departamento de ciencias médicas básicas facultad de
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Departamento de Ciencias Médicas Básicas
Facultad de Medicina
Universidad CEU San Pablo
Identificación y evaluación clínica de proteínas solubles
y exosomales del cáncer de colon activado por
endotoxinas de Escherichia coli
TESIS DOCTORAL
Madrid, 2016
Cira García de Durango
Directores:
Dr. Fernando Vidal Vanaclocha
Dra. Marina Pérez Gordo
A Nico
A mi familia
“Die Grezen meiner Sprache bedeuten die Grezen meiner Welt.”
(Los límites de mi lenguaje son los límites de mi mundo.)
Ludwig Wittgenstein
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer al Dr. Fernando Vidal Vanaclocha y a la Dra. Marina Pérez
Gordo su dirección y tutela durante estos años. Gracias, además, a la Fundación CEU
San Pablo y al banco Santander, sin cuya financiación nada de esto habría sido posible.
Tampoco lo habría sido sin la colaboración de HM-Hospitales Madrid y sin todos los
pacientes que cedieron las muestras al estudio.
I would like to thank to Dr. Connnie Jimenez, Dr. Remond Fijneman and Dr.
Meike de Wit all the support and the warm welcome in the Cancer Center Amsterdam
and in Oncoproteomics laboratory, particulally. It was a big pleasure working with
you, I just can define as gezellig.
Merece mis agradecimientos el Dr. Domingo Barber, por brindarme la
posibilidad de trabajar en su grupo y por facilitarme la labor investigadora. Gracias a
la Dra. María Escribese, por confiar en mí y dar un fuerte impulso a la investigación
en el IMMA. Gracias al Dr. José Manuel Pozuelo y Tomás Chivato, por la cálida acogida
en el Departamento de Ciencias Médicas Básicas.
Quisiera agradecer a todo el grupo de Cirugía Digestiva de Hospitales Madrid
la labor que han llevado a cabo de recogida de muestras, desde Sanchinarro,
Montepríncipe y Torrelodones. Quisiera mencionar a Catalina Oliva, al Dr. Fernando
Lapuente, Emilio de Vicente, Felipe Acedo y Vicente Fernández Nespral, así como a
todo el equipo que rescata día a día a miles de pacientes.
Gracias a la gente de la Fundación Jiménez Díaz, del laboratorio de Alergia e
Inmunología; y también a el equipo del Hospital de Parapléjicos de Toledo. Sin
vosotros no habría sido posible.
A todos los profesores del departamento de Ciencias Médicas Básicas,
especialmente a Isabel, por estar desde el inicio y querer trabajar conmigo. Tu
confianza en mí ha sido un pilar muy importante. Gracias Eva por estos últimos meses
en que he tenido la oportunidad de trabajar contigo. Gracias también a Arancha,
Charo, Verónica, Juanan, Beatriz Oltra, María, Riánsares, Esther Escudero, Esther
Durán, Cruz y Rima. Gracias por todos los buenos momentos y las palabras de aliento,
además del contrabando de horas. Gracias a Ángel Ayuso por el apoyo durante estos
años.
Gracias a Beti, mi co-directora de vida. Gracias por estar ahí a cualquier hora
del día, cualquier día del año. Como alguien escribió, entre nosotras sobran las
palabras. Gracias Dani. Qué te voy a decir que no te haya dicho ya. Me alegro de
haberte conocido (aunque niegues, preferías leer el 20minutos antes que hablarnos
durante el desayuno en Arturo´s). Sin tu ayuda habría sido todo un poco más difícil.
Gracias a los doctores, Luis y Pía, por vuestra amistad en primer lugar y por todo lo
que aprendí de vosotros. No hay día en que no os eche de menos en el laboratorio.
Gracias Noe, por tus consejos y tu sentido del humor. Gracias por esos momentos en
el despacho (si, viendo vídeos de pedidas) y fuera de él. Eres muy grande. Gracias
Álvaro por el apoyo durante mis primeros pasos en el laboratorio. Gracias Susana, por
tener siempre ánimos y apoyo. Gracias Ricardo, por todos estos años juntos. Gracias
Javi por darme la bienvenida en Ámsterdam y por tu ayuda. Gracias Soni, por una
inmejorable compañía durante prácticas y durante la vida no-prácticas (que por lo
visto, existe). Gracias a todos aquellos que me habéis acompañado en mi aventura en
el laboratorio del IMMA: Pepa, Paloma, Pilar, Irene B, Irene G, Virginia, Susana
Arahuetes e Ignacio.
Gracias a mis amigos por el apoyo incondicional. Gracias chicas del cole por
escucharme y comprenderme, por los viajes, las risas y, últimamente, las despedidas
de soltera y las bodas. Gracias Marsu. Aunque no lo diga en voz alta, te quiero
muchísimo. Un rato contigo vale más que cualquier terapia. Tú has entendido muy
bien la locura transitoria que me ha invadido estos meses de encierro. Cris, tal vez lo
que te hace grande no entienda de cómo y porqué. Almu, gracias por la alegría vital
(no me refiero sólo a las fiestas en tu casa). Gracias Irene, Mariaje, Jara, Alex, Andy,
Nuria y Luci. Por tener una sonrisa y una palabra cariñosa en cualquier momento.
A mis Farmas, mil millones de gracias. Anita, Henar, Moni, Blanca e Irene: me
alegro de formar parte de la pandilla basurilla. Gracias por tu humor chanante, Moni;
por ser una esencia que se guarda en un frasco pequeño, Anita; por ser tan auténtica
Henar, y porque tu valentía me ha inspirado cuando quería tirar la toalla. Blanqui,
genio y figura, gracias por aguantar los mil y un desahogos; Irene: gracias por creer
en mí y entusiasmarte con la ciencia. Pollo: gracias por aguantarme cada día durante
dos años, tarea no siempre sencilla, especialmente en los últimos meses. Gracias no
solo por escuchar mis TFMs y mis cosas; también por infundirme calma y enseñarme
que la solución a los problemas puede ser la más sencilla. No sé de quién salió, pero
fue una gran idea compartir espacio vital contigo, te voy a echar mucho de menos.
Viva la rebotica party house (hay que acabar JdT).
Gracias a los Ibicencos, Vane y Jesús, por quererme tal y como soy y disfrutar
de mi compañía; sois increíbles. Gracias por poneros tristes si falto 9 meses, gracias
por interesaros por mi vida y el progreso de mi trabajo. Siempre recordaré nuestra
época de sábados infinitos por el centro de Madrid.
I cannot pass without mention Joey, the stunning MD. Thank you for the
welcome in the Oncoproteomics and in the Netherlands, the student bar, the dutch
lessons and your visits to Madrid. Inge, thank you for teaching me the importance of
honesty; and all the Oncoproteomics: Davide, Marc, Sander, Thang, Carolien, Jaco,
Robin and Tessa. Gracias Javier, has sido un apoyo muy importante en Adam. Gracias
por dar la idea de las fiestas en Uilenstede y por abrirme tu casa cuando lo he
necesitado. Sabes que eres mi referente internacional para la ciencia.
Me faltan palabras para mis padres, hermanos, hermanos políticos y sobrinas.
La familia no es algo que se pueda elegir; pero, si volviera a nacer y se me presentase
la oportunidad, no albergaría duda alguna. Papá y Mamá, gracias por no decirme
nunca que es suficiente, que ya puedo dejar de formarme y estarme quieta. Gracias
por todo el apoyo que me habéis dado desde que era una niña y, como diversión,
quería hacer trabajos de Conocimiento del Medio. Vuestro ejemplo y capacidad de
sacrificio ha calado muy hondo en el pentágono. Mada, Ague, Pablo y Gabi, gracias.
Gracias por quererme, enterderme y por ser siempre sinceros conmigo. Alma y Luna,
sois la alegría de la familia. Ver vuestra carita todavía me parece un milagro. Gracias
Gonzalo y Nacho por hacer felices a mis sis, ambos sois geniales.
Gracias Abuela Consuelo, por hacerme doctora casi desde sexto de primaria.
Abuelos Ángel, Concha y Julio, dondequiera que estéis, sois responsables de todas las
cosas buenas que me ocurran.
Ti voglio ringraziare, Nico, per essere stato semplicemente te; e per avermi
insegnato che la felicità è la strada. Without you, it wouldn´t have been posible; this
amazing adventure. Me has enseñado a ver la vida de otra forma, gracias por cruzar
mar y tierra y venirte hasta aquí conmigo. Gracias por todo lo que, de una manera u
otra, me ha hecho poder terminar esta tesis.
Gracias a todos los que habéis creído en mí, aunque cometa el error de
olvidarme de vuestro nombre.
RESUMEN
RESUMEN
Inflamación y cáncer están interrelacionados durante la carcinogénesis y la
diseminación corporal del cáncer y la metástasis. Más aún, numerosas moléculas
inflamatorias y patógenos microbianos promueven el desarrollo de tumores
experimentales, habiéndose demostrado una asociación entre la respuesta
transcripcional que el lipopolisacárido (LPS) activa a través de TLR4 y la vía NFκB, y
los mecanismos moleculares de carcinogénesis y metástasis. Sin embargo, por el
momento se desconoce la naturaleza y expresión de los factores solubles y
exosomales vinculados a la respuesta tumoral al LPS y sus posibles correlaciones con
la transcripción de genes prometastásicos.
El presente trabajo se planteó con dos objetivos: 1) estudiar la respuesta
funcional de células en cultivo del CCR humano a las endotoxinas de LPS a través de
la identificación de moléculas dependientes de LPS en su secretoma mediante
métodos de proteómica; y 2) analizar la expresión génica de las moléculas del CCR
dependientes de LPS y su posible asociación a genes prometastásicos conocidos. Los
resultados obtenidos demostraron que la acción del LPS sobre la línea HT-29 de CCR
humano indujo una respuesta transcripcional y secretora de citocinas que imitó a la
de los monocitos activados por LPS. El estudio mediante 2D-PAGE y espectrometría
de masas del sobrenadante de las células HT-29 identificó 16 moléculas solubles
específicas de la respuesta a LPS, mostrando muchas de ellas un aumento de
expresión génica en la lesión tumoral frente a mucosa normal de pacientes con CCR,
y una interrelación con genes prometastásicos. Más aún, se identificaron subgrupos
de pacientes en los que la naturaleza funcional de genes prometastásicos y
dependientes de LPS fue distinta. Por último, al estudiar el secretoma de HT-29 junto
con el de otras cinco líneas celulares más de CCR humano, mediante cromatografía
líquida y espectrometría de masas, se demostró que con independencia de la
expresión de TLR4 y de la translocación nuclear de p65 en respuesta a LPS, las
proteínas LPS-dependientes fueron mayoritariamente de tipo exosomal, estando un
10% asociadas por trabajos previos a la metástasis hepática del CCR. Por tanto, la
respuesta del CCR a LPS conlleva la secreción de proteínas solubles y especialmente
exosomales, cuya expresión de sus genes se asocia a la de otros conocidos por sus
implicaciones prometastásicas.
RESUMEN
ABSTRACT
Inflammation and cancer are interrelated both in the initial progress of
carcinogenesis and in the cancer spread and distant metastasis. Moreover, microbial
pathogenes and several inflammatory molecules are known to promote cancer
development, and it has been shown an assotiation between the transcirptional
response activated by lipopolysaccharide (LPS) through TLR4 and NFκB pathway,
and other carcinogenesis and metastasis mechanisms. However, the identity and
expression of soluble and exosomal factors linked to LPS-tumor response and its
possible prometastatic genes response, remains to be elucidated.
The present work aimed two main goals: 1) to study the functional response
of colorectal cancer (CRC) established cell lines to bacterial endotoxin through the
LPS-dependent molecules identification employing proteomic techniques; and 2) to
analyze LPS-dependent molecules gene expression and its association with known
prometastic genes. The results showed that LPS action over human CRC cell line HT-
29 induced a transcriptional and citokine secreting response that mimicked LPS-
activated monocytes. The 2D-PAGE and mass spectometry study in the supernatant
of HT-29 cells identified 16 HT-29 LPS-dependent soluble proteins, many of them
showing a gene expression increase in tumoral lesion when compared to normal
mucosa in CRC patients, and a relation with prometastatic genes. Moreover,
subgroups of patients in which the functional nature of prometastatic and LPS-
dependent genes was different were identified.
Finally, to study the secretome HT-29 along with other five human CRC cell
lines, by liquid chromatography and mass spectrometry, it was shown that regardless
of TLR4 expression and p65 nuclear translocation in response to LPS, LPS-dependent
proteins were mostly exosomal type. Around 10% of these exosomal LPS-regulated
proteins had been associated to CRC liver metastasis in previous studies. Therefore,
CRC response to LPS involves soluble and especially exosomals protein secretion,
whose genes expression is associated with other known prometastatic genes.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 29
1.1. PATOGENIA Y FISIOPATOLOGÍA DEL PROCESO DE METÁSTASIS DEL CCR .... 29
1.1.1. Histofisiología de la mucosa colónica ................................................................... 29
1.1.2. Microbiología de la mucosa del colon ................................................................... 34
1.1.3. Inmunidad de la mucosa del colon ......................................................................... 36
1.1.4. Rutas de patogénesis del CCR ................................................................................... 40
1.1.5. Invasión y metástasis del CCR .................................................................................. 54
1.2. PAPEL PROCARCINOGÉNICO Y PROMETASTÁTICO DE LOS FACTORES
MICROBIANOS E INFLAMATORIOS ........................................................................................... 58
1.2.1. Inflamación y cáncer ................................................................................................... 58
1.2.2. Agentes infecciosos y cáncer .................................................................................... 61
1.3. BIOMARCADORES MOLECULARES DE PROGRESIÓN Y DE PREDICCIÓN DEL
RIESGO DE METÁSTASIS DEL CCR............................................................................................. 65
1.3.1. Patrones de expresión génica de CCR .................................................................... 65
1.4. EXOSOMAS EN LA BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS DE CÁNCER ................................. 69
1.4.1. Exosomas: concepto y efectos funcionales ........................................................... 69
1.4.2. Exosomas en el proceso de invasión y metástasis del cáncer. ....................... 71
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ........................................................................................................... 75
2.1. ANTECEDENTES ................................................................................................................... 75
2.2. HIPÓTESIS ............................................................................................................................... 79
2.3. OBJETIVOS Y DISEÑO METODOLÓGICO DEL ESTUDIO ........................................ 79
3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 83
3.1. REACTIVOS Y SOLUCIONES ......................................................................................... 83
3.1.1. Soluciones de uso general ..................................................................................... 83
3.1.2. Reactivos biológicos ................................................................................................ 84
3.2. LÍNEAS CELULARES ....................................................................................................... 85
3.3. ENSAYO DE TETRAZOLIO (MTT) .............................................................................. 85
3.4. OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SECRETOMA ...................................................... 86
3.5. OBTENCIÓN DE ARN Y PASO A ADNc ..................................................................... 87
3.6. CUANTIFICACIÓN DEL ARN POR PCR ..................................................................... 87
3.8. DEPLECIÓN DE PROTEÍNAS SÉRICAS POR INMUNOAFINIDAD ................... 90
3.9. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL (2D-PAGE-SDS) ....................................... 91
3.9.1. Isoelectroenfoque (1ª dimensión) ...................................................................... 91
3.9.2. SDS-PAGE (2ª dimensión) ..................................................................................... 91
3.9.3. Análisis de spots ....................................................................................................... 92
3.9.4. Corte de spots y digestión de proteínas ............................................................ 93
3.9.5. Espectometría de masas (MALDI TOF-TOF) ................................................... 94
3.10. ANÁLISIS DE ARN DE PACIENTES CON CCR .................................................... 95
3.10.1. Selección de pacientes ............................................................................................ 95
3.10.2. Extracción de material genético ......................................................................... 95
3.10.3. PCR a tiempo real con Arrays de Baja Densidad con sondas Taqman. . 95
3.10.4. Análisis de datos ....................................................................................................... 98
3.11. ESTUDIO DE GENES LPS-DEPENDIENTES EN MUCOSA NORMAL FRENTE
A CCR ..............................................................................................................................................98
3.12. INMUNOFLUORESCENCIA PARA TRANSLOCACIÓN NUCLEAR DE NFkB
............................................................................................................................. .................99
3.12.1. Protocolo de inmunofluorescencia .................................................................... 99
3.12.2. Captura y análisis de imagen ............................................................................... 99
3.13. AISLAMIENTO Y ANÁLISIS DEL SECRETOMA SOLUBLE Y LOS EXOSOMAS
PROCEDENTES DE CÉLULAS DE CCR EN CULTIVO ...................................................... 101
3.13.1. Aislamiento del secretoma .................................................................................. 101
3.13.2. Aislamiento de exosomas por ultracentrifugación..................................... 102
3.13.3. Western blot fluorescente para evaluar la presencia de exosomas ...... 102
3.13.4. SDS-PAGE y digestión tríptica de las bandas del gel de poliacrilamida103
3.13.5. Espectometría de masas (LC-MS/MS) ............................................................ 104
3.13.6. Identificación de proteínas ................................................................................. 105
3.13.7. Cuantificación de proteínas ............................................................................... 105
3.13.8. Análisis de datos ..................................................................................................... 106
4. RESULTADOS .......................................................................................................................... 111
4.1. MODELO DE RESPUESTA FUNCIONAL DEL CCR HUMANO HT-29 TRAS SU
EXPOSICIÓN A LPS. .................................................................................................................... 111
4.1.1. Viabilidad celular mediante ensayo colorimétrico de MTT .................... 111
4.1.2. Determinación mediante RT-PCR de la actividad transcripcional del gen
VEGFA en células HT-29 tratadas con LPS ..................................................................... 112
4.1.3. Estudio mediante Luminex de la secreción de citocinas en células HT-29
tratadas con LPS...................................................................................................................... 113
4.1.4. Identificación mediante 2D-PAGE-MS de moléculas secretadas
dependientes de LPS en cultivos de HT-29 ...................................................................... 117
4.2. ESTUDIO TRANSCRIPCIONAL DE GENES DEPENDIENTES DE LPS EN
LESIONES PRIMARIAS DE PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL AVANZADO.
…………………………………………………………………………………………………………125
4.2.1. Estudio sobre la expresión de genes dependientes de LPS en mucosa
colónica normal y tumoral. .................................................................................................. 125
4.2.2. Asociación transcripcional de los genes de HT-29 dependientes de LPS a
genes prometastásicos en lesiones primarias de pacientes con CCR. .................... 129
4.3. MODELO DE RESPUESTA A LPS DE 6 LÍNEAS CELULARES DE CCR HUMANO.
............................................................................................................................. .....................138
4.3.1. Expresión de TLR4 ................................................................................................. 138
4.3.2.. Translocación nuclear NFkB mediante inmunofluorescencia. .............. 142
4.3.3. Enriquecimiento en marcadores exosomales de las vesículas extracelulares
asiladas por ultracentrifugación ....................................................................................... 146
4.3.4. Identificación de proteínas LPS-dependientes en 6 líneas celulares .... 150
5. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 157
6. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 171
7. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................... 179
8. ANEXOS ..................................................................................................................................... 199
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Regiones anatómicas del intestino grueso. ........................................................... 29
Figura 2: Estructura histológica de las criptas de Lieberkühn. ........................................ 31
Figura 3: Irrigación del colon.. ....................................................................................................... 32
Figura 4: Estructura de la microcircuclación en la mucosa colónica. ............................. 33
Figura 5: Drenaje linfático del colon.. ......................................................................................... 34
Figura 6: Contenido bacteriano a lo largo del tracto gastrointestinal............................ 35
Figura 7: El Sistema immune a lo largo del tracto gastrointestinal. ............................... 39
Figura 8: Fracciones de casos de CCR que se dan ante ciertos factores de riesgo
familiares. ................................................................................................................................................ 40
Figura 9: Secuencia adenoma-carcinoma y alteraciones moleculares asociadas ...... 42
Figura 10: El microambiente tumoral según Augsten, et al., 2010. ................................ 54
Figura 11: Mecanismos de carcinogénesis colorrectal mediados por la inflamación
..................................................................................................................................................................... 62
Figura 12: Ruta de señalización de TLR-4................................................................................. 64
Figura 13: Biogénesis de los exosomas. ..................................................................................... 70
Figura 14: Esquema de los ciclos de amplificación de la PCR cuantitativa. ................. 88
Figura 15: Secuencia de adición de reactivos para el procedimiento de
inmunodeteción Luminex ™. ............................................................................................................ 89
Figura 16: Fundamento de la técnica de depleción de las proteínas séricas
mayoritarias por inmunoafinidad. ................................................................................................ 90
Figura 17: Fundamento de la técnica de electroforesis bidimensional. ........................ 92
Figura 18: Esquema de realización del protocolo para TLDA. .......................................... 96
Figura 19: Cuantificación de la translocación nuclear mediante análisis de imagen.
................................................................................................................................................................... 101
Figura 20: Diagrama de flujo para la identificación de proteínas secretadas en
respuesta al LPS por 6 líneas celulares de CCR. ..................................................................... 107
Figura 21: Ensayo de MTT para medir la viabilidad celular tras la incubación de la
línea HT-29 de CCR humano con concentraciones crecientes de LPS. .......................... 112
Figura 22: Resultados de expresión génica de VEGFA en las células HT-29 tras el
tratamiento con LPS. ....................................................................................................................... 113
Figura 23: Concentración en pg/ml de IL-18 (A), MCSF (B), MIF (C), SCF (D) y GROα
(E) medida mediante Luminex© en el sobrenadante de células Ht29 en cultivo,
tratadas con LPS. ................................................................................................................................ 116
Figura 24: Geles bidimensionales. Imágenes escaneada de los geles de poliacrilamida
resultantes de la separación isoelectroforética y por peso molecular del secretoma de
la línea celular HT-29 en condiciones basales (A) y tras el tratamiento con 1 µ/ml de
LPS (B).. .................................................................................................................................................. 118
Figura 25: Zonas de localización de las proteínas expresadas diferencialmente en los
geles resultantes de la separación bidimensional del secretoma de la línea celular HT-
29. ............................................................................................................................................................. 121
Figura 26: Detalle de las zonas del gel bidimensional control y tratado con LPS en que
se ubicaron las proteínas diferencialmente secretadas. ..................................................... 122
Figura 27: Expresión de los genes de HT-29 dependientes de LPS en mucosa normal
(MN, serie naranja) y tumoral de pacientes con cáncer colorectal (CCR, serie azul)
............................................................................................................................................................... 127-8
Figura 28: Diagrama de cajas de los valores promedio y dispersión en la expresión de
los genes de HT-29 dependientes de LPS en función de los Ct normalizados con
respecto al gen constitutivo HPRT1, en biopsia de lesión primaria de pacientes con
CCR. .......................................................................................................................................................... 131
Figura 29: Dendrograma de conglomerados jerárquicos basados en distancias
euclídeas al cuadrado (combinación de conglomerados de distancia re-escalados) de
los 62 genes incluidos en las placas TLDA para el estudio cuantitativo de la expresión
génica mediante RT-PCR, de muestras obtenidas de 41 lesiones primarias de CCR.
................................................................................................................................................................... 133
Figura 30: Mapa de calor (HeatMap) para representar el nivel de expresión de los
distintos genes analizados en función de las muestras obtenidas de los pacientes con
CCR. .......................................................................................................................................................... 137
Figura 31: Inmunofluorescencia para TLR4 en 6 líneas de CCR. ................................... 139
Figura 32: Inmunofluorescencia para TLR4 en seis líneas de CCR tras la estimulación
con LPS.. ................................................................................................................................................. 141
Figura 33: Inmunofluorescencia para cuantificar la translocación nuclear de NFκB
tras el tratamiento con LPS en seis líneas celulares de CCR. . ...................................... 143-5
Figura 34: Western blot en seis líneas celulares de CCR para PDCD6IP y TSG101,
marcadores exosomales típicos. .................................................................................................. 146
Figura 35 : Marcadores exosomales medidos por spectral counting en las fracciones
SS yy EVs del secretoma para 6 líneas celulares de CCR. ..............................................148-9
Figura 36: Porcentaje de proteínas del secretoma soluble en cada una de las
categorías efectuadas según su relación con el CCR y su metástasis hepática de cada
uno de los grupos resultantes tras el tratamiento con LPS. .............................................. 152
Figura 37: Porcentaje de proteínas del secretoma soluble en cada una de las
categorías efectuadas según su relación con el CCR y su metástasis hepática de cada
uno de los grupos resultantes tras el tratamiento con LPS ............................................... 153
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Síndromes de CCR hereditario, .................................................................................... 47
Tabla 2: ARNnc cuya pérdida de regulación en CCR se genera por anormalidades
epigenéticas, genéticas y cromosómicas; así como mutaciones de ADN. ...................... 49
Tabla 3: Ejemplos de agentes proinflamatorios que, si perduran en el tiempo, podrían
causar la aparición de diversos tipos de tumores. .............................................................. 58-9
Tabla 4: Taxonomía propuesta para el CCR, reflejando las diferencias biológicas
significativas en cuanto a subtipo molecular basado en la expresión. ............................ 66
Tabla 5: Familias de genes asociados a metástasis. .............................................................. 67
Tabla 6: Biomarcadores de CCR y potencial utilidad como factores de predicción,
pronóstico o de diagnóstico. ............................................................................................................ 68
Tabla 7: Genes relacionados con el proceso de metástasis hepática del CCR
identificados por el grupo y propuestos para su estudio en la presente Tesis Doctoral.
..................................................................................................................................................................... 78
Tabla 8: Lista de genes cuya expresión fue cuantificada mediante RT-PCR en las
muestras de tumores primarios de colon de 41 pacientes. ............................................. 97-8
Tabla 9: Concentración de 21 citocinas y factores de crecimiento en sobrenadantes
de medios de cultivo de la línea celular HT-29. ................................................................. 113-4
Tabla 10: Lista de spots cuya concentración varió significativamente tras el
tratamiento con LPS. ......................................................................................................................... 118
Tabla 11: Proteínas identificadas por MALDI-TOF/TOF tras el análisis por
electrophoresis bidimensional y densitometría óptica de las porteínas secretadas por
la línea cellular HT-29 en respuesta al LPS. ............................................................................. 123
Tabla 12: Valores de expresión media y su desviación estándar para las muestras de
mucosa normal y de CCR, así como para el total de muestras. ........................................ 129
Tabla 13: Distribución de proteínas solubles y exosomales de acuerdo con su
modalidad de cambio de concentración en el secretoma de las seis líneas celulares
humanas de CCR tras el tratamiento con LPS.. ....................................................................... 151
ABREVIATURAS
ADAM23: Proteína 23 con dominio desintegrina y metaloproteinasa (Disintegrin and
metalloproteinase domain-containing protein 23)
ADNc: ADN complementario a un ARNm
AJCC: Comité americano conjunto en cáncer (American Joint Committee on Cancer)
APC: Gen de la poliposis adenomatosa
APS: Persulfato de amonio
ARN: Ácido desoxirribonucleico.
ARNm: ARN mensajero
BMPR1: Receptor tipo 1 de la proteína morfogénica de hueso (Bone morphogenetic
protein receptor, type 1)
BRAF: Gen que codifica para la proteína B-raf
CAF: Fibroblastos asociados a cáncer (cancer-associated fibroblasts)
CAM: Macrófagos asociados a cáncer (cancer-associated macrophages)
CCHNP: Cáncer colorectal hereditario no polipósico
CCR: Cáncer colorrectal
CDH1: Cadherina 1
CDH13: Cadherina 13
CDKN2A: Inhibidor 2A de quinasa dependiente de ciclina (Cyclin-dependent kinase
inhibitor 2A)
CEA: Antígeno carcinoembrionario (Carcinoembryonic antigen)
CCK2R: Receptor B de colecistoquinina (Cholecystokinin B receptor)
CHFR: Proteína ubiquitina E3 ligasa (E3 ubiquitin-protein ligase CHFR)
CIMP: Fenotipo metilador de islas CpG (CpG island methylator phenotype)
CIN: Inestabilidad cromosómica (Chromosomal instability)
c-Jun: Gen que codifica para la proteína c-Jun
CMS: Subtipo molecular de cáncer colorrectal (colorectal cancer molecular subtype)
c-Myc: Proteína protoconcogénica Myc (avian myelocytomatosis viral oncogene
homolog)
COX2: Ciclooxigenasa de tipo 2
CTD: Toxina distensora citoletal (Cytolethal distending toxins)
CXCL8: Interleucina 8
CXCR4: Receptor 4 de quimiocina tipo C-X-C (C-X-C chemokine receptor type 4)
DCC: Gen que codifica para la proteína DCC (delecionada en cáncer colorrectal)
DLEC1: Proteína 1 delecionada en cáncer de pulmón y esófago (Deleted in lung and
esophageal cancer protein 1)
DMEM: Medio de cultivo de Eagle modificado por Dulbeco
DNMT: Metiltransferasa de ADN (DNA methyltransferase)
DTT: Ditiotreitol
EBV: Virus de Epstein-Barr (Epstein-Barr virus)
EMT: Transición epitelio-mesenquimal (Epithelial to mesenchymal transition)
EpCAM: Molécula de adhesión de células epiteliales (Epithelial cell adhesion
molecule)
FAE: Epitelio asociado a folículos (folicle-associated epithelium)
FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos (fibroblasts growth factor)
FOXO4: Proteína O4 forkhead box (Forkhead box protein O4)
Fra-1: Antígeno 1 relacionado con Fos (Fos related antigen 1)
GALT: Tejido linfoide asociado a intestino (Gut-associated lymphoid tissue)
HAT: Acetiltransferasa de histonas (Hitone acetyltransferase)
HBV: Virus de la hepatitis B (hepatitis B virus)
HCV: Virus de la hepatitis C (hepatitis C virus)
HDAC: Desacetilasa de histona (Hisdone deacetylase)
HHV-8: Virus herpes humano tipo 8 (Human herpesvirus 8)
HIV: Virus de la inmunodeficiencia humana (human immunodeficency virus)
hMLH1: Gen humano homólogo de MutL 1 (MutL homolog 1)
hMLH2: Gen humano homólogo de MutL 2 (MutL homolog 2)
HPV: Virus del papiloma humano (human papiloma virus)
HRAS: Gen que codifica para la proteína H-RAS (Harvey rat sarcoma viral oncogene
homolog)
HTVL-12: Virus 12 linfotópico de células T humanas (Human T-lymphotropic virus
12)
H2Omq: Agua ultrapura
H2O2: Peróxido de hidrógeno
IEL: Linfocitos intraepiteliales (Intraepithelial lymphocytes)
IgA: Inmunoglobulina de tipo A
IgM: Inmunoglobulina de tipo M
IL-3: Interleucina 3
IL-4: Interleucina 4
IL-9: Interleucina 9
IL-10: Interleucina 10
IL-13: Interleucina 13
KRAS: Gen que codifica para la proteína K-RAS (V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral
oncogene homolog)
LEF/TCF: Factor reforzador de linfocitos/factor linfocitario T
LPL: Linfocitos de lámina propia (lamina propia lymphocytes)
LPS: Lipopolisacárido
MALT: Tejido linfoide asociado a mucosas
MEC: Matriz extracelular
MET: Receptor del factor de crecimiento de hepatocitos
MGMT: O-6 metilguanina-ADN-transferasa
miARN: Micro-ARN
MIF: Factor inhibidor de la migración de macrófagos (macrophage-inhibitory factor)
MMP: Metaloproteasa de matriz extracelular (Matrix Metalloproteinase)
MMR: Maquinaria de reparación de errores de emparejamiento (mismatch repair)
MSH2: Proteína de reparación de apareamientos incorrectos en el ADN, tipo 2 (MutS
protein homolog 2)
MSH6: Proteína de reparación de apareamientos incorrectos en el ADN, tipo 26 (MutS
protein homolog 6)
MSI: Inestabilidad de microsatélites
MSS: Estabilidad de microsatélites
NFκB: Factor de transcripción nuclear kappa B
PAF: Poliposis adenomatosa familiar
PAI: Inhibidor del activador de plasminógeno (Plasminogen activator inhibitor)
PBS: Solución salina tampón de fosfato (phosphate buffer saline)
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polimerase chain reaction)
PDGF: Factor de crecimiento derivado de plaquetas (platelet-derived growth factor)
PGE2: Prostaglandina E2
PML: Proteína de leucemia polimielocítica (Promyelocytic leukemia protein)
PPAR: Receptor activado por proliferadores de peroxisomas (peroxisome
proliferator-activated receptors)
PSM2: Gen que codifica para la proteína PSM2 (endonucleasa de reparación de
apareamientos incorrectos del ADN)
p53: Proteína supresora de tumores.
RAS: Familia de genes que codifican para diferentes proteínas, pertenecientes a la
superfamilia de GTPasas RAS
ROS: Especies reactivas de oxígeno (reactive oxigen species)
RT-PCR: PCR a tiempo real (real time PCR)
SILT: Tejido linfoide solitario aislado (solitary isolated lymphoid tissue)
SL: Síndrome de Lynch
SPJ: Síndrome de Peutz-Jeghers
TIMP3: Inhibidor tisular de metaloproteasa tipo 3
TGF-β: Factor de crecimiento transformante beta (transforming growth factor beta)
TLR4: Receptor de tipo barrera 4 (Toll-like receptor 4)
TP53: Gen que codifica para la proteína p53
uPA: Activador de plasminógeno tipo urocinasa (urokinase-type plasminogen
activator)
uPAR: Receptor de superficie para uPA
VEGF: Factor de crecimiento vascular endotelial (vascular endotelial growth factor)
INTRODUCCIÓN
1.INTRODUCCIÓN
29
1. INTRODUCCIÓN
1.1. PATOGENIA Y FISIOPATOLOGÍA DEL PROCESO DE METÁSTASIS DEL CCR
1.1.1. Histofisiología de la mucosa colónica
El intestino grueso se encuentra a continuación del intestino delgado y mide
aproximadamente un metro y medio de longitud en el ser humano adulto. Es
responsable de la recuperación de agua y electrolitos del contenido digerido por el
intestino delgado. Además, en el intestino grueso ocurren varios tipos de
fermentaciones bacterianas llevadas a cabo por la microbiota comensal.
Anatómicamente, se compone de los siguientes segmentos sucesivos: ciego, colon,
recto y ano (Abeloff, et al., 2005), como puede observarse en la Figura 1.
Figura 1: Regiones anatómicas del intestino grueso: tras el ciego, el tubo digestivo se continúa en el colon ascendente, transverso, descendente y sigmoideo; para concluir en el recto y comunicar con el exterior mediante el ano.
COLON DESCENDENTE
COLON TRANSVERSO
COLON ASCENDENTE
COLON SIGMOIDEO
RECTO
ANO
CIEGO
1.INTRODUCCIÓN
30
El colon constituye la mayor parte del intestino grueso. Se subdivide en colon
ascendente, colon transverso, colon descendente y sigmoide. El colon es responsable
de absorber el exceso de agua de las heces y de devolver la misma al torrente
sanguíneo.
En la luz del intestino grueso se produce además la secreción de iones
bicarbonato y de moco. Los iones bicarbonato neutralizan el ácido producido por la
fermentación microbiana. El moco no sólo ayuda a mantener el conglomerado de
producto de desecho, las heces; sino que también protege la mucosa intestinal, porque
actúa como un lubricante cuando el material fecal pasa a través del intestino grueso.
El colon descendente está conectado al recto, que almacena temporalmente la materia
fecal hasta que se llena; momento en que las heces son empujadas entonces en el canal
anal y se eliminan del cuerpo (Kierszenbaum, 2008).
El colon carece de pliegues circulares y vellosidades, pero, al igual que el
intestino delgado, tiene invaginaciones, denominadas criptas de Lieberkühn (también
conocidas como glándulas intestinales). En su estructura microscópica se observa un
revestimiento de epitelio simple cilíndrico compuesto por cuatro tipos de células
(Kierszenbaum, 2008), (todas ellas reflejadas en la Figura 2). A este epitelio subyace
un tejido conectivo denso (denominado lámina propia), con fibras de colágeno y
fibroblastos. Debajo de la lámia propia subyace una pequeña capa muscular
(denominada muscular de la mucosa), debajo de la que se asientan los plexos
nerviosos (Plexo de Meissner) y los plexos vasculares constituidos por arteriolas,
vénulas y vasos linfáticos. Debajo existe una capa de tejido conjuntivo denominada
submucosa. A continuación, se encuentra la capa muscular. Esta se compone de dos
capas de células musculares lisas y por ella discurren vasos sanguíneos y linfáticos
que se dirigen hacia la serosa. La capa más interna tiene una orientación circular y la
más externa, de orientación longitudinal, se dispone en tres bandas longitudinales
denominadas teniae coli. Entre ambas capas se encuentra otro plexo nervioso (Plexo
de Auerbach). Las porciones intraperitoneales del colon están recubiertas por la capa
serosa, de naturaleza fibrosa; caracterizada en esta porción del tubo digestivo por la
presencia de pequeñas protuberancias en forma de péndulo, compuestas por tejido
adiposo.
1.INTRODUCCIÓN
31
Figura 2: Estructura histológica de las criptas de Lieberkühn. En el epitelio colónico hay células absortivas, células caliciformes, una población de células germinativas y células enteroendocrinas. Subyacente al epitelio se encuentra la lámina propia (Gartner & Hiatt, 2002).
Los vasos mesentéricos superiores irrigan el ciego, el colon ascendente y una
amplia porción del colon transverso (Figura 3). Las ramas principales de la arteria
mesentérica superior son la arteria ileocólica que irriga la porción ileocecal, la arteria
cólica derecha que nutre el colon ascendente y la rama cólica media para la flexura
hepática y el colon transverso. Estos vasos tienen una ramificación extensa cerca del
colon y contribuyen a la formación de la llamada arteria marginal (arteria marginal
de Drummond). Las venas que acompañan a estas arterias drenan en la vena
mesentérica superior y después en la vena porta. Se cree que este drenaje venoso
único al hígado justifica la elevada incidencia de afectación metastásica de primer
paso en el hígado para el CCR.
La arteria mesentérica superior se origina en la aorta e irriga el colon
descendente a través de la arteria cólica izquierda. La arteria marginal actúa como
vaso colateral al unir las ramas de la arteria mesentérica superior para el colon
derecho con el flujo arterial de la arteria mesentérica inferior y su arteria cólica
izquierda. En posición distal, la arteria mesentérica inferior da lugar a varias arterias
1.INTRODUCCIÓN
32
sigmoides y la arteria rectal superior. Las venas que drenan el lado izquierdo
acompañan a estas arterias y drenan a través de la vena mesentérica inferior en la
vena esplénica y después en la vena porta. La arteria marginal sana y permeable
proporciona una medida de seguridad al realizar resecciones del colon ya que permite
un flujo arterial colateral, tal y como puede apreciarse en la Figura 3 (Abeloff, et al.,
2005).
Figura 3: Irrigación del colon. La arteria mesentérica superior se ramifica en la arteria ileocólica que irriga la porción ileocecal, la arteria cólica derecha que nutre el colon ascendente y la rama cólica media para la flexura hepática y el colon transverso. La arteria marginal surge de la ramificación de estos vasos cerca del colon. El sistema venosos sigue la misma ramificación. (Szereszwski, 2014).
Las grandes ramas arteriales entran a la capa muscular propia y pasan a la
submucosa, donde se ramifican para formar grandes plexos. Las ramas del plexo
submucoso se extienden hacia la superficie, y se ramifican para formar una malla
capilar alrededor de las criptas de Lieberkühn. Desde la malla capilar periglandular,
las venas forman un plexo venoso que recorre la base de las criptas y la muscular de
la mucosa (Figura 4). Estos plexos convergen en la submucosa en un plexo venoso
submucoso, del que parten las venas de mayor calibre siguiendo la misma
distribución que las arterias, atravesando la capa muscular propia hasta la serosa
(Mescher, 2013).
1.INTRODUCCIÓN
33
El Sistema linfático intestinal consiste en dos compartimentos diferenciados:
uno que drena la mucosa (plexo linfático intramural) y otro que drena la capa
muscular (linfáticos extramurales) con vasos y ganglios que acompañan a los vasos
cólicos. Los canales de tejido existentes entre criptas entregan la linfa luminal e
intersticial a los capilares linfáticos que conectan con una red linfática ubicada en la
submucosa (Figura 4). La linfa procedente de la mucosa y del sistema linfático de la
capa muscular se acumula en vasos linfáticos colectores para su transporte a los
nódulos linfáticos de drenaje (Mowat & Agace, 2014).
Los ganglios se distribuyen de la siguiente manera (Figura 5):
Figura 4: Estructura de la microcirculación en la mucosa colónica. Las ramas arteriales entran a la capa muscular propia y pasan a la submucosa, forman plexos submucosos que llegan hasta las criptas, en que se establecen en una malla capilar periglandular Desde aquí, las venas forman un plexo venoso en dirección submucosa. Desde un plexo submucoso, parten las venas de mayor calibre siguiendo la misma distribución que las arterias. Adaptación de Mescher, 2013.
1.INTRODUCCIÓN
34
Epicólicos, aplicados a la pared del colon.
Paracólicos, entre la arcada vascular marginal y el colon.
Intermedios, ubicados en el trayecto de las colaterales de los vasos mesentéricos.
Principales, agrupados en el origen de los troncos de la mesentérica superior e
inferior. Este sería también el orden de la circulación linfática, que termina
confluyendo en los grupos cavo aórtico y desde ahí a la cisterna de Pequet.
1.1.2. Microbiología de la mucosa del colon
En el intestino humano reside un complejo ecosistema bacteriano, albergando
algunos hongos eucariotas, algunos Archaea y, como componente principal 1014
bacterias pertenecientes a más de 1000 especies. El intestino adulto está dominado
por los filos Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria y Actinobacteria, aunque la
composición varía interindividualmente y depende en parte del genotipo del
individuo (Biedermann & Rogler, 2015). La información detallada sobre el perfil
bacteriano a lo largo del tracto gastrointestinal se encuentra en la Figura 6.
La flora intestinal tiene una relación de mutualismo con el cuerpo humano: el
intestino sirve como hábitat para los microorganismos, con una temperatura óptima
y un suministro constante de nutrientes. A cambio, los microorganismos cooperan en
los procesos de digestión de hidratos de carbono y de síntesis de vitaminas y otras
Figura 5: Drenaje linfático del colon. Los ganglios se distribuyen en epicólicos, paracólicos, intermedios y principales de la mesentérica superior (Szereszwski, 2014).
1.INTRODUCCIÓN
35
moléculas que el organismo humano no es capaz de sintetizar, tales como vitamina K,
biotina y ácido pantoténico. Existe un sistema altamente regulado que impide que
estas bacterias puedan cruzar la barrera de la mucosa: algunos componentes de las
paredes celulares bacterianas, como lipopolisacárido (LPS) o peptidoglicano,
estimulan la liberación de productos quimiotácticos por las células epiteliales de la
mucosa, que atraen las células del sistema inmune, especialmente las células
dendríticas, hacia la mucosa (Mowat & Agace, 2014). Las células dendríticas abren las
uniones estrechas entre las células epiteliales y extienden prolongaciones
citoplasmáticas en la luz intestinal para evaluar antígenos microbianos. Una vez han
captado antígenos, las células dendríticas viajan a los folículos linfoides asociados a la
mucosa donde las células T detectan la presencia de antígenos. Estas activan a los
linfocitos B, provocando una respuesta secretora de inmunoglobulinas de tipo A (IgA)
que impide a los organismos comensales invadir la mucosa y desencadenar una
reacción sistémica (Maldonado-Contreras & McCormick, 2011).
Figura 6: Contenido bacteriano a lo largo del tracto gastrointestinal (Mowat & Agace, 2014). Al llegar al intestino grueso, el contenido microbiano se incrementa hasta 1012 microorganismos por mililitro, abarcando especies de Clostridia, Enterobacteria, Enterococos, Bacteroides, Bifidobacteria y Lactobacilli.
1.INTRODUCCIÓN
36
1.1.3. Inmunidad de la mucosa del colon
En el colon humano existen varios elementos que conforman la inmunidad
innata local. En primer lugar, la propia barrera epitelial y las capas de moco. Las
células del epitelio intestinal están unidas mediante complejos de unión, que
comprenden uniones adherentes y uniones estrechas. Esta capa cohesiva constituye
un impedimento físico al paso de microorganismos. Por otra parte, el moco
sintetizado por las células caliciformes, forma un gel altamente cargado que actúa
como barrera físico-química frente al paso de agentes patógenos, además de incluir
en su composición una serie de moléculas antimicrobianas (criptidinas, lisozima,
fosfolipasas y quimiocinas) (Didierlaurent, et al., 2006). La producción de moco está
regulada por mediadores inmunes (leucotrienos, interferón-γ, IL-9 e IL-3) (Mowat &
Agace, 2014). La síntesis de moléculas antimicrobianas que quedarán retenidas en el
moco se puede inducir mediante señales externas, tales como la propia invasión
patógena o la colonización microbiana neonatal que potencian la barrera
antimicrobiana en estas circunstancias. Estas señales también inician la movilización
de células fagocíticas al sitio de invasión, vía quimiocinas y remodelado de la
estructura de la mucosa. Así, en el colon se distinguen dos capas de moco: una interna,
estéril, densa y en contacto directo con las células epiteliales; y una externa, en la que
reside la flora microbiana, laxa y muy similar a la capa de moco del intestino grueso
(Antoni, et al., 2013). La propia flora comensal actúa como barrera inmunológica, al
competir con los microorganismos patógenos. Aunque están principalmente
concentradas en el intestino delgado, también existe una población de células
fagocíticas en el colon, como macrófagos o neutrófilos.
La inmunidad adaptativa está representada por el tejido linfoide asociado a
intestino (Gut-Associated Lymphoid Tissue, GALT) y por los ganglios linfáticos
mesentéricos. Las células efectoras del sistema inmune están repartidas de manera
difusa por la lámina propia y el epitelio, pudiendo distinguirse linfocitos
intraepiteliales (IEL) y linfocitos de la lámina propia (LPL).
El GALT comprende agregados linfoides situados en la mucosa y submucosa.
En el colon, existen los equivalentes a las placas de Peyer del intestino delgado, en el
ciego (placas cecales) y a lo largo del colon y recto (placas colónicas). Estas
estructuras son agregados linfocitarios macroscópicos situados en la cara
1.INTRODUCCIÓN
37
antimesentérica de la mucosa intestinal. Se componen de numerosos folículos
linfoides de células B flanqueados por zonas de menor tamaño pobladas de linfocitos
T. Subyacen a una parte del epitelio intestinal (Follicle-Associated Epithelium, FAE)
cuya estructura diverge de la general. En éste reside un tipo de células, llamadas M
(microfold o microplegadas), que carecen del recubrimiento del resto de células
epiteliales y capturan antígenos de la luz intestinal y los hacen llegar a las células
dendríticas (Mowat, 2003). Además, estas células son el puerto de entrada para los
patógenos intestinales. En su superficie apical presentan pliegues en lugar de
microvellosidades (Mowat & Agace, 2014). Por debajo del FAE yace una región difusa
denominada cúpula subepitelial, integrada por células dendríticas y algunos
macrófagos. Aquí, los antígenos que llegan a las células dendríticas pueden ser
presentados a linfocitos (Ramiro-Puig, et al., 2008).
Estos agregados son importantes como puntos de estimulación de células T y
de células plasmáticas productoras de IgA que migran al colon en respuesta a la
microbiota local.
El GALT incluye pequeños agregados linfoides que se denominan tejidos
linfoides aislados solitarios (solitary isolated lymphoid tissues, SILT). Estos varían en
tamaño: desde pequeños criptoplacas hasta folículos linfoides aislados maduros y
consisten en agregados de células B, sin células T. En cambio, las áreas interfoliculares
están compuestas por linfocitos T, mayoritariamente de tipo colaborador
o helper (Th), células dendríticas maduras y macrófagos. Inmersos en los folículos
linfoides asociados se encuentran multitud de folículos integrados por linfocitos B
IgM+, precusores de células plasmáticas productoras de IgA y en los centros
germinales de estos folículos se generan linfocitos B IgA+ memoria. A diferencia del
resto de órganos linfoides, las placas de Peyer sólo presentan vasos linfáticos
eferentes (Mowat & Agace, 2014).
Los ganglios linfáticos mesentéricos se dividen en tres regiones con distinta
composición celular: corteza, paracorteza y médula. La corteza contiene folículos
primarios y secundarios ricos en linfocitos B y células dendríticas. La paracorteza se
caracteriza por una elevada proporción de linfocitos T y células dendríticas. La
médula, región más interna del ganglio, está integrada por linfocitos T y B y células
1.INTRODUCCIÓN
38
plasmáticas (Crivellato, et al., 2004). Los linfocitos T vírgenes circulantes llegan al
ganglio a través de vénulas postcapilares. El paso de linfocitos T a la paracorteza a
través de estas vénulas está dirigido por quimiocinas producidas por células
endoteliales que activan célula T virgen, células del estroma y células dendríticas
(Crivellato, et al., 2004). En la corteza, las células dendríticas residentes internalizan
y procesan los antígenos que llegan a través de la linfa. Las células dendríticas
maduras migran hacia la paracorteza donde presentan el antígeno a los linfocitos Th
o T citotóxicos (Tc) vírgenes y se inicia la respuesta inmune adaptativa (Crivellato, et
al., 2004). Mientras que los linfocitos efectores abandonan los ganglios linfáticos y
migran hacia los tejidos no linfoides, algunos linfocitos Th permanecen en el ganglio
linfático como células memoria o migran hacia los centros germinales de los folículos
para promover el proceso final de diferenciación de los linfocitos B.
En la Figura 7 se detalla la composición linfocitaria a lo largo del intestino
grueso; así como la concentración bacteriana y los antígenos de la dieta.
1.INTRODUCCIÓN
39
Figura 7: El Sistema inmune varía a lo largo del tracto gastrointestinal. La figura resalta el contenido antigénico en el colon (gráficas rojas), el tejido linfoide asociado a intestino (GALT, gráfica verde) y varias poblaciones linfocitarias (gráfica azul y naranja) (Mowat & Agace, 2014). Los signos de interrogación señalan zonas para las cuales no se ha descrito la especialización del sistema inmune. Se observan distintos subtipos de células inmunitarias en el colon: células dendríticas, FOXP3: forkhead box P3; IEL, linfocitos intraepiteliales; ILC, célula linfoide innata; iNKT, natural killer T invariable; pDC, célula dendrítica plasmocítica; SILT, tejido linfoide solitario; Th, T helper.
1.INTRODUCCIÓN
40
1.1.4. Rutas de patogénesis del CCR
La mayoría de los tumores colorrectales (entre un 80-85%) se consideran
esporádicos (Watson & Collins, 2011), es decir, sin ningún tipo de carga genética
heredada, aunque un 30% presenta historia familiar con CCR. No obstante, existe un
porcentaje de población afectada por tumores colorrectales (5-6%) que los desarrolla
de manera asociada a síndromes hereditarios autosómicos dominantes (PDQ Cancer
Genetics Editorial Board, 2016), tal y como se resume en la Figura 8.
Figura 8: Las fracciones de casos de CCR que se dan ante ciertos factores de riesgo familiares. Adaptación de Burt, 2000.
El desarrollo de un carcinoma se produce a través de un proceso en etapas que
fue descritos por Vogelstein y Cols. (Vogelstein, et al., 1988) en un modelo de
carcinogénesis colorrectal (Fearon & Vogelstein, 1990; Lengauer, et al., 1997). Este
modelo, sometido a múltiples revisiones gracias a un avance en el conocimiento de la
patogénesis del CCR, describe una vía de mutaciones activadoras de oncogenes (como
RAS) y de inactivación de genes supresores tumorales, especialmente aquellos
localizados en el brazo largo del cromosoma cinco (5q), el brazo corto del diecisiete
(17p) y el brazo largo del cromosoma dieciocho (18q). Las múltiples vías desde la
1.INTRODUCCIÓN
41
mucosa normal hasta el carcinoma no son necesariamente secuenciales, sino más bien
una asociación de mutaciones características del CCR esporádico y hereditario
(Abeloff, et al., 2005). Se cree que para la formación de un carcinoma se alteran más
de nueve genes. Estas alteraciones genéticas comprenden deleciones y mutaciones
puntuales en los genes supresores tumorales como APC (adenomatous polyposis coli),
p53 y DCC (deleción en el cáncer de colon); así como mutaciones en el oncogén KRAS
(Figura 9).
El gen supresor tumoral APC es defectuoso en más del 80% de los pólipos
adenomatosos y cánceres colorrectales. Es el defecto más frecuente y el único que
aparece más precozmente en la secuencia de alteraciones genéticas acumuladas. En
los CCRs, la mayoría de las mutaciones del gen supresor tumoral APC causan un
truncamiento de la proteína APC y por tanto su pérdida de función. La proteína APC
normal tiene como función la degradación de la β-catenina citoplásmica, y su ausencia
produce acumulación de la misma en el citoplasma y su translocación hacia el núcleo.
Los resultados de la acumulación nuclear de β-catenina hace que forme un complejo
con LEF/TCF (factor reforzador de linfocitos/factor linfocitario T). Este complejo es
capaz de activar genes como c-Myc, ciclinaD, PPARs, matrilisina, Fra-1, UPAR, c-Jun,
PML y gastrina. El incremento de la transcripción de los mismos tiene como resultado
la estimulación de la proliferación celular y la inhibición de la apoptosis (Mann, et al.,
1999).
La mutación de RAS (normalmente en KRAS) sucede en células de un adenoma
preexistente, y mediante expansión clonal, produce un tumor de mayor tamaño y
displasia. Las deleciones de 17p y 18q suelen ocurrir en fases más avanzadas de la
tumorigénesis (más que las mutaciones en 5q o en RAS). Se han descrito deleciones
de 18q21 y se ha identificado un gen supresor tumoral Deleted in Colorrectal
Carcinoma (DCC), en esta localización cromosómica. Además, los genes SMAD2 y
SMAD4 implicados en el cáncer colorrectal también se localizan en 18q21. Parece que
la función de SMAD2 en el cáncer colorrectal es un fenómeno tardío, actuando para
acelerar la progresión en estadios tardíos de la carcinogénesis invasora. El gen
supresor tumoral p53 localizado en el cromosoma 17 es el supresor tumoral más
frecuentemente inactivado en las neoplasias malignas del ser humano. La proteína
p53 normal reconoce el ADN dañado y actúa bloqueando la progresión del ciclo
1.INTRODUCCIÓN
42
celular para permitir la reparación del ADN. Además, esta proteína p53 también
puede desencadenar apoptosis.
Entre el 3% y 10% de los adenomas tienen mutaciones BRAF en comparación
con el 30% a 60% con mutaciones KRAS. Su mutación parece darse en estadios
iniciales de una ruta alternativa de carcinogénesis. El orden de las mutaciones de
estos genes no es constante, y la acumulación de los mismas, más que el orden de
aparición, es más importante. De hecho, la nueva pérdida de genes supresores en
otros cromosomas adicionales se correlaciona con la capacidad de los carcinomas de
metastatizar y causar la muerte (Abeloff, et al., 2005).
En el desarrollo del CCR existen múltiples vías de inestabilidad genética que
dan lugar a la mutación de genes claves en el proceso (Mundade, et al., 2014). Una de
éstas es la inestabilidad cromosómica (chromosome instability, CIN), vía por la que se
desarrollan la mayor parte de los cánceres colorrectales (60-80%) y que se
caracteriza por aneuploidia, reorganizaciones cromosómicas múltiples y
heterogeneidad clonal, y otra, es la vía de defectos en el sistema de reparación del
ADN. De un 15% a un 20% de los CCRs, sin embargo, se desarrollan a través de esta
Figura 9: Secuencia adenoma-carcinoma y alteraciones moleculares (mutaciones, sobreexpresiones de proteínas) asociadas implicadas en la progresión del CCR. Tomada de Oncología Clínica, Abeloff, et al., (2005).
1.INTRODUCCIÓN
43
segunda vía, en la que existe un sistema defectuoso de reparación de apareamientos
incorrectos del ADN (Mismatch Repair, MMR). Esta vía se caracteriza por la
inestabilidad de las secuencias repetitivas (microsatélites) y se conoce como vía de la
inestabilidad de microsatélites (microsatellite instability, MSI) (Grady, 2004). Sin
embargo, los estudios en adenomas de colon benignos precoces apuntan a que
ninguna de estas formas de inestabilidad genómica es necesaria para la formación de
focos crípticos aberrantes y adenomas precoces (Haigis, et al., 2002). Existen al menos
otros dos mecanismos, uno de ellos es el fenotipo metilador de islas CpG (CpG island
metilator phenotype, CIMP) y el otro es la hipometilación global del ADN.
La forma más común de inestabilidad genómica es la inestabilidad
cromosómica (CIN), que ocurre hasta en un 85% de CCRs (Grady & Carethers, 2008).
CIN se reconoce por la presencia de aneuploidía y se define por el cambio en el
número de cromosomas o por múltiples aberraciones estructurales (Walther, et al.,
2008). A pesar de la frecuencia con que ocurre CIN en CCR, se desconocen los
mecanismos que la generan; así como su papel en la progresión tumoral. Sin embargo,
existen evidencias de que la CIN promueve la progresión tumoral mediante un
incremento en la diversidad clonal (Grady, 2004; Hermsen, et al., 2002). Se ha
demostrado, además, que la CIN es un marcador de pronóstico pobre en CCRs, a pesar
de tener un uso limitado en los laboratorios clínicos (Popat, et al., 2005; Walther, et
al., 2008).
MSI se define como la presencia de al menos un 30% de loci inestables en un
panel de 5-10 loci, consistente en extensiones de mono y dinucleótidos seleccionados
en la Conferencia Consenso del Instituto Nacional del Cáncer (Boland, et al., 1998).
Los tumores MSI son aproximadamente el 15% de los CCRs y se consideran
mutualmente exclusivos de los CIN, porque presentan un cariotipo normal y
mutaciones génicas únicas en comparación con los CCRs CIN, aunque parece que
existe un subconjunto de tumores con ambas (Walther, et al., 2009). Hay laboratorios
que emplean un panel de 5 mononucleótidos marcadores para la evaluación del
estado MSI (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 and MONO-27), seleccionados por su alta
sensibilidad y especificidad (Bacher, et al., 2008). Cuando los tumores tienen entre un
10 y un 29% de loci inestables, se designan como MSI bajo (MSI-low, MSI-L); mientras
que aquellos con MSI se denominan MSI alto (MSI-High, MSI-H). Existe cierta
1.INTRODUCCIÓN
44
controversia sobre el subtipo MSI-L como categoría independiente (Grady &
Carethers, 2008; Walther, et al., 2009). Los CCRs MSI tienen mejor pronóstico que los
CIN, (Popat, et al., 2005; Walther, et al., 2008), y probablemente responden de manera
distinta a la quimioterapia neoadyuvante en comparación con los tumores con
estabilidad de microsatélites (Microsatellite stabile, MSS o CIN) (Fallik, et al., 2003; Jo
& Carethers, 2006).
Los mecanismos de MSI implican la inactivación de genes de la familia MMR,
bien por metilación aberrante o bien por mutaciones somáticas (Grady, 2004). En
contraste con el síndrome de Lynch (explicado más adelante), en que hay mutaciones
de la línea germinal de los genes implicados en MMR, los CCRs esporádicos suelen
tener una pérdida de la actividad MMR como resultado del silenciamiento de MLH1
por metilación aberrante del ADN (Grady, 2004). Los tumores esporádicos MSI se
asocian con la ruta neoplásica serrada y suelen tener mutaciones en BRAF, a diferencia
de los tumores asociados al síndrome de Lynch (Domingo, et al., 2004; Wang, et al.,
2003); lo que ayuda al diagnóstico diferencial.
Casi todos los CCRs presentan metilación aberrante del ADN; sin embargo, un
20% de todos los tumores que tienen una proporción de loci CpG con metilación
aberrante extremadamente alta. Esta clase de tumores se denomina CIMP. Los
mecanismos que dan lugar a CIMP aún se desconocen, aunque se ha asociado con
mutaciones en BRAF; sugiriendo la implicación de BRAF activado en la patogénesis de
CCR CIMP y la relación entre MSI esporádicos y CIMP (Barault, et al., 2008;
Weisenberger, et al., 2006). El CIMP se define con la metilación de al menos tres loci
de un panel de cinco genes asociados a islas CpG, pero su utilidad clínica está
obstaculizada por la falta de un criterio totalmente uniforme a la hora de designar el
grado CIMP. Se han propuesto dos tipos de CIMP: bajo (CIMP-low, CIMP-L) y alto
(CIMP-high, CIMP-H), en función del número de loci metilados (Barault, et al., 2008),
pero aún no se ha ubicado el papel del estado CIMP en la clínica. Además de la
hipermetilación de islas CpG, se ha visto un estado de ADN hipometilado y asociado
con los CCRs CIN (Matsuzaki, et al., 2005; Rodriguez, et al., 2006); pero su papel en la
carcinogénesis y su utilidad clínica se desconocen.
1.INTRODUCCIÓN
45
Los síndromes de cáncer gastrointestinal hereditario; cuyas mutaciones y
riesgo de padecer CCR se detallan en la Tabla 1; en general, son un grupo heterogéneo
de patologías que tienen en común el incremento del riesgo de sufrir CCR. Existen
varios síndromes reconocidos de cáncer de colon hereditario: el síndrome de
poliposis adenomatosa familiar (PAF) y el síndrome de Lynch (o cáncer colorectal
hereditario no polipósico, CCHNP). Además, existen otros síndromes menos
frecuentes que pueden incrementar el riesgo de padecer cáncer colorectal, como el
síndrome de Peutz-Jeghers (SPJ) o la poliposis juvenil (American Cancer Society,
2016).
La PAF supone entre el 1-2% de los casos nuevos de cáncer colorrectal y se
asocia al gen APC (Laken, et al., 1997). La PAF tiene una alta implantación: los
miembros de una familia que heredan el alelo mutante del gen APC tienen una alta
probabilidad de desarrollar un cáncer invasivo. En el tipo más común de PAF se
desarrollan cientos de miles de pólipos en el colon y el recto del paciente,
habitualmente cuando son adolescentes o adultos jóvenes. El cáncer se desarrolla en
uno o más de un pólipo a edades tan tempranas como 20 años. A los 40 años, casi
todas las personas que presentan este trastorno ya han desarrollado cáncer de colon
si este no ha sido extirpado para prevenirlo. Las personas con PAF tienen, además, un
mayor riesgo de desarrollar cáncer en el estómago y en el intestino delgado, además
de otros órganos. Existe un síndrome de PAF atenuado, que es un subtipo del anterior,
en que los pacientes desarrollan un número menor de pólipos y el cáncer colorrectal
tiende a presentarse a una edad más avanzada. Aun así, estos pacientes tienen un 69%
de riesgo de desarrollar CCR.
El CCHNP o síndrome de Lynch (SL) es un síndrome autosómico dominante
que supone hasta un 10% de todos los casos de CCR, y, en función del gen que esté
mutado, el riesgo de padecerlo para estos pacientes va de un 10 hasta casi un 80%
(Syngal, et al., 2015). En este tipo de pacientes, pueden existir varios tipos de
mutaciones: o bien en la línea germinal de alguno de los genes de reparación de ADN
(como MLH1, MSH2, MSH6 o PMS2) o bien en EpCAM. Precisamente por presentar este
tipo de mutaciones, los tumores en pacientes con Lynch suelen tener inestabilidad en
los microsatélites (Brosens, et al., 2015). La mayor consecuencia clínica del síndrome
de Lynch es el CCR, que suele aparecer 20 años antes que en el resto de la población
1.INTRODUCCIÓN
46
(no tan pronto como en la PAF), a la edad de 45 años. Para la identificación de estos
pacientes, se establecieron en 1990 una serie de criterios (posteriormente
modificados): 3 o más familiares con CCR verificado histológicamente, uno de los
cuales ha de ser un familiar de primer grado de los otros dos; (se debe excluir PAF);
CCR que implique al menos dos generaciones; y al menos un caso de CCR
diagnosticado antes de la edad de 50 años (Vasen, et al., 1991). En 1999 (Vasen, et al.,
1999) y en 2004 (Umar, et al., 2004) se modificaron estos criterios, conformando los
criterios de Amsterdam II y los de Bethesda. Los criterios de Amsterdam II pasaron a
incluir algunos tumores extracolónicos que se daban con cierta frecuencia en
pacientes con SL como calificativo, en concreto cánceres de endometrio, de intestino
delgado o de vejiga. Actualmente se incluyen otros cánceres, como de ovario,
estómago, tracto hepatobiliar y cerebro. El último conjunto de criterios (Bethesda) se
desarrolló para identificar a individuos susceptibles de investigación para la
evaluación de SL, MSI e incluso realización de inmunohistoquímicas de sus tumores.
El SPJ se trasmite con herencia autosómica dominante (Brosens, et al., 2015),
y tiene lugar por mutaciones en el gen STK11, un gen supresor de tumores, en 19p.
Cuando la enfermedad se manifiesta, los pacientes presentan pólipos
gastrointestinales y pigmentación mucocutánea. Los pólipos son de gran tamaño,
escaso número y presentes en colon y, sobre todo, en el intestino delgado. Se puede
manifestar como hemorragia digestiva u obstrucción intestinal. Hasta un 94% de
familias con SPJ tienen mutaciones en este gen; y en un tercio de los mismos, las
mutaciones causan una enfermedad (sobre todo grandes deleciones). Un 25% de los
casos nuevos diagnosticados presentan mutaciones de novo. No parece haber
correlación genotipo-fenotipo según dónde se produzca la mutación de STK11. Una
vez se identifica la mutación que causa el inicio de la enfermedad, el resto de
miembros de la familia han de ser testados para dicha mutación, para determinar si
la enfermedad está o no presente e iniciar un protocolo de vigilancia; puesto que el
riesgo de padecer cáncer colorrectal aumenta.
La Poliposis juvenil se caracteriza por la existencia de pólipos generalmente
limitados a colon, si bien se han descrito casos a nivel gástrico y de intestino delgado.
Se asocia a mutaciones en la línea germinal PTEN, SMAD4 y BMPR1.
1.INTRODUCCIÓN
47
Tabla 1: Síndromes de CCR hereditario, genes que se encuentran mutados e incremento del riesgo de padecer CCR (Brosens, et al., 2015).
Los mecanismos epigenéticos tienen una gran implicación en la regulación de
la expresión de genes en procesos como la patogenia del CCR (Migheli & Migliore,
2012). Consisten en una serie de cambios heredables en el ADN sin que cambie su
secuencia, y suponen procesos como la metilación del ADN, modificaciones
específicas de histonas e intervenciones de ARNs no codificantes (ARNs de
silenciamiento o miARN). Una de las modificaciones epigenéticas mejor
caracterizadas es la metilación del ADN, una adición covalente de un grupo metilo
(CH3-) a una citosina, que ocurre en dinucleótidos CpG. Existen regiones del ADN ricas
en CpG, llamadas islas CpG, y están asociadas con las regiones reguladoras del
promotor de casi todos los genes constitutivos y de otros genes específicos de cada
uno de los tejidos (Esteller, 2011). En el contexto del cáncer, la hipermetilación del
promotor se asocia con una baja expresión del gen, y los cambios globales en el estado
de metilación del ADN se correlacionan con una expresión génica alterada y una
estabilidad genómica. Una alta densidad de citosinas metiladas en las islas CpG en la
región del promotor de genes supresores de tumores puede llevar a un bloqueo
completo de la transcripción de los mismos. Precisamente, uno de los subtipos de CCR
Síndromes genéticos Genes mutados Riesgo de padecer
CCR
Poliposis Adenomatosa
Familiar (PAF)
APC 100%
Síndrome de Lynch MLH1/MSH2 ♀ 22-61%
♂ 27-74%
MSH6 ♀ 10-30%
♂ 22-69%
PSM2 ♀ 15%
♂ 20%
Síndrome de Peutz-
Jeghers
STK11 39%
Poliposis juvenil PTEN, SMAD4 y BMPR1 38-68%
1.INTRODUCCIÓN
48
se caracteriza por su alto nivel de metilación en las islas CpG, CIMP (fenotipo
metilador de islas CpG, de sus siglas en inglés). Este fenotipo de CCR puede presentar
un grado elevado, bajo o negativo de metilación; dándose el primero en casi un 40%
de tumores proximales de colon y un 12% de tumores rectales y distales de colon.
Estos tumores tienen un buen pronóstico, mientras que aquellos con un gado CIMP
bajo presentan un peor pronóstico (Shen, et al., 2007).
Sin embargo, la mucosa colónica puede presentar metilación en condiciones
no patológicas, y según una serie de factores (edad, raza…). RUNX3, TIMP3, DCC,
CDH13, ADAM23, MINT, COX2, CDH1, APC, SFR1, MGMT, hMLH1, hMLH2, RASSF1A,
CDKN2A, CHFR, DLEC1, MYOD o RGC-32 son algunos de los genes más estudiados que
se encuentran metilados en CCR, algunos durante todas las fases del CCR (hLMH1,
MGMT y TSP1) y otros en estados más avanzados e incluso metástasis (RASSF1A o
TIMP3).
Otro mecanismo epigenético crítico es la modificación química de las colas de
histonas. Además de ser las proteínas de empaquetamiento del ADN, las histonas
pueden regular las secuencias subyacentes de ADN a través de modificaciones
postraduccionales de las colas N-terminales (acetilación, metilación o fosforilación de
residuos aminoacídicos). Las acetiltransferasas de histonas (HATs) añaden un grupo
acetilo en los residuos de lisina en la parte aminoterminal; y son las desacetilasas de
histonas (HDACs) las que quitan dicho grupo. Los efectos opuestos de HATs y HDACs
regulan la expresión génica a través de la modificación de la cromatina. La acetilación
de residuos de lisinas conservados debilita la asociación de la histona con el ADN y
permite la unión de factores de transcipción, consintiendo la transcripción de genes.
La eliminación de los grupos acetilo mediada por HDAC en la zona aminoterminal de
las histonas desencadena la condensación de cromatina y la inactivación
transcripcional del ADN implicado (Ropero & Esteller, 2007). Esta inactivación
transcripcional contribuye a la supresión de la expresión de genes supresores de
tumores y puede contribuir a la tumorigénesis. Se conoce poco sobre la alteración en
los patrones de modificación de histonas en CCR.
Los ARNs no codificantes (ARNnc) están implicados en la regulación de
muchos procesos biológicos importantes. Los ARNnc más estudiados son los miARN,
1.INTRODUCCIÓN
49
involucrados en el silenciamiento postranscripcional de genes mediante el control la
traducción de los ARNm en proteínas. Las alteraciones (genéticas o epigenéticas) de
los genes que codifican para estos ARNnc pueden modificar el perfil de expresión de
los mismos, alterando de esta manera los mecanismos que regulan. En la Tabla 2 se
listan algunos de los miARNs desregulados en CCR. Por ejemplo, la alteración
epigenética del miR-143, cuyo gen diana es KRAS, puede interferir su expresión e
inducir proliferación celular (Liu & Chen, 2010); de la misma manera, la alteración
epigenética del miR-148b, cuyo gen diana es el del receptor de colecistocinina-2
(CCK2R) puede desencadenar proliferación celular (Song, et al., 2012).
Tabla 2: ARNnc cuya pérdida de regulación en CCR se genera por anormalidades epigenéticas, genéticas y cromosómicas; así como mutaciones de ADN (Migheli & Migliore, 2012).
El primer paso en la carcinogénesis colorectal suele ser el desarrollo de pólipos
neoplásicos de tipos específicos en la mucosa colónica. La histología del pólipo es
crítica para la determinación del potencial maligno. Los tipos histológicos más
comunes son hiperplásico y adenomatoso. Histológicamente, los pólipos
ARNnc Procesos regulados
miR-34b/c, miR-9-1, miR-
129-2 y R-137
Se observó el silenciamiento de estos genes en líneas
celulares de CCR y en tumores primarios de CCR
(comparados con mucosa normal).
miR-143 Regula la expression de KRAS y la proliferación celular.
miR135 Inhibe la expression de APC y la actividad de la ruta Wnt.
miR-34a Actúa como supresor de tumores bloqueando SIRT1;
regula la proliferación celular.
mir-345 Regula negativamente BAG3; está implicado en la
proliferación celular y en la invasión del CCR humano.
HOTAIR Regula la expression de múltiples genes en cooperación
con PRC2. Está asociado con la metástasis del CCR.
let-7c Desestabiliza los ARNm de KRAS, MMP11 y PBX3; se asocia
con la metástasis del CCR.
miR-148b Regula CCK2R y la proliferación celular.
let-7a Regula Np95 ICBP90 RING finger y la proliferación celular.
miR-499-5p Inhibe FOXO4 y PDCD4; asociado con la metástasis del CCR.
1.INTRODUCCIÓN
50
hiperplásicos contienen un alto número de células glandulares con disminución del
moco citoplasmático, pero con ausencia de hipercromasia (el ADN se tiñe
intensamente), estratificación o atipia (Tsai & Lu, 1995). Los núcleos adenomatosos
son hipercromáticos, con un tamaño aumentado y se presentan en empalizada. Los
adenomas se clasifican en tubulares o vellosos. Histológicamente, los adenomas
tubulares se componen de túbulos ramificados, mientras que los vellosos contienen
vellosidades digitiformes. Los adenomas tubulovellosos contienen ambos elementos
(Cappell, 2008). La mayoría de los CCR surgen de los adenomas (progresión adenoma-
carcinoma), tal y como se ha podido demostrar gracias a los hallazgos
epidemiológicos, clínicos, patológicos, moleculares y genéticos.
En primer lugar, las muestras obtenidas tras la cirugía de CCR con frecuencia
contienen uno o más adenomas sincrónicos. En segundo lugar, el riesgo de CCR
aumenta marcadamente al aumentar el número de pólipos adenomatosos en el colon.
Además, el tejido adenomatoso con frecuencia se encuentra contiguo al carcinoma;
los pacientes que tienen poliposis adenomatosa familiar (PAF), que tienen cientos o
miles de pólipos colónicos adenomatosos, inevitablemente desarrollan cáncer de
colon si no se realiza una colectomía. Los pacientes que tienen pólipos adenomatosos
de más de 1 cm diagnosticados por enema de bario que no se someten a polipectomía
endoscópica desarrollan cáncer de colon a una tasa de 1 % a 1,5 % por año (Boland,
et al., 1998).
A pesar de que la mayoría de los pólipos hiperplásicos parecen no tener
relación con el CCR, algunos sí están asociados. Los factores de riesgo de malignidad
en estos pólipos hiperplásicos son el tamaño el pólipo, (más de 1 cm de diámetro),
localización en el colon derecho, un foco de adenoma dentro del pólipo (con pólipo
hiperplásico y adenomatoso, ambos), más de veinte pólipos hiperplásicos en el colon
y una historia familiar o bien de poliposis o de CCR (Cappell, 2008). La ruta por la que
los pólipos hiperplásicos parece estar relacionada con el recientemente reclasificado
adenoma serrado (sésil). Un adenoma serrado surge en un pólipo hiperplásico, pero
difiere de los pólipos hiperplásicos en una proliferación anormal del epitelio de la
cripta y por atipia nuclear.
1.INTRODUCCIÓN
51
El estudio del estroma tumoral como agente efector se inicia en 1863, cuando
Rudolph Virchow observó leucocitos en torno a los tumores, y sugirió el origen de los
mismos en sitios donde se producía inflamación crónica (Balkwill & Mantovani,
2001). Poco tiempo después, el cirujano Stephen Paget presentó su hipótesis "seed
and soil" donde ya se abarcaban todos los componentes del microambiente (Paget,
1889). En 1982, Bissell, et al., describieron por primera vez la teoría moderna que
propone que el microambiente en el cual se desarrollan las células tumorales es tan
fundamental para su evolución como las mutaciones genéticas que en ellas se
produzcan (Bissell, et al., 1982; Augsten, et al., 2010). En este microambiente existen
distintos tipos celulares: fibroblastos asociados a tumores (Cancer associated
fibroblasts, CAF), macrófagos asociados a tumores (Cancer associated macrophages,
CAM), células endoteliales y pericitos, entre otros.
Los CAF son miofibroblastos (Beacham & Cukierman, 2005) similares a los que
se encuentran en procesos de curación de heridas. Los fibroblastos son uno de los
tipos de células más activos del estroma (Xouri & Christian, 2010). Los CAF pueden
derivar de fibroblastos residentes, de células progenitoras derivadas de la médula
ósea, de células endoteliales o cancerosas a través de transición endotelio/epitelio-
mesénquima y también de otros tipos de células incluidas las células de músculo liso,
pericitos, adipocitos o células inflamatorias (Allen & Louise, 2011). Algunos de los
marcadores de CAF más comunes son α-SMA (α-Smooth Muscle Actin), FSP1
(Fibroblast-Specific Protein 1) también conocido como S100A4 y FAP (Fibroblast
Activation Protein) (Xouri & Christian, 2010; Räsänen & Vaheri, 2010). Los
fibroblastos asociados a tumores pueden promover el crecimiento y progresión del
tumor, favoreciendo una variedad específica de mecanismos tumorales (Orimo &
Weinberg, 2006) que influyen en el comportamiento de los tumores y el pronóstico
de los pacientes (Gout & Hout, 2008). De esta forma, los CAF se han visto implicados
en la remodelación de la matriz extracelular (Beacham & Cukierman, 2005; Calvo, et
al., 2013), la liberación de factores solubles, la regulación de la migración e invasión
de células tumorales y la formación de la metástasis (Sugimoto, et al., 2006; Orimo &
Weinberg, 2006; Gout & Hout, 2008; De Wever, et al., 2014). Además, intervienen en
la modulación de la respuesta inmune (Harper & Sainson, 2014), el metabolismo del
tumor (Martinez-Outschoorn, et al., 2014) promueven la angiogénesis (Orimo, et al.,
1.INTRODUCCIÓN
52
2005) y favorecen el mantenimiento de la pluripotencialidad y la resistencia a
fármacos (Chen, et al., 2014).
Los CAM engloban dos tipos de poblaciones de macrófagos: los macrófagos
activados clásicamente (M1) y los macrófagos activados alternativamente (M2)
(Murray & Wynn, 2011). Los macrófagos asociados a tumores exhiben un fenotipo M2
caracterizado por la expresión de una serie de marcadores, como CD163, el fragmento
Fc de la IgG, los dominios de lectina de tipo C, chaperonas o DCSIGN (Biswas, et al.,
2006; Beck, et al., 2009; Domínguez-Soto, et al., 2011). Por otro lado, el
microambiente del tumor contiene un conjunto de factores como IL-4, IL-13, TGF-β, e
IL-10, que inducen un fenotipo de tipo M2 (Sica, et al., 2002). Existe controversia en
relación a su función en los tumores ya que se ha descrito que en los tumores
colorrectales los macrófagos del tumor son pro-inflamatorios, y desempeñan un papel
antitumoral, lo que conduce a un buen pronóstico (Dumont, et al., 2008; Ong, et al.,
2012). Sin embargo, en tumores como los de mama, próstata, ovario, cérvix, pulmón,
y melanoma cutáneo, se considera que los macrófagos son anti-inflamatorios y
correlacionan con un mal pronóstico (Salvesen & Akslen, 1999; Ono, et al., 1999).
Además, los estudios epidemiológicos han sugerido que un microambiente rico en
macrófagos promueve la agresividad tumoral y el potencial metastásico (Nardin &
Abastado, 2008). Puede que esta aparente contradicción sea esclarecida con estudios
que analicen marcadores específicos de M1 y M2.
Las células endoteliales constituyen los vasos sanguíneos necesarios para
proveer al tumor de oxígeno y nutrientes y eliminar sus productos de desecho. Al
mismo tiempo, la estructura vascular del tumor es la mejor ruta para la dispersión de
células metastásicas a partir del tumor primario. En los tumores, los vasos sanguíneos
tienen una morfología diferente a la de los vasos normales, formando una
arquitectura irregular (Bergers & Benjamin, 2003; Ruoslahti, 2002). Existen
numerosas moléculas implicadas en la inducción, estabilización, migración y
ramificación de los vasos que se forman en el tumor. Moléculas como VEGF, FGF o
CXCL8 estimulan la formación de vasos sanguíneos actuando directamente sobre las
células endoteliales. Otras proteínas importantes en la formación de los vasos son
angiopoyetina-1, Dll4 y los miembros de la familia efrinas, así como TGF-β (Shibuya,
2008).
1.INTRODUCCIÓN
53
Los pericitos son células que rodean la pared de los vasos sanguíneos que
regulan la diferenciación endotelial, y que a su vez responden a factores derivados de
las células endoteliales como PDGF o TGF-β, afectando la estabilidad y funcionalidad
de los vasos. En los tumores, los pericitos están menos adheridos a los vasos, tienen
una morfología diferente y expresan marcadores distintos a los pericitos de los vasos
normales (Morikawa, et al., 2002). Además, son menos abundantes, lo que incrementa
la permeabilidad de la estructura vascular tumoral. Algunos datos experimentales
han mostrado que el aumento de pericitos puede mejorar el crecimiento del tumor
(Furuhashi, et al., 2004; Abramsson, et al., 2003) aunque también puede representar
una barrera para la metástasis (Xian, et al., 2006). El análisis de distintos marcadores
parece indicar que existen distintos tipos de pericitos, y esto puede traer consigo
diferencias en la sensibilidad a agentes que tienen como diana el receptor de PDGF,
presente en pericitos (Song, et al., 2005) (Hasumi, et al., 2007). Aunque algunos
estudios han demostrado que la reducción de la cubierta de pericitos se correlaciona
con metástasis y con mal pronóstico, su importancia pronóstica está poco estudiada
(Yonenaga, et al., 2005).
La matriz extracelular (MEC) es una red compleja de macromoléculas
(colágeno, laminina, fibronectina, proteoglicanos y ácido hialurónico) que afecta tanto
a células tumorales, promoviendo la metástasis, como a las células del estroma,
facilitando la angiogénesis y la inflamación asociada al tumor (Augsten, et al., 2010;
Lu, et al., 2012). Tiene distintas funciones como el anclaje de las células a la membrana
basal, el mantenimiento de la polaridad tisular y la división celular asimétrica de
células madre. También regula la migración celular y la comunicación intercelular,
por ser reservorio de moléculas de señalización, factores de crecimiento y de
fragmentos de proteínas funcionales activos que son procesados por proteasas como
las metaloproteasas (MMP). Además, las células detectan directamente las
propiedades biomecánicas de la MEC, como su rigidez, lo que afecta a una amplia
variedad de comportamientos como la diferenciación celular o la funcionalidad del
tejido (Lu, et al., 2012).
Un esquema de la composición celular y el perfil molecular del microambiente
tumoral con los elementos descritos previamente se detalla en la Figura 10.
1.INTRODUCCIÓN
54
Figura 10: El microambiente tumoral según Augsten, et al., 2010. Participan de una manera activa en su regulación células del sistema inmune (como macrófagos asociados a tumor), fibroblastos asociados a tumomres, matriz extracelular y componentes de vasos sanguíneos, como por ejemplo células endotelialtes.
1.1.5. Invasión y metástasis del CCR
El carcinoma y adenocarcinoma de colon se caracterizan por tener un
crecimiento local incontrolado con infiltración de las estructuras de los tejidos en los
que se ha formado (epitelio intestinal) e incluso con la posibilidad de invadir tejidos
vecinos y algunas de sus células por su capacidad de producir una colonización en
otros órganos, no necesariamente vecinos, en forma de metástasis.
El colon y el recto son órganos en que los tumores se consideran in situ (Tis) a
pesar de haber invadido la lámina propia. El CCR se considera invasivo solo cuando el
tumor ha invadido la submucosa. El razonamiento es que la lámina propia carece de
vasos linfáticos, por lo que el tumor no tendría medios para extenderse. Además, hay
1.INTRODUCCIÓN
55
evidencias del escaso potencial para malignizar de estos tumores (Compton, et al.,
2000).
Una vez el tumor ha invadido la submucosa, el tumor puede profundizar hasta
la muscular e incluso traspasarla e invadir tejidos circundantes. El examen histológico
de especímenes resecados quirúrgicamente juega un papel irremplazable en la
determinación de la invasión tumoral (T) y la extensión de la metástasis en los
nódulos linfáticos (N). La determinación de Tis (tumor in situ), T1, (el tumor invade
la submucosa), T2 (el tumor invade la capa muscular propia) y T3 (el tumor invade a
través de la capa muscular los tejidos pericolorrectales), se hace habitualmente
siguiendo el sistema de estadificación TNM del American Joint Committee on Cancer
(AJCC) (Edge, et al., 2010).
La linfangiogénesis y la vasculogénesis son esenciales para el crecimiento del
tumor primario y de los focos metastásicos en los órganos a distancia. Hay una serie
de factores secretados por el tumor primario que juegan un papel relevante en estos
procesos. Los tumores con un alto grado de vascularización se asocian con mayor tasa
metastásica que los escasamente vascularizados. La proliferación de los vasos
linfáticos tumorales está regulada por miembros de la familia de proteínas del VEGF:
VEGF-C y VEGF-D, secretados principalmente por el tumor, a través de la activación
de su receptor VEGFR3, expresado en células endoteliales. Por otra parte, VEGF-A
participa en la diseminación hematógena, mediante la inducción de angiogénesis,
uniéndose a los receptores VEGFR-1 y VEGFR-2. En CCR se ha descrito una correlación
entre la expresión de VEGF-C y VEGF-D y la formación de vasos linfáticos en el tumor
primario y formación de metástasis en ganglios regionales.
En la resección quirúrgica del CCR, se extrae el máximo número posible de
nódulos linfáticos locales para la evaluación del grado N del tumor (número de
nódulos afectados). Se considera que un ganglio está afectado cuando hay evidencia
de la presencia de células tumorales en el mismo. Cuando no hay nódulos linfáticos
afectados, se considera N0; cuando hay menos de tres nódulos se considera N1 y si
hay más de tres, N2.
La metástasis es un proceso que implica la salida de células tumorales del
tumor primario, su acceso a vasos linfáticos y sanguíneos y su colonización y
1.INTRODUCCIÓN
56
crecimiento en órganos a distancia. Las metástasis hepáticas son frecuentes en CCR y
tienen gran importancia clínica ya que la mayoría de los pacientes acaban
desarrollándolas, lo que limita su supervivencia. Para que se produzca la metástasis,
las células tumorales deben completar una progresión en varias etapas, a través de
una serie de mecanismos selectivos y secuenciales. Existen una serie de moléculas que
intervienen en cada una de las etapas, y entre estas se incluyen enzimas de
degradación de la MEC, moléculas de adhesión celular, factores de crecimiento y
factores de crecimiento vascular (Zhang, et al., 2012).
Las moléculas de adhesión tienen un papel no solamente en el proceso de
desadhesión de células del tumor primario, sino también en el anclaje al tejido
distante. Entre ellas, destacan CD44 y el antígeno carcinoembrionario
(carcinoembryonic antigen, CEA). CD44 es una glucoproteína transmembrana, que
sirve como receptor reciclable al hialuronato. Actúa como molécula de anclaje para
las células epiteliales en la membrana basal, y en CCR se ha relacionado con la
metástasis hepática. El CEA es una glucoproteína presente en el tracto gastrointestinal
y en el hígado. Además, se ha encontrado en la superficie de la mayoría de los CCR
metastásicos. Su relación con la metástasis hepática se debe a la alteración de las
propiedades adherentes de las células, resultando en un aumento de la retención de
las células por el hígado. La molécula modifica el microambiente hepático, haciéndolo
más apropiado para la supervivencia de las células de CCR (Zhang, et al., 2012).
Durante la metástasis del CCR se liberan numerosas metaloproteasas de
matriz extracelular (Matrix metalloproteases, MMPs) que degradan la malla de
colágeno de la MEC y otros componentes de la membrana basal (colágeno IV,
proteoglicano, elastina, laminina y fibronectina). En la mayoría de los CCRs, las MMPs
están sobreexpresadas y sus niveles elevados se correlacionan con la metástasis
hepática (Adachi, et al., 1999). El sistema de la uroquinasa activadora de
plasminógeno (uPA), que comprende a su receptor (uPAR) y al inhibidor de la misma
(PAI-1) está íntimamente implicado en las interacciones con la MEC y es
imprescindible en la progresión del tumor. En el CCR, se ha demostrado la
sobreexpresión del uPAR en comparación con la mucosa normal e incluso con las
células del estroma (Cantero, et al., 1997; Morita, et al., 1998), y los niveles elevados
del mismo se correlacionan con una menor supervivencia a los 5 años (Ganesh, et al.,
1.INTRODUCCIÓN
57
1994). Además, la inhibición de uPAR se ha asociado con una disminución de la
motilidad y capacidad invasiva en líneas celulares (Ahmed, et al., 2003). Las
catepsinas son un tipo de peptidasas (serín, aspartato o cisteín peptidasas), cuyos
niveles de expresión y actividad enzimática se encuentran elevados en CCRs, y van
aumentando según el adenoma progresa a adenocarcinoma; sugiriendo a esta familia
de proteasas como un biomarcador de progresión de CCR premaligno a CCR invasivo
(Ahmed, et al., 2003).
El CCR expresa una gran variedad de factores de crecimiento y sus receptores
que son necesarios para el crecimiento. La degradación de la MEC aumenta la
disponibilidad de factores. El factor de crecimiento epidérmico (EGF), y el factor de
crecimiento transformante alfa (TGF-α) actúan como factores autocrinos e inducen la
expresión de ARNm del propio EGF, TGF-α, el receptor de EGF (EGFR), el (ERBB2) y
el factor de crecimiento derivado de plaquetas (Platelet derived growth factor, PDGF).
También estimulan la expresión de los genes que codifican para las MMPs. El EGFR
está altamente expresado y amplificado en un alto porcentaje de CCR metastásicos
(Zhang, et al., 2012; Delektorskaia, et al., 2003).
El crecimiento metastásico de un tumor depende, en última instancia, de las
interacciones entre tumor y el microambiente del paciente, incluido el desarrollo de
una red de vasos que permita la extravasación de las células con capacidad
metastásica. Tal y como se vio en el apartado anterior, las proteínas de la familia VEGF
juegan un importante papel en el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. Existen,
además, otras moléculas relacionadas con la angiogénesis y metástasis, como la
timidina fosforilada o PDECGF. El PDECGF actúa como agente quimiotáctico in vitro
para células del endotelio y tiene actividad angiogénica in vitro. Su expresión en CCR
está relacionada con la capacidad angiogénica (Beckner, 1999).
Otras moléculas relacionadas con la metástasis del CCR son: Tiam1 (T-cell
lymphoma invasion and metastasis-inducing protein 1), factor de intercambio de
nucleótidos de guanina que activa a Tac. Su expresión está relacionada con la
metástasis del CCR, a través de la regulación de la migración e invasión celulares.
Malliri et al (2006) identificaron que Tiam1 es un gen de respuesta a Wnt, ruta en
permanente activación en el CCR. Su expresión se relaciona con la formación de vasos
1.INTRODUCCIÓN
58
linfáticos, convirtiéndolo en un candidato a biomarcador del CCR y posible diana
terapéutica. PRL-3 (phosphatase of regenerating liver-3/PTP4A3) es una proteína
fosfatasa sobreexpresada en CCR metastásico. Este hecho se debe, según Marti et al
(2009) a la regulación que ejerce sobre la motilidad celular a través de la ruta β1-
ERK1/2-MMP2.
1.2. PAPEL PROCARCINOGÉNICO Y PROMETASTÁTICO DE LOS FACTORES
MICROBIANOS E INFLAMATORIOS
1.2.1. Inflamación y cáncer
La conexión entre cáncer e inflamación fue descrita por primera vez por el
cirujano francés Jean Nicholas Marjolin, quien, en 1828, describió la incidencia de
carcinoma de células escamosas en heridas postraumáticas, con inflamación crónica
(Balkwill & Mantovani, 2001). En 1863 Rudolf Virchow observó un infiltrado
leucocitario en tejidos con neoplasias y sugirió que reflejaba el origen de cáncer en
sitios de inflamación crónica (Balkwill & Mantovani, 2001); contradiciendo la opinión
popular, que consideraba el infiltrado linforeticular como una reacción a la presencia
del tumor. Un siglo después, la incidencia de cánceres tras un proceso de inflamación
prolongada se ha descrito para muchos otros órganos (Tabla 3). Muchos de ellos
pueden atribuirse a agentes infecciosos, mecánicos e incluso químicos; a través de la
inducción de una respuesta inmune de forma crónica. Un ejemplo de esta
circunstancia se da en los pacientes con colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn, cuyo
riesgo de padecer CCR es muy superior que el de la población general (Axelrad, et al.,
2016).
Tabla 3: Ejemplos de agentes proinflamatorios que, si perduran en el tiempo, podrían causar la aparición de diversos tipos de tumores. Adaptación de Dalgleishl & O'Byrne (2006).
Estímulo inflamatorio causante Cáncer Mecanismo de acción y estados
precursores
EBV Linfoma de Burkitt
Linfoma nasofaríngeo
Cáncer de pecho
Linfoma postransplante
Linfoma asociado a
Asociado con activación inmune
crónica
1.INTRODUCCIÓN
59
inmunosupresión
HBV/HCV Cáncer de hígado La alfatoxina parece incrementar
el grado de inflamación
HPV Cáncer de cérvix, anal,
perineo, sistema
aerodigestivo superior
Puede requerir la sinergia con
otros agentes causantes de
cervicitis (clamidia,
inmunosupresión)
HHV-8 Sarcoma de Kaposi
HIV Linfoma (por EBV)
Sarcoma de Kaposi (por HHV-
8)
Cáncer de cérvix (por HPV)
No es oncogénico, pero induce
inmunosupresión y activación
crónica inmune (depende del
hospedador)
HTVL-1 Linfomas de células T y
leucemias
Causa activación crónica de
células T
Helicobacter pylori Cáncer de estómago
Linfoma de intestino (MALT)
Úlceras, Gastritis
Schistosomiasis Cáncer de vejiga Cistitis crónica
Humo del tabaco
Nicotina
Infecciones
Cáncer de pulmón Bronquitis crónica, inflamación
de la túnica media
Asbestos Mesotelioma Inducción de fibrosis
Colitis ulcerosa
Enfermedad de Chron
Cáncer colorrectal Induce enfermedad inflamatoria
crónica intestinal, con pólipos y
adenomas
Reflujo gastroesofágico Cáncer de esófago Esofagitis, obesidad, tabaco,
nicotina
Prostatitis Cáncer de próstata Causa infecciosa
Pancreatitits crónica Cáncer de páncreas Agente causal desconocido
Luz ultravioleta Melanoma Inflamación de la piel e
inmunosupresión
Irritación crónica por exposición
al alquitrán/hollín
Cáncer de escroto Común en deshollinadores de la
época victoriana
Es un hecho que la inflamación crónica predispone al desarrollo de cáncer, y la
vía de desarrollo característica del cáncer es la acumulación de mutaciones genéticas
y alteraciones epigenéticas; entonces estos cambios se producen por una reacción
inflamatoria en el sitio de desarrollo del tumor (Irrazábal, et al., 2014). Los
mecanismos que subyacen a esta afirmación aún no se conocen completamente, y
siguen siendo objeto de estudio.
1.INTRODUCCIÓN
60
La inflamación crónica cursa con el reclutamiento intratumoral de neutrófilos,
monocitos y mastocitos; todos ellos productores de un amplio repertorio de
quimiocinas, factores de crecimiento, factores proangiogénicos y agentes citotóxicos
(como especies reactivas de oxígeno, ROS). La forma en que la inflamación promueve
o incluso inicia el desarrollo de tumores, es por múltiples vías: El propio agente
infeccioso o causante de la inflamación puede generar daño en el ADN celular,
produciendo mutaciones directamente o inestabilidad genómica; o inducir la
expresión de moléculas que llevarán a otras alteraciones, o incluso activando ciertas
rutas en la célula como la de señalización vía NFkB (Jackson & Evers, 2006). Las
células innunocompetentes liberan mediadores inflamatorios, como Prostaglandina
E (PGE2), que activa la ruta Wnt/β-catenina en células epiteliales y lleva a una
proliferación incontrolada (Castellone, et al., 2005).
Durante la inflamación crónica tiene lugar una proliferación celular, en un
intento del organismo por regenerar el tejido dañado. La proliferación incontrolada
de células en un ambiente proinflamatorio aumenta el riesgo de pérdida de control
sobre el ciclo celular. Las células fagocíticas que acuden al sitio de la infección (para
luchar contra estas) y los propios agentes infecciosos liberan ROS y especies de
nitrógeno que dañan el ADN de las células que están proliferando. Por tanto, un daño
repetido en el tejido, en presencia de especies altamente reactivas de oxígeno y
nitrógeno interacciona con el ADN de las células en proliferación, resultando en
alteraciones genómicas permanentes como mutaciones puntuales, deleciones o
translocaciones. De hecho, las mutaciones de p53 se ven con una frecuencia similar
tanto en tumores como en enfermedades inflamatorias crónicas (artritis reumatoide,
enfermedad inflamatoria crónica intestinal) (Hussain, et al., 2000).
Las citocinas liberadas por leucocitos pueden causar modificaciones en el
genoma de las células por varios mecanismos: regulando factores de transcripción en
las células diana, que controlan la expresión de genes reguladores de supervivencia,
proliferación y angiogénesis; induciendo la actividad de la enzima ADN
metiltransferasa (DNA methyltransferase, DNMT), como por ejemplo IL-6 o IL-β; y,
por último, induciendo la expresión de miARN, que reducen la expresión de ciertos
genes supresores de tumores (Irrazábal, et al., 2014). El factor inhibidor de la
migración de macrófagos (Macrophage Migration Inhibitory Factor, MIF), por
1.INTRODUCCIÓN
61
ejemplo, liberado por los macrófagos activados, es capaz se suprimir la actividad
transcripcional de p53 (Hudson, et al., 1999).
Otros mecanismos de daño en el ADN comprenden la producción de
clastógenos por macrófagos activados. Los agentes clastógenos son factores que
inducen la rotura cromosómica, como por ejemplo 4-hidroxinonenal, que difunde en
las células vecinas para dañar el ADN (Wang & Huycke, 2007; Yang, et al., 2013).
La inflamación inhibe enzimas importantes para la reparación del ADN, como
las implicadas en el proceso MMR. A través de diferentes mecanismos, como por
ejemplo el estrés oxidativo, la inflamación crónica inhibe la expresión de los genes
implicados en MMR (Colotta, et al., 2009).
1.2.2. Agentes infecciosos y cáncer
Sabiendo que los estados de inflamación crónica se asocian al desarrollo de
cáncer; y que existen agentes infecciosos que son capaces de generar este estado; cabe
esperar que ciertos patógenos se relacionen con la iniciación y progresión tumoral
(Dalgleishl & O'Byrne, 2006). Como se muestra en la Tabla 3 (arriba), se han descrito
diversos virus, bacterias y parásitos que, en determinadas circunstancias conducen a
la aparición de diferentes tipos de neoplasias malignas.
Se estima que el 15% de todos los cánceres a lo largo de todo el mundo
(aproximadamente 1,2 millones de casos) se pueden atribuir a agentes infecciosos
(Stoicov, et al., 2004). Los daños causados por infecciones conducen a la proliferación
celular y la regeneración, que normalmente cesan una vez que el agente causante es
neutralizado o bien cuando el tejido es reparado satisfactoriamente. Pero si la
respuesta inmune falla en la eliminación del agente incitante, la proliferación celular
continúa en un microambiente rico en citocinas, factores de crecimiento y productos
de desecho celulares acumulados, en un intento prolongado de reparación, que
resulta de manera frecuente en la acumulación de errores genéticos y mecanismos de
proliferación incontrolados (Jackson & Evers, 2006).
En el caso del CCR, la microbiota juega un importante papel en el desarrollo de
CCR (Irrazábal, et al., 2014). En estados de cambio en la composición de la flora
bacteriana (estado denominado disbiosis), hay un incremento de bacterias
1.INTRODUCCIÓN
62
anaerobias facultativas, incluyendo microorganismos potencialmente patógenos que
generan inflamación (Winter, et al., 2013). La disbiosis se produce por procesos
inflamatorios preexistentes o bien a causa de otros factores (como la dieta) en que la
consecuencia es un proceso inflamatorio. Como resultado, la integridad de la barrera
epitelial se ve comprometida y los productos bacterianos de la flora comensal se
translocan libremente, activando leucocitos y células epiteliales que a su vez podrían
iniciar su transformación maligna (Figura 11).
Figura 11: Mecanismos de carcinogénesis colorrectal mediados por la inflamación. Un desequilibrio en la flora intestinal puede generar, o bien agentes mutágenos o bien especies reactivas que pueden causar daños permanentes en el ADN (1 ay b). Además, como consecuencia del proceso, se pueden activar células del sistema inmune, cuya acción encaminada a eliminar el patógeno puede tener efectos mutagénicos sobre las células del epitelio intestinal; tales como inhibición en la regulación de la expresión de oncogenes (2a), o el estímulo a través de citocinas inflamatorias que inducen la actividad de enzimas que modifican el ADN (2b) o la expresión de miARNs que silencian la expresión de genes supresores de tumores. Irrazábal, et al., 2014.
Las toxinas bacterianas tienen un gran potencial para inducir CCR. Un ejemplo
es la fragilisina, toxina producida por miembros del género Bacteroides y con varios
efectos sobre el epitelio colónico. La fragilisina induce la proliferación de las células
epiteliales del colon mediante la activación del oncogén c-MYC (Wu, et al., 2003) y
1.INTRODUCCIÓN
63
desencadena respuestas inflamatorias mediante la producción de IL-8 en las células
epiteliales colónicas (Sanfilippo, et al., 2000; Wu, et al., 2004).
Las toxinas producidas por bacterias tienen, además, la capacidad de dañar el
ADN. Hace relativamente poco se vio que tanto la toxina distensora citoletal
(Cytolethal distending toxin, CTD) y la Colibactina, ambas producidas por cepas de
Escherichia coli y otras bacterias Gram negativas, ejercían daño en el ADN y conducían
al desarrollo de CCR (Arthur, et al., 2012; Cuevas-Ramos, et al., 2010; Wu, et al., 2009).
Durante el desarrollo de CCR el tejido intestinal asociado al tumor presenta un
deterioro en la función de barrera, facilitando la translocación bacteriana y la
inducción de citocinas que mantienen un ambiente inflamatorio dentro del tumor
(Jobin, 2012). De hecho, el deterioro de la barrera inducido durante el CCR conduce a
la invasión del adenoma por productos microbianos, lo que a su vez promueve la
secreción de citocinas inflamatorias por el tumor tales como IL-17 e IL-23. Estas
citocinas llevan a un mayor crecimiento tumoral (Grivennikov, et al., 2012).
Respecto a los efectos potenciales del Lipopolisacárido (LPS) o endotoxina
bacteriana, una molécula de la pared bacteriana de microrganismos Gram negativos,
recientemente se han correlacionado sus niveles séricos y los de flagelina con el riesgo
de padecer CCR (Kong, et al., 2016). Además de un posible papel en las rutas de
carcinogénesis, se ha sugerido que el LPS podría incrementar el potencial metastásico
en el CCR. Durante la ventana perioperatoria de la cirugía resectiva de CCR, el LPS
contamina la cavidad peritoneal y accede a circulación sistémica, debido a la
translocación bacteriana en el intestino. Esta translocación se ha relacionado con un
pronóstico desfavorable en la supervivencia a largo plazo, sugiriendo que los
productos bacterianos liberados durante la cirugía podrían contribuir a la formación
de metástasis. En modelos animales, se ha demostrado que el LPS circulante induce la
liberación de ROS por los macrófagos, conduciendo a un daño del recubrimiento
vascular del hígado y, de esta forma, permitiendo la adherencia de células de CCR al
hígado (Gül, et al., 2012).
El LPS es reconocido por el TLR-4 e induce la activación de la respuesta inmune
(Figura 12) (Hsu et al., 2011) lo que a su vez conlleva una cascada de señalización vía
PI3K/AKT que promueve la función de la integrina β1, incrementando la adhesividad
1.INTRODUCCIÓN
64
y capacidad metastásica de las células del CCR. (Hsu, et al., 2011). Tras el
reconocimiento de LPS por su receptor, se ponen en marcha diferentes vías
alternativas que, en última instancia, llevan a la transcripción de genes implicados en
la respuesta inflamatoria dependientes de la vía NFκB (Figura 12). Además, en otros
estudios el LPS fue capaz de promover la capacidad migratoria de las células de CCR
in vitro e in vitro, y la activación del eje SDF-1α/CXCR4 y de la EMT (Liu, et al., 2016).
La producción final de SDF-1α producía un daño hepático, y, además, se vio que el LPS
inducía la expresión de CXCR4 y la EMT a través de la ruta de señalización NFκB. En
este estudio, la inhibición de la ruta NFκB hacía recuperar el fenotipo epitelial y
atenuaba la expresión de CXCR4, inhibiendo la capacidad migratoria de las células
tumorales. Por tanto, el LPS participa en el proceso de la metástasis hepática del CCR
no solo causando daño hepático (Liu, et al., 2016), si no también incrementado la
capacidad invasiva de las células de CCR y la EMT.
Figura 12: Ruta de señalización de TLR-4. El LPS libre se reconoce por TLR4. El complejo LPS-TLR4 se dimeriza, desencadenando el reclutamiento de MyD88. Se inicia la cascada de señalización, que, en última instancia genera la degradación del complejo IKB, lo que libera al factor de transcripción NF-κB. Este se transloca al núcleo e inicia la transcripción de citocinas proinflamatorias. Por una vía diversa, iniciada por adaptadores diferentes, se transcriben los genes de interferón I, desencadenando la producción de IFN-α/β.
1.INTRODUCCIÓN
65
1.3. BIOMARCADORES MOLECULARES DE PROGRESIÓN Y DE PREDICCIÓN DEL
RIESGO DE METÁSTASIS DEL CCR
1.3.1. Patrones de expresión génica de CCR
El CCR es una enfermedad que se desarrolla a través de múltiples rutas y
mutaciones en genes supresores de tumores y oncogenes. Tras múltiples intentos por
clasificar los subtipos de CCR (Muzny, et al., 2012; Perez-Villamil, et al., 2012;
Schlicker, et al., 2012; De Sousa E Melo, et al., 2013; Budinska, et al., 2013;
Sadanandam, et al., 2013; Marisa, et al., 2013; Roepman, et al., 2014), recientemente
se ha llegado a una clasificación global de CCR, empleando datos de transcripción
génica, proteómica y genómica (Guinney, et al., 2015).
En esta investigación conjunta se llegó a la conclusión de que existían cuatro
subtipos de CCR con distintos patrones de expresión génica, denominados Consensus
Molecular Subtype (Subtipos moleculares consenso, CMS) 1, CMS2, CMS3 y CMS4,
cuyas características se resumen en la Tabla 4. El estudio reveló, además, la baja
relación genotipo-fenotipo en el CCR.
CMS1 se caracteriza por estar hipermutados y tener baja prevalencia de
alteración del número de copias somáticas (somatic copy number alterations,
SCNA). Este subtipo abarca la mayoría de tumores MSI y tiene sobreexpresión
de proteínas implicadas en la reparación del daño en el ADN. Además,
presentan un estado de hipermetilación. BRAF está mutado con bastante
frecuencia (en línea con el hecho de que la mayoría sea MSI). La ruta del
receptor tirosín-cuinasa (RTK) y de la proteína quinasa activada por
mitógenos (mitogen-activated protein kinase, MAPK) están activadas en este
subtipo y en CMS3. Los genes asociados a un infiltrado inflamatorio difuso,
principalmente compuesto por células T colaboradoras (Th) y T citotóxicas
(Tc), están sobreexpresados; junto con una fuerte activación de las rutas de
evasión inmune.
CMS2: SCNA alta, por lo tanto, la CIN es alta. Presentan la mayor frecuencia de
entre todos los subtipos en cuento a ganancia en el número de copias de
oncogenes y pérdida de genes supresores de tumores. Por ejemplo, en este
1.INTRODUCCIÓN
66
subtipo se ve una amplificación del gen que codifica para el factor de
transcripción HNF4A. Los tumores de este grupo presentan diferenciación
epitelial y una regulación positiva de las moléculas efectoras de WNT y MYC.
CMS3: En comparación con los otros subtipos, tienen un perfil global
genómico y epigenómico, con SCNA baja. 30% de muestras hipermutadas,
solapando con el estado MSI. Prevalencia alta de CIMP-L, niveles de
hipermetilación intermedios. KRAS suele estar sobreexpresado. La ruta RTK y
MAPK está activada. En este tipo se da un enriquecimiento de patrones
metabólicos, en línea con la activación de KRAS.
CMS4: SCNA alta (luego CIN alta). Los genes relacionados con la EMT están
regulados positivamente, así como aquellos relacionados con la señalización
TGF-β, señalización de angiogénesis, de remodelado de la MEC y del sistema
inflamatorio mediado por el complemento. Las muestras de este grupo
presentan un patrón de expresión génica compatible con infiltrado estromal,
sobreexpresión de proteínas de la MEC e inclusión de células no tumorales
(Guinney, et al., 2015).
Tabla 4: Taxonomía propuesta para el CCR, reflejando las diferencias biológicas significativas en cuanto a subtipo molecular basado en la expresión. CIMP, Fenotipo metilador de islas CpG; MSI, inestabilidad de microsatélites; SCNA, alteraciones en el número de copias somáticas. Adaptación de Guinney, et al., 2015.
CMS1
MSI inmune
CMS2
Canónico
CMS3
Metabólico
CMS4
Mesenquimal
14% 37% 13% 23%
MSI, CIMP-H, SCNA alto SCNA alto
BRAF mutado KRAS mutado
Infiltración y activación
inmune
Activación de WNT y
MYC
Desregulación
metabólica
Infiltrado estromal,
activación de TGF-β y
angiogénesis
Peor supervivencia tras
el diagnóstico
Peor tiempo libre de la
enfermedad y
supervivencia general
El paradigma convencional de la invasión y metástasis del CCR consiste en una
compleja serie de pasos, incluyendo la proteólisis de la MEC local, adhesión,
angiogénesis, diseminación y crecimiento celular. Hay muchos genes implicados en
estos procesos, detallados en la Tabla 5 (Takayama, et al., 2006). Todos ellos se
relacionan con el aumento de la motilidad, de la capacidad de degradar la MEC de la
supervivencia celular, lo que conduce al desarrollo de la capacidad invasiva de las
1.INTRODUCCIÓN
67
células; y por otro, con la producción de factores que generen nuevas vías de
diseminación (proangiogénicos) y síntesis de moléculas que facilitan la adhesión
celular a los nichos prometastásicos.
Tabla 5: Familias de genes asociados a metástasis. Se clasifican en distintas familias funcionales: genes que codifican para moléculas relacionadas con la degradación de la matriz extracelular, genes que codifican para moléculas de adhesión, de angiogénesis y de supervivencia celular.
Se ha sugerido un gran número de marcadores moleculares como factores
pronóstico potenciales: genes supresores (LOH 1p/p53, LOH 8p, LOH 1p, LOH 5q),
oncogenes (K-ras, c-myc), genes de apoptosis (bcl-2, BAX), genes relacionados con la
síntesis de ADN (timidina fosfatasa, timidilato sintetasa), factores de crecimiento
(TGF), factores de crecimiento epidérmicos (EGF-R), genes TGF alfa, TGF beta, c-erb-
b/her2/neu, EGF-R, genes inhibidores de la cinasa dependiente de ciclina p27,p21),
genes relacionados con la angiogénesis (factor de crecimiento del endotelio vascular:
VEGF), genes de adhesión molecular y glicoproteínas (CD44, E-cadherin, sialo-Tn
antigeno), genes supresores de metástasis (nm23-H1).
Genes Características de los productos de los genes
Genes de proteólisis
MMP-7 (matrilisina)
MMP-2, -9 (gelatinasas)
MMP-1, -8, -13 (colagenasas)
MMP-3 (estromelisina-1)
TIMP-1
uPAR
Digestión de fibronectina, laminina, colágeno IV y proteoglicanos
Digestión de gelatinas y colágeno IV
Digestión de colágenos I, II, III, IV, VI, IX, X y XI
Digestión de fibronectina y laminina
Inhibidores tisulares de MMP
Activación del sistema plasmina-plasminógeno
Genes de adhesión
Integrinas
Cadherinas
CD44
CEA
Unión a laminina, colágeno, fibronectina y vitronectina
Adhesión célula-célula
Unión a hialuronano
Unión a receptor de células de Kupffer
Genes de angiogénesis
VEGF
PD-ECGF
Angiogénesis, inducción de MMP-9
Angiogénesis
Genes de supervivencia y otros
TRAIL-R
CSCR4
Drg-1
c-Met
Unión a TRAIL para inducir apoptosis
Unión a SDF-1 para incrementar la migración e invasividad
Diferenciación celular
Unión a HGF para incrementar la motilidad e invasividad
1.INTRODUCCIÓN
68
En la Tabla 6 se resumen los biomarcadores en CCR y su potencial como
factores predictivos, de pronóstico o de diagnóstico.
Tabla 6: Biomarcadores de CCR y potencial utilidad como factores de predicción, pronóstico o de diagnóstico (Grady & Pritchard, 2014).
Biomarcador Lesión molecular Frecuencia en CCR
Predicción Pronóstico Diagnóstico
KRAS Mutaciones activadoras en
codón 12/13, y en 61, 117 y 146
raramente
40% Si Posible -
BRAF Mutaciones activadoras en
V600E
10% Probable Probable Síndrome de Lynch
PIK3CA Mutaciones en los dominios helical y
quinasa
20% Posible Posible -
PTEN Pérdida de la proteína, IHQ
30% Posible - -
Inestabilidad de
microsatélites (MSI)
MSS, MSI-L o MSI-H
15% Probable Si Síndrome de Lynch
Inestabilidad cromosómica
(CIN)
Aneuploidía 70% Probable Si -
18qLOH Deleción del brazo largo del
cromosoma 18
50% Probable Probable -
Fenotipo metilador de
islas CpG (CIMP)
Metilación de al menos tres loci
(panel de 5)
15% +/- +/- -
Vimentina Metilación 75% - - Detección temprana
TGFBR2 Mutaciones inactivadoras
30% - - -
Mutaciones TP53
Mutaciones inactivadoras
50% - - -
Mutaciones APC
Mutaciones inactivadoras
70% - - PAF
CTNNB1 (β-catenina)
Mutaciones activadoras
2% No No -
Genes de reparación de apareamiento
incorrecto (MMR)
Pérdida de la proteína por IHQ,
metilaciones, mutaciones
inactivadoras
1-15% - - Síndrome de Lynch
Antígeno carcino
embrionario (CEA)
Suero SI Si Si
Antígeno de carbohidrato 19-9 (CA19-9)
Suero
1.INTRODUCCIÓN
69
1.4. EXOSOMAS EN LA BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS DE CÁNCER
1.4.1. Exosomas: concepto y efectos funcionales
Un gran número de células de mamíferos libera tanto de manera constitutiva
como en respuesta a estímulos pequeñas vesículas recubiertas por una bicapa lipídica
denominadas Vesículas Extracelulares (Extracellular Vesicles, EVs). Su tamaño varía
entre 30 y 5000 nm y tienen orígenes muy diversos, que parecen jugar un papel en la
comunicación intercelular. Se componen de una amplia variedad de proteínas, ARN y
lípidos de membrana. Las EVs no sólo juegan un papel en la comunicación
intercelular, también cumplen otras funciones como en el control de la apoptosis, la
regulación inmunológica, la coagulación sanguínea, la reparación celular, la
exportación de proteínas, hormonas peptídicas, residuos celulares, agentes
citotóxicos y desechos metabólicos de la célula.
Los exosomas son uno de los varios grupos de EVs, entre los que se incluyen
ectosomas, que son grandes vesículas membranosas liberadas directamente desde la
membrana plasmática; y vesículas apoptóicas liberadas por células en proceso de
muerte. Los exosomas están recubiertos por una bicapa de fosfolípidos y se pueden
distinguir por su tamaño y composición. Van desde los 30 a los 100 nm de diámetro,
mientras que los ectosomas tienen de 50 a 1000 nm de diámetro y los cuerpos
apoptóticos 5000 nm. Los exosomas son de origen endosomal y se almacenan dentro
de los cuerpos multivesiculares (multivesicular bodies, MVBs) para ser liberados al
ambiente mediante la fusión con la membrana celular (Dorronsoro & Robbins, 2013;
Théry, et al., 2002). Contienen numerosas proteínas y lípidos, así como ácidos
nucleicos, tales como ADN, ARNm, microARN y ARN no codificante (Figura 13). Los
exosomas pueden ser empleados por las células como la ruta mayoritaria de excreción
para deshacerse de ARN y proteínas inservibles y potencialmente dañinas; o, como
mensajeros y transportadores de señales importantes hacia otras células,
modificando su fisiología normal, así como su estado patológico. Además, los
exosomas se pueden aislar de células en cultivo y emplearse para dirigir a una
patología específica, pudiendo ser de utilidad en numerosas aplicaciones terapéuticas
una vez se defina su biología de una forma precisa (Kourembanas, 2015). Una vez
liberados por las células, los exosomas entregan su carga a otras células vecinas,
1.INTRODUCCIÓN
70
pudiendo modificar su expresión génica, señalización y funcionamiento general. Son
endocitados por muchos tipos celulares, incluyendo macrófagos, células endoteliales
y células tumorales (Barrès, et al., 2010; Tian, et al., 2010). De hecho, los exosomas
juegan un papel en el sistema inmune, ya que las células dendríticas inmaduras
transfieren péptidos MHC a través de exosomas a otras células dendríticas para
activar la respuesta inmune (Segura, et al., 2005).
La carga específica con ARNm y miARN en los exosomas puede ser un vector
de intercambio genético y comunicación entre células (Valadi, et al., 2007). Como
consecuencia de su origen, los exosomas de distintos tipos celulares contienen
proteínas asociadas al endosoma (GTPasa Rab, SNARE, Anexinas y flotilina), algunas
de las cuales están implicadas en la biogénesis del MVB (como Alix o Tsg101, van Niel,
et al., 2006). Las proteínas de membrana que se agrupan en microdominios en la
membrana plasmática o en los endosomas se encuentran con bastante frecuencia en
las EVs.
Figura 13: Los exosomas se secretan a través de la fusión de los cuerpos multivesiculares y llevan carga que incluye proteínas, ADN y ARN. La toma de exosomas ocurre por la vía endocitótica, fusión de membranas o incluso por internalización mediada por receptores. Adaptación de Kourembanas, 2015.
1.INTRODUCCIÓN
71
1.4.2. Exosomas en el proceso de invasión y metástasis del cáncer.
Las células tumorales también generan exosomas en estado basal y en
respuesta a estímulos de estrés, en un intento por contribuir a regular el
microambiente tumoral o el control del sistema inmune (Kucharzewska & Belting,
2013). Los últimos estudios en este campo han demostrado que la composición de los
exosomas secretados por las células tumorales, entre otras funciones, condicionan el
tropismo de las metástasis y preparan el nicho premetastásico (Hoshino, et al., 2015).
Los exosomas derivados de líneas celulares de CCR metastásico están enriquecidos
en factores metastásicos como MET, S100A8, S100A9 o TNC; moléculas de
transducción de señales como EFNB2 o TNIK y componentes de balsas lipídicas;
cuando se comparan con líneas celulares de CCR no metastásico (Ji, et al., 2013). Los
exosomas producidos por los tumores metastásicos contienen, según Syn y col.
(2016), un programa pro-EMT, incluyendo TGF-β, caveolina-1, factor inducible por
hipoxia 1 α (Hypoxia-inducible factor 1 alpha, HIF-1α) y β-catenina, que incrementa
las capacidades invasivas y migratorias de las células receptoras, y contribuye al
remodelado estromal y a la formación del nicho premetastásico (Peinado, et al.,
2012).
A través de la expresión de moléculas como CD39 y CD73, los exosomas
derivados de tumores modifican el contexto inmune del microambiente tumoral, con
implicaciones en la inmunoterapia. Por ello, dirigiendo las terapias hacia las rutas de
desregulación de exosomas derivados de tumores, como por ejemplo el eje
heparanasa/sindecan-1, se están planteando nuevas estrategias contra el cáncer (Syn,
et al., 2016).
Recientemente también se han descrito las moléculas determinantes para la
preparación de un microambiente favorable en futuros sitios de metástasis en células
de CCR, así como los patrones de metástasis (Hoshino, et al., 2015). El grupo identificó
los determinantes del condicionamiento órgano-específico mediado por exosomas
que permite la redirección de la metástasis. El patrón de expresión de integrinas en
los exosomas derivados de tumores parece dictar su captura preferencial por células
órgano-específicas.
1.INTRODUCCIÓN
72
Además, Demory Beckler y cols., (2013), demostraron en líneas celulares de
CCR en que las células en que KRAS está mutado, que las alteraciones en el
comportamiento celular no se limitan a la propia célula; sino que existen efectos no
autónomos: KRAS modifica la producción de exosomas. En los exosomas derivados de
estas células, se encuentra KRAS, y este puede transferirse a células con KRAS sin
mutar. Además, en el estudio, el tratamiento de células de CCR con KRAS sin mutar
con exosomas derivados de células con KRAS indujo un aumento del crecimiento
celular. Por lo tanto, los mecanismos de invasión y metástasis mediados por exosomas
estudiados en el CCR consisten en:
La naturaleza de la cubierta exosomal: integrinas determinan el órgano
diana de la metástasis.
El contenido exosomal: contienen proteínas y ARNs (ARNm y miARN),
que, pueden cooperar en la iniciación y progresión tumoral
promoviendo la transformación de células no-malignas, transfiriendo
moléculas como KRAS o EGF, y modificando el microambiente tumoral
de los nichos premetastásicos.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
75
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2.1. ANTECEDENTES
La inflamación y el cáncer están interrelacionados en el progreso inicial de
carcinogénesis (Dalgleish & Haefner, 2006) y más adelante en el proceso de
diseminación corporal del cáncer y de formación de metástasis (Coussens & Werb,
2002). Numerosas patologías inflamatorias crónicas se asocian a la aparición de
tumores malignos (Balkwill & Mantovani, 2001; Axelrad, et al., 2016). Así mismo,
algunos tumores aceleran su desarrollo cuando aparecen procesos inflamatorios
intercurrentes (Khan, et al., 2016). Más aún, hay tumores malignos con acciones
proinflamatorias directas e indirectas (Irrazábal, et al., 2014) que facilitan sus
mecanismos de neoangiogénesis, invasión, diseminación intravascular (Liu, et al.,
2016), inmunosupresión, y crecimiento metastásico (Shahriyari, 2016).
Numerosas proteínas y genes inflamatorios asociados a la fisiopatología y al
microambiente tumoral del paciente con cáncer se utilizan con biomarcadores
moleculares en el pronóstico del paciente con cáncer (González-pons & Cruz-correa,
2015). Así mismo, también se investigan como posibles dianas moleculares en la
innovación terapéutica para la prevención e inhibición de la carcinogénesis y la
metástasis tumoral (Grady & Pritchard, 2014).
Numerosos microorganismos patógenos tienen efectos promotores de la
carcinogénesis y la metástasis tumoral (Stoicov, et al., 2004; Dalgleishl & O'Byrne,
2006). En general, su acción es indirecta a través de sus efectos proinflamatorios,
proangiogénicos, inmunosupresores (Cario, 2013) y regenerativos (Jackson & Evers,
2006).
La flora microbiana intestinal también se asocia al desarrollo de CCR
(Irrazábal, et al., 2014). Los cambios en su composición bacteriana por múltiples
causas, incluidas las dietéticas, conllevan el aumento de productos bacterianos que
generan inflamación local (Winter, et al., 2013) y alteraciones en la biología funcional
de la mucosa colónica, afectando principalmente a las células epiteliales y de la lámina
propia subyacente (Biedermann & Rogler, 2015). Numerosas endotoxinas
bacterianas, tales como fragilisina (Goodwin, et al., 2011), flagelina (Kong, et al.,
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
76
2016), CTD (Arthur, et al., 2012), colibactina (Sheflin, et al., 2014) pueden alterar la
proliferación de colonocitos (Wu, et al., 2003), dañar su ADN (Arthur, et al., 2012;
Cuevas-Ramos, et al., 2010; Wu, et al., 2009) y estimular sus acciones proinflamatorias
directas (Sanfilippo, et al., 2000) (Wu, et al., 2004) e indirectas (Jobin, 2012;
Grivennikov, et al., 2012) que a su vez estimulan el crecimiento tumoral.
El lipopolisacárido (LPS), molécula de la pared bacteriana de microrganismos
Gram negativos como E. Coli, es una de las endotoxinas bacterianas más estudiadas
en la carcinogénesis y metástasis tumoral (Hsu, et al., 2011; Guo, et al., 2015). Sus
niveles séricos se han asociado con la aparición y evolución del CCR (Kong, et al.,
2016), existiendo numerosas evidencias experimentales de la asociación entre la
respuesta transcripcional que el LPS activa a través de TLR4 y la vía NFκB y los
mecanismos moleculares de carcinogénesis (Gül, et al., 2012; Liu, et al., 2016) y
metástasis (Hsu, et al., 2011). Sin embargo, a pesar de la importancia de los factores
de secreción tumoral (factores solubles y exosomales del intersticio tumoral) (Kaplan,
et al., 2006), en la regulación de los distintos componentes celulares del
microambiente tumoral (Mlecnik, et al., 2016) y del nicho premetastásico (Hoshino,
et al., 2015), se desconoce en gran medida los efectos del LPS sobre su regulación en
células de CCR.
A pesar de la importancia de estos estudios en la definición de las
implicaciones pro-carcinogénicas y pro-metastásicas de la inflamación inducida por
LPS y otros factores microbianos en el microambiente tumoral y la fisiopatología del
paciente con CCR, se desconoce en gran parte la relación funcional entre la respuesta
al LPS de las células del CCR y la expresión de los genes realmente implicados en el
desarrollo del CCR y sus metástasis.
El grupo de investigación en el que se desarrolla el presente proyecto de Tesis
Doctoral ha identificado en estos últimos años numerosos genes del CCR asociados a
diferentes mecanismos que contribuyen al proceso de metástasis (Vidal-Vanaclocha,
2011; Márquez, et al., 2013). En algunos casos son genes implicados en la regulación
de la implantación, la angiogénesis y la proliferación tumoral (Badiola, et al., 2012),
en otros casos son genes asociados al proceso de diseminación de las células del CCR
y su adhesión microvascular (Márquez, et al., 2013), o a la respuesta inflamatoria e
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
77
inmunosupresora (Arteta, et al., 2010). Además, muchos de estos genes se expresan
en los tumores primarios de los pacientes que sufren metástasis en menos de 5 años,
estando sobreexpresados en las metástasis hepáticas (Vidal-Vanaclocha, 2011). En su
conjunto representan un panel multifuncional de genes prometastásicos (Tabla 7)
cuya expresión en los tumores primarios con o sin expresión de genes representativos
de la respuesta del CCR a factores microbianos se desconoce.
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
78
Tabla 7: Genes relacionados con el proceso de metástasis hepática del CCR identificados por el grupo y propuestos para su estudio en la presente Tesis Doctoral. Se dividen en tres categorías: aquellos expresados en metástasis hepáticas y tumores primarios; los que se expresan en tumores primarios y se han relacionado con el desarrollo de metástasis hepáticas y aquellos que están regulados en los tumores primarios por factores premetastáticos experimentales.
Categorías Genes Genes de metástasis hepática expresados en tumores colorrectales primarios
PRDX4 S100P SHFM1 DMBT1
Genes expresados en tumores colorrectales primarios relacionados con metástasis hepáticas
SPP1 CLDN3 CLDN4 CSE1L ETS2 FCGBP FXYD3 ITGB4 KRT8 LGALS3 NET1 SPINT2 MT1E KRT19 CKS2
Genes expresados en tumores colorrectales primarios regulados por factores prometastáticos experimentales
NDRG1 FHL2 CFTR ANXA2 FABP5 DGCR8 DGKE DPY19L1 EFEMP1 PDIA2 PPP6R2 PVR RPL38 USP11 ITPKC KIAA0753 SDC1 PPP3CC HMGB1 S100A10 TNF S100A13 TERT LPAR1 NME1
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
79
2.2. HIPÓTESIS
Por todo lo anteriormente expuesto, el presente proyecto plantea como
hipótesis de trabajo la posible acción procarcinogénica y prometastásica del LPS a
través de un efecto estimulante sobre la secreción de factores solubles y exosomales
vinculados directa o indirectamente a la transcripción de los genes prometastásicos
en los tumores primarios del CCR.
2.3. OBJETIVOS Y DISEÑO METODOLÓGICO DEL ESTUDIO
Por todo lo anteriormente expuesto, el presente proyecto se planteó con el
objetivo de estudiar la respuesta funcional de las células del CCR a la endotoxina
bacterina (LPS), a través de la identificación de moléculas de su secretoma mediante
métodos de proteómica y la evaluación de la actividad de rutas moleculares
relacionadas con la inflamación y a continuación, del análisis transcripcional de los
genes de moléculas dependientes de LPS y su asociación a genes prometastásicos
conocidos del CCR.
Sobre esta base los objetivos concretos del presente estudio son los siguientes:
1. Establecimiento de un modelo de respuesta transcripcional y secretora de
citocinas leucocitarias de las células en cultivo de la línea celular de CCR humano
HT-29, tras su breve exposición a concentraciones fisiológicas de endotoxinas de
E. Coli conocidas como lipopolisacáridos (LPS).
2. Identificación mediante 2D-PAGE-MS de moléculas solubles del secretoma de
células HT-29 expuestas a LPS.
3. Estudio transcripcional de moléculas del secretoma de HT-29 dependientes de
LPS en biopsias pareadas de mucosa colónica normal y tumoral de pacientes con
cáncer CCR.
4. Estudio de asociaciones transcripcionales en biopsias de lesiones primarias de
pacientes con CCR, entre moléculas del secretoma de HT-29 dependientes de LPS
y genes prometastásicos identificados en trabajos anteriores, y su contribución a
la clasificación de los pacientes con CCR por su perfil de expresión de genes
dependientes de LPS y prometastásicos.
5. Estudio, por análisis de imagen en inmunofluorescencia, del grado de
translocación nuclear del factor de transcripción NFκB tras el tratamiento de seis
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
80
líneas celulares de CCR; así como evaluación de la positividad de señal para el
receptor TLR4 en las seis líneas celulares con o sin tratamiento con LPS.
6. Estudio mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas del secretoma
de HT-29 junto con el de otras cinco líneas celulares más de CCR humano (CaCo2,
COLO-205, HCT-116, LoVo y SW480) para determinar la identidad, naturaleza
soluble y exosomal y regulación por LPS de las moléculas del secretoma, y su
relación con los procesos de carcinogénesis y metástasis del CCR.
MATERIALES Y MÉTODOS
3. MATERIALES Y MÉTODOS
83
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. REACTIVOS Y SOLUCIONES
3.1.1. Soluciones de uso general
Agua miliQ (Milli-Q®Integral), obtenida mediante ultrafiltración.
PBS: NaH2PO4 20 mM, Na2HPO4 20 mM y NaCl150 mM, pH 7.9.
PBS-T: PBS con 0.1% (v/v) Tween 20.
PBS-T 0.05%: PBS con 0.05% (v/v) Tween 20.
Tampón de carga de electroforesis: 0.1 M Tris-HCl, pH 6.8, 4% (p/v) SDS, 20% (p/v)
glicerol, 10% (p/v) 2 -mercaptoetanol y 0.02% (p/v) azul de bromofenol.
Tampón de electroforesis: 0.025 M Tris-HCl, pH 8.3, 0.192 M glicina y 0.1% (p/v)
SDS.
Solución de azul Coomasie R-250: 0.3% (p/v) Coomasie Brilliant Blue R-250, 45%
(v/v) metanol y 10% (v/v) ácido acético.
Tampón de transferencia: 4,8 mM Tris-HCl, 3,9 mM glicina, 20% (v/v) metanol y
0.036% (p/v) SDS.
Tampón de lisis: Urea 7M, tiourea 2M y CHAPS 4%.
Tampón de equilibrado: Tris-Cl 1,5M pH 8,8, urea 6M, glicerol 30% y SDS 4%.
Solución stock para ensayo de tetrazolio (MTT): 5 mg/ml en PBS.
Solución de trabajo de MTT: se diluyó una parte de solución de stock de MTT en 11
partes de DMEM sin rojo fenol.
2-propanol acidificado: HCl 0,04 N en 2-propanol como diluyente.
Tricloroacético
3. MATERIALES Y MÉTODOS
84
3.1.2. Reactivos biológicos
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Lonza Biowhittaker, Verviers,
Belgium)
DTT (Biorad Laboratories, Inc. California USA)
FBS (Lonza Biowhittaker, Verviers, Belgium)
Glutamina (Lonza Biowhittaker, Verviers, Belgium)
IAA (Biorad Laboratories)
LPS (de Escherichia coli, O55:B55, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)
Penicilina/estreptomicina (Lonza Biowhittaker, Verviers, Belgium)
3. MATERIALES Y MÉTODOS
85
3.2. LÍNEAS CELULARES
Se utilizaron las siguientes líneas celulares establecidas de CCR: CaCo-2,
Colo205 HT-29, HCT116, LoVo y SW480 que fueron obtenidas de la ATCC (Manassas,
MD, USA).
CaCo-2: Adenocarcinoma colorectal, aislada del tumor primario.
COLO-205: Adenocarcinoma colorectal, estadio D de Duke, aislada del líquido
ascítico.
HCT-116: Adenocarcinoma colorectal, aislada del tumor primario.
HT-29: Adenocarcinoma colorectal, aislada del tumor primario.
LoVo: Adenocarcinoma colorectal metastásico, aislada del sitio metastásico
(región supraclavicular izquierda).
SW480: Adenocarcinoma colorectal, Estadio B de Duke, aislada del tumor
primario.
Todas las líneas se mantuvieron en el medio DMEM (Dulbecco's Modified
Eagle's Medium, Lonza, Basilea, Suiza) suplementado con FBS al 10% (Gibco, Thermo
Fisher, Waltham, Massachusett), L-glutamine 2mM (Lonza), y
penicilina/estreptomicina al 1 % (Lonza). Se mantuvieron en un incubador a 37°C,
con un 5% de CO2 y en presencia de humedad.
3.3. ENSAYO DE TETRAZOLIO (MTT)
Se realizó un estudio de viabilidad celular mediante un ensayo MTT (bromuro
de dimethiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolio, Sigma Aldrich), en el cual las células se
incubaron con MTT que se metaboliza por las células vivas (en las mitocondrias) para
originar formazan, que es insoluble (Alley, et al., 1988). Los cristales de formazan se
disuelven en propanol ácido y se puede medir la densidad óptica de la solución
resultante por espectofotometría, cuyos valores son proporcionales al número de
células vivas/viables.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
86
El ensayo consistió en la adición de la solución MTT a una placa de 96 pocillos
de fondo plano, con células subconfluyentes de CCR que se consideró como placa
control de calibración. Tras añadir el reactivo, se incubó 1 hora a 37°C y se añadió
propanol acidificado para disolver los cristales de formazan. Después se agitó 20
minutos, asegurando la disolución de todos los cristales por inspección visual en el
microscopio, y se leyó la absorbancia a 540 nm.
En otra placa preparada en las mismas condiciones (placa de tratamiento) se
añadieron concentraciones crecientes de LPS, a un mínimo de 6 pocillos por cada
concentración. Tras 72 horas en un incubador humidificado a 37°C y con 5% de CO2,
se añadió la solución MTT de trabajo a la placa de tratamiento y se procedió de la
misma manera para leer la absorbancia a 540 nm. Con los datos de densidad óptica,
se aplicó la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de crecimiento relativo de la
placa de tratamiento respecto a la placa control:
𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 (%) = [ (𝐷𝑂𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 − 𝐷𝑂𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜)𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑡𝑡𝑜 − (𝐷𝑂𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 − 𝐷𝑂𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜)𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑐𝑡𝑟𝑜𝑙
(𝐷𝑂𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐷𝑂𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜)𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑡𝑡𝑜 − (𝐷𝑂𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 − 𝐷𝑂𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜)𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑐𝑡𝑟𝑜𝑙] × 100
3.4. OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SECRETOMA
Tras alcanzar un 85% de confluencia, se lavaron las células hasta tres veces
con PBS y se añadió medio libre de suero (DMEM) suplementado con antibióticos y
glutamina. Tras 18 horas a 37°C en humedad y 5% de CO2, se recogieron los medios
condicionados por las células en cultivo. Estos medios fueron centrifugados para
eliminar células muertas, filtrados con un filtro de 0,22 µm y tratadas con inhibidor
de proteasas comercial (Sigma Aldrich) al 1%. Además, las muestras fueron
concentradas mediante una centrifugación en filtros Amicon (Milipore, Billerica,
Massachusetts) con un tamaño de poro de 10 KDa; para llevarlas a un volumen final
de 3 ml.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
87
3.5. OBTENCIÓN DE ARN Y PASO A ADNc
Tras alcanzar un 85% de confluencia, se lavaron las células hasta tres veces
con PBS y se añadió medio libre de suero (DMEM) suplementado con antibióticos y
glutamina. Tras 18 horas a 37°C en humedad y 5% de CO2, se llevó a cabo una
extracción de ARN basada en el método de Chomczynski & Sacchi (1987), con
isotiocianato de guanidina (TRI Reagent de Sigma Aldrich), fenol y cloroformo.
Durante el procedimiento debe realizarse una etapa de homogenización de la muestra
con el TRI Reagent, que se encarga de conservar la integridad del ARN, mientras
rompe las células y disuelve sus componentes; la adición posterior de cloroformo, que
separa la solución en fase acuosa y orgánica, donde la primera de estas contiene el
ARN. Esta fase acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para recuperar por
precipitación el ARN.
Su concentración y pureza se analizó por espectrofotometría a 260 nm en el
espectofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts).
A partir del ARN total celular, el ADNc fue sintetizado utilizando la retro-
transcriptasa aviar del virus de la mieloblastosis con cebadores hexaméricos al azar
(High capacity RNA to cDNA Kit, Applied Byosystem Foster City, CA, EEUU).
3.6. CUANTIFICACIÓN DEL ARN POR PCR
La PCR a tiempo real se llevó a cabo en un sistema Realplex (Eppendorf;
Hamburg, Germany), según las instrucciones del fabricante. Se empleó una enzima
polimerasa activada por calor TaqDNA (Morris, et al., 1996) y cebadores
fluorogénicos específicos para los diferentes genes a analizar (VEGF: Hs 00173626
m1, 18S) y las sondas TaqMan MGB (“Assay-by-Design”, Applied Biosystems).
Tras una incubación inicial de 10 minutos a 25°C y una de dos horas a 37°C, las
muestras se sometieron a ciclos a 4°C (Figura 14). Los resultados se expresaron como
niveles de expresión de cada gen (una vez normalizados frente a los ARN de 18s como
gen constitutivo) en cada condición experimental, respecto a su control
correspondiente: 2 ‐ΔCt, donde Ct representa el ciclo umbral de PCR en el cual el
programa detecta por primera vez un incremento apreciable de fluorescencia sobre
3. MATERIALES Y MÉTODOS
88
la señal basal. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. (Δ Ct = Ct (Gen
de interés) – Ct (control endógeno 18S)).
Figura 14: Esquema de los ciclos de amplificación de la PCR cuantitativa.
3.7. CUANTIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE CITOCINAS MEDIANTE INMUNO-ENSAYO CON TECNOLOGÍA LUMINEX™
Para el análisis de muestras de los sobrenadantes del cultivo de las líneas
celulares de CCR (en adelante secretoma), se utilizó un kit de alta sensibilidad para
citocinas Bio-Plex (Biorad Laboratories) que contenía un panel de anticuerpos
conjugados con microesferas de distinta fluorescencia interna para cuantificar la
concentración de los siguientes factores: IL-1α, IL-2Rα, IL-3, IL-12 (p40), IL-16, IL-18,
CTACK, GRO-α, HGF, IFN-α2, LIF, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, β-NGF, SCF, SCGF-β, SDF-
1α, TNF-β, TRAIL. Tal y como se muestra en la Figura 15, se comenzó incubando
durante 1 hora las muestras a una dilución 1:4 con la mezcla de anticuerpos
primarios, tras lo cual se incubaron con el anticuerpo secundario durante 30 min, y
con la estreptavidina-ficoeritrina un máximo de 30 minutos. Se procedió
posteriormente a la lectura de la placa para cuantificar la inmunodetección
empleando el equipo Luminex 200 (Luminex™ Corporation, Austin, Texas) y el
software BioPlex Manager v.6.0 adaptado al equipo Luminex™ 200.
10 min
25 °C
120 min
37 °C
Mantenimiento
4°C
3. MATERIALES Y MÉTODOS
89
Figura 15: Secuencia de adición de reactivos para el procedimiento de inmunodeteción Luminex ™. Se incuban las muestras con las esferas magnéticas que llevan adherido el anticuerpo primario, y a continuación se incuban con el anticuerpo secundario conjugado y, por último, con la molécula Estreptavidina-ficoeritrina, que se unirá a los secundarios conjugados. El resultado final se lee en el equipo Luminex™200. Adaptación de LuminexCorp.
Muestra: sobrenadante de cultivos celulares con líneas de CCR
Adición del anticuerpo secundario
Adición de Estreptavidina-ficoreritrina
Lavado de la placa
Lectura de la placa en el equipo Luminex ™: contabilización de fluorescencia simple y doble
Microesferas magnéticas con anticuerpo primario y fluorescencia interna
Incubación
3. MATERIALES Y MÉTODOS
90
3.8. DEPLECIÓN DE PROTEÍNAS SÉRICAS POR INMUNOAFINIDAD
Para la depleción de las proteínas séricas residuales en el secretoma de los
cultivos celulares se utilizó el Kit Preoteoprep® Immunoaffinity Albumin & IgG
Depletion, (Sigma Aldrich), provisto de pequeñas columnas con ligandos
recombinantes inmunoafines tanto a albúmina como a IgGs, tal y como se
esquematiza en la Figura 16. Tras el equilibrado de la columna, en que se añade un
tampón compatible con el ensayo, se añadieron las muestras concentradas a la
columna y se incubaron durante 10 minutos, para recoger el eluido por centrifugación
a 11000 g durante un minuto. Este paso se repitió una vez más con el eluido obtenido
para asegurar la depleción óptima. La muestra obtenida de esta doble depleción fue
la que se empleó posteriormente para la electroforesis bidimensional.
Figura 16: Fundamento de la técnica de depleción de las proteínas séricas mayoritarias por inmunoafinidad. En la columna se encuentra la resina que retendrá las proteínas de la muestra, con anticuerpos que reconocen a las proteínas séricas mayoritarias adheridos. Tras la incubación de la muestra con la resina, se eluyen las proteínas no unidas por los anticuerpos, que constituirán la muestra carente de las proteínas séricas mayoritarias.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
91
3.9. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL (2D-PAGE-SDS)
Para la separación electroforética bidimensional, las muestras de secretoma
se sometieron a dos fases de separación: Isoelectroenfoque (primera dimensión) y
PAGE-SDS (segunda dimensión), resumidas en la Figura 17.
3.9.1. Isoelectroenfoque (1ª dimensión)
Para la primera dimensión se emplearon tiras de gel de poliacrilamida con
gradientes de pH (tiras ReadyStrip ™IPG strip, Biorad Laboratorioes) de 3.3 mm de
ancho, 0.5 mm de espesor, una longitud de 17 cm, y con rangos de pH de 3-10. Se
precipitaron 200 µg de proteína procedente del secretoma mediante el sistema Clean
Up (GE Healthcaree, Little Chalfont, Reino Unido) y se resuspendieron en tampón de
rehidratación: Urea, 7M, Tiourea 2M, CHAPS 4%, TBP 80 mM (Biorad Laboratories),
D-Streak reagent y un cóctel de anfolitos de 3-10 hasta completar el volumen
recomendado de carga en las tiras IPG de 17 cm, 300 µl. El isoelectroenfoque se llevó
a cabo en un sistema Protean IEF (Biorad Laboratories). Primero se aplicó un
programa de rehidratación activa, consistente en 12h a 50 V, cubriendo las tiras con
aceite mineral para evitar la evaporación de la muestra durante el proceso.
Posteriormente, el programa de IEF aplicado fue el siguiente: 500 V durante una hora,
300 V durante una hora y media, 1000 V durante media hora, 5000 V durante una
hora y media y 5000 V hasta acumular 29000 V finales. Se incluyó un paso de
mantenimiento de 500 V durante un máximo de 25 h. El protocolo se llevó a cabo a
una temperatura de 20°C.
3.9.2. SDS-PAGE (2ª dimensión)
Previo a la segunda dimensión, las muestras se equilibraron durante 20
minutos con DTT 65 mM y a continuación IAA 135 mM, en tampón de equilibrado
(Tris-Cl 1,5M pH 8,8, urea 6M, glicerol 30% y SDS 4%). La segunda dimensión se
realizó en geles homogéneos SDS-PAGE al 10%, en los que sólo se polimeriza el “gel
separador” y la tira se coloca directamente en contacto con la región superior de éstos.
Los geles se corrieron en una cubeta de electroforesis Mini-protean III (Biorad
Laboratories). Tras la SDS-PAGE, se tiñeron los geles con plata empleando el kit de
tinción PlusOne Silver Staining (GE Healthcare) y se escanearon en un densitómetro
3. MATERIALES Y MÉTODOS
92
G: BOX Chemi XT4 (Synoptics group, Cambridge, Reino Unido) empleando el software
Dyversity® (Synoptics group).
Figura 17: Fundamento de la técnica de electroforesis bidimensional. Se carga la muestra proteica sin desnaturalizar sobre un gel de acrilamida con un gradiente de pH, y se somete a una electroforesis, de tal forma que cada proteína quedará inmovilizada en el pH correspondiente a su punto isoeléctrico. El gel resultante de esta primera electroforesis se somete a un proceso de alquilación y reducción proteica y se utiliza entonces para cargar un gel SDS-PAGE, en que las proteínas se separarán en función de su peso molecular. El gel resultante se tiñe, generando un mapa de puntos (spots) en que cada punto posee una coordenada de punto isoeléctrico y de peso molecular.
3.9.3. Análisis de spots
El estudio comparativo de las proteínas secretadas por las células con o sin
tratar con LPS se realizó mediante el software Dymension de Syngene. Tras el
escaneado de los geles, se procedió a la normalización densitométrica de las manchas
proteicas dentro de cada gel y entre todos los geles del mismo experimento, en
función de la intensidad total de tinción; se seleccionaron todos los puntos
encontrados en los geles, considerando como aptas las proteínas que aparecieron
bien definidas y con una expresión mínima fácilmente detectable por tinción de plata;
y se realizó el solapamiento de puntos entre los geles implicados en el análisis.
Segunda dimensión: separación según peso molecular
Primera dimensión: separación según pI
Mezcla proteica
Electroforesis desnaturalizante
Enfoque isoeléctrico
El primer gel se carga sobre el segundo
Equilibrado: alquilación + reducción
3. MATERIALES Y MÉTODOS
93
En primer lugar, para cada condición (control y tratado) se determinaron los
puntos de consenso (es decir, aquellos que aparecieron en todos los duplicados) para
poder superponer las imágenes de ambas condiciones experimentales, y poder
obtener información sobre diferencias de expresión en cada uno de los puntos
considerados (representantes de proteínas diferentes). El programa asignó un
número a cada uno de los puntos consenso, siguiendo el orden de aparición de
izquierda a derecha y de arriba debajo de las manchas en el gel de referencia para
cada grupo.
Tras la obtención de puntos diferenciales, se procedió a la comparación de las
densidades normalizadas de todos los puntos del grupo de geles procedentes de
células control con los puntos del grupo de geles procedentes de células tratadas con
LPS. Como proteínas diferenciales se seleccionaron las manchas que aumentaron o
disminuyeron de densidad en más de 1,5 veces (t-student, p<0,05).
3.9.4. Corte de spots y digestión de proteínas
Los spots de proteínas se recortaron utilizando EXQuest Spot Cutter (Biorad
Laboratories), y a continuación se digirieron por el equipo Ettan Digestor (GE
Healthcare). La digestión se realizó según el protocolo previamente descrito
(Schevchenko A, 1996), con pequeñas variaciones: los fragmentos de gel se
sometieron a una reducción con ditiotreitol 10 mM (Sigma Aldrich) en bicarbonato de
amonio 50 mM (99% de pureza; Scharlau) y a un proceso de alquilación con yodo-
acetamida 55 mM (Sigma Aldrich) en bicarbonato de amonio 50 mM. Después, las
piezas de gel se enjuagaron con bicarbonato de amonio 50 mM en 50% de metanol
(gradiente, grado HPLC, Scharlau) y acetonitrilo (gradiente, grado HPLC, Scharlau) y
se secaron en un Speedvac. Una vez desecadas, se añadió tripsina porcina modificada
(grado de secuenciación; Promega, Madison, WI, USA) a dichas piezas, a una
concentración final de 20 ng/l en bicarbonato de amonio 20 mM y se incubó a 37°C
durante toda la noche. Finalmente, se procedió a la extracción peptídica con
acetonitrilo acuoso al 60% y ácido trifluoroacético al 0,5% (99,5% de pureza; Sigma
Aldrich).
3. MATERIALES Y MÉTODOS
94
3.9.5. Espectometría de masas (MALDI TOF-TOF)
Utilizando el método de capa fina, se depositaron 0,5 µl de cada solución de
digestión, sobre una placa Opti-TOF 123x81 mm MALDI 384 (Applied Biosystems) y
se dejaron secar a temperatura ambiente. Se aplicó el mismo volumen de matriz
(3mg/ml de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (Sigma Aldrich) en acetonitrilo 60% y
ácido trifluoroacético 0,5%) en cada muestra en la placa MALDI. Los datos de MALDI-
MS/MS se obtuvieron en un análisis automatizado en bucle usando un 4800 Plus
MALDI-TOF/TOF Analyzer (Applied Biosystems). Los espectros se adquirieron en el
reflector en el modo de ion positivo con un láser Nd: YAG de 355 nm de longitud de
onda, a 200 Hz de frecuencia láser, promediando entre 1000 y 2000 espectros
individuales. Los experimentos fueron adquiridos de manera uniforme con una
intensidad del láser fija. Para el modo de análisis MS/MS 1 kV, precursores se
aceleraron a 8 kV, seleccionados con una resolución relativa de 200 (FWHM). Los
fragmentos de iones generados por la colisión con aire en una cámara CID se
aceleraron aún más mediante 15 kV. Se realizó un análisis de datos de masa utilizando
el “4000 Series Explorer Software” versión 3.5.3 (Applied Biosystems). La calibración
interna de los espectros de masa de MALDI-TOF se realizó usando dos iones de
autolisis de tripsina con m/z = 842.510 y m/z = 2211.105. Para MALDI-TOF/TOF, las
calibraciones se realizaron con los espectros de los fragmentos iones Glub-
fibrinopéptido (4700 Cal Mix, Applied Biosystems). Los datos de MALDI-TOF y
TOF/TOF se combinaron a través del software GPS Explorer versión 3.6 para buscar
en una base de datos no redundante de proteínas (Swissprot 2012_11), utilizando el
software Mascot versión 2.2 (Matrix Science) (Perkins DN, 1999). Los espectros de
MALDI-TOF/TOF y los resultados de la búsqueda fueron inspeccionados
manualmente en detalle utilizando el software anterior. Para los datos combinados
de huella peptídica (protein molecular fingerprint, PMF) y secuenciación por
espectrometría de masas en tándem, las identificaciones fueron aceptadas cuando
Intervalo de confianza (I.C. %) de software de GPS fue del 95% o superior. Para los
espectros de PMF, también se aceptaron cuando las identificaciones %I.C. del
software GPS fue del 99% o superior.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
95
3.10. ANÁLISIS DE ARN DE PACIENTES CON CCR
3.10.1. Selección de pacientes
El estudio de CCR con muestras humanas se llevó a cabo con la aprobación del
CEIC de HM-Hospitales y los pacientes cuyas muestras fueron utilizadas en este
estudio, firmaron un consentimiento informado (Anexo I) acerca de este este estudio,
para la cesión de sus muestras. Las muestras utilizadas fueron biopsias de CCR
primario y CCR metastásico, adicionales a las requeridas para el diagnóstico.
3.10.2. Extracción de material genético
Las muestras de CCR fueron conservadas en RNA later tras la cirugía, con el fin
de prevenir el proceso de degradación de ARN. La extracción de ácidos nucleicos se
llevó a cabo disgregando el tejido en TRI Reagent (Thermo Fisher) con las esferas
metálicas Stainless Steel beads 5 mm en el equipo Tissue Lyser (Qiagen). El material
genético se extrajo de la fase acuosa resultante tras añadir cloroformo al tejido
disgregado y centrifugar a 15300 g durante 15 minutos, a 4°C. El ARN se purificó con
el kit Rneasy Mini Kit (Qiagen).
3.10.3. PCR a tiempo real con Arrays de Baja Densidad con sondas Taqman.
Los Arrays de Baja Densidad con sondas TaqMan (TaqMan Low Density
Arrays: TLDA) de Applied Biosystems (California, Estados Unidos) consisten en la
amplificación del ADNc complementario a un ARNm de forma proporcional a su
concentración en una muestra. Permiten analizar mediante PCR cuantitativa a tiempo
real la expresión de varias decenas de genes previamente seleccionados. Las tarjetas
contienen 384 pocillos (Figura 18) en los que se fija, previo encargo, las sondas
TaqMan y los oligonucleótidos de hasta 96 x 4 genes, de tal forma que en cada tarjeta
se pueden cargar dos muestras, obteniendo duplicados de cada gen para cada
condición.
La incubación necesaria y la cuantificación de la expresión de los genes se realizó en
el equipo 7900HT Fast Real-Time PCR System, de Applied Biosystems. La Tabla 8
muestra la lista de genes cuya expresión de ARN fue cuantificada.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
96
Figura 18: Esquema de realización del protocolo para TLDA. El primer paso consiste en la transcripción reversa, para pasar de ARNm a ADNc, más estable. En el segundo paso, se cargan los ADNc en las tarjetas, que contienen sondas para varios genes (previamente encargados a la casa comercial). Se procedió a la incubación 7900HT Fast Real-Time PCR System y se obtuvieron los datos de expresión de 62 genes en 4 muestras por cada placa. Adaptado de especificaciones del fabricante.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
97
Tabla 8: Lista de genes cuya expresión fue cuantificada mediante RT-PCR en las muestras de tumores primarios de colon de 41 pacientes.
Nombre del gen Símbolo del gen Nombre del gen Símbolo del gen
Aldehído deshidrogenasa 1 ALDH1A1 Lactato deshidrogenasa B LDHB
Anexina A2 ANXA2 Lectina soluble de unión a
galactósido, 3 LGALS3
Inhibidor de la disociación GDP rho, alfa
ARHGDIA Receptor de ácido lisofosfatídico.,1
LPAR1
Subunidad 5 (épsilon) de la Chaperona conTCP1
(épsilon) CCT5
Factor inhibidor de la migración del macrófago
MIF
Regulador de la conductancia transmembrana de fibrosis
quística CFTR Moesina MSN
Subunidad reguladora 2 de la proteína quinasa CDC28
CKS2 Metalotioneína 1E MT1E
Claudina 3 CLDN3 Regulado 1 downstream
de N-myc NDRG1
Claudina 4 CLDN4 Transformador de células
neuroepiteliales 1 NET1
Gen de la exportina 2 CSE1L NucleósidoNME/NM23
difosfato quinasa 1 NME1
Subunidad del complejo microprocesador de DGCR8
DGCR8 Proteín disulfuro
isomerasa, familia A miembro 2
PDIA2
Dicacilglicerol quinasa épsilon 64KDa
DGKE Fosfoglicerato quinasa 1 PGK1
Delecionado en tumores cerebrales malignos 1
DMBT1 Piruvato quinasa
(músculo) PKM
Similar a dpy-19 1 (C. elegans)
DPY19L1 Subunidad catalítica (gamma) de proteína
fosfatasa 3 PPP3CC
Proteína de matriz extracelular similar a
fibulina con dominio EGF, 1 EFEMP1
Subunidad reguladora 2 de la proteína fosfatasa 6
PPP6R2
Enolasa 1 (alfa) ENO1 Peroxirredoxina 4 PRDX4
Receptor erbB-2 tirosina quinasa
ERBB2 Receptor polivirus PVR
Factor de transcripción del protooncogén 2 ETS
ETS2 Proteína ribosomal L38 RPL38
Ezrina EZR Proteína de unión al
calcio S100, A10 S100A10
Proteína de unión a ácidos grasos 5
FABP5 Proteína deunión al calcio
S100, A13 S100A13
Fragmento Fc de la proteína de unió an IgG
FCGBP Proteína de unión al
calcio S100 S100P
Dominios 2 de LIM cuatro y medio
FHL2 Sindecan 1 SDC1
Regulador del transporte de iones 3 (con dominio FXYD)
FXYD3 Serpina de la familia B
miembro 1 SERPINB1
Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa
G6PD Proteína tipo 1 de la malformación de la
separación mano/pie SHFM1
Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa
GAPDH Inhibidor de serina-
proteasa tipo Kunitz 2 SPINT2
Glutation sintetasa GSS Fosfoproteina secretada1
(osteopontina) SPP1
Grupo de alta movilidad, Box 1
HMGB1 Transadolasa 1 TALDO1
3. MATERIALES Y MÉTODOS
98
3.10.4. Análisis de datos
Los datos de los TLDAs se analizaron mediante varios métodos
independientes. Se aplicó un análisis de conglomerado jerárquico (hierarchical
cluster analysis), para determinar la similitud en los patrones de expresión entre
pacientes y entre genes, medido como la distancia euclídea. Los valores introducidos
para cada gen fueron los ΔCt de cada experimento, calculada mediante los datos de Ct
normalizados con los datos de Ct para el control endógeno (HPRT1) en cada caso
(retalive standard curve method). Posteriormente, se subdividieron los pacientes en
dos subgrupos: alta y baja expresión para cada gen, estudiando las diferencias entre
ambos subgrupos mediante pruebas de homogeneidad de varianzas (ANOVA o
Kruskal Wallis, según procediera) y se estudiaron los coeficientes de correlación de
Pearson con el resto de los genes de la placa para ambos grupos, además de la
naturaleza de los grupos funcionales cuya correlación fue significativa y superior a
0,6.
Todos los cálculos estadísticos se realizaron con el programa IBM SPSS
Statistics 22 y XLSTAT.
3.11. ESTUDIO DE GENES LPS-DEPENDIENTES EN MUCOSA NORMAL FRENTE A
CCR
Se estudió la expresión de los genes LPS- dependientes en el conjunto de datos
GSE8671, publicado por Sabates-Bellver, y cols (2007), en el repositorio GEO
DataSets, que contiene el transcriptoma completo de 32 pacientes con muestras
pareadas de CCR y mucosa colónica normal. Se analizaron los 17 genes LPS
Integrina beta 4 ITGB4 Transcriptasa reversa de
la telomerasa TERT
Inositol trifosfato 3-quinasa C
ITPKC Transcetolasa TKT
Proteína moonraker KIAA0753 Factor de necrosis
tumoral TNF
Queratina 19 KRT19 Peptidasa específica de
ubiquitina, 11 USP11
Queratina 8 KRT8
proteína de activación zeta tirosina 3 -
monooxigenasa / triptófano 5 -
monooxigenasa (14-3-3 zeta/delta)
YWHAZ
3. MATERIALES Y MÉTODOS
99
dependientes, mediante el método de cuantificación relativa, normalizando con el
control endógeno HPRT1 y empleando la fórmula ΔCt; y se comparon los niveles de
expresión relativa de las muestras de mucosa colónica normal frente a las muestras
de CCR. Se obtuvo el porcentaje de casos por encima y por debajo del valor de
expresión relativa promedio para cada gen.
Todos los cálculos estadísticos se realizaron con el programa IBM SPSS
Statistics 22 y XLSTAT.
3.12. INMUNOFLUORESCENCIA PARA TRANSLOCACIÓN NUCLEAR DE NFkB
3.12.1. Protocolo de inmunofluorescencia
Las células se fijaron en solución de PFA al 4% tras el tratamiento y un lavado
con PBS. Después, se permeabilizaron durante diez minutos con PBS-0,1% de Triton
y se realizó el bloqueo con PBS-BSA al 5% durante 30 min. Para la inmunotinción, se
utilizó un anticuerpo policlonal frente a la subunidad p65 de NFĸB (Santa Cruz
Biotechnology) a una dilución 1:50 en la solución de bloqueo y PBS-Tween 0,05% en
proporción 1:1, a 4°C durante toda la noche. Después de dos lavados con PBS-Tween
0,05% de 10 minutos cada uno, se añadió el anticuerpo secundario Alexa 488 (Life
Technologies) diluido 1: 400 en mismo diluyente que se añadió el anticuerpo primario
durante 1 hora a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con Hoescht 1: 1000
(Life Technologies), diluido en la solución de anticuerpo secundario.
3.12.2. Captura y análisis de imagen
Las imágenes de fluorescencia se capturaron en un microscopio Leica DM
5500. Se realizó un análisis de imagen utilizando el software ImageJ 1.47v. Se
seleccionaron para el análisis dos campos de dos ensayos celulares diferentes, y se
tomaron fotos tanto de la tinción nuclear como de la tinción para NF-κBp65. Cada
campo se seleccionó en primer lugar por la tinción nuclear, para limitar a campos al
70% de confluencia. Para cada campo, se crearon máscaras de imagen binarias de la
tinción de Hoescht (Life technologies, Carlsbad, California) para definir las regiones
de interés (ROI) para el análisis, que en este caso se trataba de la región nuclear. Esto
se hizo mediante la aplicación de un filtro de mediana (3 × 3 de radio de pixel) para
3. MATERIALES Y MÉTODOS
100
eliminar el ruido y para aproximar la distribución de intensidad de la tinción al valor
de la mediana. Se utilizó un umbral automático, utilizando el algoritmo de Isodata
(Ridler y Calvard, 1978) para convertir la imagen en una máscara binaria que incluyó
a todos los datos de fluorescencia por encima del fondo. La máscara de la tinción de
Hoescht se utilizó para definir la región nuclear. El uso de la calculadora de imagen, la
máscara binaria Hoescht y su imagen inversa se restaron de la imagen de p65 para
crear dos imágenes de tinción p65: nuclear y citoplasmática. Ambas imágenes fueron
cuantificadas utilizando el umbral creado por el algoritmo Isodata y los histogramas
de fluorescencia por encima del fondo fueron exportados al software Microsoft Excel.
La medida de la fluorescencia nuclear por sí sola no distingue de la
translocación nuclear de NFĸB de una alta intensidad de fondo o incluso de
diferencias artefactuales de la tinción; por tanto, fueron necesarias las intensidades
nuclear y total; teniendo el total como la suma de la intensidad total más la
citoplasmática. Se utilizó la medida del ratio intensidad nuclear: total de fluorescencia
como una medida relativa de la localización nuclear de p65 (Figura 19). Los datos de
los histogramas nucleares y citoplasmático primero se normalizaron por el número
total de puntos de datos incluidos en el análisis y, a continuación, se hizo la
comparación de la suma de las frecuencias de intensidades de tinción. Siguiendo este
análisis, la translocación al núcleo del factor de transcripción, implicó un aumento del
ratio de fluorescencia nuclear: total.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
101
Figura 19: Cuantificación de la translocación nuclear mediante análisis de imagen. Basado en el método desarrollado para monocitos activados por Noursadeghi et al (2008), cuantifica la fluorescencia nuclear y la fluorescencia total de cada imagen, y crea un cociente fluorescencia nuclear/total, que varía en función del proceso de translocación nuclear de la subunidad p65 del factor de transcripción NFκB.
3.13. AISLAMIENTO Y ANÁLISIS DEL SECRETOMA SOLUBLE Y LOS EXOSOMAS
PROCEDENTES DE CÉLULAS DE CCR EN CULTIVO
3.13.1. Aislamiento del secretoma
Tras alcanzar un 85% de confluencia, las células se lavaron tres veces con PBS
con el fin de eliminar los restos de suero bovino del medio de cultivo; se añadió o bien
el medio (DMEM con penicilina/estreptomicina 1 % y L-Glutamina 2mM) libre de
suero o bien el mismo medio libre de suero con LPS (cepa E. coli, O55:B55, Sigma
Aldrich) a una concentración de 1 µg/ml; y se mantuvieron las células durante 18-20
horas a 37°C, 5% CO2, en atmósfera húmeda. En estas condiciones de deprivación de
Tinción NFkBp65
Análisis de imagen: ImageJ
Filtro de imágenes con umbrales y creación de máscaras binarias (imágenes A y B)
Resta de máscaras a la imagen de tinción NFkBp65 (imagen C)
Resta de C-A: fluorescencia nuclear
Resta de C-B: fluorescencia
citoplasmática
Histograma C-A: fluorescencia nuclear
Histograma C-B: fluorescencia citoplasmática
Tinción nuclear
Medida del histograma de fluorescencia de cada una de las
imágenes (número de píxeles por intensidad de fluorescencia)
3. MATERIALES Y MÉTODOS
102
suero la viabilidad celular no se vio afectada, tras test de exclusión con Trypan Blue
(Sigma Aldrich).
Los medios condicionados de células control y tratadas fueron recogidos y
centrifugados primero suavemente con el fin de disminuir en lo posible la lisis de
células arrastradas al recoger el sobrenadante (500g, temperatura ambiente, 10 min)
para eliminar células vivas, y luego a mayor velocidad (2,000 g, 4°C, 15 min) con el fin
de eliminar restos celulares y conservar la integridad proteica del denominado
secretoma. El sobrenadante final se concentró hasta un volumen final de 10 ml
mediante la centrifugación en filtros de concentración de 4 kDa de corte, que
permitieron la elución del agua y sales, y la retención de las moléculas de mayor peso
molecular al corte citado.
3.13.2. Aislamiento de exosomas por ultracentrifugación
El secretoma concentrado se transfirió a tubos Ultra-Clear™ 14*95 mm
(Beckman Coulter, California) y se centrifugó a 21.500 g durante 30 minutos en una
ultracentrífuga (Beckman Coulter) con el rotor adecuado: SW40Ti (Beckman Coulter)
para limpiar el secretoma de los posibles restos celulares que aún permanecieran.
Después, el sobrenadante se transfirió a tubos nuevos Ultra-Clear™ 14*95 mm y se
centrifugó a 160.000 g durante 1 hora a 4°C. El pelet resultante de esta centrifugación
es la fracción de microvesículas secretadas por las células y el sobrenadante se trata
del que denominamos secretoma soluble, que constituye el conjunto de proteínas
secretadas por la célula bajo unas condiciones concretas. El sobrenadante se
concentró mediante centrifugación en filtros de concentración de 4 KDa unas 10 veces
y el pelet de microvesículas se resuspendió en PBS para ser lavado mediante una
última centrifugación (150.000 g, 1 hora, 4°C). Este último sobrenadante se eliminó y
el pelet se resuspendió en tampón de muestra reductor (NuPAGE de Thermo Fisher).
3.13.3. Western blot fluorescente para evaluar la presencia de exosomas
El protocolo de western blot se llevó a cabo mediante la carga de 15 µl del pelet
de microvesículas en un gel de SDS-poliacrilamida al 12,5% y se transfirieron a una
membrana de PVDF (Millipore). La membrana se bloqueó por incubación en tampón
de bloqueo para western blot fluorescente (Rockland research, West Nyack, Nueva
York) durante 1 h, a temperatura ambiente y se lavó tres veces con PBS-Tween 0,05%.
A continuación, la membrana se incubó con anticuerpo anti-Alix (Cell signaling
3. MATERIALES Y MÉTODOS
103
technologies, Denvers, Massachusetts) 1: 400 durante toda la noche a 4°C. La
membrana se lavó tres veces con PBS-Tween 0,05% y se incubó con un anticuerpo
anti-rabbit conjugado con un fluorocromo verde durante 1 h a temperatura ambiente.
Después de la incubación de anticuerpo secundario, la membrana se lavó de nuevo
tres veces con PBS-Tween 0,05%. El revelado de la membrana se desarrolló en el
sistema Odyssey (Li-Cor, Lincoln, Nebraska). En la misma membrana se llevó a cabo
una segunda incubación con un anticuerpo primario anti-TSG101 (Cell signaling), así
como una segunda incubación con el anticuerpo secundario anti-especie conjugado y
el revelado de la membrana.
3.13.4. SDS-PAGE y digestión tríptica de las bandas del gel de poliacrilamida
El pelet de microvesículas y el secretoma soluble se mezclaron con 15 o 20 µl
respectivamente de tampón de muestra reductor 4X (NuPage), se hirvieron durante
5 minutos a 95 oC y se enfriaron en hielo. Estos extractos desnaturalizados se cargaron
entonces en un gel SDS-PAGE con un gradiente de concentración de poliacrilamida del
4-12% (NuPage) y se llevó a cabo la electroforesis durante 1 hora a 100 V. Los geles
se lavaron brevemente con agua miliQ y se fijaron posteriormente en etanol
50%/ácido fosfórico 1% durante 15 minutos. Después de un segundo lavado con agua
miliQ, los geles se tiñeron durante la noche con azul de Coomasie (azul brillante R250
en una solución de metanol al 1% y ácido fosfórico al 40%, con NH4SO4 al 1%).
Después de la tinción, los geles se lavaron con agua miliQ para eliminar el fondo de
Coomasie y fueron escaneados utilizando un escáner digital (Hewlett-Packard, Palo
Alto, CA).
El gel teñido con Coomassie y lavado se transfirió a un recipiente cerrado de
dimensiones similares (w × l) al gel y se lavó por agitación suave en 50 ml de NH4HCO3
25 mM durante 10 minutos. Siempre eliminando el solvente anterior en cada nuevo
paso, se lavó el gel dos veces en NH4HCO3 50 mM/acetonitrilo (ACN) 50% durante 10
min. Se sometió el gel a un paso de reducción en 25 ml de DTT 10 mM en NH4HCO3 50
mM a 56°C en un baño de agua durante 60 min. Se dejó enfriar y se procedió a un paso
de alquilación con 25 ml yodoacetamida 54 mM en NH4HCO3 50 mM durante 45
minutos, en oscuridad y a temperatura ambiente. Se lavó el gel en 25 ml NH4HCO3 50
mM durante 10 minutos y en 25 ml de NH4HCO350 mM/acetonitrilo 50%. Este paso
se repitió dos veces. El gel se transfirió a una placa de vidrio limpio en una cabina de
3. MATERIALES Y MÉTODOS
104
flujo laminar y en base a la imagen escaneada con anterioridad, y el uso de los
marcadores preteñidos (All blue, Bio rad) como guía, se cortó el gel en láminas, en
primer lugar, para separar cada carril, correspondiente a una muestra. Cada carril se
cortó en 3 bandas equivalentes (mismo tamaño o misma cantidad predicha de
péptidos), y cada banda se cortó en cubos de, aproximadamente, 1 mm3. Los cubos de
gel se transfirieron a tubos de reacción de 1,5 ml. Los cubos de gel se secaron en una
centrífuga de vacío a 50°C durante 10 minutos y, una vez secos los trozos se cubrieron
con solución de tripsina (6,25 ng/l en NH4HCO3 50 mM). Se eliminó el exceso de
tripsina tras la rehidratación de los trozos de gel y se cubrieron con exceso de
NH4HCO3 50 mM. Se realizó la digestión durante la noche a 25°C en un bloque de
calentamiento. Después de la digestión, los péptidos se extrajeron de los cubos de gel
con 100 µl de ácido fórmico 1% con agitación en vórtex. El sobrenadante se transfirió
a tubos nuevos de 1,5 ml y se volvieron a extraer los péptidos de los cubos de gel con
100 µl de ácido fórmico 5%/acetonitrilo 50%. El sobrenadante se combinó con el
primer eluido. La segunda extracción se repitió una vez más y el sobrenadante se
combinó con los extractos anteriores. Los extractos fueron almacenados a -20°C.
Previo a la identificación de péptidos por Espectometría de masas, los extractos se
concentraron en una centrífuga de vacío a 50°C y los volúmenes se ajustaron a 50 µl
mediante la adición de ácido fórmico 0,05%.
3.13.5. Espectometría de masas (LC-MS/MS)
Los péptidos fueron separados mediante el sistema Ultimate 3000 nanoLC-
MS/MS (Dionex LC Embalaje, Amsterdam, Países Bajos), equipado con una columna
de sílice fundida de 20 cm×75 μm con un relleno de 3 μm de 120 Å Reprosil Pur C18
aqua (Dr. Maisch GMBH, Ammerbuch-Entringen, Alemania).
Después de la inyección, los péptidos fueron capturados a una velocidad de 6
µl/min en una columna ID trap de 10 mm x 100 µm llena con 5 µm de Reprosil Pur
C18 aqua 120 Å en 2% de tampón B (tampón A: ácido acético 0,5% en agua milliQ;
tampón B: ACN 80%+ ácido acético 0,5% en agua milliQ) y separados a 300 nl/min en
un gradiente de tampón B 10-40% en 60 min (90 min de inyección a inyección).
Los péptidos eluidos se ionizaron a un potencial de +2 kVa en un
espectrómetro de masas Q Exactive (Thermo Fisher). Las masas intactas se midieron
3. MATERIALES Y MÉTODOS
105
a una resolución de 70.000 (en m/z 200) en el orbitrap utilizando un valor AGC diana
de 3×106 cargas. Los péptidos con las 10 señales más altas (estado de carga 2+ y
superior) fueron sometidos a MS/MS en una celda de colisión de alta energía (HCD),
con un ancho aislamiento 4 amu, el 25% de la energía de colisión normalizada). Los
espectros de MS/MS fueron adquiridos a una resolución de 17.500 (en m / z 200) en
el orbitrap utilizando un valor AGC diana de 2 × 105 cargas y una relación de llenado
insuficiente de 0,1%. Se aplicó una dinámica de exclusión con un número de
repetición de 1 y un tiempo de exclusión de 30 s.
3.13.6. Identificación de proteínas
La búsqueda de espectros de MS/MS se realizó en el archivo FASTA del
proteoma humano de referencia Uniprot, publicado en enero de 2014, sin fragmentos;
con 42.104 entradas; usando MaxQuant 1.4.1.2. (Cox J, 2008). Se estableció la tripsina
como enzima y se permitieron dos residuos perdidos. Se trató la cisteína
carboxamidometilación (Cys, 57.021464 Da como modificación fija y la oxidación de
metionina (Met, + 15,994915 Da) y la acetilación N-terminal (N-terminal, 42.010565
Da) como modificaciones variables. La búsqueda de iones precursores de pétidos se
realizó con una desviación máxima masa de 4,5 ppm y con una desviación máxima
masa para los fragmentos de iones de 20 ppm (ajustes MaxQuant por defecto). Las
identificaciones de péptidos y proteínas se filtraron con un ratio de descubrimiento
falso (FDR) de 1%, usando la estrategia de “decoy database”. Las proteínas que no
pudieron ser diferenciadas basándose en los espectros de MS/MS por sí solos se
agruparon por grupos de proteínas (configuración por defecto de MaxQuant).
3.13.7. Cuantificación de proteínas
Cada muestra se separó en 5 fracciones que fueron sometidos a nano-LC-
MS/MS. Las proteínas fueron cuantificadas por recuento espectral; es decir,
cuantificando el número de todos los espectros MS/MS para cada proteína
identificada (Liu HB, 2004), método englobado en proteómica “label-free”. Para el
análisis cuantitativo de las muestras, los recuentos espectrales para las proteínas
identificadas en una muestra de cada una de las 5 fracciones se sumaron y se
normalizaron por la suma de los recuentos espectrales totales para esa muestra. Esto
proporciona la contribución del número de recuentos espectrales relativos de una
proteína al recuento total de espectros en una muestra. Al comparar diferentes
3. MATERIALES Y MÉTODOS
106
muestras biológicas, se utilizaron estos recuentos espectrales normalizados. De esta
manera, se corrigieron las diferencias de concentración proteica entre las muestras.
Se realizó un análisis diferencial de las muestras mediante el test beta binominal
(Pham TV, 2010), que tiene en cuenta las variaciones intra e inter-muestra, y
proporciona un valor de la regulación de las proteínas (positivo o negativo, según
aumenten o disminuyan en la muestra) y un valor p asociados para todas las proteínas
identificadas. Además, se realizó análisis de conglomerados de proteínas de las
proteínas expresadas diferencialmente usando la agrupación jerárquica en R. Las
abundancias de proteínas se normalizaron con un valor de media igual a cero y un
valor de varianza igual a uno para cada proteína individual. Posteriormente, se utilizó
la medida de la distancia euclídea para el agrupamiento de proteínas.
3.13.8. Análisis de datos
Se seleccionaron aquellas proteínas reguladas para cada línea celular cuyo
valor p fue inferior a 0,05 para la prueba del test beta binomial. Se utilizaron dos
filtros adicionales: se eliminaron de la lista aquellas proteínas cuyo número de
recuentos espectrales normalizados no superaba al menos en una de las condiciones
(control o tratado con LPS) y se eliminaron, en segundo lugar, aquellas que no estaban
reguladas de la misma manera en ambos duplicados biológicos (duplicados
consistentes); como se muestra en la Figura 20.
La lista final fue utilizada para el estudio de Ontología Génica (GO), utilizando
las herramientas bioinformática DAVID:
http://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp (Huang WD, 2009) (Huang WD, 2009) y
String: http://string-db.org/ (Snel B, 2000) (Franceschini A, 2013).
3. MATERIALES Y MÉTODOS
107
Figura 20: Diagrama de flujo para la identificación de proteínas secretadas en respuesta al LPS por 6 líneas celulares de CCR. En primer lugar (A) se trataron las células con la endotoxina bacteriana y se recolectó el secretoma completo. La porción de vesículas extracelulares se separó mediante ultracentrifugación, y ambas se cargaron en geles SDS-PAGE y se recortaron en bandas para la digestión tríptica y la obtención de pétidos. Todas las muestras (B) se llevaron al espectrómetro de masas acoplado a cromatografía líquida y se obtuvieron las identidades de todas las proteínas que conformaban cada una de las muestras, así como su abundancia. Se procedió al análisis de datos (C), mediante el test-betabinomial con el programa R y se creó una lista final de proteínas reguladas por LPS
RESULTADOS
4. RESULTADOS
111
4. RESULTADOS
4.1. MODELO DE RESPUESTA FUNCIONAL DEL CCR HUMANO HT-29 TRAS SU
EXPOSICIÓN A LPS.
4.1.1. Viabilidad celular mediante ensayo colorimétrico de MTT
Los cultivos de células HT-29 se mantuvieron hasta un estado de confluencia
celular en el que la mayoría de las células disminuyeron su nivel intracelular de
Glutation, dejando de proliferar e incrementando su actividad transcripcional
dependiente del estrés oxidativo, tal como ha sido descrito en trabajos anteriores del
grupo de investigación (Solaun, et al., 2002)
A continuación, se intercambió el medio por otro fresco sin suero, y se
realizaron ensayos de viabilidad celular tras la incubación de los cultivos de HT-29
con concentraciones crecientes de LPS (0,1-100 µg/ml) durante 24 horas,
cuantificándose la supervivencia celular en función del marcaje con MTT.
Como se observa en la Figura 21, en estas circunstancias funcionales del HT-
29, las concentraciones de 0.1 a 1 µg/ml no alteraron ni la viabilidad, ni la
proliferación de sus células. En cambio, las concentraciones de 2 y 10 µg/ml
aumentaron levemente (30%) la proliferación, tal como se ha descrito en trabajos
previos del grupo utilizando líneas 51b de CCR murino (Solaun, et al., 2002), y la
concentración de 100 µg/ml fue tóxica, disminuyendo significativamente la población
celular del cultivo en un 50%.
4. RESULTADOS
112
4.1.2. Determinación mediante RT-PCR de la actividad transcripcional del gen VEGFA
en células HT-29 tratadas con LPS
Con el fin de estudiar si la respuesta de las células HT-29 al LPS siguió el
modelo de estimulación transcripcional del gen VEGF-A, que es característico de los
monocitos activados por LPS (Guha & Mackman, 2001; Lee, et al., 2008), a
continuación, los cultivos de células HT-29 se mantuvieron en medio con 10% de FBS
hasta un estado de confluencia, y recibieron 1 µg/ml de LPS durante 30 min, 1, 3, 6 y
18 horas. Entonces se extrajo el ARNm, se retrotranscribió a ADN copia, y se incubó
con los cebadores específicos para cuantificar de la expresión génica de VEGF-A. Los
resultados demostraron (Figura 22) un efecto estimulante transcripcional del LPS
sobre el gen VEGF-A que fue estadísticamente significativo a los 30 minutos del
tratamiento, disminuyendo progresivamente durante las 3 horas siguientes; para
volver a aumentar levemente (no fue significativo) durante las 6 horas siguientes de
tratamiento.
Figura 21: Ensayo de MTT para medir la viabilidad celular tras la incubación de la línea HT-29 de CCR humano con concentraciones crecientes de LPS. Los datos corresponden a valores medios de viabilidad para un ensayo por sextuplicado (n=6) y se representan para cada dosis de LPS, como porcentajes de células vivas en los cultivos con LPS con respecto a la concentración celular en los cultivos basales.
* *
4. RESULTADOS
113
Figura 22: Resultados de expresión génica de VEGFA en las células HT-29 tras el tratamiento con LPS. Se realizaron dos experimentos por duplicados (n=4), La expresión de VEGFA aumentó significativamente a los 30 minutos de tratamiento y disminuyó de manera progresiva a continuación, llegando a niveles basales a las tres horas de tratamiento. A continuación, volvió a incrementar progresivamente pero no de manera significativa.
4.1.3. Estudio mediante Luminex de la secreción de citocinas en células HT-29 tratadas
con LPS
Una vez determinadas las concentraciones más fisiológicas de LPS para esta
línea, a continuación, las células HT-29 recibieron de nuevo 0.1, 1 y 2 µg/ml de LPS
durante 24 horas, y se determinó, mediante una placa BioPlex de LUMINEX™, la
secreción de citocinas y factores de crecimiento en los sobrenadantes de cultivos
controles y tratados (Tabla 9). A pesar de la naturaleza epitelial de las células HT-29,
las citocinas cuya concentración en el sobrenadante varió significativamente (p<0,01)
fueron en todos los casos factores solubles inmuno-inflamatorios, típicos del
monocito activado (GROalfa/CXCL1, IL-18, M-CSF, MIF y SCF). Como se observa en la
Figura 23 todos estos factores, salvo el CSF-M, aumentaron su concentración, entre
tras el tratamiento, aunque su patrón de acumulación en el sobrenadante fue distinto
en cada caso. Con respecto a la dosis de LPS, 0.1 y 1 µg/ml fueron las concentraciones
que indujeron una mayor respuesta secretora, mientras que la dosis de 2 µg/ml
4. RESULTADOS
114
conllevó una menor respuesta secretora de las citocinas estudiadas. La secreción de
MCSF tuvo un comportamiento inverso, al reducirse su secreción en más de un 50%
tras el tratamiento con LPS.
Tabla 9: Concentración de 21 citocinas y factores de crecimiento en sobrenadantes de medios de cultivo de la línea celular HT-29. Tras el tratamiento con distintas dosis de LPS (0,1, 1 y 2 µg/ml); aumentó significativamente la concentración de GROα, MIF, IL18 y SCF; y disminuyó significativamente la concentración de MCSF.
Citocina Descripción Concentración
basal 0.1 µg/ml 1 µg/ml 2 µg/ml
CTACK/
CCL27
Quimiocina atrayente
de células T cutáneas 833,8±41,1 900,4±62,1 962,3±29,9 *624,6±40,6
GROα/
CXCL1
Proteína regulada por
el crecimiento 1811,8±10,3 **2922,8±196,3 2016,2±65,4 1931,9±73,1
HGF Factor de crecimiento
de hepatocitos 380,0±16,5 344,9±24,5 392,4±29,0 *286,3±20,0
IFN-α Interferón alfa 215,3±6,3 216,2±6,1 228,4±4,6 202,7±4,5
IL-1α Interleucina 1 alfa 65,8±7,8 57,7±4,0 66,4±3,0 48,2±5,3
IL-3 Interleucina 3 1003,5±84,0 922,0±62,3 996,2±100,0 781,6±78,7
IL-12p40 Interleucina 12,
subunidad beta 2311,7±238,3 2123,6±240,7 2363,7±245,6 *1135,7±238,9
IL-16 Interleucina 16 541,9±37,1 538,9±19,4 584,4±29,7 531,1±8,8
IL-18 Interleucina 18 27,8±2,7 31,8±2,3 **51,5±3,4 35,8±3,2
LIF Factor inhibidor de
leucemia 462,2±35,2 387,0±24,33 373,4±13,2 **265,7±34,9
MCP-3
Proteína
quimioatrayente de
monocitos
345,3±11,5 370,9±24,3 361,8±34,9 389,8±5,8
IL-2Ra Receptor de
interleucina 2, soluble .158,8±4,2 158,1±5,6 184,9±10,0 151,9±8,2
MCSF Factor estimulador de
colonias de macrófagos 4466,3±282,4 **1779,4±238,4 **1392,4±188,5 **1158,2±328,5
MIF Factor inhibidor de
macrófagos 1969,9±94,5 **9261,8±623,1 **15519,3±1370,5 **12075,2±1766,40
MIG
/CXCL9
Monocina inducida
por interferón gamma 853,8±44,2 947,7±90,34 1033,1±79,4 832,6±82,1
Β-NGF Factor de crecimiento
neural beta 141,6±3,6 135,7±7,3 141,6±17,2 101,5±13,8
SCF Factor de células
madre (ligando c-Kit) 602,7±12,2 **834,3±41,9 **867,3±17,1 703,5±40,3
4. RESULTADOS
115
SCGFβ Factor de crecimiento
de células madre beta 1706,2±67,4 1670,4±287,7 1756,9±89,4 1589,5±200,9
SDF-1α Factor derivado de
estroma 1 alfa 1829,0±102,9 1654,8±91,4 1827,0±94,0 **1063,8±178,2
TNF-β Factor de necrosis
tumoral beta 264,0±11,9 254,9±4,3 270,0±5,1 **213,2±9,0
TRAIL/
Apo2L
Ligando inductor de
apoptosis relacionado
con TNF
186,6±28,9 198,2±27,3 239,8±23,8 210,5±16,7
4. RESULTADOS
116
A B
C
E
Figura 23: Concentración en pg/ml de IL-18 (A), MCSF (B), MIF (C), SCF (D) y GROα (E) medida mediante Luminex© en el sobrenadante de células HT-29 en cultivo, tratadas con 0.1, 1 y 2 µg/ml de LPS y sin tratar. Se representa la media ± SD.
4. RESULTADOS
117
4.1.4. Identificación mediante 2D-PAGE-MS de moléculas secretadas dependientes de
LPS en cultivos de HT-29
El objetivo de este estudio fue identificar moléculas solubles de >10kDa,
específicas de la respuesta celular del HT-29 a LPS. Los cultivos con o sin LPS (1 µg/ml,
20 horas) se repitieron tres veces con medio sin suero. Sus sobrenadantes se
concentraron hasta un volumen de 5 ml, excluyendo moléculas con un peso molecular
menor de 10 kDa; y se obtuvieron los 2D-PAGE correspondientes a todas las
condiciones de cultivo, tal como se describe en Métodos.
Para la separación de las proteínas según su punto isoeléctrico (pI), o
isoelectroenfoque, se emplearon geles comerciales de un rango en gradiente de pH no
lineal de 3 a 10, que posibilitaron el estudio general de las proteínas de los
sobrenadantes sin excluir aquellas de pI extremos, para así tener una visión global de
las proteínas secretadas por este tipo de células. A continuación, las proteínas se
separaron por su peso molecular en geles SDS-PAGE con un 12% de poliacrilamida.
Las proteínas de los geles bidimensionales obtenidos se hicieron visible tras una
tinción de plata, y se escanearon en un densitómetro de barrido, para realizar el
análisis de imagen comparativo entre perfiles proteicos de las células con o sin el
tratamiento con LPS.
En la Figura 24 se muestran dos geles representativos de las proteínas
secretadas por células sin tratar (A) y tras el tratamiento con LPS (B).
4. RESULTADOS
118
KDa
B KDa
Figura 24: Geles bidimensionales. Imágenes escaneadas de los geles de poliacrilamida resultantes de la separación isoelectroforética y por peso molecular del secretoma de la línea celular HT-29 en condiciones basales (A) y tras el tratamiento con 1 µ/ml de LPS (B). En la coordenada horizontal se indica el pH en el cuál quedaron inmovilizadas las proteínas, que se correspondería con su pI aparente; mientras que en la coordenada vertical se representan los pesos moleculares aparentes.
A
4. RESULTADOS
119
De acuerdo con las especificaciones de Materiales y Métodos, el estudio
comparativo de las proteínas secretadas por las células con o sin tratar con LPS se
realizó mediante el software Dymension de Syngene. Se detectaron un total de 1.125
manchas consenso para los geles de HT-29 control y un total de 1005 manchas
consenso en el gel de HT-29 tratado con LPS.
Como proteínas diferenciales se seleccionaron las manchas que aumentaron o
disminuyeron de densidad en más de 1,5 veces (t-Student, p<0,05). En la Tabla 10 se
muestra la lista de manchas diferenciales, etiquetadas con el número de mancha
asignado por el programa informático, y el cambio de densidad óptica entre células
de HT-29 con y sin tratamiento con LPS.
Tabla 10: Lista de manchas cuya concentración varió significativamente tras el tratamiento con LPS. El incremento se calculó mediante la superposición de los geles controles y tratados y el cálculo en la relación de densidades ópticas para cada mancha, tomando como referencia la densidad óptica del gel control.
Num. spot Control
Vol. Norm. Num. Spot LPS 1 Vol. Norm.
138 1 102 2,684
156 1 125 2,941
195 197
1 1
154 158
4,366 4,449
226 1 202 1,601 272 1 237 1,646
282 1 260 2,577
315 1 356 2,500
519 1 459 4,865 329 1 292 1,501
347 1 317 2,029
528 1 478 2,344
667 1 575 2,569 649 1 592 2,065
680 1 611 2,999
889 1 788 2,556
862 1 799 6,311
En las FigurasFig ura 25 y 26 se muestra la localización en el gel bidimensional de las
proteínas diferenciales. Algunas de las manchas aparecieron muy juntas, formando
4. RESULTADOS
120
una línea en sentido horizontal, probablemente por tratarse de isoformas con
diferentes grados de fosforilación.
Para poder apreciar mejor algunas de las diferencias de expresión proteica
detectadas, a continuación, en la Figura 26, se muestran determinadas zonas de los
geles bidimensionales del secretoma de células HT-29 tratadas (LPS) y sin tratar
(CONTROL). Las proteínas diferencialmente expresadas se marcaron con un
asterisco.
4. RESULTADOS
121
Figura 25: Zonas de localización de las proteínas expresadas diferencialmente en los geles resultantes de la separación bidimensional del secretoma de la línea celular HT-29, en condiciones basales (A) y tras la exposición a 1 µg/ml de LPS (B).
A
B
4. RESULTADOS
122
* *
* *
*
Número de spot (referencia: gel
control) CONTROL LPS
138 156
195 197
226
272
329 347
282
519
GSS
528
667
349 680
862
Figura 26: Detalle de las zonas del gel bidimensional control y tratado con LPS en que se ubicaron las proteínas diferencialmente secretadas. En la columna izquierda figuran los números de spot en el gel control asignados por el programa informático, y en las siguientes columnas figura el detalle de las manchas diferencialmente expresadas en ambos geles (control y tratado). Los asteriscos en las imágenes del gel control señalan las manchas cuya concentración se incrementó.
Una vez seleccionadas todas las proteínas de interés mediante la comparación
de geles bidimensionales entre muestras de HT-29 control y tratadas, y tras el
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
4. RESULTADOS
123
tratamiento de los datos obtenidos en análisis de imagen, se procedió a la
identificación de las proteínas de expresión diferencial y de otras comúnmente
expresadas por la línea celular (es decir, otras manchas del gel cuya expresión no
varió entre condiciones control y tratamiento). A tal fin, las proteínas de interés se
escindieron mecánicamente del gel para su aislamiento mediante tratamiento
enzimático e identificación junto con algunas proteínas seleccionadas por su alta
expresión. El proceso se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en Materiales y
Métodos.
La Tabla 11 recoge las identidades de proteínas identificadas cuya
concentración varió significativamente. Su rango de PM osciló entre 23 kDa
(ARHGDIA) y 69 kDa (EZR) y del punto isoeléctrico entre 4,69 (PDI) y 8,57 (GAPDH).
Doce de estas fueron de naturaleza enzimática y los cinco restantes (EZR, MSN,
SERPINB1, YWHAZ, y CCT5) proteínas estructurales. De todas las proteínas
identificadas, MSN e YWHAZ fueron las únicas cuya concentración aumentó en más
de 3 veces en el secretoma tras el tratamiento con LPS, faltando en estos casos la
mancha proteica en los geles de células no tratadas. En cambio, ALDH1A1, ARHGDIA,
CCT5, EZR, G6PD, GAPDH, GSS, LDHB, PDI, PGK1, PKM2, SERPINB1, TALDO1, TKT
fueron proteínas cuya concentración incrementó en menos de tres veces en el
secretoma del HT-29 tratado con LPS.
4. RESULTADOS
124
Tabla 11: Proteínas identificadas por MALDI-TOF/TOF tras el análisis por electroforesis bidimensional y densitometría óptica de las proteínas secretadas por la línea celular HT-29 en respuesta al LPS. En la primera columna se muestran los números de spot asignados por el programa de análisis de imagen, tomando como referencia el gel control. En las columnas segunda y tercera se muestra la abreviatura del gen que codifica para la proteína y el nombre de la misma, respectivamente. Además, en las siguientes columnas se detallan tanto el peso molecular teórico como el punto isoeléctrico de cada una de las proteínas identificadas.
Spot n°
Nombre Símbolo Peso
molecular (teórico)
Punto isoeléctrico
(teórico)
329 ALDH1A1 Aldehyde dehydrogenase 1
family, member A1 54.730,65 6,29
889 ARHGDIA Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha
23.075,92 5,01
226 CCT5 Chaperonin containing TCP1,
subunit 5 (epsilon) 59.539,82 5,44
138 EZR Ezrin 69.413,00 5,94
347 G6PD Glucose-6-phosphate
dehydrogenase 59.125,56 6,41
667 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase 36.053,00 8,57
315 GSS Glutathionesynthetase 52.253,63 5,67
680 LDHB Lactatedehydrogenase B 36.507,30 5,72
156 MSN Moesin 67.688,85 6,09
282 PDIA2 Prolyl 4-hydroxylase, beta
polypeptide, proteindisulfideisomerase
55.294,02 4,69
519 PGK1 Phosphoglyceratekinase 1 44.483,49 8,30 272 PKM2 Pyruvatekinase, muscle 57.805,70 7,95
528 SERPINB1 Serpin peptidase inhibitor,
clase B (ovalbumin), member 1
42.741,81 5,90
649 TALDO1 Transaldolase 1 37.540,13 6,36 195 197
TKT Transketolase 1 67.877,63 7,58
862 YWHAZ 14-3-3 protein zeta/delta 27.745,10 4,73
4. RESULTADOS
125
4.2. ESTUDIO TRANSCRIPCIONAL DE GENES DEPENDIENTES DE LPS EN
LESIONES PRIMARIAS DE PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL
AVANZADO.
4.2.1. Estudio sobre la expresión de genes dependientes de LPS en mucosa colónica
normal y tumoral.
Tras la identificación mediante 2D-MS/MS y Luminex de proteínas exportadas
al espacio extracelular en las condiciones basales del cultivo de células HT-29
(secretoma basal), y de aquellas cuya concentración en estuvo asociada al tratamiento
de dichas células con LPS (secretoma dependiente de LPS), a continuación, se estudió
la actividad transcripcional de los genes correspondientes a dichas proteínas en
lesiones primarias de pacientes con CCR y en su mucosa colónica normal. Con este
objetivo, se utilizó la base de datos GSE8671, publicada por Sabates-Bellver, y cols
(2007), correspondiente al transcriptoma completo de biopsias pareadas de mucosa
colónica normal y tumoral, procedentes de 32 pacientes con CCR (Figura 27 y Tabla
12). Los genes estudiados fueron: MIF (previamente estudiada en el inmuno-ensayo
por Luminex) y ALDH1A1, ARHGDIA, CCT5, EZR, G6PD, GAPDH, GSS, LDHB, MSN, PDI,
PGK1, PKM2, SERPINB1, TALDO1, TKT, YWHAZ y ENO1 (previamente identificadas
por 2D-MS/MS). Los datos de expresión para cada gen y paciente se normalizaron con
los valores del gen constitutivo HPRT1. A continuación, se calcularon los valores
promedios de expresión para cada gen y se determinaron los porcentajes de muestras
de cada tipo (mucosas normal y tumoral) por encima y por debajo de dichos valores
promedios de expresión.
Como se puede observar en la Figura 27 y en la Tabla 12, hubo un subgrupo de
genes del HT-29 dependientes de LPS (ARHGDIA, CCT5, EZR, GAPDH, GSS, MSN,
PDIA2, PGK1, PKM, YWHAZ) cuyos valores medios del Ct normalizado en las muestras
de mucosa tumoral se encontraron por debajo del valor promedio de expresión en la
mayoría de los pacientes (75% de pacientes en adelante), siendo las diferencias de
expresión con respecto al valor medio del Ct normalizado en mucosa normal
estadísticamente significativas para p<0.01. Estos resultados indicaron el predominio
de pacientes con un aumento de expresión de dichos genes en sus lesiones de CCR, lo
que estuvo en concordancia con el hecho de menos del 50% de los pacientes tuvieron
4. RESULTADOS
126
alta expresión de dichos genes en mucosa normal. En segundo lugar hubo un
subgrupo de genes cuyas diferencias de expresión entre muestras de mucosa normal
y tumoral en los pacientes con CCR no fueron estadísticamente significativas
(SERPINB1, G6PD, ALDH1A1, ENO1, TALD01, TKT). En tercer lugar, también hubo
otro subgrupo de genes del HT-29 dependientes de LPS (LDHB, MIF) cuyos valores
medios del Ct normalizado en las muestras de mucosa tumoral se encontraron por
encima del valor promedio de expresión en la mayoría de los pacientes (69% de
pacientes en adelante), siendo las diferencias de expresión con respecto al valor
medio del Ct normalizado en mucosa normal estadísticamente significativas para
p<0.01. En este caso los resultados indicaron el predominio de pacientes con una
caída de expresión de dichos genes en sus lesiones de CCR, lo que estuvo en
concordancia con el hecho de más del 50% de los pacientes tuvieron alta expresión
de dichos genes en mucosa normal.
4. RESULTADOS
127
4. RESULTADOS
128
Figura 27: Expresión de los genes de HT-29 dependientes de LPS en mucosa normal (MN, serie naranja) y tumoral de pacientes con cáncer colorectal (CCR, serie azul) recogidos en la plataforma pública de Sabater-Bellver (2007) obtenida con tecnología Affymetrix. Los valores de expresión de los 17 genes de HT-29 dependientes de LPS se normalizaron con los valores de expresión del gen constitutivo HPRT1 (Ct gen estudiado/Ct gen constitutivo), utilizados como control endógeno. A continuación, se obtuvo el valor promedio de expresión de cada gen en más mucosas de todos los pacientes (línea roja) y se representaron las curvas de distribución de los valores normalizados de expresión de cada gen en mucosa normal y tumoral para determinar los porcentajes de pacientes cuyos valores de expresión estuvieron por encima (baja expresión) y por debajo (alta expresión) del valor promedio.
4. RESULTADOS
129
Tabla 12: Valores de expresión media ±desviación estándar para las muestras de mucosa normal y de CCR, así como para el total de muestras. En las dos últimas columnas se muestra el porcentaje de casos cuya expresión génica está por debajo del valor promedio para toda la serie; es decir, aquellos cuya expresión está incrementada.
4.2.2. Asociación transcripcional de los genes de HT-29 dependientes de LPS a genes
prometastásicos en lesiones primarias de pacientes con CCR.
Una vez clasificados los genes de HT-29 dependientes de LPS por sus niveles
transcripcionales en mucosa normal y tumores primarios de pacientes con CCR, el
siguiente objetivo fue determinar su asociación transcripcional a otros genes
identificados en trabajos anteriores de nuestro grupo por sus implicaciones
prometastásicas en CCR, detectadas en estudios clínicos y experimentales (Márquez,
et al., 2013).
Gen
Valores de expression génica Índice de
muestras con alta expresión
Mucosa normal
Biopsia tumoral
Todas las muestras
Mucosa normal
Biopsia tumoral
ALDH1A1 1,0562 ± 0,2218 0,8982 ± 0,4780 0,9772 ± 0,3781 41 66
ARHGDIA 0,6694 ± 0,1903 0,3671± 0,1760* 0,5183 ± 0,2372 19 87
CCT5 0,0481 ± 0,0203 0,0231 ± 0,0112* 0,0356 ± 0,0205 31 87
EZR 0,0585 ± 0,0396 0,0191 ± 0,0165* 0,0388 ± ,0361 34 91
ENO1 2,0834 ± 0,4481 2,1426 ± 0,8212 2,1130 ± 0,6569 56 56
GAPDH 13,8519 ± 2,9833 9,8100 ± 3,0558* 11,8309 ± 3,6226 25 84
G6PD 0,0686 ± 0,0327 0,0714 ± 0,0371 0,0700 ± ,0347 59 62
GSS 0,6626 ± 0,1500 0,3915 ± 0,1257* 0,5271 ± ,1937 16 84
LDHB 3,0863 ± 0,7340 3,6555 ± 1,3006* 3,3709 ± 1,0862 72 41
MIF 3,7000 ± 1,0860 4,4992 ± 0,9592* 4,0996 ± 1,0933 69 31
MSN 0,6459 ± 0,2198 0,2347 ± 0,1100 0,4403 ± ,2696 22 94
PDIA2 0,0122 ± 0,0115 0,0063 ± 0,0061* 0,0093 ± ,0096 49 75
PGK1 3,1000 ± 0,6746 2,1219 ± 0,6272* 2,6109 ± 0,8127 31 84
PKM 0,0643 ± 0,0282 0,0335 ± 0,0148* 0,0489 ± 0,0272 31 75
SERPINB1 1,6249 ± 0,3399 1,8759 ± 0,4498 1,7504 ± 0,4152 59 50
TALDO1 2,7261 ± 0,6645 2,5123 ± 0,7292 2,6192 ± 0,7004 50 49
TKT 0,0341 ± 0,0216 0,0349 ± 0,0172 0,0345 ± 0,0194 62 59
YWHAZ 0,1722 ± 0,1210 0,0856 ± 0,0644* 0,1289 ± 0,1056 41 84
4. RESULTADOS
130
A tal fin, se cuantificó la expresión de los 18 genes de HT-29 dependientes de LPS
junto con la de otros 44 genes prometastásicos, en 41 biopsias de lesiones primarias
de pacientes con CCR, mediante RT-PCR en placas TLDAs (véase Materiales y
Métodos). Los valores medios de expresión de todos los genes junto con su
desviación estándar, aparecen detallados en el Anexo II.
En la Figura 28 se representa, mediante un diagrama de cajas, los valores de
expresión (en forma de Ct normalizado con respecto al valor Ct del gen constitutivo
HPRT1) tan solo de los 18 genes de HT-29 dependientes de LPS. Los genes ENO1, EZR,
GAPDH, MIF, PGK1, PKM, SERPINB1, TALDO1, TKT, LDHB, YHWAZ y ARHGDIA se
situaron en la parte inferior del diagrama, indicando un nivel de expresión mayor. En
cambio, los genes ALDH1A1, CCT5, G6PD, GSS y MSN se situaron en la zona próxima
al valor 1, indicando un nivel de expresión similar al del gen constitutivo HPRT1. En
cambio, el gen PDIA2 se situó en la parte superior de la gráfica, indicando que su nivel
de expresión fue menor que la del gen constitutivo HPRT1.
En concordancia con los resultados obtenidos en el estudio anterior en la
base de datos de Sabater-Bellver, los genes ARHGDIA, EZR, GAPDH, PGK1, PKM, y
YHWAZ también mostraron un aumento transcripcional y la expresión de los genes
G6PD y ALDH1A1 tampoco varió significativamente en este nuevo estudio. En
cambio, a diferencia del estudio anterior, en este segundo estudio si se constataron
aumentos en la expresión de los genes ENO1, SERPINB1, TALDO1 y TKT en las
lesiones de CCR, mientras que desaparecieron los aumentos en la expresión de los
genes CCT5 y GSS en las lesiones de CCR. Los valores medios de expresión, junto con
su desviación estándar, aparecen detallados en el Anexo II.
4. RESULTADOS
131
Figura 28: Diagrama de cajas de los valores promedio y dispersión en la expresión de los genes de HT-29 dependientes de LPS en función de los Ct normalizados con respecto al gen constitutivo HPRT1, en biopsia de lesión primaria de pacientes con CCR. Gráficos de caja de valores Ct: la caja sólida muestra el rango del 50% de las muestras; el límite superior de cada caja representa el tercer cuartil de los valores de expresión para el gen, y el límite inferior el primer cuartil; la línea negra horizontal representa la mediana (o segundo cuartil, que abarca el 50% de los datos). El punto negro muestra la media; las terminaciones de las líneas verticales indican los valores de Ct máximo y mínimo de expresión del gen. Los valores atípicos (aquellos que se extienden más allá de los valores máximo y mínimo de la serie o de 1,5 veces el rango intercuartílico) aparecen representados por puntos y asteriscos, de manera aislada.
Con el fin de identificar qué genes prometastásicos del CCR están asociados a
los genes del HT-29 dependientes de LPS, a continuación, se efectuó un análisis de
conglomerados jerárquicos que se representó a través de un dendrograma donde
aparecen los 62 genes agrupados en función de sus niveles de expresión en estas
mismas 41 biopsias procedentes de lesiones primarias de pacientes con CCR (Figura
29). Además, los 45 genes prometastásicos se subclasificaron en el dendrograma en 9
categorías funcionales.
4. RESULTADOS
132
En la estructura del dendrograma hubo una subdivisión primaria en dos
grandes grupos de genes: Grupo 1, que fue el predominante e incluyó 44 genes de los
que solo 9 (20%) fueron genes prometastásicos detectados en muestras de pacientes,
y el resto (80%) fueron genes prometastásicos experimentales no estudiados hasta la
fecha en muestras de pacientes; y Grupo 2, que fue minoritario e incluyó 18 genes de
los que la mayoría (12 genes) fueron prometastásicos clínicos y solo 6
prometastásicos experimentales.
Por su parte, el grupo 1 englobó dos subgrupos (1A y 1B), siendo el subgrupo
1A donde aparecieron 14 de los 18 genes de HT-29 regulados por LPS. Más aún dicho
subgrupo comprendió otros dos nuevos subgrupos (1AA y 1AB), siendo el subgrupo
1AB en el que aparecieron 11 de los 18 genes regulados por LPS. En cambio, el
subgrupo 1B incluyó una amplia mayoría de genes asociados a la regulación del
mecanismo de adhesión celular, pero tan solo 2 de los genes de este subgrupo 1B
fueron de moléculas reguladas por LPS, aunque, en general, todos ellos fueron genes
prometastásicos experimentales.
Por otra parte, el Grupo 2 incluyó dos subgrupos (2A y 2B) donde se
localizaron 2 de los 18 genes dependientes de LPS y 7 genes específicos de tejido
epitelial (incluidas la Ezrina y la CK19), aunque hubo un predominio de genes
clasificados en otras categorías funcionales.
4. RESULTADOS
133
Figura 2729: Dendograma de conglomerados jerárquicos basados en distancias euclídeas al cuadrado (combinación de conglomerados de distancia re-escalados) de los 62 genes incluidos en las placas TLDA para el estudio cuantitativo de la expresión génica mediante RT-PCR, de muestras obtenidas de 41 lesiones primarias de CCR. Los genes prometastásicos se han clasificado por tres criterios: funcional, experimental/clínico y regulado por LPS en células HT-29.
4. RESULTADOS
134
Por último, el objetivo fue determinar la contribución de los genes del HT-29
dependientes de LPS a la clasificación de pacientes con CCR por su perfil de expresión
de genes prometastatásicos. Secundariamente, se pretendió identificar las subclases
funcionales de genes prometastásicos que presentaron los pacientes con y sin
expresión de los genes del HT-29 dependientes de LPS. Con este fin, se efectuó un
análisis de conglomerados jerárquico no supervisado, para segregar los pacientes con
CCR a partir de la agregación de genes por la similitud entre sus valores de ∆Ct por
gen y paciente, en relación al valor correspondiente del ∆Ct promedio. A este respecto,
la aplicación de distancias euclídeas entre la totalidad de genes estudiados (18
dependientes de LPS y 45 prometastásicos) dio como resultado la aparición de 4
grandes agregados o clústeres de genes (subgrupos A-D) que permitieron a su vez
distribuir los pacientes en función de su nivel de similitud transcripcional a lo largo
del panel completo de genes, con la aparición de 4 familias predominantes de
pacientes (subgrupos 1-4) cuyos perfiles transcripcionales se describen a
continuación.
Como se observa en la Figura 30, la naturaleza funcional de los genes
prometastásicos y el número de genes dependientes de LPS fue distinto en los cuatro
subgrupos predominantes de genes:
Subgrupo A: Incluyó 10 genes prometastásicos (TERT, PDIA2, NME1, LDHB,
FABP5, SHM1, HMGB1, CSK2, YWHAZ y CSE1L), muchos de ellos pertenecientes
principalmente a los subtipos funcionales metabólico y de proliferación, siendo
el 70 % experimentales. Este subgrupo se agregó con 3 genes dependientes de
LPS (PDIA2, LDHB e YWHAZ).
Subgrupo B: Incluyó 20 genes prometastásicos (RPL38, PGK1, G6PD, NDRG1,
PRDX4, DPY19L1, GAPDH, ENO1, PKM, MIF, SPP1, GSS, ETS2, SDC1, PVR, TALDO1,
ARHGDIA, TKT, CCT5, NET1) muchos de ellos pertenecientes principalmente a los
subtipos funcionales de estrés oxidativo y de proliferación, siendo el 70%
experimentales. Este subgrupo se agregó con 11 genes dependientes de LPS
(PGK1, G6PD, ENO1, PKM, MIF, GSS, TALDO1, ARHGDIA, TKT y CCT5).
Subgrupo C: Incluyó 14 genes prometastásicos (KIAA0753, DGCR8, ITPKC, DGKE,
TNF, PPP6R2, PPP3CC, MSN, EFEMP, USP11, LPAR1, MT1E, ALDH1A1, S100A13),
muchos de ellos pertenecientes principalmente al subtipo funcional de adhesión
4. RESULTADOS
135
celular, siendo el 92 % experimentales. Este subgrupo se agregó con 2 genes
dependientes de LPS (MSN y ALDH1A1).
Subgrupo D: Incluyó 18 genes prometastásicos (SERPINB1, EZR, FHL2, ANXA2,
0S100A10, ERBB2, SPINT2, ITGB4, LGALS3, S100P, FCGBP, KRT8, FXYD3, CLDN4,
CLDN3, KRT19, DMBT1, CFTR) muchos de ellos pertenecientes principalmente al
subtipo funcional epitelial, siendo el 33% experimentales. Este subgrupo se
agregó con 2 genes dependientes de LPS (SERPINB1 y EZR).
Así mismo, el heatmap también generó otros cuatro subgrupos predominantes
de pacientes con perfiles de expresión de genes prometastásicos y dependientes de
LPS completamente diferentes.
El subgrupo 1 integrado por 11 pacientes se ubicó en la parte izquierda del
heatmap y presentó una baja expresión de los subgrupos de genes
prometastásicos A-C, pero alta expresión de los genes del subgrupo D. Con
respecto a los genes dependientes de LPS, en general estos no presentaron
variaciones importantes de expresión, aunque algunos mostraron caídas de
expresión y otros presentaron aumentos en un 20-30% de pacientes,
principalmente los genes dependientes de LPS agregados a los subgrupos C y D
(MSN, ALDH1A1, EZR y SERPINB1).
El subgrupo 2, integrado por 10 pacientes se ubicó en el heatmap en otra rama
distinta del anterior y presentó una alta expresión de los subgrupos de genes
prometastásicos A, B y D, pero baja expresión de los genes del subgrupo C. Con
respecto a los genes dependientes de LPS, en general estos presentaron aumentos
de expresión, principalmente los agregados a los subgrupos A y B de genes
prometastásicos (PDIA2, LDHB, YWHAZ, PGK1, G6PD, ENO1, PKM, MIF, GSS,
TALDO1, ARHGDIA, TKT y CCT5).
El subgrupo 3, integrado por 12 pacientes se ubicó en el heatmap en la misma
rama que el subgrupo 2 y presentó una alta expresión de todos los subgrupos de
genes prometastásicos siendo muy llamativo el aumento de los genes del
subgrupo D. Con respecto a los genes dependientes de LPS, en general estos
presentaron aumentos de expresión, principalmente los asociados a los
subgrupos C y D (MSN, ALDH1A1, EZR y SERPINB1).
4. RESULTADOS
136
El subgrupo 4, integrado por 6 pacientes se ubicó en la parte derecha del heatmap
en rama independiente del subgrupo anterior y presentó una alta expresión de
los subgrupos de genes prometastásicos A, B y C, con una llamativa caída de
expresión de los genes del subgrupo D. Con respecto a los genes dependientes de
LPS, en general con una llamativa caída de expresión de los genes del subgrupo
D. Con respecto a los genes dependientes de LPS, en general estos presentaron
aumentos de expresión en la mayor parte de los pacientes para los genes
asociados a los subgrupos A, B y C, cayendo también la expresión de sus dos genes
asociados al subgrupo D.
4. RESULTADOS
137
Figura 30: Mapa de calor (HeatMap) para representar el nivel de expresión de los distintos genes analizados en función de las muestras obtenidas de los pacientes con CCR. De esta forma, genes y muestras de pacientes se agrupan mediante un análisis jerárquico no supervisado en conglomerados o clústeres según la similitud en su patrón de expresión génica. El color indica diferencia con la media de ΔCt (ΔCt=Ct gen-Ct endógeno): rojo indica aumento y verde indica disminución. Distancia de medida: distancia euclídea. Método de agrupación o clustering: ligamiento promedio. Tipo de mapa: global ΔCt. El punto cero en la escala de color, que representa la ausencia de cambios en la expresión génica, se asigna a la media de ΔCt para todos los genes analizados (color negro).
ALTA EXPRESIÓN
BAJA EXPRESIÓN
Subgrupos 1 2 3 4
A
B
C
D
4. RESULTADOS
138
4.3. MODELO DE RESPUESTA A LPS DE 6 LÍNEAS CELULARES DE CCR
HUMANO.
4.3.1. Expresión de TLR4
Los cultivos de seis líneas celulares de CCR (CaCo2, COLO-205, HCT-116, HT-
29, LoVo y SW480) se mantuvieron en estado subconfluyente en placas de 24 pocillos,
y se fijaron con PFA al 4%, para estudiar su expresión celular basal de TLR4 mediante
inmunofluorescencia y análisis de imagen. En la Figura 1 (A-F) se muestran las
imágenes de superposición de la fluorescencia verde para el marcaje de la molécula
TLR4 con la azul para el marcaje de la estructura nuclear. Como se observa en las
imágenes, la mayoría de las líneas celulares mostraron señal fluorescente verde, que
indica expresión positiva para TLR4. Solamente la línea celular HCT-116 fue negativa
para la expresión de TLR4, tal y como ocurrió en su control negativo (Fig. 31 C y D).
4. RESULTADOS
139
C A B C
D E F
Figura 31: Inmunofluorescencia para TLR4 en 6 líneas de CCR. Todas las líneas celulares excepto la HCT-116 (A, B, D, E y F) mostraron expresión positiva del receptor. La localización del receptor fue citoplasmática para las líneas COLO-205 (B), HT-29 (D) y SW408 (F); mientras que para CaCo-2 (A) y LoVo (5) fue en la membrana plasmática.
4. RESULTADOS
140
Los cultivos de las seis líneas celulares de CCR (CaCo2, COLO-205, HCT-116,
HT-29, LoVo y SW480), mantenidos en estado subconfluyente en placas de 24
pocillos, recibieron o no 1 µg/ml de LPS, y cada 30 min se fijaron con PFA al 4%, a lo
largo de los siguientes 60 min, para estudiar el efecto de LPS sobre la expresión celular
de TLR4 mediante inmunofluorescencia y análisis de imagen. Tras una hora de
tratamiento con LPS (Fig. 32 A-F) se produjo un claro aumento de expresión en la
superficie de las células HCT116 (Fig. 32C), que fue más leve en la línea SW480 (Fig.
32F). En el resto de líneas celulares, CaCo2, COLO-205, HT-29 y LoVo, no se constató
variación alguna de TLR4 (Fig. 32A, B, D y E), ni modificación alguna en su
localización.
4. RESULTADOS
141
Figura 32: Inmunofluorescencia para TLR4 en seis líneas de CCR tras la estimulación con LPS. Transcurrida 1 hora tras la estimulación con LPS se observa un aumento en la expresión superficie de TLR4 en las células HCT116 (C). Dicho aumento fue más ligero en la línea SW480 (F). En el resto de líneas celulares, CaCo2 (A), COLO-205 (B), HT-29 (D) y LoVo (E), no se produjo un aumento neto en la expresión de TLR4.
A B C
D E F
4. RESULTADOS
142
4.3.2. Translocación nuclear NFkB mediante inmunofluorescencia.
Otros cultivos de las mismas seis líneas celulares de CCR se mantuvieron hasta
un estado subconfluyente en placas de 24 pocillos y recibieron o no 1 µg/ml de LPS.
Cada 5 min se estudió la translocación nuclear de p65, mediante inmunofluorescencia
y análisis cuantitativo de imagen. Tras la captura de imágenes (dos imágenes de
campos aleatorios en dos experimentos independientes), se halló la intensidad
nuclear de la inmunofluorescencia para p65 y la fluorescencia total, delimitando la
región mediante la tinción nuclear Hoescht. Se normalizaron las medidas para cada
imagen y se calculó el ratio fluorescencia nuclear/total, como medida de la cantidad
de p65 en el núcleo. El incremento de dicho ratio tras el tratamiento con LPS se
interpretó como translocación nuclear del factor de transcripción.
Como se observa en la Figura 33, A y C, el aumento en el ratio fluorescencia
nuclear/total fue significativo a los 5 y 10 minutos para las líneas celulares CaCo-2 y
HCT-116; a los 55 minutos para CaCo-2 y a los 40 minutos para HCT-116. Sin embargo,
en las líneas celulares HT-29 (Fig. 33D) y COLO-205 (Fig. 33C) no se produjo un
aumento significativo del ratio fluorescencia nuclear/total, y en las líneas LoVo (Fig.
33E) y SW480 (Fig.33F) el ratio apenas varió a lo largo del tratamiento. Por otro lado,
a partir de los 5 minutos tras la exposición a LPS, se produjo un aumento en el número
de células CaCo-2, COLO-205, HCT-116 y HT-29 con marca fluorescente de p65
nuclear, indicativo de translocación nuclear (Fig.33A-D). Este aumento se hizo más
evidente a los 10 minutos en dichas células para volver a caer de nuevo a los 15
minutos de tratamiento. Esta cuantificación de la intensidad de expresión
citoplasmática y nuclear a lo largo de la primera hora evidenció el carácter oscilante
en la translocación nuclear de p65, con períodos alternativos de aumento y
disminución, que tuvieron una duración variable para cada línea celular.
4. RESULTADOS
143
A
B
4. RESULTADOS
144
C
D
4. RESULTADOS
145
Figura 33 (A-F): Inmunofluorescencia para cuantificar la translocación nuclear de NFκB tras el tratamiento con LPS en seis líneas celulares de CCR : CaCo-2 (A), COLO-205 (B), HCT116 (C), HT-29 (D), LoVo (E) y SW480 (F).
E
F
4. RESULTADOS
146
4.3.3. Enriquecimiento en marcadores exosomales de las vesículas
extracelulares asiladas por ultracentrifugación
Tras estas evidencias de respuesta celular al LPS con cambios de expresión de
TLR4 y translocación nuclear de NFkB, a continuación se recogió el secretoma de las
seis líneas celulares de CCR tras su exposición a LPS, y se aisló por ultracentrifugación
la fracción secretada de vesículas extracelulares, siguiendo un método descrito
previamente (Piersma, et al., 2010). Para evidenciar el enriquecimiento en exosomas,
se realizó un western blot para dos marcadores típicos exosomales (PDCD6IP o Alix y
TSG101) (Kourembanas, 2015), tal y como se muestra en la Figura . Así mismo, se
compararon las fracciones de vesículas extracelulares (EVs) y del secretoma soluble
(SS), considerado este último como todas aquellas proteínas no secretadas a través
de vesículas, obtenidas del remanente del proceso de ultracentrifugación utilizado
para aislar las vesículas del resto del secretoma.
Las líneas celulares CaCo-2, COLO-205, HCT-116, HT-29 y LoVo (Fig. 34A-E)
mostraron una expresión positiva para ambos marcadores en la fracción EVs, que fue
más tenue y casi indetectable para Alix en la línea SW480 (Fig. 34F). Así mismo, hubo
cierto grado de positividad para TSG101 en la fracción soluble.
Figura 34: Western blot en seis líneas celulares de CCR para PDCD6IP y TSG101, marcadores exosomales típicos. SS: secretoma soluble; EVs: vesículas extracelulares.
A B C
DD
E F
4. RESULTADOS
147
Tras la identificación de todas las proteínas contenidas en la fracción de
vesículas extracelulares y secretoma soluble por espectrometría de masas (GeLC-
MS/MS), también se estudiaron por el método de Spectral counting (contaje de
espectros) otros marcadores exosomales (CD63, CD81 y CD9) además de Alix y
TSG101 (Figura 35). Este método consiste en la cuantificación del número de veces
que aparece el espectro de una proteína en concreto, normalizando por el total de
proteínas identificadas y el total de muestras entre las que se quiere realizar el
análisis. Como se puede observar en la figura 39, todas las líneas celulares mostraron
diferencias estadísticamente significativas en la concentración de Alix, TSG101 y CD9
entre las fracciones de proteínas solubles y exosomales. En cambio, para los
marcadores CD63 mostraron diferencias significativas todas las líneas excepto
SW480; y para CD81 mostraron diferencias significativas las líneas celulares CaCo2,
COLO-205, HCT116 y LoVo. El análisis de conglomerados jerárquicos mostró claras
diferencias entre las proteínas exosomales y aquellas solubles y similitudes entre las
muestras de cada una de las líneas celulares (Anexo I).
4. RESULTADOS
148
CaCo-2
PDCD6I
P
TSG10
1
Cd63
Cd81
Cd9
0
100
200
300
400*
*
* * *
No
rm.
sp
ectr
al co
un
ts
COLO-205
PDCD6I
P
TSG10
1
Cd63
Cd81
Cd9
0
200
400
600
*
** *
*
No
rm.
sp
ectr
al co
un
ts
HTC116
PDCD6I
P
TSG10
1
Cd63
Cd81
Cd9
0
50
100
150
200
250*
**
* *
No
rm.
sp
ectr
al co
un
ts
A
B
C
4. RESULTADOS
149
HT-29
PDCD6I
P
TSG10
1
Cd63
Cd81
Cd9
0
50
100
150 *
* **
No
rm.
sp
ectr
al co
un
ts
LoVo
PDCD6I
P
TSG10
1
Cd63
Cd81
Cd9
0
50
100
150
200
*
*
* *
*
No
rm.
sp
ectr
al co
un
ts
SW480
PDCD6I
P
TSG10
1
Cd63
Cd81
Cd9
0
50
100
150
**
*
No
rm.
sp
ectr
al co
un
ts
Figura 35 (A-F): Marcadores exosomales medidos por spectral counting en las fracciones SS y EVs del secretoma para 6 líneas celulares de CCR: CaCo-2 (A), COLO-205 (B), HCT116 (C), HT-29 (D), LoVo (E) y SW480 (F).
D
E
F
4. RESULTADOS
150
4.3.4. Identificación de proteínas LPS-dependientes en 6 líneas celulares
Una vez identificadas todas las proteínas existentes en las dos fracciones
secretadas (SS y EVs) por las 6 líneas de CCR, se procedió al análisis estadístico
mediante el test betabinomial (Pham TV, 2010), considerándose como proteínas
dependientes de LPS aquellas cuya concentración varió al menos 1,5 veces (p<0,05)
con respecto a su concentración en la misma línea celular que no recibió LPS. Además,
dichas proteínas dependientes de LPS se clasificaron en cuatro categorías: aquellas
que se detectaron únicamente en las muestras que recibieron LPS (Subgrupo de
nueva expresión); aquellas que se detectaron únicamente en las muestras control
(Subgrupo de pérdida de expresión); aquellas cuya concentración aumentó en las
muestras que recibieron LPS (Subgrupo de aumento de expresión); y aquellas cuya
concentración disminuyó en las muestras que recibieron LPS (Subgrupo de
disminución de expresión).
En la Tabla 13 se recoge el número total de proteínas dependientes de LPS por
categorías y líneas de CCR. Como se puede apreciar las proteínas dependientes de LPS
fueron mayoritariamente de tipo exosomal en todas las líneas de CCR estudiadas, ya
que las proteínas solubles dependientes de LPS representaron menos de la mitad en
la mayoría de las líneas. Este hecho fue especialmente notorio en las líneas HCT116
y SW480 donde apenas hubo proteínas solubles de respuesta a LPS y la mayoría de
los cambios en respuesta a LPS se produjeron en las proteínas exosomales. Así mismo,
el LPS inhibió la mayoría de las proteínas solubles de las líneas LoVo y SW480. En
cambio, el LPS aumentó el número de proteínas solubles en las líneas CaCo2, Colo205
y HT-29. Con respecto a los cambios inducidos por LPS en proteínas exosomales, éstas
aumentaron llamativamente en la línea HCT116 y algo en la CaCo2 y LoVo, mientras
que disminuyeron o desaparecieron en el resto de las líneas, especialmente en
Colo205, HT-29 y SW480.
4. RESULTADOS
151
Tabla 13: Distribución de proteínas solubles y exosomales de acuerdo con su modalidad de cambio de concentración en el secretoma de las seis líneas celulares humanas de CCR tras el tratamiento con LPS. Subgrupo de nueva expresión (detectadas únicamente en las muestras que recibieron LPS); Subgrupo de pérdida de expresión (detectadas únicamente en las muestras control); Subgrupo de aumento de expresión (su concentración aumentó en las muestras que recibieron LPS); y Subgrupo de disminución de expresión (su concentración disminuyó en las muestras que recibieron LPS).
Así mismo, para estudiar las implicaciones funcionales procarcinogénicas y
prometastásicas de las proteínas solubles y exosomales dependientes de LPS en CCR,
a continuación, las proteínas identificadas en este estudio se clasificaron por su
relación o no con la progresión y metástasis del CCR en estudios clínicos y
experimentales anteriores. De este modo, las proteínas se distribuyeron en cuatro
categorías: 1) Proteínas asociadas a metástasis hepática del CCR; 2) Proteínas
asociadas a la carcinogénesis y progresión del CCR; 3) Proteínas asociadas a la
carcinogénesis y progresión de otros tumores malignos; y 4) Proteínas no asociadas
con cáncer.
En las Figura y 37 y se representan los porcentajes de las proteínas solubles y
exosomales en las cuatro categorías. Como se puede observar, la mayoría de las
proteínas dependientes de LPS identificadas en el presente estudio, y especialmente
de las proteínas exosomales (que además son las predominantes), estuvieron
relacionadas con el cáncer, sea o no CCR. A este respecto, casi el 50% de las proteínas
solubles nuevas o aumentadas, y solo el 6% y 36% de la que desaparecieron o
disminuyeron por LPS, estuvieron relacionadas por trabajos anteriores con CCR,
tanto con los mecanismos de carcinogénesis y progresión como de metástasis. Más
aún, en torno al 10% de las proteínas exosomales dependientes de LPS estuvieron
CaCo2 Colo205 HCT116 Ht29 LoVo SW480
Se
cre
tom
a
solu
ble
Nuevas 8 0 0 5 2 0
Aumentadas 19 10 2 8 5 4
Perdidas 0 1 2 0 6 6
Disminuidas 0 4 2 2 19 7
Ve
sícu
las
ex
tra
celu
lare
s Nuevas 25 10 58 10 16 19
Aumentadas 11 13 51 9 14 16
Perdidas 18 21 5 22 9 35
Disminuidas 4 13 7 27 16 13
4. RESULTADOS
152
asociadas a metástasis hepática del CCR y entre el 45 y 50% a la carcinogénesis y
progresión del CCR.
Figura 36: Porcentaje de proteínas del secretoma soluble en cada una de las categorías efectuadas según su relación con el CCR y su metástasis hepática de cada uno de los grupos resultantes tras el tratamiento con LPS.
4. RESULTADOS
153
Figura 37: Porcentaje de proteínas del secretoma soluble en cada una de las categorías efectuadas según su relación con el CCR y su metástasis hepática de cada uno de los grupos resultantes tras el tratamiento con LPS.
En los Anexos V al XI se listan las proteínas solubles y exosomales, en función
de su modalidad de cambio de concentración en el secretoma de las seis líneas
celulares humanas de CCR tras el tratamiento con LPS.
DISCUSIÓN
5. DISCUSIÓN
157
5. DISCUSIÓN
La respuesta inflamatoria contribuye al desarrollo del cáncer al facilitar
mecanismos clave desde la carcinogénesis hasta la metástasis (Coussens & Werb,
2002). En estos últimos años se han identificado numerosas proteínas y genes del
proceso inflamatorio que están asociados a la fisiopatología y al microambiente
tumoral del paciente con cáncer (Mlecnik, et al., 2016). Al mismo tiempo, numerosos
microorganismos patógenos tienen efectos promotores de la carcinogénesis y la
metástasis (Stoicov, et al., 2004; Dalgleishl & O'Byrne, 2006). Más en concreto, se ha
observado que numerosas endotoxinas bacterianas —incluido el lipopolisacárido
(LPS) de microrganismos Gram negativos como E. Coli— pueden alterar proliferación
de colonocitos, dañar su ADN y activar acciones proinflamatorias que a su vez
estimulan el crecimiento tumoral (Wu, et al., 2003, Arthur, et al., 2012; Cuevas-Ramos,
et al., 2010; Wu, et al., 2009, Jobin, 2012; Grivennikov, et al., 2012).
Fue precisamente este campo del conocimiento sobre la regulación del cáncer
por factores microbianos en el que se planteó el presente proyecto con dos objetivos:
1) estudiar la respuesta funcional de células en cultivo del CCR humano a las
endotoxinas, a través de la identificación de moléculas dependientes de LPS en su
secretoma, mediante métodos de proteómica; y 2) determinar la expresión génica de
las moléculas del CCR dependientes de LPS en biopsias de pacientes con CCR
avanzado, y analizar su posible asociación transcripcional a genes prometastásicos ya
conocidos por su expresión en este mismo tipo de cáncer.
Los resultados obtenidos demostraron que la acción del LPS sobre la línea HT-
29 de CCR humano indujo una respuesta transcripcional y secretora de citocinas que
imitó a la de los monocitos activados por LPS, tal como muestran los aumentos en
GROalfa/CXCL1, IL-18, M-CSF, MIF y SCF, todos factores solubles típicos del monocito
activado. Al profundizar en el estudio del sobrenadante de las células HT-29 se pudo
identificar, mediante 2D-PAGE y espectrometría de masas, una familia de 16
moléculas solubles en el secretoma que fue específica de la respuesta de dichas células
al LPS, siendo dos de ellas de nueva aparición y catorce con aumento significativo en
su concentración. Más aún, diez de estas moléculas (ARHGDIA, CCT5, EZR, GAPDH,
5. DISCUSIÓN
158
GSS, MSN, PDIA2, PGK1, PKM, YWHAZ) presentaron aumentos significativos de su
nivel de expresión génica en las biopsias obtenidas de lesiones de CRC, comparado
con las obtenidas de mucosa normal, de más del 75% de una cohorte de 32 pacientes
con CCR, verificando de esta forma su asociación a la carcinogénesis del CCR.
Así mismo, al cuantificar mediante RT-PCR, la expresión génica de las
moléculas del secretoma de HT-29 dependientes de LPS, junto con la de otros 44
genes, identificados en trabajos anteriores por sus implicaciones prometastásicas, en
41 biopsias de lesiones primarias de pacientes con CCR, y tras analizar los resultados
mediante conglomerados jerárquicos, se demostró que la mayoría de las moléculas
dependientes de LPS se asociaron transcripcionalmente a genes prometastásicos muy
concretos. Este hecho se verificó en un segundo análisis jerárquico de conglomerados
no supervisado para clasificar los pacientes con CCR en función del patrón de
agregación de los genes prometastásicos y de moléculas dependientes de LPS por su
nivel de similitud transcripcional estimada en distancias euclídeas. En este caso, de
nuevo se detectó un subgrupo específico de pacientes en el que una mayoría de los
genes de moléculas del secretoma de HT-29 dependientes de LPS se asociaron con los
genes prometastásicos vincualdos al estrés oxidativo y la proliferación celular. En su
conjunto, genes prometastásicos y dependientes de LPS se asociaron por su patrón
transcripcional de una forma heterogénea entre los pacientes con CCR, pudiendo
detectarse un subgrupo específico de pacientes cuya expresión de genes
prometastásicos y dependientes de LPS fue a la vez elevada.
Por último, el estudio del secretoma de HT-29 junto con el de otras cinco líneas
celulares adicionales de CCR humano, mediante cromatografía líquida y
espectrometría de masas, demostró que con independencia de los niveles de
expresión de TLR4 y de translocación nuclear de la proteína p65 en respuesta a LPS,
las proteínas dependientes de LPS fueron mayoritariamente de tipo exosomal, siendo
las solubles minoritarias y muchas de ellas inhibidas en algunas de las líneas tras su
exposición a LPS. Así mismo, la mayoría de las proteínas dependientes de LPS, y en
especial las exosomales, estuvieron relacionadas con el cáncer por trabajos
anteriores. Concretamente, en torno al 10% de las proteínas exosomales
dependientes de LPS estuvieron asociadas al proceso de metástasis hepática del CCR
y alrededor del 50% a la carcinogénesis y progresión del mismo tumor.
5. DISCUSIÓN
159
Por tanto, en su conjunto, los resultados obtenidos verificaron la hipótesis
inicial planteada en este proyecto, permitiendo afirmar que la respuesta del cáncer de
colon a endotoxinas de LPS conlleva una secreción de proteínas solubles y
especialmente de proteínas exosomales, cuya expresión de sus genes se asoció a la de
otros genes conocidos por sus implicaciones prometastásicas, a través de estudios
clínicos y experimentales anteriores.
De esta forma, el presente estudio aporta un nuevo concepto al conocimiento
sobre los efectos carcinogénicos de los factores microbianos proinflamatorios en el
CCR, demostrando por vez primera que, en las lesiones primarias de pacientes con
CCR, los genes prometastásicos del CCR se interrelacionan transcripcionalmente con
la expresión de genes que representan las moléculas del secretoma del CCR activado
por LPS.
Esta nueva evidencia podría tener implicaciones en la activación
prometastásica de lesiones establecidas, pero asintomáticas de CCR y, por tanto,
conocer el estado de la flora microbiana del paciente, y en particular los niveles de
expresión de los receptores de LPS y de sus moléculas subrogadas, en la mucosa y la
sangre de estos pacientes podría contribuir a la evaluación del riesgo prometastásico
del paciente con CCR. Sin embargo, futuros estudios deberán determinar en series
más grandes de pacientes el significado fisiopatológico de la expresión concomitante
de genes prometastásicos y dependientes de LPS en pacientes con CCR y qué
correlaciones clínicas existen.
Aunque no están claras las implicaciones funcionales que pudieran tener las
asociaciones transcripcionales entre genes prometastásicos y dependientes de LPS,
ya existen trabajos que describen la importancia de los genes dependientes de LPS,
tales como EZR y MSN, en la progresión de varios tumores epiteliales (Leiphrakpam,
et al., 2014). Otros autores también han descrito el papel de otros genes dependientes
de LPS, tales TKT, MIF o YWHAZ, como biomarcadores del CCR (Diehl, et al., 2007).
Sin embargo, queda por esclarecer si es la expresión de genes dependientes de LPS lo
que conlleva la expresión de genes prometastásicos en el CCR, o si es la expresión de
genes prometastásicos en el CCR lo que regula la respuesta al LPS con expresión de
genes dependientes de LPS y secreción de moléculas solubles y exosomales que
puedan colaborar en el proceso metastásico.
5. DISCUSIÓN
160
A favor de la expresión de genes dependientes de LPS como inductores de la
expresión de genes prometastásicos en el CCR está el hecho de que la microbiota
intestinal y sus múltiples moléculas extracelulares están en continuo contacto con la
mucosa colónica normal y tumoral, sugiriendo que la expresión de genes
prometastásicos es consecuencia de la expresión previa de genes dependientes de
LPS. Un ejemplo de este posible mecanismo es la expresión de aquellas moléculas
dependientes de LPS ya relacionadas con la carcinogénesis e incluso la metástasis del
CCR como por ejemplo el TNFα (Bhat, et al., 2016). Además, la acción del LPS también
podría producirse sobre células metastásicas ya implantadas en el tejido hepático ya
que el LPS y otros muchos factores microbianos llegan continuamente al hígado por
la vía de la circulación portal (Hsu, et al., 2011). Esta posible acción directa del LPS
sobre células metastásicas del CCR en el hígado está respaldada por la existencia de
numerosos genes dependientes de LPS, cuya expresión también está aumentada en
dichas lesiones secundarias (Liu, et al., 2016). Más aún, resultados previos de nuestro
grupo también han verificado que el pretratamiento con LPS de células del CCR
metastásico murino 51B incrementa su implantación metastásica en el hígado,
apoyando el mecanismo prometastásico directo del LPS sobre el CCR (Solaun, et al.,
2002).
Por otro lado, a favor de la acción de genes prometastásicos del CCR como
agentes reguladores de la respuesta celular a LPS, y secundariamente de la expresión
de genes dependientes de LPS, está el hecho de que genes prometastásicos y
dependientes de LPS se asociaron por su patrón transcripcional de una forma
heterogénea entre los pacientes con CCR, habiéndose detectado en este estudio un
subgrupo específico de pacientes cuya expresión de genes prometastásicos y
dependientes de LPS fue a la vez elevada y otros en los que los aumentos en la
expresión de genes prometastásicos no conllevaron aumentos similares en la
expresión de genes dependientes de LPS. Más aún es posible que algunos genes
prometastásicos en realidad lo sean a través de la actuación funcional de genes
dependientes de LPS, a los que inducen.
Fue precisamente este el motivo por el que el presente proyecto incluyó como
último objetivo la identificación por espectrometría de masas de todas las proteínas
contenidas en la fracción del secretoma soluble y de vesículas extracelulares de 6
5. DISCUSIÓN
161
líneas humanas de CCR activadas por LPS, y su clasificación en función de evidencias
en estudios clínicos y experimentales anteriores sobre su relación o no con la
progresión y metástasis del CCR.
Un hecho concordante entre las seis líneas celulares de CCR utilizadas fue el
que una mayoría de las proteinas aparecidas o aumentadas por efecto del LPS, fueran
ya conocidas por su relación con mecanismos de carcinogénesis y metástasis del CCR.
Sin embargo, muy pocas variaron de la misma forma en las seis líneas de CCR lo que
evidencia las distintas formas de respuesta a LPS entre las células de un mismo tipo
de tumor. Este hecho podría deberse en parte a los distintos niveles de expresión de
TLR4 y de translocación nuclear de NFkB constatados antes y después del tratamiento
aplicado de LPS. Entre las proteínas solubles de nueva aparición en respuesta a LPS y
con implicaciones en la carcinogénesis y metástasis del CCR se detectaron las
siguientes:
- NOTCH3 (Neurogenic locus notch homolog protein 3), cuya implicación en la
invasión y metástasis de tumores del sistema digestivo tales como
adecarcinoma pancreático o el hepatocarcinoma ha sido demostrada (Serafin,
et al., 2011; Zhou, et al., 2016).
- LCN2 (Lipocalin-2), una proteína habitual de las secreciones glandulares que
interviene en la regulación de procesos celulares tales como la muerte y
supervivencia celular, la migración, invasión y diferenciación celular, la
inflamación y la regeneración de tejidos (Chakraborty, et al., 2012). En
estudios previos sobre células tumorales se ha evidenciado la contribución de
la lipocalina a la inhibición de la apoptosis (cáncer de tiroides), a la invasión y
angiogénesis (cáncer de páncreas), y al aumento de la proliferación tumoral y
metástasis (cáncer de mama y colon). Por tanto, no es de extrañar su existencia
en el sobrenadante de alguna de las líneas de CCR. En concreto, el presente
estudio constató la aparición de lipocalina como proteína soluble en el
secretoma de células CaCo2, pero también su desaparición como proteína
exosomal en el secretoma de las células LoVo. Por último, los factores que
regulan la secreción de lipocalina son numerosos y van desde citocinas pro-
inflamatorias a vitaminas como el ácido retinoico, pero se desconocía su
regulación por LPS.
5. DISCUSIÓN
162
- DBN1 (Drebrin), proteína citoplasmática de unión a actina que regula la
organización del citoesqueleto de actina y contribuye al desarrollo de
proteínas en el cerebro. Se sobreexpresa en la variante metastásica de las
células HCT-116, así como en biopsias de ganglios linfáticos y metástasis
hepáticas de pacientes con CCR (Lin, et al., 2014 ). El presente estudio constató
la aparición de drebrina como proteína soluble en el secretoma de células HT-
29.
- LGALS8: (Galectin-8) (Chen, et al., 2014), proteína secretada que actúa como
un modulador fisiológico de la adhesión celular, al formar complejos con
integrinas que activan cascadas de señalización mediada por integrina. Así
mismo, cuando está presente en exceso como un ligando soluble, la galectina-
8 (al igual que la fibronectina) forma complejos con integrinas que inhiben la
adhesión celular lo que en conjunto contribuye a regular funciones celulares
en una amplia variedad de condiciones fisiológicas y patológicas. Su nivel de
expresión se han correlacionado positivamente con tumores como el cáncer
de próstata. El presente estudio constató la aparición de galectina-8 como
proteína soluble en el secretoma de células CaCo-2.
- CXCL1/GROα: (Growth-regulated alpha protein) (Lee, et al., 2015), quimiocina
secretada por células tumorales con propiedades mitogénicas y
prometastásicas. CXCL1 se expresa también en macrófagos, neutrófilos y
células epiteliales, y tiene una actividad quimioatrayente de neutrófilos, y
participa en los procesos de angiogénesis, inflamación, y cicatrización. El
presente estudio constató la aparición de CXCL1 como proteína soluble en el
secretoma de células HT-29.
- CCL20: (C-C motif chemokine 20) (Fujiie, et al., 2001) quimiocinas expresada
en numerosos tejidos que está implicada en la formación y función del tejido
linfoide asociado a mucosa. En concordancia con los resultados obtenidos, su
expresión puede ser inducida por LPS y al igual que CXCL1, CCL20 apareció
como proteína soluble en el secretoma de células HT-29 sugiriendo su función
proinflamatoria.
Entre las proteínas solubles que incrementaron en respuesta a LPS y con
implicaciones en la carcinogénesis y metástasis del CCR se detectaron las siguientes:
5. DISCUSIÓN
163
- HMGB1 (High mobility group protein B1) (Li, et al., 2015), también conocida
como anfoterina, es una proteína intracelular que puede trasladarse al núcleo
para interactuar con nucleosomas, factores de transcripción e histonas,
contribuyendo a organizar el ADN, a remodelar la cromatina y a regular la
transcripción de muchos genes. Su hiperacetilación en los residuos de lisina
hace que pase al citosol y los macrófagos y monocitos activados la secretan
como un mediador de la inflamación. Entre sus receptores se incluyen RAGE y
TLR4, con el que interactúa a través de complejos con LPS para activar la vía
NF-kB, que a su vez aumenta la producción de citocinas inflamatorias y la
liberación de ROS tras la activación de NADPH oxidasa. El presente estudio
constató la aparición de anfoterina como proteína soluble únicamente en el
secretoma de células HT-29, evidenciando su actuación pro-inflamatoria.
Por otro lado, aunque algunas de las proteínas modificadas tras el tratamiento
con LPS fueron solubles, la mayoría fueron exosomales, ya que muchas de las solubles
desaparecieron o se inhibieron en respuesta al LPS. En estos últimos años se ha
comenzado a conocer el papel de las moléculas exosomales en la comunicación
intercelular de numerosos procesos fisiológicos y patológicos, incluida la
carcinogénesis y especialmente la metástasis (Syn, et al., 2016). Entre las proteínas
exosomales de nueva aparición en respuesta a LPS y con implicaciones en la
carcinogénesis y metástasis del CCR se detectaron las siguientes:
- NUMB, (Protein numb homolog) (Pastò, et al., 2014), proteína que actúa como
inhibidor de la señalización Notch durante la diferenciación celular,
manteniendo el potencial de auto-renovación en células madre y progenitoras.
También actúa como supresor de oncogenes, inhibiendo la proliferación de
células tumorales mediante la supresión de la señalización Notch. De hecho, se
observa un aumento de señalización Notch en tumores en los que se ha
perdido la actividad Numb (cáncer de mama, carcinoma de pulmón de células
no pequeñas, carcinoma de glándulas salivales y leucemia mielógena crónica).
De esta forma, el antagonismo biológico entre señalización Notch y Numb, que
controla el equilibrio proliferación/diferenciación, desempeña un papel en la
carcinogénesis, y su activación podría contribuir a la supresión tumoral. En el
presente estudio, Numb se detectó como proteína exosomal en el
5. DISCUSIÓN
164
sobrenadante de las células CaCo y COLO-205 lo que evidencia un posible
papel supresor tumoral de LPS en dicha líneas de CCR a través de la producción
de Numb.
- HRAS, (GTPase Hras) (Fornaro, et al., 2013), proteína tipo pro-oncogen, que
está implicada en la regulación de la división celular en respuesta a la
estimulación del factor de crecimiento. Actúa como GTPasa que se une a GTP
para escindir su fosfato terminal convirtiéndolo en GDP, lo que le implica en
muchas vías de transducción de señales como un interruptor molecular. Sus
mutaciones conllevan la transformación tumoral (p.e., cáncer de vejiga) ya que
la proteína HRAS mutada se activa permanentemente dentro de la célula,
estimulando la proliferación celular en ausencia de señales externas, lo que
conduce a la formación de tumores. En el presente estudio, HRAS se detectó
como proteína exosomal en el sobrenadante de las células HCT-116 lo que de
nuevo evidencia un posible efecto del LPS sobre la regulación de la
proliferación en esta línea de CCR.
- PSMD10, (26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 10), también
llamado “Gankyrin” es un complejo de proteinasa multicatalítico que forma
parte del sistema de ubiquitina-proteasoma para contribuir a la regulación del
ciclo celular a través de interacciones con CDK4 dependiente de ciclina y con
la ligasa MDM2, un regulador de la degradación del factor supresión tumoral
p53. Está mutada en algunos tipos de cáncer (CCR, carcinoma de esófago,
páncreas y hepatocelular), actuando como oncoproteína con efecto anti-
apoptótico y su expresión aumenta en los CCR metastásicos donde se sugiere
que actúa a través de IL-8 (Bai, et al., 2014). Aunque su sobreexpresión en
células LoVo incrementa su potencial tumorigénico experimental (Tang, et al.,
2010), en el presente estudio no se observaron cambios significativos de su
expresión tras el tratamiento con LPS de dicha línea de CCR. En cambio, si se
detectó la aparición de Gankyrin como proteína exosomal en HCT-116, lo que
sugiere un posible efecto prometastásico del LPS en dicha línea de CCR.
- RAB27B, (Ras-related protein Rab-27B), proteína enzimática tipo GTPasa,
implicada en el transporte de proteínas y la transducción de señales que
contribuye a la regulación de la secreción celular y cuya mutación la convierte
en oncogén implicado en la progresión del cáncer y su crecimiento invasivo del
5. DISCUSIÓN
165
cáncer de mama (Zhang, et al., 2012), el hepatocarcinoma (Dong, et al., 2012)
y el CCR (Bao, et al., 2014). Su papel como regulador de la exocitosis vesicular
le implica en el control funcional del microambiente tumoral. De hecho,
muchos cánceres promueven su desarrollo al suministrar numerosos factores
por exocitosis al microambiente tumoral (Palmer, et al., 2002), siendo muy
importantes los mecanismos moleculares intracelulares para la secreción
regulados por Rabs secretoras, como la Rab27B (Hendrix, et al., 2010). En el
presente estudio, se detectó Rab27B como proteína exosomal en el
sobrenadante de las células LoVo lo que de apoya de nuevo el posible efecto
tumorigénico del LPS en el CCR y concuerda con evidencias previas sobre la
mayor expresión de Rab27b en CRC y su correlación con parámetros de mal
pronóstico clínico como el nivel sérico de CEA, la aparición de metástasis en
ganglios linfáticos y a distancia (Bao, et al., 2014).
- ASAH1, (Acid ceramidase 1), es un enzima que cataliza la síntesis y
degradación de la ceramida en esfingosina y ácido graso, contribuyendo a la
regulación de la respuesta inmune innata inducida por factores como el LPS a
través de su acción vía TLR4 (Sakata, et al., 2007; Andreyev, et al., 2010).
ASAH1 también actúa como enzima extracelular tras su secreción por células
endoteliales, macrófago y fibroblastos (Romiti, et al., 2000 ). En el presente
estudio, se detectó ASAH1 como proteína exosomal en el sobrenadante de las
células SW480 lo que evidencia el posible efecto del LPS como regulador, a
través de ceramidas, de las acciones del CCR sobre la respuesta pro-
inflamatoria de las células inmunes innatas en el microambiente tumoral.
- CASP3, proteína que interactúa con caspasa-8 y caspasa-9 para desencadenar
la apoptosis celular. Recientemente, se ha descrito que la caspasa-3 está
activada en los exosomas derivados de células de estroma de la médula ósea
(Vardaki, et al., 2016). En el presente estudio, se detectó CASP3 como proteína
exosomal en el sobrenadante de las células SW480 lo que evidencia el posible
efecto del LPS como regulador de la apoptosis en el microambiente tumoral.
- GDF15, (Growth/differentiation factor 15) (Xue, et al., 2010), proteína que
pertenece a la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta y que
tiene un papel en la regulación de las vías inflamatorias y apoptóticas en
tejidos alterados, al inhibir la producción de citocinas proinflamatorias. Su
5. DISCUSIÓN
166
expresión está inducida por varias vías supresoras de tumores (p53, GSK-3β y
EGR-1) y por compuestos que ayudan a prevenir experimentalmente el
desarrollo del cáncer. Sin embargo, su aumento sérico indica mal pronóstico
en pacientes con algunos cánceres (Windrichova, et al., 2016; Ishige, et al.,
2016), sugierendo que, al igual que otros miembros de la familia TGF-β, puede
tener funciones diferentes en etapas precoces y tardías de la carcinogénesis.
En el presente estudio, se detectó GDF15 como proteína exosomal en el
sobrenadante de las células SW480 lo que evidencia el posible efecto del LPS
como activador del potencial estromagénico en el microambiente tumoral.
Entre las proteínas exosomales que incrementaron en respuesta a LPS y con
implicaciones en la carcinogénesis y metástasis del CCR se detectaron las siguientes:
CUL1 (Cullin-1) (Wang, et al., 2015), REG4 (Regenerating islet-derived protein 4)
(Oue, et al., 2007), S100A6 (Protein S100-A6) (Komatsu, et al., 2002), HMGA1 (High
mobility group protein HMG-I/HMG-Y) (Takahashi, et al., 2013), KRAS (GTPase Kras)
(Passiglia, et al., 2016), ABI1 (Protein phosphatase 2C 56) (Steinestel, et al., 2014),
PRDX4 (Peroxiredoxin-4) (Li, et al., 2004), RAC1 (Ras-related C3 botulinum toxin
substrate 1) (Nie, et al., 2015), GSTP1 (Glutathione S-transferase P) (Tan, et al., 2011),
LGALS1 (Galectin-1) (Wu, et al., 2015), CD151 (CD151 antigen) (Chien, et al., 2008),
HLA-A (HLA class I histocompatibility antigen, A-2 alpha chain) (Menon et al., 2004),
CLIC4 (Chloride intracellular channel protein 4) (Deng, et al., 2014) CAT (Catalase)
(Nishikawa, et al., 2004).
De entre estas, son de destacar por sus propiedades funcionales las proteínas
KRAS (Demory Beckler, et al., 2013; Demory Beckler, et al., 2013) y S100A6. Ambas
ya han sido descritas en estudios previos en heces y tejido tumoral, así como en líneas
celulares de CCR. En el caso de S100A6, incluso se ha propuesto una correlación con
la incidencia de metástasis (Komatsu, et al., 2002). Al igual que HMGB1, S100A6
también es ligando de RAGE, un receptor proinflamatorio implicado en la progresión
del CCR. En trabajos previos del grupo en el que se ha desarrollado el presente
proyecto se ha demostrado que S100A6 es un gen específico de metástasis hepática,
cuya expresión aumenta en células HT-29 expuestas a factores solubles de
hepatocitos humanos previamente activados por factores solubles del propio HT-29,
5. DISCUSIÓN
167
evidenciando que S100A6 es una molécula específica del transcriptoma de la
metástasis hepática del CCR, dependiente de factores del microambiente hepático y
cuya expresión según los resultados del presentes estudio también está regulada por
LPS (Vidal-Vanaclocha, 2011).
La revisión efectuada sobre la naturaleza funcional de las proteínas solubles y
exosomales identificadas en el secretoma de las seis líneas de CCR tratadas con LPS
evidencia el predominio de moléculas con implicaciones funcionales en la regulación
del microambiente tumoral, existiendo una cierta redundancia en aquellas con efectos
proinflamatorios e inmunorreguladores directos (CXCL1, CCL20, HMGB1, S100A6) e
indirectos (ASAH1, LGAL8, GDF15). Así mismo, también son de destacar aquellas
moléculas que modulan la proliferación (HRAS, CASP3), la migración (DBN1, Numb),
y la secreción de factores (LCN2, Rab27b). En su conjunto, aunque la respuesta
funcional al LPS fue heterogénea entre las 6 líneas de CCR, resulta llamativo que el
efecto funcional de la mayoría de las proteínas dependientes de LPS fueron directa o
indirectamente carcinogénicas y prometastásicas.
Los resultados de este proyecto demuestran el interés patogénico de las
proteínas del CCR dependientes de LPS, y la necesidad de estudiar su interrelación
con la regulación y efectos funcionales del resto de genes prometastásicos conocidos
del CCR, así como su posible interés como biomarcadores carcinogénicos y
prometastásicos en pacientes con CCR.
CONCLUSIONES
6. CONCLUSIONES
171
6. CONCLUSIONES
1. Al estudiar los efectos del LPS sobre las células HT-29 de CCR humano se
verificó que dicha endotoxina induce una respuesta transcripcional y
secretora de citocinas tales como VEGF, CXCL1, IL-18, SCF y MIF, que imita la
descrita en trabajos previos sobre monocitos activados por LPS.
2. El estudio mediante 2D-PAGE y espectrometría de masas del sobrenadante de
las células HT-29 permitió identificar una familia de 16 moléculas solubles en
el secretoma que fue específica de la respuesta de dichas células a LPS, entre
las cuales se encontraron dos proteínas de nueva aparición (MSN e YWHAZ), y
catorce que aumentaron significativamente, en su mayoría de naturaleza
enzimática (ALDH1A1, ARHGDIA, CCT5, EZR, G6PD, GAPDH, GSS, LDHB, PDI,
PGK1, PKM2, SERPINB1, TALDO1, TKT).
3. El análisis de la expresión génica de las moléculas del secretoma de HT-29
dependientes de LPS, efectuado en la base de datos publicada por Sabates-
Bellver y colaboradores en 2007, correspondiente al transcriptoma completo
de biopsias pareadas de mucosa colónica normal y tumoral procedentes de 32
pacientes con CCR, verificó un aumento en la expresión génica de 10 de las
moléculas dependientes de LPS (ARHGDIA, CCT5, EZR, GAPDH, GSS, MSN,
PDIA2, PGK1, PKM, YWHAZ) en la lesión tumoral de más del 75% de los
pacientes, existiendo además una molécula (LDHB) con descenso en su
expresión génica y 6 (SERPINB1, G6PD, ALDH1A1, ENO1, TALD01, TKT) sin
variación de expresión entre mucosa normal y tumoral.
4. Al cuantificar mediante RT-PCR la expresión génica de las moléculas del
secretoma de HT-29 dependientes de LPS, junto con la de otros 44 genes
identificados en trabajos anteriores por sus implicaciones prometastásicas, en
41 biopsias de lesiones primarias de pacientes con CCR, y tras analizar los
resultados mediante conglomerados jerárquicos, para clasificar los pacientes
con CCR en función de la agregación de genes dependientes de LPS y
6. CONCLUSIONES
172
prometastásicos por su nivel de similitud transcripcional estimada en
distancias euclídeas, se demostró:
- Que la mayoría de las moléculas dependientes de LPS (11 de un total de 17)
se asociaron transcripcionalmente a los genes prometastásicos : RPL38,
NDRG1, PRDX4, DPY19L1, SPP1, ETS2, SDC1, PVR y NET1.
- La existencia de cuatro subgrupos de genes en los que la naturaleza
funcional prometastásica y el número de genes dependientes de LPS fue
distinta, habiendo un subgrupo específico en el que se concentraron una
mayoría de los genes de moléculas del secretoma de HT-29 dependientes
de LPS (PGK1, G6PD, ENO1, PKM, MIF, GSS, TALDO1, ARHGDIA, TKT y
CCT5) en combinación con los genes prometastásicos asociados a la
regulación del estrés oxidativo y la proliferación.
- La existencia de cuatro subgrupos predominantes de pacientes con perfiles
diferentes de expresión génica, indicando que genes prometastásicos y
dependientes de LPS se asociaron de forma distinta por su actividad
transcripcional en los pacientes con CCR. Este hecho fue particularmente
llamativo en un subgrupo de 12 pacientes, cuya expresión de todos los
genes prometastásicos y dependientes de LPS fue a la vez elevada.
5. Por último, el estudio del secretoma de HT-29 junto con el de otras cinco líneas
celulares más de CCR humano, mediante cromatografía líquida y
espectrometría de masas, demostró que con independencia de los niveles de
expresión de TLR4 y de translocación nuclear de la proteína p65 en respuesta
a LPS, las proteínas dependientes de LPS fueron mayoritariamente de tipo
exosomal, siendo las solubles minoritarias y muchas de ellas inhibidas en
algunas de las líneas tras su exposición a LPS. Así mismo, la mayoría de las
proteínas dependientes de LPS, y especialmente de las proteínas exosomales,
estuvieron relacionadas con el cáncer por trabajos anteriores. Concretamente,
alrededor del 10% de las proteínas exosomales dependientes de LPS
estuvieron asociadas al proceso de metástasis hepática del CCR y el 50% a la
carcinogénesis y progresión del mismo tumor.
6. CONCLUSIONES
173
En su conjunto, los resultados obtenidos verificaron la hipótesis
planteada, permitiendo afirmar que la respuesta del cáncer de colon a
endotoxinas de LPS conlleva una secreción de proteínas solubles y
espcialmente exosomales, cuya expresión de sus genes se asocia en la respuesta
a LPS, a la de otros genes conocidos por su implicaciones prometastásicas a
través de estudios clínicos y experimentales anteriores.
6. CONCLUSIONES
174
CONCLUSIONS
1. Studying LPS effeccts on HT-29 cell line, we could verify that the endotoxin
induced a transcriptional and citokine secreting response, for citokines such as
VEGF, CXCL1, IL-18, SCF and MSCF; mimicking LPS-activated monocytes.
2. The study carried out by 2D-PAGE and mass spectometry in the supernatant of
HT-29 cell line identified a family of 16 soluble molecules in the secretome, that
was specific of the response of the cell to LPS. Among them, there were 2 newly
expressed proteins (MSN and YWHAZ) and 14 whose expression was significantly
increased, mostly enzimatic proteins (ALDH1A1, ARHGDIA, CCT5, EZR, G6PD,
GAPDH, GSS, LDHB, PDI, PGK1, PKM2, SERPINB1, TALDO1 and TKT).
3. The gene expression analysis of the LPS-dependent HT-29 molecules, performed
in the database published by Sabates-Bellver and colleagues in 2007,
corresponding to the full transcriptome of paired normal colonic mucosa and
tumoral tissue in 32 colorectal cancer patients, verified and increase in the tumor
tissue gene expression for 10 LPS-dependent molecules (ARHGDIA, CCT5, EZR,
GAPDH, GSS, MSN, PDIA2, PGK1, PKM and YWHAZ), in more than 75% of the
patients; whereas the tumoral gene expression of 2 molecules (LDHB and MIF)
decreased, and 6 molecules (SERPINB1, G6PD, ALDH1A1, ENO1, TALD01, TKT)
did not show changes when comparing to normal mucosa.
4. Gene expression quantitation by RT-PCR of LPS-dependent HT-29 secretome
molecules, altogether with other 44 genes previously reported as prometastatic
implicated, in 41 primary tumor biopsies from colorectal cancer patients, and the
subsequent hierarchical cluster analysis, in order to classify colorectal cancer
patients according to their LPS-dependent and prometastatic gene aggregation,
showed:
- That the most of the LPS-dependent molecules (11 out of 17) were
transcriptionally associated with the following prometastatic genes:
RPL38, NDRG1, PRDX4, DPY19L1, SPP1, ETS2, SDC1, PVR and NET1.
6. CONCLUSIONES
175
- The existence of 4 gene subsets in which the functional prometastatic
nature and the number of LPS-dependent genes was different was
demonstrated. There was an specific subset where most of the genes for
LPS-dependent HT-29 molecules (PGK1, G6PD, ENO1, PKM, MIF, GSS,
TALDO1, ARHGDIA, TKT and CCT5) were aggregated, in combinationwith
prometastatic genes linked to oxidative stress regulation and cellular
proliferation.
- The existence of 4 predominant patients subsets, with different gene
expression profiles, showing that prometastatic and LPS-dependent genes
were associated in a different way fro their transcriptional activity in
colorectal cancer patients. This fact was particulary striking in a subset of
12 patients, whose gene expression was increased.
5. Lastly, the study of the secretome of 6 colorectal cancer cell lines by liquid
cromatography and mass spectrometry, demonstrated that, in a TLR4 expression
and LPS-induced p65 nuclear translocation independent manner, the LPS-
dependent proteins were mostly exosomal, being soluble proteins minoritary and
many of them inhibited in several cell lines. Likewise, most of the LPS-dependent
proteins, and especially exosomal proteins, were previously linked to cancer.
Specifically, around 10% of exosomal proteins were previously reported to be
linked to colorectal cancer hepatic metastasis; and between 40 and 50 % to
colorectal carcinogenesis and progression.
These results verified the hipothesis raised, allowing to confirm that
colorectal cancer response to bacterial endotoxin leads to a soluble and
especially exosomal protein secretion, whose gene expression in associated to
other previously reported by clinical and experimental studies prometastatic
genes.
6. CONCLUSIONES
176
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ANEXOS
8. ANEXOS
199
8. ANEXOS
Anexo I: Modelo de consentimiento informado para los pacientes de CCR cuyas muestras fueron recogidas para el presente estudio.
8. ANEXOS
200
8. ANEXOS
201
Anexo II: Tabla de valores medios de expresión génica (normalizados con HPRT1) con su correspondiente desviación estándar para los 62 genes que se cuantificaron en las 41 muestras de tumores primarios.
Gen Media Desviación
estándar Gen Media
Desviación estándar
ALDH1A1 0,984 0,068 LDHB 0,899 0,035
ANXA2 0,821 0,030 LGALS3 0,851 0,044
ARHGDIA 0,906 0,033 LPAR1 1,039 0,064
CCT5 0,940 0,031 MIF 0,815 0,028
CFTR 0,990 0,092 MSN 0,949 0,044
CKS2 0,948 0,029 MT1E 0,901 0,074
CLDN3 0,876 0,073 NDRG1 0,869 0,043
CLDN4 0,848 0,063 NET1 1,050 0,021
CSE1L 0,962 0,026 NME1 1,062 0,032
DGCR8 1,113 0,029 PDIA2 1,167 0,09
DGKE 1,041 0,033 PGK1 0,877 0,026
DMBT1 0,998 0,141 PKM 0,844 0,039
DPY19L1 1,050 0,030 PPP3CC 1,049 0,041
EFEMP1 1,023 0,059 PPP6R2 1,018 0,044
ENO1 0,824 0,032 PRDX4 0,902 0,033
ERBB2 0,945 0,041 PVR 1,025 0,026
ETS2 0,889 0,028 RPL38 0,76 0,025
EZR 0,865 0,032 S100A10 0,876 0,037
FABP5 0,910 0,039 S100A13 0,944 0,054
FCGBP 0,932 0,121 S100P 0,890 0,065
FHL2 0,955 0,042 SDC1 0,939 0,043
FXYD3 0,857 0,080 SERPINB1 0,892 0,028
G6PD 0,997 0,030 SHFM1 0,930 0,026
GAPDH 0,775 0,029 SPINT2 0,860 0,048
GSS 0,953 0,029 SPP1 0,928 0,094
HMGB1 0,939 0,029 TALDO1 0,901 0,026
ITGB4 0,941 0,053 TERT 1,143 0,071
ITPKC 1,015 0,033 TKT 0,887 0,032
KIAA0753 1,104 0,033 TNF 1,122 0,073
KRT19 0,845 0,072 USP11 1,043 0,031
KRT8 1,094 0,082 YWHAZ 0,798 0,028
8. ANEXOS
202
Anexo III: Análisis de conglomerados jerárquicos en función de la medida de spectral counts para todas las proteínas identificadas para las fracciones de vesículas extracelulares (EVs) y solubles (SS). Se observa una agrupación según la fracción (EVs y SS) y entre líneas celulares.
8. ANEXOS
203
Anexo IV: Identidad de las proteínas solubles de nueva aparición en el secretoma de 6 líneas celulares de CCR, clasificadas según su asociación al CCR y a su metástasis hepática.
Asociados a CCR metastásico
Asociadas a CCR
Asociadas a cáncer (no CCR)
No asociadas a cáncer
NOTCH3(1) LCN2 (1) DBN1 (4) LGALS8 (1) CXCL1 (4) CCL20 (4)
SNX1 (5) HNRNPH2 (4) SMARCA4 (1)
MRTO4 (1) NELL2 (5) SMPDL3A (4) BCAP31 (1)
MYO18A (1) NYNRIN (1)
1: CaCo-2; 2: COLO-205; 3: HCT-116; 4: HT-29; 5: LoVo y 6: SW480.
8. ANEXOS
204
Anexo V: Identidad de las proteínas solubles cuya concentración se incrementó tras el tratamiento con LPS en el secretoma de 6 líneas celulares de CCR, clasificadas según su asociación al CCR y a su metástasis hepática.
Asociados a CCR metastásico
Asociadas a CCR
Asociadas a cáncer (no CCR)
No asociadas a cáncer
HMGB1 (1)
ANP32A (1) CCAR1 (1) CHD4 (1) RPL38 (1) SART3 (1) SRSF6 (1) SSRP1 (1) CXCL3 (2) RPA3 (2) RPL22 (2,4) RPS23 (2) RPS5 (2) RPS7 (4) RPS4X (1,4,5) C3 (6)
EIF3D (1) PPM1G (1) PTPN23 (1) RPS17 (1,2, 3,4,6) RPS9 (1) SF3B2 (1) SMARCA5 (1) RPL21 (2) RPL9 (2) RPS3A (4,5) NPEPL1 (5)
KIAA0332 (1) RPS25 (1-6) SET (1) FAM136A (2) SGSH (4) TROVE2 (4) POLR2B (5)
1: CaCo-2; 2: COLO-205; 3: HCT-116; 4: HT-29; 5: LoVo y 6: SW480.
8. ANEXOS
205
Anexo VI: Identidad de las proteínas solubles desaparecidas tras el tratamiento con LPS en el secretoma de 6 líneas celulares de CCR, clasificadas según su asociación al CCR y a su metástasis hepática.
Asociados a CCR metastásico
Asociadas a CCR
Asociadas a cáncer (no CCR)
No asociadas a cáncer
CDK5RAP3 (6) UBXN1 (3) RAB5B (3) CSPG4 (4) LARP7 (5) PRPSAP2 (5) QPCT (5) AFAP1L2 (6) LAMTOR1 (6)
NT5C3B (2) NAA20 (5) ZFPL1 (5) FYCO1 (6) SLK (6) ZFR (6)
1: CaCo-2; 2: COLO-205; 3: HCT-116; 4: HT-29; 5: LoVo y 6: SW480.
8. ANEXOS
206
Anexo VII: Identidad de las proteínas solubles cuya concentración disminuyó tras el tratamiento con LPS en el secretoma de 6 líneas celulares de CCR clasificadas según su asociación al CCR y a su metástasis hepática.
Asociados a CCR metastásico
Asociadas a CCR
Asociadas a cáncer (no CCR)
No asociadas a cáncer
LRP6 (4) ARF1 (5) HNRNPM (5)
CST1 (4,5) CHD4 (6) ERP29 (6) NSUN2 (6) RANBP2 (6)
APOA1 (2) COPS3 (2) PREP (2) SFRS2 (3) PSMA8 (2) ADI1 (5) EIF1 (5) ISG20 (5) ELAC2 (6) EXOSC5 (6) IARS2 (6)
METTL5 (3) C21orf33 (5) GNPNAT1 (5) MAGOHB (5)
1: CaCo-2; 2: COLO-205; 3: HCT-116; 4: HT-29; 5: LoVo y 6: SW480.
8. ANEXOS
207
Anexo VIII: Identidad de las proteínas liberadas en EVs de nueva aparición en el secretoma de 6 líneas celulares de CCR clasificadas según su asociación al CCR y a su metástasis hepática.
Asociados a CCR metastásico
Asociadas a CCR Asociadas a cáncer (no CCR)
No asociadas a cáncer
NUMB (1) EVA1B (3) GTF2F1 (3) HRAS (3) PSMD10 (3) SEC22B (3) RAB27B (5) TTC38 (5) ASAH1 (6) CASP3 (6) GDF15 (6)
AOC1 (1) ATP5B (1) NAT10 (1) PNKP (1) PSMA5 (1) RPS23 (1) SRPRB (1) TUFM (1) HPGD (2) IKBKG (2) CDK4 (3) CSRP1 (3) DSC1 (3) GAR1 (3) HEBP1 (3) KIF23 (3) LRCH1 (3) PPIL1 (3) RAB1A (3) REXO2 (3) RPS10 (3) RPS27L (3) TPD52 (39 TPT1 (3) YRDC (3) CDK9 (3) IFNGR1 (3) LGALS9 (3) ZW10 (4) SAE1 (5) TMC7 (5) TNIK (5) CRK (6) ITPA (3,6) PRDX4 (6) SPRR2A (6) TXNDC17 (6)
C14orf166 (1) CHP1 (1,3) CLSTN3 (1) DDX27 (1) GEMIN5 (1) GMFB (1) HSPA2 (1) LRPAP1 (1) PNPO (1) RAB3D (1) RPL21 (1) U2AF1 (1) XPO4 (1) ACTBL2 (2) CMTM6 (2) MYO10 (2) NUP205 (2) POLR2E (2,3) ABHD14B (3) ATP6AP1 (3) CBFB (3) COMT (3) COPS8 (3) COPZ1 (3) CRIP2 (3) CTSC (3) DYNLL1 (3) GSTK1 (3) HPCAL1 (3) LYPLA1 (3) MTPN (3) PHPT1 (3) PPM1A (3) PRPSAP1 (3) PSMB2 (3) RBM8A (3) SLC39A6 (3) SNRPD1 (3) SRP54 (3) VAMP7 (3) ZNF207 (3) MAN1A2 (3) PPFIBP2 (3)
ACOT13 (1) GAA (1) HEATR5B (1) NMD3 (2) RAB8A (3) REEP5 (2,3) ARL15 (3) DPCD (3) GLTP (3) HDDC2 (3) NIP7 (3) PFDN6 (3) PRH1 (3) TLDC1 (3) UBE2I (3) UEVLD (3) KIAA1455 TGM1 (3) DDOST (5) PSMG1 (5) SLC17A5 (5) TUBB8 (5) SF3B14 (6) SNRPA1 (6) VBP1 (6)
8. ANEXOS
208
SERINC3 (3) TNIP1 (3) ARIH1 (5) ATP1A3 (5) DCXR (5) DLST (5) FAM171A1 (5) FRK (5) NUDT21 (5,6) B3GNT2 (6) CDSN (6) DCXR (6) DIS3L2 (6) EXOSC4 (6) MAN2A1 (6) TGM3 (6)
1: CaCo-2; 2: COLO-205; 3: HCT-116; 4: HT-29; 5: LoVo y 6: SW480.
8. ANEXOS
209
Anexo IX: Identidad de las proteínas liberadas en EVs cuya concentración se incrementó tras el tratamiento con LPS en el secretoma de 6 líneas celulares de CCR clasificadas según su asociación al CCR y a su metástasis hepática.
1: CaCo-2; 2: COLO-205; 3: HCT-116; 4: HT-29; 5: LoVo y 6: SW480.
Asociados a CCR metastásico
Asociadas a CCR Asociadas a cáncer (no CCR)
No asociadas a cáncer
CUL1 (1) REG4 (2) S100A6 (2) HMGA1 (2) KRAS (3) ABI1 (3) PRDX4 (3) RAC1 (3) GSTP1 (3) LGALS1 (3) CD151 (5) HLA-A (5) CLIC4 (5) CAT (6)
COMT (1) DDX21 (1) RPL5 (1) EEF1E1 (2) HINT1 (2) TXN (2) NUMB (2) NME2 (2) CYCS (3) PARK7 (3) SCRN1 (3) IL18 (3) EIF3K (3) NPC2 (3) HPRT1 (3) SOD1 (3) GLO1 (3) PRDX2 (3) UBE2M (3) RPS7 (3) PDCD6 (3) S100A10 (3) RPS20 (3) RAP1B (3) HNRNPH1 (3) ATP2B4 (4) ATP8B1 (4) PDCD10 (5) PLEKHB2 (5) RALA (5) EIF6 (5) ANXA3 (5) PSPH (6) CSTA (6) PCMT1 (6) HPRT1 (6) PDCD10 (6) GSTO1 (6) SDC4 (6)
RPS17 (1) VARS (1) RPL14 (1) VLDLR (2) UBE2L3 (2) HSPE1 (2) HIST1H2AC (2) RAB14 (3) RHOF (3) EFHD2 (3) PTRF (3) RPL9 (3) VPRBP (3) COTL1 (3) PSMA2 (3) RAB13 (3) LMNB2 (3) LIN7C (3) TCEB2 (3) RAB2A (3) RPL21 (3) CRABP2 (3) RPL18A (3) SFRS3 (3) RAB7A (3) RPS9 (3) IGHG1 (4) DSG1 (4) LY75 (4) PLXNA2 (4) KIAA1522 (4) GLG1 (4) IGSF3 (4) MYO1B (5) GNB1 (5) SPAST (5) CAPZA1 (5) ATP6AP2 (5) TSN (6) PSMA6 (6) PSMA3 (6) APEH (6) DSG1 (6)
RPL17 (1) H2AFV (1) TMED10 (1) ARL15 (1) HIST2H2AB (2) PPIH (3) TSN (3) CMPK1 (3) SNRPD2 (3) RAB6A (3) RPL12 (3) UBE2N (3) UEVLD (5) XP32 (6) ZBTB8OS (6) KPRP (6)
8. ANEXOS
210
Anexo X: Identidad de las proteínas liberadas en EVs desaparecidas tras el tratamiento con LPS en el secretoma de 6 líneas celulares de CCR clasificadas según su asociación al CCR y a su metástasis hepática.
1: CaCo-2; 2: COLO-205; 3: HCT-116; 4: HT-29; 5: LoVo y 6: SW480.
Asociados a CCR metastásico
Asociadas a CCR Asociadas a cáncer (no CCR)
No asociadas a cáncer
DMD (1) HMGB1 (1) LGALS8 (1) S100P (1) SRSF1 (1) ABCB6 (2) KDM1A (3) AMIGO2 (4) TNFRSF10B (4) CCL15 (5) MTOR (6) MYO5A (6) REPIN1 (6)
GCNT3 (1) MAT2B (1) METAP1 (1) ADRM1 (2) ATP5B (2) HNRNPH2 (2) MANBA (2) MAPKAPK3 (2) PTPRJ (2) TSR1 (2) ZW10 (2) C12orf57 (4) CKAP5 (4) RCN1 (4) RPS10 (4) SLC25A6 (4) TNFRSF21 (4) VIM (4) BAX (5) DUT (5) BAZ1B (6) CAPN5 (6) ENAH (6) KIF13B (6) LRCH1 (6) MED12 (6) NFKB1 (6) POLR1A (6) SEC31A (6) SLC26A2 (6) TM9SF4 (6) TNFRSF18 (6)
GDI1 (1) GRHPR (1) PALM3 (1) PKN1 (1) ABCF3 (2) GOT2 (2) MTMR2 (2) PIK3R4 (2) SMARCD2 (2) SNRPA (2) TFG (2) ATG9A (3) RABGGTB (3) ACO2 (4) ALDH18A1 (4) CLNS1A (4) KLC1 (4) PVRL1 (4) SWAP70 (4) TBC1D4 (4) UBE3A (4) VDAC2 (4) DLG3 (5) LRRC1 (5) PRRC2C (5) RFC2 (5) UBR1 (5) AGPS (6) BTBD11 (6) DOCK4 (6) DRG2 (6) ELP3 (6) EXOC1 (6) GOLIM4 (6) PCYT1A (6) POLR1B (6) PROSC (6) RRP12 (6) TMOD3 (6) TNKS1BP1 (6) TUBGCP2 (6) WDR20 (6) WDR3 (6) ZFR (6)
BOLA2 (1) GIPC2 (1) KIAA1455 (1) SNRPF (1) TPRN (1) VPS11 (1) EIF2B3 (2) GOLGA3 (2) LRRC40 (2) PPM1G (2) THUMPD1 (2) CDC42BPA (3) TAOK2 (3) NAGLU (4) NCDN (4) NSFL1C (4) SEC61A1 (4) HIST2H2BD (5) CCDC22 (6) GPRIN1 (6) SACS (6)
8. ANEXOS
211
Anexo XI: Identidad de las proteínas liberadas en EVs cuya concentración disminuyó tras el tratamiento con LPS en el secretoma de 6 líneas celulares de CCR clasificadas según su asociación al CCR y a su metástasis hepática.
Asociados a CCR metastásico
Asociadas a CCR Asociadas a cáncer (no CCR)
No asociadas a cáncer
LGALS4 (2) USP14 (3) CALR (4) CLU (4) CUL1 (4) FCGBP (4) GCLC (4) LCN2 (5)
CNDP2 (1) CTSC (2) GNB2L1 (2) RCC2 (2) TALDO1 (2) TNC (2) USP7 (2) CLSTN1 (3) LACTB2 (3) PPP5C (3) TMEM30A (3) CFB (4) EIF2S2 (4) GRN (4) HK1 (4) KHSRP (4) LOXL4 (4) PAM (4) PSAP (4) RPA1 (4) SF3A1 (4) TPP1 (4) LAMA2 (5) MIA (5) PFN2 (5) UBE2L3 (5) RPL6 (6) SLC3A2 (6) SLK (6) PLCD1 (6) PTPRG (6)
AP1M2 (1) RBMX (1) COPE (2) EXT2 (2,4) FIBP (2) MDH2 (2) NAPA (2) PPA1 (2) MYH14 (3) SF3B2 (3) CLSTN1 (3) HNRNPAB (4) NCL (4) PDIA4 (4) PRKCSH (4) NDUFAF2 RPL27 (5) SDF4 (5) SFRS3 (5) SNRPE (5) RASA2 (6) SRP68 (6) TBC1D10A (6) HNRNPA3 (6)
C2orf6 (1) APLP2 (4) DDX42 (4) DKC1 (4) DNAJC3 (4) GNS (4) NADSYN1 (4) SNRPD2 (5) SEC16A (6) THOC2 (6) CLUH (6) MEMO1 (6)
1: CaCo-2; 2: COLO-205; 3: HCT-116; 4: HT-29; 5: LoVo y 6: SW480