morfológico de M3 no se logró comprobar la presencia de t(15:17) o t(11;17) lo cual nos lleva a discutir si se trata de variantes de M3 o si el diagnóstico morfológico no corresponde a este subtipo leucémico.En consecuencia será de gran importancia para nuestros pacientes asegurar el diagnóstico de la t(15;17) debido a la respuesta favorable al ácido trans-retinóico junto con el ARA-c (Daunorubicina). Desafortunadamente la sobrevida en este grupo fue pésima seguramente debido a la falta de inclusión del ácido trans-retinóico en el tratamiento.

•t(8;21)Como se comentó anteriormente la t(8;21) es un marcador genético presente principalmente en LMA M2 y en algunos casos en LMA M4, se ha considerado que esta aberración es de buen pronóstico porque la mayoría de pacientes (90%) alcanzan remisiones completas durante la inducción(Chang, k., Fan, Y., Stass, S., Estey, E., Wang, G, Trujillo y col.(9)). pero la sobrevida a largo plazo no se diferencia de otros subgrupos de LMA.Las técnicas de RT-PCR en esta translocación se han utilizado en el seguimiento de EMR, Tobal.K., Newton, M. Y Col. utilizaron RT-PCR cuantitativa encontrando disminución de 2-3 log del transcrito AML1-MTG8 después de la quimioterapia de inducción y adicional

disminución de 2-3 log después de la consolidación e intensificación, los bajos niveles de expresión se asociaron con remisiones más prolongadas y niveles altos a recaídas dentro de los 3-6 meses siguientes. Otros autores han observado presencia del transcrito después de 5 años de remisión completa lo cual ha cuestionado el valor pronóstico de la presencia de células con la translocación durante esta fase clínica.Un total de seis casos (24%) con t(8;21) se detectaron en la población analizada con LMA mediante RT-PCR , en niños 40% y en adultos 13% lo cual coincide con los estudios anteriores donde se observó el predominio de esta alteración en la población pediátrica (Ver figura 23). En este mismo grupo, las técnicas citogenéticas solo detectaron un 14% en niños y 10 % en adultos confirmándose nuevamente la mayor sensibilidad de los métodos moleculares.Cinco casos (60%) (Ver figura 23) correspondieron con la morfología M2 y uno a M4, no se observaron coexpresiones de marcadores linfoides reportado en algunos casos de M2 con t(8;21), cinco pacientes permanecen vivos, la mayor sobrevida de quince meses, uno falleció antes del mes (Ver tabla 7,8).

•Inversión del 16Es una alteración muy difícil de diagnosticar por técnicas citogenéticas, se asocia con morfología M4 con exceso de eosinófilos, con el advenimiento de las técnicas moleculares dicho diagnóstico se puede hacer de una manera más segura alcanzándose una frecuencia del 10%. En este grupo se detectó un solo paciente adulto que mostraba un recuento elevado de leucocitos y morfología M4 eosinofilica (Ver tabla 8). En nuestro país y en el mundo no existen estadísticas claras sobre el impacto pronóstico de esta translocación, por este motivo se necesitan análisis y seguimiento de un mayor número de casos.

Hoy día se siguen implementado las técnicas diagnósticas que permitan observar un mayor numero de alteraciones en una misma muestra con gran exactitud, este es el caso de microarrays, que nos proporciona gran cantidad de datos a partir de un único análisis. En un tiempo futuro se espera contar este tipo de técnicas que nos permitan detectar el mayor número de alteraciones y brindarle así un mejor manejo a cada patología.

CONCLUSIONES Y PROPUESTA

Hoy en día no se concibe el manejo terapéutico de las leucemias agudas sin un diagnóstico inmunológico y la investigación de aberraciones genéticas asociadas, dos elementos indispensables para la asignación del riesgo. La mayoría de estudios están de acuerdo en asignar 2 grupos de buen pronóstico en niños con LLA: las hiperdiploidías y la t(12;21) y de muy mal pronóstico la t(9;22) y t(4;11), un grupo intermedio puede estar conformado por los cariotipos normales y la t(1;19), otras alteraciones, por su baja frecuencia, no se ha logrado definir su impacto sobre el riesgo. En adultos con LLA el panorama es más complicado por el alto riesgo de esta neoplasia pero se propone que paciente con t(9;22) deben recibir TMO, las hiperdiploidías aunque no son tan frecuentes en este grupo de edad siguen siendo de pronóstico más favorable.Con la implementación de la técnica RT-PCR adicional a la técnica citogenética nos permite lograr una mayor certeza de la presencia de estas translocaciones. Un aspecto importante es el estudio de EMR durante el tratamiento, conscientes de que un gran número de pacientes recaen y mueren por este motivo, la detección y cuantificación de EMR pueden ser un punto de gran trascendencia clínica.Consideramos los análisis citogenéticos realizados en el Laboratorio de Genética del INC más los resultados de este trabajo consideramos que tenemos una aproximación adecuada a las frecuencias de las translocaciones en la población colombiana con leucemia aguda, aunque estos porcentajes podrían aumentar un poco considerando la mayor sensibilidad de la RT-PCR. Queda por definirla frecuencia de la t(12;21) alteración que no se había logrado diagnosticar anteriormente por métodos cromosómicos. Caso particular es la LMA con morfología promielocítica dónde no se logra demostrar la t(15;17) o las translocaciones variantes, este hecho implicaría una revisión del diagnóstico por parte de los hematopatólogos y a los genetistas a profundizar el diagnóstico molecular de estas leucemias.En cuanto a la LLA aunque tradicionalmente algunos subgrupos inmunológicos se han relacionado con una anomalía cromosómica específica, no siempre es el caso, por ejemplo la t(9;22) se puede

presentar en diversos subtipos inmunológicos, como se demostró en este estudio, anulando el valor pronóstico del marcador inmunológico (Ej: LLA CALLA +, Ph+). La t(12;21) se encontró asociada con fenotipos pre-B enfrentando factores de buen y mal pronóstico respectivamente, únicamente los estudios multivariados podrían ayudar o solucionar esta disyuntiva; otra translocación como la t(1;19) se encontró asociada con fenotipo de riesgo favorable: LLA-c.

Adicionalmente el mejoramiento de las técnicas de RT-PCR que incrementa su sensibilidad al utilizar primers internos (RT-PCR nested), la hacen de gran valor en la detección de EMR durante el tratamiento, aunque los estudios de seguimiento clínico con pacientes PCR positivos o PCR negativos están en desarrollo para definir el valor predictivo, consideramos que de acuerdo con la de esta enfermedad y que gran parte de los pacientes fallecen debido a recaída, estos hallazgos deben tener un gran valor en el manejo de la enfermedad.En nuestro medio será necesario aumentar el número de pacientes analizados para ajustar las frecuencias observadas en un trabajo que combine los estudios citogenéticos y moleculares, queda por definir con más precisión la frecuencia de la t(12;21) e Inv.16; este trabajo también aporta desde el punto de vista técnico una herramienta para los hemato-oncólogos que les ayudará a definir el manejo terapéutico de los pacientes.Casos particulares como LMA M3 requiere de una mayor investigación y los análisis genéticos pueden colaborar en esta dirección, los pocos estudios en nuestro medio sobre la frecuencia de esta morfología indican que la M3 es tan frecuente o más común que la M2, comportamiento diferente a lo reportado a nivel mundial, cabe preguntarse si ese 40% que no poseen la translocación comprende variantes o una dificultad diagnóstica, estos porcentajes deben alertar a los hematopatólogos a reconsiderar los diagnósticos en ausencia de la t(15;17) o sus variantes y a los investigadores a profundizar más en la biología de las leucemias.Aunque en las LMAs existe una buena correspondencia entre la morfología y la alteración genética , en los casos de LLAs no siempre se observa una correlación entre la subclasificación inmunológica y la alteración genética.Aunque tradicionalmente algunos subgrupos como Pre-B se han asociado con t(1;19), LLA CALLA+ con t(12;21), hiperdiploidías con

LLA CALLA+, no siempre es el caso, la t(9;22) se puede encontrar prácticamente en cualquier subtipo inmunológico y como se demostró en nuestro estudio no siempre una alteración genética de buen pronóstico, como por ejemplo la t(12;21), se asocia de igual forma a un subgrupo inmunológico de buen pronóstico, en nuestro estudio la t(12;21) se diagnosticó con subtipos Pre-B y Pre pre-B CALLA -, fenotipos asociados a pronóstico menos favorable. Otro ejemplo es la t(1;19) que no se considera de buen pronóstico, observó en casos LLA CALLA+, inmunofenotipo considerado de buen pronóstico.Finalmente con la experiencia recogida en nuestro medio y considerando la literatura disponible queremos proponer algunas pautas para el manejo y solicitud de los estudio moleculares en LLA y LMA:

•t(9;22): en todos los casos de LLA en adultos por su alta frecuencia observada(30%), de igual forma en los casos donde existe LLAs con coexpresión de marcadores mieloides.•t(1;19): en casos se leucemias con fenotipo Pre-B.•t(4;11): en los casos de leucemias en infantes.•t(12;21): en los casos de leucemias en niños que no presenten ninguna alteración citogenética observable o en pacientes con cariotipos negativos.•t(15;17): en los casos de LMA M3.•t(8;21): en los caso LMA M2 y M4.•Inv.16: en los casos de LMA M4 Eo.

Dichos análisis se deberán realizar al momento del diagnóstico y en caso de ser positiva durante el tratamiento para identificar EMR.

PERSPECTIVAS

1. Aumentar el número de casos nuevos de leucemia aguda analizados mediante RT-PCR.

2. Implementar técnicas de RT- PCR cuantitativa para investigar carga tumoral durante el tratamiento.

3. Correlacionar los resultados obtenidos por RT-PCR con la citogenética, inmunología y morfología.

4. Realizar estudios de seguimiento y sobrevida de los pacientes con las diferentes alteraciones.

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RNA

FIGURA 24

EVALUACIÓN DNAc

FIGURA 25

t(12;21)

FIGURA 26

t(9;22) p210

FIGURA 27

t(9;22) p190

FIGURA 28

t(1;19)

FIGURA 29

t(4;11)

FIGURA 30

Inv.(16)

FIGURA 31

t(8;21)

FIGURA 32

t(15;17)

FIGURA 33

1a 2 3 4 5 6 7 8

breakpoint region15Kb

1 2 3 4 5 6 7a 7b 8

breakpoint region150 Kb

t(12;21)

TEL (12p13)

AML1 (21q22)

FIGURA 2

58

4 5 2 3 4 5 6

4 5 3 4 5 6

A

C

E5’

B

D

t(12;21)

TEL AML1

FIGURA 2

t(1;19)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15b 15a 16

BREAK POINT REGION

3.5Kb

E2A (19p13)

PBX1 (1q23)1 2 3 4 5 6 7 8

BREAK POINT REGION

50Kb

FIGURA 3

27

A B

C D

E3’

13 2

13 2

1518 388

t(1;19)

FIGURA 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11-15 16 17 18 19 20 21 22 23 e1

1b 1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 a2 a3

t(9;22)BCR (22q11)

ABL (9q34)

M-bcr2.9 Kb

m-bcr55 Kb

BREAK POINT REGION

200 Kb FIGURA 3

t(9;22)

1 32 4 > 95 %

BCR

1 3 4 Raro

A

C D

E3’

B

ABL

FIGURA 4

11 12 13 14 2 3 4 b3a2 55%

t(9;22)

BCR ABL

11 12 13 2 3 4 b2a2 40%

A BC D

E3’

FIGURA3

1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 - 16 17 18-21 22 - 27 28 29 - 31 32 33 - 36 37

BREAK POINT REGION

40 Kb

MLL (11q23)

BREAK POINT REGION

6.5 Kb

1a 1b 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 - 15 16 - 19 20

AF4 (4q21)

t(4;11)

FIGURA 5

t(4;11)

6

108 9 11 4 5 6 7 8 9

8 6 7 8 9

8 4 5 6 7 8 9

98 4 5 7 8 9

108 9 6 7 8 9

108 9 4 5 6 7 8 9

108 9 11 6 7 8 9

108 9 11 5 6 7 8 9

58 9 6 7 8 9

108 9 5 6 7 8 9

A B

C D

E5’

55% <5%

<10 % Raro

Raro <5 %

<10 % 16 %

Raro 25 %

Raro <5 %

<10 % <5 %

18% 39 %

Raro <5 %

Raro <10 %

MLL AF4

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6

t(15;17)

PML (15q22)

RARA (17q21)

bcr31.5kb

bcr20.3Kb

bcr12 Kb

breakpoint region15 Kb

FIGURA 6

3

3

3

4

4

5

5

6

6

3

3

3

bcr155%

bcr2 5%

bcr3 40%

A2 A1 B

C2 C1 D

E3’

PML RARA

FIGURA 6

t(8;21)AML1 (21q22)

1 2 3 4 5 6 7a 7b 8

BREAK POINT REGION

25 KbETO (8q22)

1b 1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

BREAK POINT REGION

15 KbFIGURA 7

t(8;21)

1 2 3 4 5 2 3 4 5

A B

DC

E5’

AML1 ETO

FIGURA 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 - 16 17 18 19 20 21

breakpoint region7.5Kb

4 5 12 13 14

4 5 11 12 13 14

4 5 8 9 10 11 12 13 14

A B1 B2

C D1 D2

E5’

88%

Inv. 16

FIGURA 8

4 7 8 9 10 11 12 13 14

4 13 14

4 5 9 10 11 12 13 14

4 5 7 8 9 10 11 12 13 14

4 12 13 14

4 8 9 10 11 12 13 14

A B1 B2

C D1 D2

E5’

5%

5%

Inv. 16

FIGURA 8

LEUCEMIAS AGUDAS NIÑOS vs. ADULTOS

NIÑOS

ADULTOS

LLA

92 CASOS

40%60%

LMA

25 CASOS

DISTRIBUCION POR SEXO EN LLA

48%

52%

NIÑOS

63 CASOS

45%

55%

ADULTOS

29 CASOS

FEMENINO

MASCULINO

68%32%

FIGURA 9

FIGURA 10

SEGIMIENTO EN LLA

56%

3% 41%42%

37%

21%NIÑOS ADULTOS

63 CASOS 29 CASOS

ABANDONOSVIVOS MUERTOS

FAB EN LLANIÑOS ADULTOS

53 CASOS 27 CASOS

38%

3%6%

2%

51%

26%

67%

7%

L1L2L3LEUCEMIA/LINFOMAMIXTA

FIGURA 12

FIGURA 11

INMUNOFENOTIPO EN LLA

NIÑOS ADULTOS

59 CASOS 21 CASOS

40%

28%

13%

3%

10% 6%

38%

17%

28%

7%7%

3%

LLAc CALLA+Pre pre-B CALLA-Pre-BB MaduraTNo clasificable

ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LLA

17%

63%6%3%

8%

3%

88%

6%

6%

NIÑOS ADULTOS

35 casos 16 casos

Normalt(4;11)t(1;19)t(8;14)t(9;22)OtrasHiperdiploidias

Normalt(4;11)t(1;19)t(8;14)t(9;22)OtrasHiperdiploidias

FIGURA 14

FIGURA 13

ALTERACIONES MOLECULARES EN LLA

ADULTOS

29 CASOS

NIÑOS

63 CASOS

NTt(4;11)t(1;19)t(9;22)t(12;21)

80%

3%5%

10%

2%83%

3%

7%

7%

FIGURA 15

NTt(12;21)Otrast(8;14)t(9;22)t(4;11)t(1;19)Hiperdiploidías

TOTAL DEALTERACIONES LLA EN NIÑOS (Citogenética y Molecular)

3%

49%

2%6%8% 5%

17%10%

FIGURA 16

0

1

2

3

4

5

6

RT-PCRCITOGENÉTICA

t(12;21) t(4;11) t(1;19) t(9;22)

COMPARACION CASOS EN LLA RT-PCR Vs. CITOGENÉTICA(VALORES ABSOLUTOS)

0

1

2

3

4

5

6

RT-PCRCITOGENÉTICA

t(15;17) t(8;21) Inv. (16)

COMPARACION CASOS EN LMA RT-PCR Vs. CITOGENÉTICA(VALORES ABSOLUTOS)

FIGURA 3 4

70%30%

67%

33%

DISTRIBUCION POR SEXO EN LMA

MASCULINO

FEMENINO

NIÑOS ADULTOS

10 CASOS 15 CASOSS

50%50%33%

67%MUERTOS

VIVOS

NIÑOS ADULTOS

10 CASOS 15 CASOSS

SOBREVIDA EN LMA

FIGURA 18

FIGURA 17

FAB EN LMA

20%

20%

10%

50%

NIÑOS

10 CASOS

20% 7%20%

53%

ADULTOS

15 CASOSS

M1M2M3M4

57%29%

14%10%

10%

80%

ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LMA

NIÑOS ADULTOS

7 CASOS 10 CASOS

NORMALt(15;17)t(8;21)

FIGURA 20

FIGURA 19

40%

20%

40%

27%

53%

7%

13%

NIÑOS ADULTOS

10 CASOS 15 CASOS

ALTERACIONES MOLECULARES EN LMA

TRANSLOCACIONES t(8;21) Y t(15;17) EN M3 Y M2

N.Tt(15;17)t(8;21)INV.16

60%

40%

M3 - t(15;17) M2 - t(8;21)

10 CASOS

62%

38%

8 CASOS

NORMALt(15;17)t(8;21)

FIGURA 22

FIGURA 21

TABLA. 3 LMA EN NIÑOSN° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX.MOL. INM COEX SBV1 14 M M2 17700 - t(8;21) DR 91.5, 12+2 12 F M1 194000 - - DR 55.2, CD33 53.87, CD13 68.2, 1,53 9M M M4 120000 NO t(8;21) CD13 79.8, CD33 46.8, CD2 33.6, CD3 28.6 0,94 14 F M2 22400 - - CD33 83.7, CD13 39.2, DR58 0,45 3 M M2 43900 NO t(8;21) CD13 27, CD33 12.8, CD14 16 CD2 25. 6,6+6 6 M M2 40400 t(8;21) t(8;21) 15+7 5 M M2 8400 NO - SIN 12,88 10 M M1 260000 NO - SIN 0,29 8 F M3 3400 t(15;17) t(15;17) CD33 70, CD13 70, CD45 76 11,2+10 13 M M3 1000 t(15;17) t(15;17) 10,1+

TABLA. 4 LMA EN ADULTOSN° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX. MOL. INM COEX SBV

1 39 M 2 9700 NO t(8;21) CD13 30, CD14 20, CD33 28 3.5+2 21 M 2 237000 - - CD34 40, DR 70 3,33 29 F 3 50000 - t(15;17) CD13 40, DR 5, MPO+, CAE+ 0,14 18 F 3 12100 NO t(15;17) CD13 78, CD33 86.7, 0,45 17 M 2 7500 t(8;21) t(8;21) DR81, CD13 34.8, 20+6 22 F 3 9600 NO t(15;17) CD13 68, CD33 70.2, CD19 34.3 0,27 48 M 4 15800 - - SIN REPORTE -INADECUADA 2,18 87 M 3 227000 NO - CD13 15, DR 90, 0,069 44 M 1 13500 NO - CD13 15, CD33 15 CD10 20, CD2 30, CD3 70 1,2

10 30 M 3 98100 NO - CD13 87.4, CD33 86.2, CD15 29 9.4+11 29 M 4 2400 - - CD13 38, DR 56, CD33 45, CD15 22 CD3 22 4,312 24 M 3 3600 NO - 9+13 32 M 3 471046,XY t(15;17) t(15;17) 0,0614 25 F 4 70400 NO INV(16) CD34 77, CD15 48, CD14 18 5+15 32 F 3 7000 - - SIN 77,3

CD13 35, CD33 20, TdT 29

Cy MPO 91, CD33 97, CD1398

Cy MPO 68, CD13 78, CD33 87, CD15 74Cy MPO 66, CD33 96, CD13 21, DR21

Cy MPO 49, CD33 97, DR 98, CD13 97,

TABLA. 7 ALTERACIONES MOLECULARES LMA EN NIÑOS N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX.MOL. INM COEX SBV1 14 M M2 17700 - t(8;21) DR 91.5, 12+3 9Me M M4 120000 NO t(8;21) CD13 79.8, CD33 46.8, CD2 33.6 y CD3 28.6 0,95 3 M M2 43900 NO t(8;21) CD13 27 CD2 25. 6,6+6 6 M M2 40400 t(8;21) t(8;21) 15+

N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX.MOL. INM COEX SBV9 8 F M3 3400 t(15;17) t(15;17) CD33 70, CD13 70, CD45 76 11,2+10 13 M M3 1000 t(15;17) t(15;17) 10,1+

TABLA. 8 ALTERACIONES MOLECULARES LMA EN ADULTOS

N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX. MOL. INM COEX SBV3 29 F 3 50000 - t(15;17) CD13 40 0,14 18 F 3 12100 NO t(15;17) CD13 78, CD33 86.7, 0,46 22 F 3 9600 NO t(15;17) CD13 68, CD33 70.2, CD19 34.3 0,2

13 32 M 3 4710 46,XY t(15;17) t(15;17) 0,06

N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX. MOL. INM COEX SBV1 39 M 2 9700 NO t(8;21) CD13 30, CD14 20, CD33 28 3.5+5 17 M 2 7500 t(8;21) t(8;21) DR81, CD13 34.8, 20+

N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX. MOL. INM COEX SBV14 25 F 4 70400 NO INV(16) CD34 77, CD15 48 5+

CD13 35, CD33 20, TdT 29

Cy MPO 91, CD33 97, CD13 98

Cy MPO 66, CD33 96, CD13 21, DR21

Cy MPO 49, CD33 97, DR 98, CD13 97

TABLA. 1 LLA EN NIÑOSN° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX. MOL INM COEX SBV1 13 M (L2) 167000 - - CD3 88 18.56+ 2 3 F (L1) 57000 NOR - 1,23 4 F (L1) 1200 NOR - LLA T 0,264 10 M (L2) 4100 H - CD13: 40; CD33: 52 0,25 19MESES M (L2) 14500 H - A6 12 M (L2) 2380 NOR - A7 5 F LLA/LIN 9210 NOR - 14.53+8 6 M (L1) 106000 NOR t(1;19) 14.6+9 6 F (L1) 6310 - - Pre pre B CD13: 35 A10 4MESES F (L1) 7400 - - Pre pre B 14.2+11 12 M (L2) 9000 - - LLA T CD13:25 12.9+12 6 M (L2) 10800 H - Pre pre B 12.7+13 3 F (L1) 10300 - - LLA T 11,3614 2 F (L1) 6200 NOR - Pre pre B 12.46+15 7 F (L2) 81200 NOR - Pre B NO RTA16 22MESES M (L1) 2900 NOR - 11.8+17 6 M (L2) 6500 NOR - Pre pre B A18 3 F (L1) 22000 t(1;19) t(1;19) Pre B 13,3619 8 M (L2) 5000 - - 9,420 7MESES M (L1) 17700 NOR - Pre B CD13 :70 A21 8 F (L2) 4900 - - 7.8+22 14 F LLA/LIN 17100 t(8;14) - B MADURA 3,7623 4MESES F (L2) 430000 - t(4;11) Pre B 7.6+24 4 M (L2) 2700 - - Pre pre B CD34:31, 6,725 3 M (L2) 3680 NO t(12;21) Pre-B 6,426 8 M (L2) 34000 NO t(12;21) Pre pre B 7.46+27 2 F (L1) 500000 NO - LLA T A28 11 M LLA/LIN 56800046 XY , 14q+, 8/14 - B MADURA 0,1329 10 F (L2) 12100 - - LLAc CD13: 89.0%, CD33: 6.9% 1.83+30 4 F (L1) 7900 NO t(12;21) Pre-B 7.1+31 3 F (L1) 304000 - - Pre pre B 1,0632 5MESES M (L1) 176000 - - Pre pre B CD15/CD19 : 55.0% 0,3633 13 F (L1) 1000 - - Pre pre B NO 6.73+

LLAcLLAc

LLAcLLAcLLAcLLAcLLAc

LLAc

LLAc

LLAc

TABLA. 1 LLA EN NIÑOSN° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX. MOL INM COEX SBV34 6 M (L2) 3700 H - LLAc 7.2+35 5 F (L1) 1300 H - Pre B CD13: 56.0 6+36 11 M (L1) 130000 - t(9;22)p190 LLAc CD13:94Y CD33:90.0 5,2337 3 F (L2) 10000 NOR t(12;21) Pre pre B A38 5 M (L1) 73100 NOR - LLAc 3,2339 11 F (L1) 327000 - - LLA T 9,2340 12 F (L1) 14600 - - LLAc A41 9 M (L1) 2800 - - LLA T 17.63+42 3 F (L1) 5500 - - LLAc 2,4643 13 F (L2) 1320046 XX , ISO 11q - LLAc 11,5344 15 M (L2) 20100 - - Pre pre B 2.13+45 9MESES M (L1) 196000 - - Pre pre B 15.9+46 6 M LLA/LIN 8310 H - LLAc A47 7 M (L2) 80300 - - LLAc CD13:25.3% A48 6 F (L2) 3290 - t(12;21) LLAc 20.4+49 4 M (L1) 535000 t(4;11) t(4;11) Pre B A50 9MESES M LLA/LIN 21000 - - Pre pre B 551 6 F (L2) 3500 46XX , 9p(-) - Pre pre B CD13: 43 8.2+52 8 M (L1) 134000 - - LLAc 7.56+53 5 M (L1) 49500 NOR - LLAc 5.46+54 10 F (L2) 900 46XX , 9p(+) t(12;21) Pre pre B 0,4655 2 M (L1) 16900 NOR - 5.5+56 8 M (L1) 456000 NOR - Pre pre B CD13: 89 4.63+57 3 M (L2) 700 - - A58 12 F (L1) 15800 NOR - Pre pre B A59 3 F (L1) 4100 - t(1;19) 3.16+60 12 M R 43000 - - R 35.4+61 10 F R 2600 NOR - R 3262 10 M R 13700 NOR - R 28,1

LLAc

LLAc

LLAc

63 5 F R MUY BAJO - - R CD13:56 12

WBC: Recuento de leucocitosA: Abandono

DX. MOL:Diagnóstico molecularNO TRA: No respuesta l

TABLA. 2 LLA EN ADULTOSN° EDAD SEXO FAB z DX. CIT DX.MOL. INM COEX SBV1 18 F L2 78500 - - 13,5+2 39 F L1 166000 - - T 213 42 F L1 128000 - - SIN 24 18 M L2 21300 NO - SIN 9,55 22 M L2 48200 - - 7,66 16 M L2 175000 - - NO CLA 10,37 16 F L2 18900 - - 38 68 M SIN SIN - - 0,6+9 16 F L1 900 - - 0,7+10 16 M L2 67500 - t(9;22)p190 PRE PRE B CD33 43, 10,3+11 44 F L1 6200 - - 5,612 19 M L1 2600 - - NO CLA 10,4+13 35 M L2 51600 NO - PRE PRE B 1,714 16 F L2 6000 NO - PRE PRE B CD13 20 1415 32 M L2 4600 NO - LLA PRE B CD13 29 CD33 77 11,316 16 M L2 79700 - - 4,3+17 34 M L3 5310 - - B MADURA 0,8+18 19 M L2 1900 NO - PRE PRE B CD13 37, CD33 23 9,5+19 30 M L2 46600 NO - CD33 71 12+20 35 F L2 2400 NO t(4;11) PRE PRE B 1,721 34 F L3 4800 t(8;14) - B MADURA CD13 18 0,5

SIN: Sin disgnósticoINM: InmunofenotipoCOEX: Coexpresión SBV: SobrevidaR: Recaida DX.CIT; Diagnóstico citogenético

LLA/LIN: Leucemia / LinfomaNOR: Cariotipo normal-':Cariotipo negativo NO CLA: No clasificable

LLAc

LLAc

LLAcLLAcLLAc

LLAc

LLAc

LLAc

22 32 F L2 4100 NO t(4;11) LLA PRE B CD13 46 A23 57 F L2 166000 NO - CD13 46 1,124 19 F L1 2000 NO t(1;19) CD13 24 7,8+25 16 F L2 8300 NO - 0,226 17 F R 108000 NO - R 15,227 26 F R 2600 t(9;22) t(9;22)p210 R CD13 50.4 6,8+28 20 M R 15600 NO - R 127,429 30 F R SIN NO - R 0,6+

TABLA. 5 ALTERACIONES MOLECULARES LLA EN NIÑOS

t(12;21)N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX. MOL INM COEX SBV25 3 M (L2) 3680 NOR t(12;21) Pre-B NO 6,426 8 M (L2) 34000 NOR t(12;21) Pre pre B NO 7.46+30 4 F (L1) 7900 NOR t(12;21) Pre-B SI 7.1+37 3 F (L2) 10000 NOR t(12;21) Pre pre B SI A48 6 F (L2) 3290 - t(12;21) NO 20.4+54 10 F (L2) 900 46XX , 9p(+) t(12;21) Pre pre B NO 0,46

t(1;19)N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX. MOL INM COEX SBV8 6 M (L1) 106000 NOR t(1;19) NO 14.6+18 3 F (L1) 22000 t(1;19) t(1;19) Pre B NO 13,3659 3 F (L1) 4100 - t(1;19) NO 3.16+

LLAcLLAcLLAc

LLAc

LLAc

LLAc

t(4;11)N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX. MOL INM COEX SBV23 4MESES F (L2) 430000 - t(4;11) Pre B N0 7.6+49 4 M (L1) 535000 t(4;11) t(4;11) Pre B NO A

t(9;22)N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX. MOL INM COEX SBV36 11 M (L1) 130000 - t(9;22)p190 LLAc CD13:94.0% Y CD33:90.0% 5,23

TABLA. 6 ALTERACIONES MOLECULARES LLA EN ADULTOS

t(4;11)N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX.MOL. INM COEX SBV20 35 F L2 2400 NO t(4;11) PRE PRE B 1,722 32 F L2 4100 NO t(4;11) LLA PRE B CD13 46 A

t(1;19)N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX.MOL. INM COEX SBV24 19 F L1 2000 NO t(1;19) LLAc CD13 24 7,8+

t(9;22) p190N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX.MOL. INM COEX SBV10 16 M L2 67500 - t(9;22)p190 PRE PRE B CD33 43, 10,3+

t(9;22)p210N° EDAD SEXO FAB WBC DX. CIT DX.MOL. INM COEX SBV27 26 F R 2600 t(9;22) t(9;22)p210 R CD13 50.4 6,8+

SEGUIMENTO

VIVOS EN RC 48%ABANDONOS 21%MUERTOS 31%

SE REALIZA SIN REACAIDAS ALTERACIONES MOLECULARES EN LLA EN 59 CASOS NUEVOS

detecciÓn molecular de las translocaciones

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