detección de la secuencia...
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Detección de la secuencia Alu mediante la técnica Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR )
N. Rodríguez
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Objetivos • Entender la técnica: Reacción de Polimerasa
en Cadena (PCR por sus siglas en inglés) • Definir el concepto PCR y sus aplicaciones en
la investigación y los procesos biológicos • Extraer, amplificar y analizar muestras de
DNA de tejido bucal • Entender qué es Genética Poblacional y los
principios que cobijan la teoría Hardy-Weinberg
• Calcular las frecuencias alélicas y genotípicas de las muestras de cada sección
• Analizar e interpretar los resultados
Objetivos
3
4
Reacción de Polimerasa en Cadena
• ¿Qué es PCR?
• ¿Qué se necesita ?
• ¿Cómo trabaja?
• ¿Qué estamos amplificando?
5
¿Qué es PCR?
• ¡Replicación del DNA en un microtubo!
• Hacer muchas copias de una secuencia partiendo de un molde o templado
• Utiliza enzima resistente a altas temperaturas- Taq-Polymerasa
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PCR
Melting 95 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo 5’ 3’
3’ 5’
7
PCR Melting
95 oC Te
mpe
ratu
ra
100
0
50
Tiempo 5’ 3’
3’ 5’
Calor
8
PCR
Melting 95 oC
Annealing Primers 58 oC
Extension 72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
3’ 5’
5’
5’
5’ 3’
Melting 95 oC
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PCR Melting
95 oC Melting
95 oC Annealing Primers 58 oC
Extension 72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30x
3’ 5’
5’ 3’
Calor
Calor
5’
5’
5’
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PCR Melting
95 oC Melting
95 oC Annealing Primers 58 oC
Extension 72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
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PCR Melting
95 oC Melting
95 oC Annealing Primers 58 oC
Extension 72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’ 5’
5’
5’
5’
Calor
Calor
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PCR Melting
95 oC Melting
95 oC Annealing Primers 58 oC
Extension 72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
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Fragmentos de largo definido
PCR Melting
95oC Melting
95 oC Annealing Primers 58 oC
Extension 72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
DNA se replica
0 Número de Ciclos
Copias 1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
14
Perkin Elmer GeneAmp 2400 Thermal Cycler PCR
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16
Electroforesis de Productos de PCR
Heterocigótico Homocigótico para la presencia
de Alu
Homocigótico para la ausencia
de Alu
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¿Qué se necesita para llevar a cabo PCR?
• Templado de interés • Iniciadores (primers) de secuencia específica que
flanqueen la secuencia del templado de interés è Forward (upstream) ç Reverse (downstream)
• Nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
• MgCl2 (cofactor enzima)
• Amortiguador • Taq Polimerasa
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¿Cómo trabaja el PCR?
• Calor (95oC) para desnaturar las cadenas de DNA
• Enfriar (58oC) para pegar los “primers” al templado
• Calor (72oC) para activar la Taq-Polimerasa, encargada de extender los “primers”
• Repetir ciclos: 95°C - 1 minutos
58°C - 30 segundos 72°C - 30 segundos
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Desnaturando el templado
Las altas temperatura permite la separación de las cadenas de DNA
3’
5’
5’
3’
95oC
5’
3’
3’
5’
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Hibridización de los iniciadores (primers)
• Iniciadores hibridizan con el templado • Taq Polimerasa reconoce la doble cadena
3’
5’
5’
3’
58oC 3’
5’
5’
3’ 3’ 5’ 3’ 5’
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Diseño de los iniciadores (primers)
• El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. La relación máxima de purinas/pirimidinas será 60%/40%.
• Evitar zonas con largas secuencias de una sóla base. • Tamaño: se recomienda de 18-30pb. • La temperatura de hibridización de los iniciadores debe
ser similar en ambos y será variable en función de la secuencia de los mismos. Generalmente oscila entre los 45 y 60°C.
Tm=4 (G +C) +2 (A+T)
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Sales
KCl- Influye en la desnaturalización del DNA. Altas concentraciones de K+ favorece la desnaturalización de secuencias cortas de DNA. Bajas concentraciones de K+ ayudan en la desnaturalización de secuencias largas.
MgCl2- Aumenta la temperatura de hibridización del DNA.
• Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la reacción.
• Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción.
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Extensión
3’
5’
5’
3’
Repetir 30 veces: desnaturación, hibridización, y extensión
3’ 5’ 3’ 5’
72oC
3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
5’
3’
Extensión Extensión
• Taq Polimerasa extiende los iniciadores • Se sintetiza de una cadena sencilla (produciendo un fragmento
doble por la complementaridad) en la dirección 5’ 3’
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3’ 5’
5’ 5’
3’
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
5’ 3’
3’
Ciclo 1
Ciclo 2
Ciclo 3 3’ 3’
3’ 3’ 5’
5’ 5’
5’
El producto amplificado se logra a partir del tercer ciclo
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Secuencia de interés
• Cromosoma 8 • Intron en el gen TPA (tissue plasminogen activator) • Alu-TPA25
Exon 8 Exon 9 Exon 10 5’ 3’ Alu
Intron 8
Amplified Region
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Alu-TPA25
• No está asociado a ningún desorden o enfermedad
• La familia de elementos Alu consiste de secuencias repetitivas (200-300 pb) que se repiten a lo largo del genoma. Estos elementos derivan su nombre por el lugar de reconocimiento que tiene la enzima Alu I.
Exon 8 Exon 9 Exon 10 5’ 3’ Alu
Intron 8
Amplified Region
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Secuencias Alu
• Cada secuencia Alu está flanqueada por “direct repeats”
• Surgen como resultado de retrotransposiciones.
• Occurre ~300,000 veces en el genoma humano
Exon 8 Exon 9 Exon 10 5’ 3’ Alu
Intron 8
Amplified Region
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Significado evolutivo Alu-TPA 25
• Secuencias altamente conservadas • Se insertó hace 1,000,000 años
• Dimorfismo (+/+, +/-, -/- ) • Utilizado en genética poblacional, pruebas
forenses y análisis de paternidad
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Procedimiento Extracción del DNA genómico
v Chelex (resina de intercambio iónico) enlaza MgCl2
v 56oC libera el tejido conectivo e inactiva las DNasas
v 100oC Rompe la membrana celular y desnatura las proteínas
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Extracción de ADN
Calor rompe la membrana
Membrana celular
Membrana nuclear
La resina Chelex enlaza los iones de Mg++
DNA genómico
Mg++
Mg++
Mg++
Mg++
Mg++
Mg++
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• Asegurarse de no transferir la resina • Mezclar bien el DNA templado junto a los “primers”
y el “bead” • El “bead” contiene: Taq-Polimerasa, amortiguador,
dNTPs, MgCl2
Programa máquina PCR: 95ºC 5 minutos 95ºC 1 minuto 58ºC 30 segundos 72ºC 30 segundos 4ºC ∞
30 ciclos
Preparación de la reacción de PCR
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Resultados….
• La inserción es dimórfica. Esto significa que puede estar presente en unos individuos y en otros no.
Productos: fragmento 400 bp fragmento 100 bp
Existen tres posibles genotipos: +/+, -/-, +/-
Exon 8 Exon 9 Exon 10 5’ 3’ Intron 8
Amplified Region Alu
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Resultados Alu-PCR
+/+
-/-
+/-
400pb 100pb
Marcador 100pb
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v Amplificar la región Alu de una muestra representativa de una población
v Calcular la frecuencia genotípica observada y la frecuencia alélica
Para estimar la frecuencia de Alu en la población
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Equilibrio Hardy-Weinberg
p2 + 2pq + q2 = 1
+/+ = p2 +/- = 2pq -/- = q2
pp pq
qq pq
p
p
q
q
Alu y Genética Poblacional
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Calcular la Frecuencia Genotípica Observada
Genotipo +/+ (p2) +/- (2pq) -/- (q2) Total (N)
# de individuos Frecuencia observada
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Calcular la frecuencia alélica observada
• Frecuencia de p = número de alelos p (+) = total alelos
• Frecuencia de q = número de alelos q (-) = total alelos
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Frecuencias genotípicas de una muestra al azar de una población
Genotipo # de cada genotipo
Frecuencia
+/+ 2422 0.2422
+/- 5528 0.5528
-/- 2050 0.2050
Total 10,000 1.0 § Calcular las frecuencias alélicas para toda la población. § ¿Serán las frecuencias alélicas y genotípicas de la clase
similares a las de la población? § ¿Qué prueba estadística debemos utilizar?
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Equilibrio Hardy-Weinberg
• Determinar frecuencia genotípica esperada • p2, 2pq y q2 Ejemplo: • Si p = 0.45 , entonces q = 0.55 ya que p + q = 1
p2 + 2pq + q2 = 1 (0.45)2 + 2 (0.45)(0.55) + (0.55)2 = 1
0.20 + 0.50 + 0.30 = 1 • p2 = 0.20 • 2pq = 0.50 • q2 = 0.30
Representa las frecuencias genotípicas esperadas si la población está en
equilibrio genético.
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Calcular el número de genotipos
• Calcular la frecuencia genotípica esperada para la clase presumiendo que la población está en equilibrio genético
• Calcular el # de genotipos esperados. • Qué prueba estadística podemos usar para
determinar si la población se encuentra en equilibrio?
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( )∑
−=
EEO 2
2χPrueba χ2
Observados Esperados (O-E)2/E
+/+
+/- -/-
Observados Esperados (O-E)2/E
+/+
+/- -/-
Clase
Población