Detección de patógenos en alimentos, utilizando la técnica de PCR, reacción en

cadena de la polimerasa.

Lic. Esp. Mariano Diego Massari

1er Congreso Bioquímico – Córdoba 20118ª Jornada de Actualización en Especialidades Bioquímicas

2ª Jornada: “El Rol del Bioquímico y la Formación de los Futuros Profesionales””

Tendencia en la utilización de la Biología Molecular como herramienta para el

diagnóstico.

• Desarrollo de metodos más rápidos y efectivos , altamente especificos .

• Los metodos convencionales son laboriosos y llevan demasiado tiempo.

• El éxito de la implementación de la PCR para la identificación de microorganismos patógenos es la elección correcta de secuencias blanco .

Fundamento del PCR

• La PCR es una metodología que consiste en laamplificación enzimática en ciclos repetidos de unfragmento específico de ADN o ARN utiliza laenzima ADN polimerasa , a partir de pequeñascantidades de moléculas de ADN o ARN. Doscantidades de moléculas de ADN o ARN. Dosoligonucleótidos son utilizados como cebadores“Primers” . Estos son cadenas de nucleótidos quese unen a secuencias complementarias en elextremo 5´ de cada hebra de ADN a amplificar.

Pasos a realizar en una PCR

• Obtener el ADN “templado”• Preparación de la mezcla de la reacción .• Agregar el templado a la mezcla de reacción.• Ciclado.• Electroforesis en gel de agarosa.• Electroforesis en gel de agarosa.• Visualización / registro de resultados.

Obtención de Templados• Estandarizar el método de extracción de acuerdo a

la matriz .• Para el aislamiento bacteriano, solo es necesario el

proceso de hervido . En cambio para el aislamiento en muestras mas complejas que pueden llegar a contener inhibidores o poca carga bacteriana , es necesario un enriquecimiento bacteriano previo y en necesario un enriquecimiento bacteriano previo y en algunos casos la necesidad de eliminar los inhibidores.

• Para la realización de una simple PCR no es necesario un ADN tan limpio y purificado, pero para realizar una secuenciación si es necesario que este ADN este limpio y purificado.

Preparación de la mezcla de reacción

• Buffer Tris-HCl 20mM y 50nM KCl pH 8.3- 8.9. es necesario para la adecuada actividad enzimática.

• Cloruro de Magnesio: cofactor indispensable (Taqpolimerasa) y afecta el “annealing” de los “primers“. Los rangos de concentración utilizados son de (1 a 3) mM.mM.– Altas concentraciones disminuyen la especificidad de

la reacción.– Bajas concentraciones disminuyen la eficiencia de la

reacción.

• Deoxirribonucleotidos: ATP, CTP, GTP Y TTP, (dNTps). – Agregados en iguales proporciones para minimizar falsas

incorporaciones en la polimerización. – Se ajusta la concentración para optimizar la especificidad y

fidelidad de la reacción. Generalmente 100 uM en el ensayo.

• Primers o cebadores:– Preferentemente entre 15 y 30 pb de longitud.– No deben ser complementarios entre si .– No deben ser complementarios entre si .– Deben tener similar contenido de (G + C) y en baja conc. en

el extremo 3´. – No deben contener estructuras secundarias.

– El rango de concentración en el ensayo varía desde (0.3 a 1) uM.

• Altas concentraciones disminuyen la especificidad de la reacción.• Bajas concentraciones disminuyen la eficiencia de amplificación.

• Enzima ADN polimerasa:– Enzima Taq polimerasa.– Tienen actividad de polimerasa y exonucleasa 5´ - 3 ´.

– Debe agregarse al final de la preparación de la máster mix.

– El rango habitual en cada ensayo es de (0.5 – 2.5) U. • baja concentración disminuye el rendimiento de la reacción • altas concentraciones generan productos inespecíficos.

“ La concentración en la que se utilizan cada uno de los reactivos va a afectar la

sensibilidad y especificidad de la reacción”.

Todos los reactivos deben ser conservados a -20 °C.

• ADN blanco, – La secuencia a amplificar debe contener desde menor a 0.1

a unas pocas kilobases. – La cantidad total de ADN usado normalmente es de 0.05 a

1.0 ug. – No es necesario que la muestra conteniendo la secuencia a

amplificar esté altamente purificada .

ControlesControles

• Blanco de Templado: – Reactivos solos, sin templado .

• Control positivo:– templado de una cepa patrón que se sabe + (positiva) .

• Control negativo:- templado de una cepa patrón que se sabe – (negativa)

Pasos del termociclado

• El ciclado, consiste en una serie de pasos descriptos a continuación:

• Desnaturalización inicial: (94-96)°C, (2-5) min• Desnaturalización (94-96)°C , 30 seg – 1 min• Annealing : (variable)°C, 30 seg – 1 min• Annealing : (variable)°C, 30 seg – 1 min• Extensión : 72°C , 30 seg – 1 min. (Temperatura

óptima de la polimerasa)• Extensión final: 72°C, 10 min.• Generalmente pueden ir de 25 a 35 ciclos

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealingPrimers50 oC

Extension72 oC

Tem

per

atu

ra

100

0

50

Tiempo

30ciclos

5’3’ 5’

5’

3’5’

5’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealingPrimers50 oC

Extension72 oC

Tem

per

atu

ra

100

0

50

Tiempo

30ciclos

5’3’ 5’

5’

Fragmentos de tamaño definido

3’5’

5’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealingPrimers50 oC

Extension72 oC

Tem

per

atu

ra

100

0

50

Tiempo

30ciclos

5’3’ 5’

5’

3’5’

5’5’

5’

5’

5’

Calor

Calor

• Altas concentraciones de nucleótidos.• Bajas temperaturas de annealing.• Bajas temperaturas de extensión.

Producción de productos inespecíficos

Electroforesis en gel de agarosa• Se utilizan soluciones de agarosa a variadas

concentraciones % P/V utilizando como solvente Buffer Tris Acético EDTA (TAE) 1X o Tris Borato EDTA (TBE) 0.5X.

• La concentración de la solución de agarosa a preparar va a depender del tamaño de los preparar va a depender del tamaño de los fragmentos a separar en la electroforesis

Agarosa % (P/V) Rango de separación de fragmentos de ADN (kb)

0.7 0.8 - 10

0.9 0.5 - 7

1.2 0.4 - 6

1.5 0.2 - 3

2.0 0.1 - 2

Condiciones de corrida electroforética

• Dependiendo del número y tamaño de los fragmentos a separar , se ajusta el voltaje y tiempo aplicado a la cuba electroforética en donde se realizará la corrida.

• Generalmente en varias aplicaciones se utiliza un fuente con voltaje de 100V durante un tiempo aproximado de 30 minutos.

Visualización del gel de agarosa

• Posterior a la corrida electroforética el gel puede teñirse, sumergiéndolo en una solución de Bromuro de Etidio por el transcurso de un tiempo. Luego este es observado bajo una lámpara ultravioleta , en donde se notaran las diferentes bandas separadas mediante la corrida electroforética.mediante la corrida electroforética.

• Para un posterior análisis y una documentación del ensayo realizado puede tomarse una fotografía del gel.

Tipos de PCR• PCR simple

Sensibilidad analítica alta (100 a 1000 copias de genoma, detectable).

• PCR Anidado - Nested PCRConsta de dos ciclos de amplificación (2 PCR) con cuatro cebadores , denominados cebadores externos e internosLa primera amplificación da 2 fragmentos resultantes.La primera amplificación da 2 fragmentos resultantes.La segunda reacción trabaja sobre los fragmentos obtenidos en la 1ra reacción.Sensibilidad analítica: menor a 10 copias de genoma. Muy sensible.Este modo es mas especifico, ya que cuando la Taq trabaja con grandes cantidades de DNA, su fidelidad disminuye.En cambio con este método, se trabaja con fragmentos cortos desde la segunda reacción, lo que hace mas efectivo el proceso. La especificidad también aumenta porque cuatro oligonucleótidos tienen que unirse específicamente

• PCR Multiple ( Chamberlain 1988)

Se lleva a cabo la reacción de PCR tradicional , pero con mas de un par de primers , para amplificar varias regiones al mismo tiempo.

• PCR Invertido o PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:RT-PCR sería:� 1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.� 2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de

ADNc.� 3er paso: PCR estándar.

• Real Time PCR (r t PCR)– Los productos de amplificación se detectan de

forma directa durante los ciclos de amplificación, utilizando sondas marcadas con fluorescencia, TaqMan o Molecular Beacon.

– La fluorescencia se mide a través de la tapa o del lado del recipiente de reacción

Se puede dividir en las técnicas basadas: 1- En fluorocromos no específicos.2- En sondas específicas.

1- Utiliza el SYBR Green, que es un fluoróforo que se intercala en el DNA de doble hebra . Por ende, mientras mas DNA amplificado exista en el medio, mas SYBR green se intercalara y la luminiscencia mas SYBR green se intercalara y la luminiscencia aumentara proporcionalmente a los fragmentos amplificados.-Ventaja : Utilizar cebadores normales.

Más económica que la que usa sondas específicas.- Desventaja: Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción.

2- Utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el iniciador directo (forward) y el inverso (reverse).

Esto permite monitorizar el cambio de patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.- Ventaja: • Muy Precisos y evita posibles secuencias inespecíficas. • Permite cuantificar el ADN amplificado.• Permite cuantificar el ADN amplificado.

- Desventaja: • Mas laborioso y costoso (diseño de secuencias específicas

como sondas)

.

Hairpin Probes (Molecular Beacons)

• Sondas con secuencias repetidas invertidas en sus extremos

• Permitiendo forme una estructura de horquilla. • Ventaja:

– Mas específica que las sondas TaqMan.– Puede combinar varias Molecular Beacons en una única – Puede combinar varias Molecular Beacons en una única

reacción. (Multiplex PCR).

• Desventaja:– Diseño riguroso de las regiones tallo y asa de la horquilla.

Sondas Hidrolizadas (TaqMan)

quencherreportero

Actividad exonucleasa

Hybridization Probes :

Ventajas del PCR en tiempo real

• Simple y rápida. Tiempo considerablemente menor.• Muy sensible. Sensibilidad próxima o igual a la PCR anidada,

pero con un riesgo de contaminación mucho más bajo• Extraordinariamente específico.• No hay manipulación post-PCR, evita la contaminación por

amplicones.• Detección de más de un producto específico en una misma

reacción.• Sin necesidad de utilizar la tinción con bromuro de etidio, con

lo que, de nuevo, se reduce el riesgo de contaminación. • Posibilita realizar ensayos cuantitativos.

• Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción o RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) – Electroforesis en gel de campo pulsante.

– Técnica estandar de referencia para tipificar la mayoria de bacterias, hongos y parásitos.

– Se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en – Se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que varían entre individuos.

– Desventaja: Laboriosa y duradera. (4 días analisis de pulsotipos)

Dendrograma

•Interpretación de patrones de banda. Programas informáticos que los agrupan en clusters.•Elevado poder de discriminación y excelente reproducibilidad.•Puede mostrar la relación genética entre individuos.

Ventajas en utilizar PCR• Detección rápida y segura, económica y fiable de

patógenos. • Procesamiento de grandes cantidades de muestras.• La sensibilidad diagnóstica es muy alta, ya que se

producen varios millones de copias de la diana seleccionada. También puede ser muy alta la especificidad de la reacción, debida a las secuencias nucleotídicas específicas formadas por los oligonucleótidos nucleotídicas específicas formadas por los oligonucleótidos (cebadores). Los cebadores están diseñados para detectar secuencias nucleotídicas específicas en los genomas de los agentes infecciosos diana seleccionados.

• Mayor poder discriminativo que los métodos fenotípicos.• Detección de Factores de Virulencia• Determinar los Perfiles Plasmídicos

Desventajas en utilizar PCR

• Resultado poco satisfactorio, dando falsos negativos por problemas de inhibición.

• Las sustancias inhibitorias pueden actuar a diferentes niveles.– Hemoglobina– Lactoferrina– Lactoferrina– Polisacaridos– Grasas– Proteinas– Iones metálicos– Sales (presentes en los protocolos de extracción).

(eliminación por preenriquecimiento).

A tener en cuenta:

• Aunque los genes que codifican para los factores de virulencia puedan ser detectados, no implica que virulencia puedan ser detectados, no implica que estos se expresen.

Precauciones

• Existen medidas de control para minimizar contaminaciones , para ello es necesario contar con distintas áreas dentro del laboratorio:

– Área de preparación de la mezcla de reacción (zona limpia)– Área de manipulación de muestras, cultivo y extracción del ADN (zona

intermedia).– Área de amplificación y análisis del producto de la reacción (zona sucia).

• Utilizar campanas para la preparación de master mix y para el agregado de las muestrasagregado de las muestras

• Almacenamiento de Reactivos en áreas libres de contaminación.• En lo posible cada área debe tener dos entradas (Flujo

unidireccional) , circulación de aire para recontaminación de aerosoles y lámparas de luz UV . El movimiento de las muestras y del personal tiene que ser de un área libre de ampliaciones hacia áreas contaminadas con ellos y nunca en sentido contrario.

• Utilizar pipetas “Calibradas” diferentes para cada área• Descontaminación de mesadas, pipetas y quipos (con UV y/o

solución de NaCLO).• Optimizar un método para abrir los tubos.• Utilizar material nuevo y descartable (como lo son tips con filtro y

microtubos). • Reactivos fraccionándolos en pequeñas alícuotas y estos que sean

de grado Biología Molecular para asegurar la pureza de ellos.• Incluir Control Negativo ( Muestra que sea tan parecida como sea

posible pero sin la diana) 1c-/5m

• Los falsos positivos pueden deberse a:– Contaminación cruzada.– Contaminación por ADN proveniente del entorno.– Contaminación por el producto amplificado.

• Los falsos negativos pueden deberse a:– Contaminación por DNAsas. Que pueden provenir de las manos, por ello

es recomendable utilizar guantes.– Presencia de Inhibidores.– Errores en el pipeteo

posible pero sin la diana) 1c-/5m

– Utilizar controles Internos (miméticos)• Garantizan la evaluación segura de los

resultados.• Indicador de la eficacia de la amplificación• Tienen la misma secuencia de unión a los

cebadores pero flanquean un fragmento de ADN heterólogo de diferente tamaño .

• Aumenta la fiabilidad del diagnóstico por PCR• Precaución: Ajustar la concentración,

competencia con los cebadores afectando la sensibilidad analítica. Concentración ligeramente superior al limite de detección.

Diseño de una PCR

• Identificar la secuencia blanco. • Diseñar los primers teniendo en cuenta variados

factores:– La especificidad– El tamaño– El tamaño– La secuencia– La temperatura de melting.

Criterios principales para la selección de cebadores.

Aplicaciones de la PCR a diferentes patógenos

• Detección y Confirmación de patógenos. Intoxicaciones alimentarias.

• Tipificación genotípica.• Determinar factores de virulencia.• Determinar factores de virulencia.• Útil en Brotes Epidémicos

– Determinar el n°de clones circulantes.– Identificar la fuente de contaminación.– Evaluar las medidas de control.– Diferenciar entre infección o recidiva.

Aplicaciones.• Salmonella spp.– Gen invA

• Escherichia coli productora de toxina Shiga– Genes Stx1 y Stx2– antígeno flagelar H7– hly A (hemolisina)– factor eae (intimina)– adhesina aglutinante de STEC ( saa )

• Staphylococcus aureus– Multiplex (Priemers seb 667pb, sea 521pb, sec 284pb.)

• Listeria.– Genes Imo0737, Imo1118, ORF2819, ORF2110, Prs.– Genes Imo0737, Imo1118, ORF2819, ORF2110, Prs.

• Shigella spp.– Gen IpaH

• Eneterobacter sakazakii.– Gen ompA

• Vibrio cholerae.– Gen stn, tcpl– Multiplex: (factores de virulencia ctx y tcpA); (Serogrupos O1 y O139)

• Bacillus cereus– Gen de la toxina B

• Yersinia enterocolitica– Gen yad A

PCR- RFLP (gen mitocondrial de la subunidad I del citocromo c-oxidasa) - 9 genotipos del género Trichinella

PCR- Multiplex ( ADN ribosomal) - 5 pares de primers – 9 genotipos de Trichinella. ( T. spiralis, T. pseudospiralis, T. murrelli, T. papuae, T.

zimbabwensis, T. britovi, T. nelsoni, otras )