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DEPARTAMENTO DE POSGRADOS
MAESTRÍA EN GESTIÓN DE LA CALIDAD Y SEGURIDAD
ALIMENTARIA
“AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
PRESENTES EN EL SUERO DE QUESOS ARTESANALES DE LA
PROVINCIA DE CAÑAR CONTRA CEPAS PATOGENAS”
TRABAJO DE GRADUACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
“MAGÍSTER EN GESTIÓN DE LA CALIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA”
AUTOR: BQ. JÉSSICA PRISCILA CALLE LÓPEZ
DIRECTOR: MST. MARÍA FERNANDA ROSALES
CUENCA, ECUADOR
2016
ii
DEDICATORIA.
La presente tesis la dedico a Dios, quien guía mi camino y ha llenado de fortaleza mis pasos.
A mis padres por su sacrificio diario para darme la mejor herencia la educación, por su amor
incondicional y las noches en vela junto a mí, por estar siempre con brazos abiertos para
cobijarme y enseñarme que los sueños se hacen realidad cada día al despertar, son mi motor y
a ellos les debo la mujer que hoy soy.
A mi hermana mi ejemplo y orgullo, en ella veo el esfuerzo y sacrificio al dejar el circulo y
lanzarse a la vida, mi enanita bella te adoro gracias por ser mi compañera, amiga y cómplice,
el mejor regalo que me han dado mis padres.
A mi amigo, novio y compañero de vida Xavier gracias por cada detalle, por cada abrazo, por
cada comida que ha llenado mi estómago y mi alma, tus palabras de aliento pero sobre todo
gracias por no cortar mis alas, siempre hacerme reír y caminar a mi lado.
Cuando tome la decisión de estudiar la maestría mi familia me alentó y hoy les agradezco a
ellos, en especial a un luchador, a un guerrero de la luz, tío me hace tanta falta pero sé que
cada rayo de sol que ilumina mi día es un abrazo y cada día de lluvia es la manera de seguir
bailando juntos en este mundo.
A todos mis amigos que de alguna manera estaban ahí pendientes para festejar un logro más
obtenido en este caminar, de manera especial a Fifa, Moti y sus seis hijos.
iii
AGRADECIMIENTOS
A mi tutora de tesis Ing María Fernanda Rosales por confiarme este proyecto, haberme guiado y
ayudado a culminar con éxito el presente trabajo, por su apoyo y colaboración no solo material sino
aquella que tiene más valor sus principios y valores.
A todos mis compañeros y jefes del Proyecto MEDPLAN por su apoyo incondicional y préstamo del
material y equipos necesarios para la realización de este tema, por brindarme sus palabras de
aliento, por su ayuda en momentos cruciales, a mi amiga Andrea por la paciencia.
A las personas que he conocido durante estos dos años, compañeros de aula y algunos hoy
llamados amigos, con los que he compartido un tiempo muy valioso y espero no olvidar jamás.
A todas les ofrezco mis más sinceros agradecimientos.
iv
RESUMEN
El presente trabajo tuvo por objetivo el de aislar bacterias acido lácticas de quesos frescos
artesanales de la Provincia del Cañar y determinar su capacidad antibacterial. Las muestras fueron
recolectadas de diferentes fabricantes y sembradas en agar MRS y M17. A través de pruebas
bioquímicas miniaturizadas API 50 CHL, se identificaron dos cepas de BAL, con un 99.8% de
tipificación Lactobacillus paracasei ssp paracasei y con 95.3% Lactobacillus plantarum.
Posteriormente a estas bacterias se les probó su actividad antibacteriana contra Salmonella Enteritis,
Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus, por pruebas de difusión en agar. Se determinó
que L. paracasei es efectivo contra Gram + y –, y L. plantarum es inhibidor del crecimiento Gram -.
Esto es importante desde el punto de vista de la efectividad sobre todo contra bacterias como
Salmonella que son más difíciles de inhibir su crecimiento debido a su capa de peptidoglucano que
las convierte en más resistentes a los compuestos antibacteriales como las bacteriocinas. Finalmente
estas cepas de BAL fueron crioconservadas para posteriores estudios.
PALABRAS CLAVES: BAL, difusión en agar, Gram, bacteriocina, antibacteriano.
v
ABSTRAC AND KEYWORDS
vi
INDICE DE CONTENIDO
Contenido
DEDICATORIA. ................................................................................................................................ ii
AGRADECIMIENTOS .....................................................................................................................iii
RESUMEN ......................................................................................................................................... iv
PALABRAS CLAVES: BAL, difusión en agar, Gram, bacteriocina, antibacteriano. ............ iv
ABSTRAC AND KEYWORDS ....................................................................................................... v
INDICE DE CONTENIDO................................................................................................................ vi
INDICE DE FIGURAS. ................................................................................................................... vii
INDICE DE TABLAS ..................................................................................................................... viii
INTRODUCCIÓN: ............................................................................................................................ 1
Generalidades de género Lactobacillus. ............................................................................. 2
Caracteres morfológicos. ......................................................................................................... 2
Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas. .............................................. 2
Principales efectos benéficos de las bacterias ácido lácticas. ..................................... 3
Cepas patógenas usadas en la actividad antibacteriana. ............................................... 3
OBJETIVO GENERAL: ................................................................................................................... 4
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ......................................................................................................... 4
CAPITULO I. ..................................................................................................................................... 5
MATERIALES Y METODOS ...................................................................................................... 5
1.1. Localización del Estudio .......................................................................................... 5
1.2. Origen de las muestras ............................................................................................. 5
1.3. Aislamiento de las bacterias, preparación de las muestras ........................... 5
1.4. Método microbiológico de aislamiento e identificación de Lactobacillus .. 7
1.5. Método de evaluación de actividad antimicrobiana .......................................... 8
CAPITULO II ................................................................................................................................... 10
RESULTADOS ........................................................................................................................... 10
2.1. Aislamiento e identificación de las bacterias ácido láctico .............................. 10
vii
2.2. Perfil Bioquímico de las BAL. ................................................................................... 11
2.3. Evaluación de la actividad antibacteriana ............................................................. 12
2.4. Pruebas estadísticas de la inhibición en placa por el método de difusión del
agar de las BAL obtenidas contra las cepas de Gram negativos y Gram
positivos muestras realizadas por triplicado. .............................................................. 13
CAPITULO III .................................................................................................................................. 21
DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 21
CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 23
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................... 24
INDICE DE FIGURAS.
Figura 1.Lugares de recolección de las muestras Provincia del Cañar ................................... 6
Figura 2. Aislamiento de las muestras sembradas en medios selectivos ............................... 6
Figura 3. Preparación de las pruebas bioquímicas API 50 ........................................................ 7
Figura 4. Preparación del ensayo de actividad antibacteriana ................................................. 9
Figura 5. Tinción de Gram muestra N° 4 .................................................................................... 10
Figura 6. Tinción de Gram muestra N° 1 .................................................................................... 10
Figura 7. Resultado del API TEST para muestra MRS N° 4 el perfil fue Lactobacillus
paracasei ssp con un 99.8% de tipificación ............................................................................... 11
Figura 8. Resultado del API TEST para muestra M17 N° 1 el perfil fue Lactobacillus
plantarum con un 95.3% de tipificación ...................................................................................... 11
Figura 9. Pruebas de actividad antibacteriana en Lactobacillus paracasei contra
Salmonella enteritis y Staphylococcus aureus........................................................................... 12
Figura 10. Pruebas de la actividad antibacteriana en Lactobacillus plantarum contra
Salmonella enteritis y Listeria monocytogenes .......................................................................... 13
Figura 11. Cepas de Listeria monocytogenes vs Salmonella enteritis con respecto a
Lactobacillus plantarum (ensayo por triplicado) ........................................................................ 15
Figura 12. Cepas de Salmonella enteritis vs Staphylococcus aureus con respecto a
Lactabacillus paracasei (ensayo por triplicado) ......................................................................... 18
Figura 13. Lactobacillus plantarum vs Lactobacillus paracasei con respecto a la cepas de
Salmonella enteritis ........................................................................................................................ 20
viii
Figura 14. Se indica despúes del análisis estadístico en la prueba de hipótesis que no
existe diferencia significativa entre las muestras ...................................................................... 20
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Codificación de las muestras de quesos para elaborar los ensayos .................................... 5
Tabla 2. Resultados obtenidos por el método de difusión del agar, halos de inhibición resultantes
por triplicado usando Lactobacillus paracasei contra las cepas de Salmonella enteritis y
Staphylococcus aureus ..................................................................................................................... 13
Tabla 3. Resultados obtenidos por el método de difusión del agar, halos de inhibición resultantes
por triplicado usando Lactobacillus plantarum contra las cepas de Listeria monocytogena y
Salmonella enteritis ........................................................................................................................... 13
Calle López 1
Calle López Jéssica Priscila
Trabajo de graduación
Ing. María Fernanda Rosales
Mayo 2016
“AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE
BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS PRESENTES EN EL SUERO DE QUESOS ARTESANALES
DE LA PROVINCIA DE CAÑAR CONTRA CEPAS PATÓGENAS”
INTRODUCCIÓN:
Las bacterias del ácido láctico (BAL) han desempeñado un rol importante en la tecnología de los
alimentos y tienen una larga historia debido al uso dado por el hombre para la producción de
comestibles y la preservación de los mismos ya que su presencia disminuye la proliferación de
bacterias patógenas que son los principales culpables de intoxicaciones alimentarias. Esto
representa una problemática de salud que ha dado paso a la investigación de nuevos métodos
para conservación de los alimentos con componentes naturales que se incorporan al alimento
para garantizar su seguridad.
Las bacterias ácido lácticas contribuyen de manera que las características organolépticas de los
alimentos no se alteran, además generan en los mismos ambientes poco favorables para el
desarrollo de microorganismos patógenos debido a su marcada capacidad antagonista, se ha
podido comprobar que algunas cepas de bacterias lácticas, entre ellas las del género
Lactobacillus, son beneficiosas para la salud, tanto humana como animal (probióticos). Ambos
efectos beneficiosos, ocasionados por su capacidad antagónica, se basan en la producción de
ácidos orgánicos y otros metabolitos inhibidores, entre los que cabe mencionar el peróxido de
hidrógeno (H2O2) y otros derivados del metabolismo del oxígeno, así como compuestos
aromáticos (diacetilo, acetaldehido), derivados deshidratados del glicerol (reuterina), enzimas
bacteriolíticas, bacteriocinas y otros.
En los tiempos actuales la problemática a nivel salud dada por las intoxicaciones alimentarias ha
dado paso a la investigación de diferentes mecanismos para asegurar la calidad de dichos
alimentos, ya sea retardando el crecimiento de microorganismos o en el mejor de los casos
matándolos por completo. Es por ello que surge la idea de estudiar algunos tipos de
antimicrobianos o conservantes naturales y así contribuir en mayor medida a eliminar los
productos químicos de los alimentos y de esta manera podemos aportar con la investigación de
Calle López 2
BAL aisladas de las muestras de queso que pudieran tener el efecto antibacteriano contra alguna
cepa patógena. (Blackburn, 2006; Doyle, Beuchat, & Montville, 2001)
Generalidades de género Lactobacillus.
El término bacterias lácticas engloba a un grupo heterogéneo de microorganismos que se ubican
en la familia Lactobacillaceae cuya característica definitoria es la producción de ácido láctico a
partir de la fermentación de azúcares que en cantidades suficientemente elevadas podría causar
inhibición o total destrucción de otros microorganismos.
Las bacterias lácticas se han venido utilizando inadvertidamente durante miles de años para la
producción de alimentos tales como queso y yogur. Sin embargo, no fue hasta mediados del siglo
XIX cuando Louis Pasteur demostró que la producción de ácido láctico en fermentaciones se
debía a la acción de microorganismos (fermentos lácticos). El aislamiento y obtención de un
cultivo puro de Bacterium lactis por Joseph Lister marcó el inicio del estudio microbiológico de las
bacterias lácticas.
Las bacterias ácido lácticas producen ácido láctico o bien, ácidos láctico y acético y también
pueden producir otras sustancias inhibidoras tales como: diacetilo, peróxido de hidrógeno,
reuterina (b- hidroxipropionaldehido) y bacteriocinas. Estas últimas son producidas
ribosomalmente como proteínas o polipéptidos precursores que, en su forma activa, ejercen un
efecto antibacterial contra un espectro limitado de bacterias estrechamente relacionadas.(De Vos,
Whitman, & Bergey, 2009)
Caracteres morfológicos.
El género Lactobacillus se caracteriza por presentar células en forma de bacilos largos y
extendidos, largos cortos, o cocos Gram positivos que se dividen como bacilos solamente en un
plano, produciendo cadenas o tétradas de forma ocasional y filamentos, falsamente llamados
ramificados.(Ingraham et al., 1998), aunque con frecuencia pueden observarse bacilos cortos o
coco-bacilos coryneformes; lo cual hace que se puedan confundir con géneros aislados
habitualmente de origen clínico. Los grandes bacilos homofermentativos presentan gránulos
internos revelados por tinción de Gram o por tinción con azul de metileno. (Blackburn, 2006)
Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas.
Las bacterias acido lácticas se comportan como inhibidoras de otros microorganismos en la
mayoría de los casos, y es precisamente este comportamiento la clave para estudiar su calidad
de conservación de algunos productos alimenticios, un factor clave es la producción de ácido
láctico y acético junto con la baja de pH lo que inhibe el crecimiento y supervivencia microbiana.
Calle López 3
Muchas cepas de Lactobacillus forman sustancias antimicrobianas inhibidoras del crecimiento de
otros microorganismos “in vivo”. Las bacterias ácido lácticas preservan los alimentos como
resultado de un conocimiento competitivo producto de su metabolismo y de la producción de
bacteriocinas, que son péptidos o proteínas bactericidas generalmente activas frente a especies
relacionadas con el organismo que la produce. Es de gran importancia para la industria
alimentaria ya que podría considerase como un conservante natural, en la actualidad una de ellas
muy reconocida es la nisina producida por cepas de Lactococcus lactis es usada por la industria.
(Adams M. R, Moss, & Ramis Verges, 1997)
Principales efectos benéficos de las bacterias ácido lácticas.
Se ha identificado muchos beneficios producidos por las bacterias ácido láctico llegando a ser
efectivos organismos probióticos con lo que tienen una relación directa con los alimentos
fermentados, además debemos resaltar su habilidad de adherirse a las células, el poder excluir
o reducir la adherencia patógena, su resistencia y multiplicidad, su capacidad para producir
bacteriocinas antagonistas al crecimiento patógeno y formar una flora balanceada.
Es necesario destacar las posibilidades terapéuticas de las bacterias ácido lácticas que pueden
ser útiles en el tratamiento de patologías infecciosas, como en la prevención de infecciones
urinarias, para el tratamiento de diarreas infantiles o del viajero ya que tienen función protectora
de la microflora del intestino, así como para las relacionadas con el consumo de antibióticos, en
el tratamiento del estreñimiento y en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal, dada su
capacidad de modular la flora intestinal ya que nuevas investigaciones las han orientado a
mecanismos con efectos antitumorales.(Adams M. R et al., 1997)
Cepas patógenas usadas en la actividad antibacteriana.
Staphylococcus aureus.
Es un coco Gram-positivo que forma células de 1 um de diámetro aproximadamente,
forma agrupaciones irregulares semejantes a un racimo de uvas. Son catalasa-positivo,
oxidasa-negativo, anaerobios facultativos. Es un mesófilo típico con un intervalo de
temperatura de crecimiento entre 7 y 48°C, óptima a 35 y 40°C.
La producción de la enterotoxina está relacionada a esta especie, aunque también se la
ha relacionado con Staphylococcus intermedius y Staphylococcus hyicus. Como
enfermedad de tipo relativamente benigno y de corta duración, la intoxicación alimentaria.
(Blackburn, 2006)
Calle López 4
Listeria monocytogenes.
Es un organismo Gram-positivo, anaerobio facultativo, catalasa-positivo, oxidasa-
negativo. Morfología es de cocoide a bacilar cultivadas a 20 – 25°C, con alto intervalo de
temperatura para su crecimiento desde 0 a 42°C, siendo lo óptimo entre 30 y 35°C. La
listeriosis humana es en mayor problema debido a los alimentos que son la fuente
principal de infección, se ha identificado a L. monocytogenes como el principal causante
de esta infección que aunque poco frecuente tiene elevada tasa de mortalidad en
población de riesgo (embarazadas, niños, personas adultas y con sistema inmunológico
alterado). Las fuentes de carne y pescado son las que tienen mayor significancia y
presentan niveles altos de este patógeno.(Adams M. R et al., 1997; Doyle et al., 2001)
Salmonella.
De la familia de las enterobacteriaceae, son bacilos Gram-negativo, facultativamente
anaerobios, catalasa-positivos, oxidasa-negativos, temperatura de crecimiento de 5
hasta 47°C con crecimiento óptimo a 37°C. Son termosensibles y destruidas fácilmente
a temperatura de pasteurización. Se divide en dos especies Salmonella entérica y
Salmonella bongori, siendo los serotipos S. Enteritidis y Thyphimurium los de mayor
presencia en infecciones de salmonelosis. Se ha asociado a S. Enteritidis el consumo de
huevos contaminados y carne de aves, mientras que S. Thyphimurium al consumo de
carne de cerdo o bovino.(Adams M. R et al., 1997; Doyle et al., 2001)
OBJETIVO GENERAL:
Aislamiento e identificación de BAL presentes en el suero de quesos artesanales de la provincia
del Cañar.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Recolectar las muestras requeridas para el presente estudio provenientes de las
queserías artesanales más representativas de la provincia del Cañar.
Realizar el aislamiento de BAL de las muestras de quesos e identificación por medios
químicos.
Determinar la actividad antibacteriana de BAL en cepas pátogenas (Staphylococcus
aureus ATCC 25923 , Salmonella Enteritis ATCC 1408 y Listeria monocytogenes)
Crioconservar las cepas purificadas para ensayos posteriores.
Calle López 5
CAPITULO I.
MATERIALES Y METODOS
1.1. Localización del Estudio
La investigación es de tipo experimental y se realizó en el Laboratorio de microbiología del
proyecto MEDPLAN perteneciente a la facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de
Cuenca.
1.2. Origen de las muestras
Las muestras fueron obtenidas aleatoriamente de queserias artesanales de la provincia de Cañar
en total 5 muestras, con un peso de 500 gramos, las muestras fueron recolectadas, trasportadas
en cooler y tratadas de manera inmediata en el laboratorio.
1.3. Aislamiento de las bacterias, preparación de las muestras
Las muestras se identificaron por numeración correspondiente al lugar de recolección de la
siguiente manera:
Tabla 1. Codificación de las muestras de quesos para elaborar los ensayos
Código de la muestra Lugar de recolección
1 Fábrica de quesos Biblián
2 El Salto
3 Pame
4 Ghillosmar
5 Cristo Pobre
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Figura 1.Lugares de recolección de las muestras Provincia del Cañar
Se pesa 10 gramos de cada muestra (suero y queso) se coloca en bolsas estériles con 90ml de
agua peptona al 1%, mezclado y homogenizado se siembran por el método ecométrico en placas
de agar de medios selectivos agar De Man Rogosa Sharpe (MRS) (Merck 1.10661.0500) y M17
todo este procedimiento se lo realiza en la cabina de seguridad y con material estéril. Se colocan
las muestras en la jarra de anaerobiosis y después en la estufa a 37°C durante 48 horas.
Además necesitamos tener una base genética madre de microorganismos presentes en la
muestras de quesos, por lo tanto homogenizando la muestra colocamos en tubos eppendorf que
contiene 2ml con leche descremada UHT esterilizada y los guardamos a -80°C en el Biofreezer.
Se usaron como Medios de Cultivo: De Man Rogosa Sharpe MRS (caldo, agar), M17 (caldo,
agar), Tripticase Soya (agar, caldo), Agua de peptona y Cepas: Staphylococcus aureus ATCC
25923, Salmonella enteritis ATCC 13076, Listeria monocytogenes ATCC 15313.
Figura 2. Aislamiento de las muestras sembradas en medios selectivos
Calle López 7
1.4. Método microbiológico de aislamiento e identificación de Lactobacillus
Después de revisar las placas de las muestras sembradas se realiza tinción de Gram y en ella
podemos evidenciar la presencia de una o varias colonias, para las que presentaron diversas
colonias se volvió a aislar mediante los medios selectivos, mientras que para aquellas que
presentaron una solo colonia se continua con el siguiente paso que son las pruebas bioquímicas
usando el método API 50 que es específico para cepas de los géneros Bacillus y Lactobacillus.
Las pruebas API se realizaron para dos muestras de interés aisladas del medio M17 la número 1
y del medio MRS la número 4, el test consiste en un método estándar que consta de 50
microtubos que contienen diferentes sustratos.
Primero preparamos la suspensión de la muestra aislada y la colocamos en el diluyente que viene
en el test, posteriormente se inocula en cada capsula de la galería al finalizar se cubre cada
cápsula con aceite mineral para garantizar la anaerobiosis. Se incuba las galerías a 37°C durante
48 horas y después de este tiempo se procede a leer los resultados en el programa informático
APIWEB en el laboratorio de microbiología de la Universidad del Azuay.
La fermentación de los sustratos implica un cambio de color en la cápsula que viene determinado
por un indicador de pH incorporado en cada sustrato y al finalizar las cepas de bacilos ya
identificadas por el sistema se crioconservaron a menos 80°C para los ensayos posteriores.
Figura 3. Preparación de las pruebas bioquímicas API 50
Calle López 8
1.5. Método de evaluación de actividad antimicrobiana
Determinación de la actividad antibacteriana por el método de difusión en agar:
Primero sembramos las muestras ya identificadas por el test API en tubos falcon de 15ml, para
Lactobacillus paracasei se siembra en caldo MRS y para Lactobacillus plantarum en caldo TSA,
se colocan en la jarra de anaerobiosis y en estufa a 37°C durante 24 horas.
Mientras tanto preparamos los medios para la inoculación de los discos de Lactobacillus
plantarum y Lactobacillus paracasei se realiza el medio MRS colocando 10ml del mismo en cada
caja Petri.
Para las cepas patógenas se realiza el medio TSA y se siembra 10 ul de manera estriada, se
incuba a 37°C en estufa.
Cumplidas las 24 horas de siembra de los lactobacilos se igualan a un patrón McFarland 2 y se
inoculan a manera de disco sembrando 2ul en puntos designados por triplicado en la caja Petri
con agar MRS, se deja secar y lo utilizamos luego de 8 horas.
Continuamos con la preparación de agar blando que será nuestro césped que contiene las cepas
patógenas este agar deberá permanecer a 45°C para evitar su solidificación, sacamos de la
estufa las cepas sembradas en agar TSA y en tubo falcon estéril con suero fisiológico lo llevamos
a un patrón McFarland 0,5 que se evidencia con la densidad óptica medida en el
espectrofotómetro.
Por cada 9ml de agar blando se adiciona 1 ml de cepa patógena se mezcla en el vortex y se vierte
sobre las cajas Petri ya inoculadas con los discos de lactobacillus. Se deja 24 horas en la estufa
a 37°C.
Se observó la formación de zonas de inhibición alrededor de las BAL, lo cual se consideró como
prueba positiva de la actividad antagónica y a su vez se obtuvo el diámetro corregido de los halos
formados, se realizó la sustracción del diámetro de la colonia y el diámetros del halo de inhibición.
Este procedimiento se efectuó por triplicado.
Calle López 9
Figura 4. Preparación del ensayo de actividad antibacteriana
Una vez realizado los análisis, los resultados serán analizados y discutidos para poder llegar a
las conclusiones de este trabajo.
Calle López 10
CAPITULO II
RESULTADOS
Los resultados obtenidos de las metodologías antes indicadas son:
2.1. Aislamiento e identificación de las bacterias ácido láctico
Al realizar la tinción de Gram se evidencia la forma de lactobacilos alargados para el caso de
la muestra número 1 y la forma de cocos bacilos para la muestra número cuatro:
Figura 5. Tinción de Gram muestra N° 4
Figura 6. Tinción de Gram muestra N° 1
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2.2. Perfil Bioquímico de las BAL.
Los resultados obtenidos en las pruebas de galería API constituyen el perfil bioquímico de las
cepas, que tiene su fundamento en el cambio de color que se ha desarrollado en cada
capsula, y fueron los siguientes:
Figura 7. Resultado del API TEST para muestra MRS N° 4 el perfil fue Lactobacillus paracasei ssp con un 99.8% de tipificación
Figura 8. Resultado del API TEST para muestra M17 N° 1 el perfil fue Lactobacillus plantarum
con un 95.3% de tipificación
Calle López 12
2.3. Evaluación de la actividad antibacteriana
Evaluación de la actividad antibacteriana, aquí se observan los halos de inhibición alrededor
de los inóculos que evidencian la presencia de compuestos que inhiben el crecimiento de las
cepas patógenas. Las zonas de inhibición se miden en milímetros (mm).
La actividad inhibitoria se calcula por la medida del diámetro de la inhibición producida (mm)
menos el diámetro del inoculo (mm).
Se puede observar claramente el diámetro del inoculo y la inhibición producida en el método
de difusión del agar, en las siguientes figuras.
Figura 9. Pruebas de actividad antibacteriana en Lactobacillus paracasei contra Salmonella enteritis y Staphylococcus aureus
Calle López 13
Figura 10. Pruebas de la actividad antibacteriana en Lactobacillus plantarum contra Salmonella enteritis y Listeria monocytogenes
2.4. Pruebas estadísticas de la inhibición en placa por el método de difusión del agar
de las BAL obtenidas contra las cepas de Gram negativos y Gram positivos muestras
realizadas por triplicado.
Tabla 2. Resultados obtenidos por el método de difusión del agar, halos de inhibición resultantes por triplicado usando Lactobacillus paracasei contra las cepas de Salmonella
enteritis y Staphylococcus aureus
Lactobacillus paracasei
Halos en mm replica
Cepa ATCC 1 2 3
Salmonella enteritis 13 12 12
Staphylococcus aureus 12 11 11
Tabla 3. Resultados obtenidos por el método de difusión del agar, halos de inhibición resultantes por triplicado usando Lactobacillus plantarum contra las cepas de Listeria
monocytogena y Salmonella enteritis
Lactobacillus plantarum
Halos en mm replica
Cepa ATCC 1 2 3
Listeria monocytogenes 7 8 7
Salmonella enteritis 12 12 12
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Pruebas no paramétricas. Prueba de Mann-Whitney para Lactobacillus plantarum
Con esta prueba lo que podemos observar es como actúa Lactobacillus plantarum frente a la
cepas de Listeria monocytogenes vs Salmonella enteritis al realizar la prueba de inhibición
por triplicado.
Rangos
Bact N Rango
promedio
Suma de
rangos
Re
p1
Listera 1 1,00 1,00
Salmonella 1 2,00 2,00
Total 2
Re
p2
Listera 1 1,00 1,00
Salmonella 1 2,00 2,00
Total 2
Re
p3
Listera 1 1,00 1,00
Salmonella 1 2,00 2,00
Total 2
Tabla 3. Pruebas no paramétricas Prueba de Mann-Whitney Cepas de Listeria
monocytogenes vs Salmonella con respecto a Lactobacillus plantarum
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Estadísticos de contrastea
Rep1 Rep2 Rep3
U de Mann-Whitney ,000 ,000 ,000
W de Wilcoxon 1,000 1,000 1,000
Z -1,000 -1,000 -1,000
Sig. asintót. (bilateral) ,317 ,317 ,317
Sig. exacta [2*(Sig.
unilateral)] 1,000b 1,000b
1,000b
a. Variable de agrupación: Bact
b. No corregidos para los empates.
Figura 11. Cepas de Listeria monocytogenes vs Salmonella enteritis con respecto a Lactobacillus plantarum (ensayo por triplicado)
Calle López 16
.
Pruebas no paramétricas. Prueba de Mann-Whitney para Lactobacillus paracasei
Con esta prueba lo que podemos observar es como actúa Lactobacillus paracasei frente a
la cepas de Salmonella enteritis vs Staphylococcus aureus al realizar la prueba de inhibición
por triplicado.
Rangos
Bact N Rango
promedio
Suma de
rangos
Re
p1
Salmonella 1 2,00 2,00
Aureus 1 1,00 1,00
Total 2
Re
p2
Salmonella 1 2,00 2,00
Aureus 1 1,00 1,00
Total 2
Re
p3
Salmonella 1 2,00 2,00
Aureus 1 1,00 1,00
Total 2
Tabla 4. Pruebas no paramétricas Prueba de Mann-Whitney Cepas de Salmonella vs
Staphylococcus aureus con respecto a Lactobacillus paracasei
Calle López 17
Estadísticos de contrastea
Rep1 Rep2 Rep3
U de Mann-Whitney ,000 ,000 ,000
W de Wilcoxon 1,000 1,000 1,000
Z -1,000 -1,000 -1,000
Sig. asintót. (bilateral) ,317 ,317 ,317
Sig. exacta [2*(Sig.
unilateral)] 1,000b 1,000b
1,000b
a. Variable de agrupación: Bact
b. No corregidos para los empates.
Calle López 18
Figura 12. Cepas de Salmonella enteritis vs Staphylococcus aureus con respecto a Lactabacillus paracasei (ensayo por triplicado)
Figura 12. Cepas de Salmonella vs Staphylococcus aureus con respecto a Lactobacillus
paracasei por triplicado
Pruebas no paramétricas. Prueba de Mann-Whitney para la cepa de Salmonella enteritis
que es Gram negativa y como es la inhibición frente a L. plantarum vs L. paracasei
Rangos
BAL N Rango
promedio
Suma de
rangos
Re
p1
L plantarum 1 1,00 1,00
L paracasei 1 2,00 2,00
Calle López 19
Total 2
Re
p2
L plantarum 1 1,50 1,50
L paracasei 1 1,50 1,50
Total 2
Re
p3
L plantarum 1 1,50 1,50
L paracasei 1 1,50 1,50
Total 2
Tabla 5. Pruebas no paramétricas Prueba de Mann-Whitney Lactobacillus plantarum vs
Lactobacillus paracasei con respecto a Salmonella
Estadísticos de contrastea
Rep1 Rep2 Rep3
U de Mann-Whitney ,000 ,500 ,500
W de Wilcoxon 1,000 1,500 1,500
Z -1,000 ,000 ,000
Sig. asintót. (bilateral) ,317 1,000 1,000
Sig. exacta [2*(Sig.
unilateral)] 1,000b 1,000b
1,000b
a. Variable de agrupación: BAL
b. No corregidos para los empates.
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Figura 13. Lactobacillus plantarum vs Lactobacillus paracasei con respecto a la cepas de Salmonella enteritis
Figura 14. Se indica después del análisis estadístico en la prueba de hipótesis que no existe diferencia significativa entre las muestras
Calle López 21
CAPITULO III
DISCUSIÓN
Durante la elaboración de este trabajo mucha información recolectada ha generado una discusión
sobre el tema clave que gira en torno a la actividad antagónica o inhibición antibacteriana
producida por las bacterias ácido láctico, siendo este el debate principal ya que la identificación y
aislamiento de las BAL son un paso necesario para poder llevar a cabo los siguientes ensayos,
es decir partimos de la presencia de dichas bacterias ácido lácticas su identificación mediante
pruebas bioquímicas para utilizarlas en el método de difusión del agar, en la que obtuve como
resultado la actividad inhibitoria contra una variedad de organismos que compiten en los
alimentos y resultan hoy en día los principales causantes de infecciones alimentarias, las cepas
patógenas escogidas fueron Staphylococcus aureus, Salmonella enteritis, Listeria
monocytogenes.
Es un tema de gran importancia por las investigaciones realizadas en el margen de hallar nuevos
compuestos que contengan esta actividad bactericida para la industria alimenticia, este trabajo
ayuda con el primer escalón en un proceso largo que podría continuar con la identificación del
compuesto que está causando esta inhibición, por ejemplo una bacteriocina que resultaría ser
uno de los preservativos de alimentos naturales más prometedores; preservando los alimentos
como resultado de un conocimiento competitivo producto de su metabolismo y de la producción
de dichas sustancias. De esta forma, Lactobacillus plantarum es la cepa más frecuentemente
productora de bacteriocinas, lo cual explica su habilidad para controlar otros microorganismos,
como se puede evidenciar en las pruebas realizadas en este trabajo. (De Vos et al., 2009; Doyle
et al., 2001; 2009)
Las BAL son microrganismos fermentativos que pueden seguir dos rutas metabólicas para
hidrolizar los hidratos de carbono: homofermentativa y heterofermentativa, la primera casi de
manera exclusiva produce ácido láctico, responsable del descenso de pH durante la fermentación
lo que resulta en la inhibición del crecimiento de microorganismos causantes de alteración
alimentaria, mejorando su conservación. (2009; Doyle et al., 2001; Oguntoyinbo & Narbad, 2015)
En este trabajo se realizó el método de ensayo para determinar la actividad antibacteriana en la
que se utilizó Lactobacillus plantarum frente a las cepas de Salmonella y Listeria monocytogenes
las cuales presenta actividad, siendo mayor el poder de inhibición contra la cepa de Salmonella,
Calle López 22
además se analiza también esta cepa utilizada en los dos casos con Lactobacillus plantarum y
paracasei pero en ambos instancias se pudo observar que presenta similar poder de inhibición,
inclusive los halos son casi los mismos para los diferentes Lactobacillus contra este patógeno.
Por lo que podría decir que Lactobacillus plantarum resulta más efectivo contra la cepa Gram
negativa siendo un dato muy interesante ya que según algunos artículos, pocos son los extractos
de bacterias ácido lácticas que han mostrado actividad antimicrobiana frente a este grupo de
bacterias.(Katusic, 2002, 2002; Ming, Zhang, Yang, & Huang, 2015; Oguntoyinbo & Narbad, 2015;
Suárez M, Francisco, & Beirão, 2008)
En el caso de Lactobacillus paracasei probado contra Staphylococcus aureus y Salmonella los
halos de inhibición que se formaron eran muy semejantes entre sí, por lo tanto se podría utilizar
esta referencia de la actividad antibacteriana muy similar tanto para Gram positivo como para
Gram negativo. Para estos resultados se ha tomado como referencia diferentes artículos en los
que el mismo método de ensayo difusión en agar considera la presencia del halo de inhibición
mayor a 2mm como positivo, previamente restando el halo del inoculo del halo formado en la
inhibición.(Anas, Eddine, Mebrouk, & others, 2008; Gudiña, Rocha, Teixeira, & Rodrigues, 2010;
Juodeikiene et al., 2012; Karska-Wysocki, Bazo, & Smoragiewicz, 2010)
Los resultados y el proceso realizado para este tema pueden continuar con ensayos más
específicos en donde se podría determinar el producto que está efectuando esta inhibición para
ello se realizó la crioconservación de las muestras.
Calle López 23
CONCLUSIONES
Se cumplieron los objetivos iniciales de este trabajo es decir el aislamiento e identificación
de bacterias ácido láctico (BAL) presentes en el suero de quesos artesanales
recolectados en diferentes queserias de la provincia del Cañar.
Identificación de las BAL por medios bioquímicos en este caso por medio de la galería
API 50 para dos muestras elegidas de las diez obtenidas con las que se prosiguió el
método de inhibición antimicrobiana.
Determinación de la actividad antibacteriana de BAL en cepas patógenas
(Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella enteritis ATCC 13076, Listeria
monocytogenes ATCC 15313).
Crioconservación de las cepas iniciales o madres, y de las cepas aisladas y purificadas
para ensayos posteriores que podrían ser más específicos en cuanto a determinar las
bacteriocinas se refiere.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Adams M. R, Moss, M. O., & Ramis Verges, M. (1997). Microbiologia de los alimentos: A.R.
Adams, M.O. Moss ; tr. Manuel Ramis Verges. Zaragoza: Acribia.
Anas, M., Eddine, H. J., Mebrouk, K., & others. (2008). Antimicrobial activity of Lactobacillus
species isolated from Algerian raw goat’s milk against Staphylococcus aureus. World J
Dairy Food Sci, 3(2), 39–49.
BACTERIOCIN, O. (2009). Aislamiento de Lactobacillus plantarum LPBM10 y caracterización
parcial de su bacteriocina. Vitae, 16(1), 75–82.
Blackburn, C. de W. (Ed.). (2006). Food spoilage microorganisms. Boca Raton, Fla: CRC Press.
De Vos, P., Whitman, W. B., & Bergey, D. H. (Eds.). (2009). The Firmicutes (2. ed). Dordrecht:
Springer.
Doyle, M. P., Beuchat, L. R., & Montville, T. J. (2001). Microbiología de los alimentos:
fundamentos y fronteras. Zaragoza, España: Editorial Acribia.
Gudiña, E. j., Rocha, V., Teixeira, J. a., & Rodrigues, L. r. (2010). Antimicrobial and antiadhesive
properties of a biosurfactant isolated from Lactobacillus paracasei ssp. paracasei A20.
Letters in Applied Microbiology, 50(4), 419-424. http://doi.org/10.1111/j.1472-
765X.2010.02818.x
Ingraham, J. L., Ingraham, C. A., Prentiss, H., Nieto, J. J., Quesada, E., & Ventosa, A. (1998).
Introducción a la microbiología. Barcelona; México: Reverté.
Juodeikiene, G., Bobinas, C., Eidukonyte, D., Urbonaviciene, D., Bartkiene, E., & Viskelis, P.
(2012). Fermentation processes using lactic acid bacteria producing bacteriocins for
preservation and improving functional properties of food products. INTECH Open
Access Publisher. Recuperado a partir de http://cdn.intechweb.org/pdfs/26396.pdf
Karska-Wysocki, B., Bazo, M., & Smoragiewicz, W. (2010). Antibacterial activity of Lactobacillus
acidophilus and Lactobacillus casei against methicillin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA). Microbiological Research, 165(8), 674-686.
http://doi.org/10.1016/j.micres.2009.11.008
Calle López 25
Katusic, A. (2002). Capacidad antagonista frente a listeria monocytogenes de dos sustancias
tipo bacteriocina utilizadas en combinación con NaCl y CO2. Tesis para optar el grado
de Licenciado en Ingeniria de alimentos. Universidad Austral De Chile Facultad De
Ciencias Agrarias Escuela De Ingeniería En Alimentos. Valdivia, Chile. Recuperado a
partir de http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2002/fam381c/doc/fam381c.pdf
Ming, L., Zhang, Q., Yang, L., & Huang, J.-A. (2015). Comparison of antibacterial effects
between antimicrobial peptide and bacteriocins isolated from Lactobacillus plantarum on
three common pathogenic bacteria. International Journal of Clinical and Experimental
Medicine, 8(4), 5806-5811.
Oguntoyinbo, F. A., & Narbad, A. (2015). Multifunctional properties of Lactobacillus plantarum
strains isolated from fermented cereal foods. Journal of Functional Foods, 17, 621-631.
http://doi.org/10.1016/j.jff.2015.06.022
Suárez M, H., Francisco, A. de, & Beirão, L. H. (2008). INFLUENCIA DE BACTERIOCINAS
PRODUCIDAS POR Lactobacillus plantarum LPBM10 SOBRE LA VIDA ÚTIL DE
FILETES DEL HÍBRIDO DE CACHAMA Piaractus brachypomus x Colossoma
macropomum EMPACADO AL VACÍO: INFLUENCE OF BACTERIOCINS PRODUCED
BY Lactobacillus plantarum LPBM10 ON SHELF LIFE OF CACHAMA HYBRID FILLETS
Piaractus rachypomus x Colossoma macropomum VACUUM PACKAGED. Vitae, 15(1),
32-40.