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“De la Investigación a la Clínica: Aplicaciones de Citometría de Flujo en la Práctica Clínica”
T.M. MsC Juan Luis Castillo N.Citometría de Flujo
Hospital del Trabajador Concepción,Facultad de Medicina
Universidad de Concepción
Lunes 24 de Abril de 2006
www.oncoinmun.co.cl
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0 13 24 71 113223
481 611811940
10771234
15051861
22722413
27462919
35753518
357636273899
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0
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1976
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2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
Papers
Datos Tomados de PubMed usando las palabras: “flow Cytometry”
AÑOS
Citometría de Flujo: Publicaciones / año(23/04/2006 : 17:00 hrs)
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Flow Cell
InjectorTip
FluorescenceFluorescencesignalssignals
FocusedFocused laserlaserbeambeam
Sheathfluid
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Citometría de flujo: mediciones
L
M
G
SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN
“GATE”
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Parámteros Citoplasmáticos
Parámetros Nucleares
Parámetros Superficie Celular
Parámetros Extracelulares
Enzimas
EnzimasEnzimas
Proteínas
Proteínas
Pared Celular
Proteínas Secretadas
¿Qué se puede analizar por citometría de flujo?
Moléculas Superficie Celular
DNA
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CITOMETRIA DE FLUJO:APLICACIONES
• Hematología• Inmunología• Patología• Transplantes• Farmacología• Biología
• Toxicología• Microbiología• Parasitología• Citogenética• Virología• . . . . . . . . . . .
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CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias
• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas
• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular
• Estudio de HLA-B27
• Estudio de Células Progenitoras (CD34)
• Estudio de Citokinas Intracelulares
1996
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• 20 a 30% de los leucocitos circulantes• Se originan en médula ósea• Se encuentran
• Sangre• Linfa• Ganglio linfático • Timo• Médula ósea
Linfocitos
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Linfocitos
Células NK-TCélulas NKLinfocitos BLinfocitos T
Linfocitos T CD4 Helper
Linfocitos TCD8
Citotóxicos Supresores
Subpoblaciones Linfocitarias y sus funciones
Lisis de células Tumorales y células infectadas por virus.Regulación inmune
Citoxicidad Directa. Destrucción de células
tumorales y células infectadas por
microorganismos
Producción de Anticuerpos
Colaboran y Dirigen la Respuesta Inmune Citotoxicidad celular.
Suprimen la respuesta inmune
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Linfocitos
Células NK-TCélulas NKLinfocitos BLinfocitos T
Linfocitos T CD4 Helper
Linfocitos TCD8
Citotóxicos Supresores
Subpoblaciones Linfocitarias y sus Marcadores de Superficie
CD3(+)/CD16(-)/CD56(+)CD3(-)/CD16(+)/CD56(+)CD3(-)/CD19(+)
CD3(+)/CD4(-)/CD8(+)CD3(+)/CD4(+)/CD8(-)
CD3(+)
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HLA-DR
• Indicador de activación celular• Expresado en:
• Linfocitos T activados• Células NK activadas• Células NK-T activadas• células presentadoras de antígeno:
• Linfocitos B• Monocitos y Macrófagos
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Infección VIH-SIDA
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Terapia Inmunosupresora
NNInfección viral (herpes)
NInmunodepresión celular severa(SIDA)
NNNInmunodepresión celular (infección VIH)
NNNSupresión y control de la respuesta inmune celular
Establecimiento de respuesta inmune celular
NK-T
Inicio de respuesta inmune celular (ej.: infección)
LT HLA-DR(+)
NKLBLTCD8LTCD4LT Totales
Situación
: Aumentado: Disminuido
N : Normal
Ejemplo de alteraciones del recuento de Subpoblaciones Linfocitarias
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Varón 28 años, Síndrome Disentérico, CEG y Baja de peso (15 -20 kgen 2 meses).Paciente relata haber presentado un cuadro gripal 1 mes antes del comienzo de su cuadro diarreico.
3 Coproparasitológicos (-)
EDB y biopsia compatibles
Test de Elisa para VIH (-)
HospitalizaciónTerapia ATB, corticoides.
El 10º día se reemplaza terapia por sulfasalazina, prednisona oral y nutrición vía oral
CU
Caso Clínico
Paciente sufre de una inmunodepresión severa por tratamiento para CU, y desarrolla infecciones por agentes oportunistas.
Recuento Linfocitos TCD4: 5 mm3
VIH (+) Confirmado por ISP
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Evaluación de la Fagocitosis y del metabolismo oxidativo
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Estallido Respiratorio
• En la destrucción de microorganismos fagocitados se libera peróxido de hidrógeno (H2O2)
• La prueba de estallido respiratorio mide la producción de H2O2
• Permite determinar:• El grado de activación celular• La respuesta a la estimulación.
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• Adulto normal• No estimulado :• Estimulado con PMA :
25.86 %76.98 %
Estallido respiratorio en Fagocitos
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Ejemplo de alteraciones del Estallido Respiratorio
NN
NN
>40 >50N>40 >50NTTO antioxidantes / vitaminas / Zn / Se
>25 <50N>25 >50NInfección viral / Herpes / Aftas bucales / Estrés
>25 <50>25 <50Infección Bacteriana leve a moderada
<20<20Sepsis
<20<20E.G.C.
>50NN>50NNNormal
Δ B-EEBΔ B-EEB
MonocitosGranulocitosSituación
: Aumentado: Disminuido
N : Normal
B : BasalE : EstimuladoΔ B-E: Diferencia
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Expresión de HLA-DR en Monocitos
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Monocitos
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CPA
Ag
Procesamiento Ag
Presentación Ag
Molécula MHC ( HLA-DR)
Procesamiento y Presentación de Antígenos
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Procesamiento y Presentación de Antígenos
Molécula MHC (HLA-DR)
TCR/CD3
Ag
CPA (monocito)
Procesamiento Ag
Presentación Ag
Linfocito T Respuesta Inmune
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74 (68 – 79)76 (56 – 90)≥ 7 %APACHE II score
72 (67-77)83 (64 – 94)≤ 78 %HLA-DR(+) monocytes
Specificity (%)Sensitivity (%)Cut-off point
Predicting organ failure in patients with acute pancreatitis (Values in parentheses are 95% CI)
The Biochemical Society: Clinical Science 2003; 105: 409-417
Expresión de HLA-DR en Monocitos
60
40
20
2 days 5 days
Survivors
Non survivors
HL
A-D
R(%
Exp
ress
ion) Changes in HLA-DR expression on monocytes in
patients with septic shock after admittance to theintensive care unit.
Clinical Chemistry 2002; 48: 1589-92
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Inmunodepresión severa, sepsis, compromiso vital de alto riesgo.
Menor a 24
Inmunodepresión severa. Presencia de inflamación sistémica, sepsis.
24 – 62
Inmunodepresión. Presencia de cuadro infeccioso moderado a severo.
62 – 78
Inmunodepresión leve. Cuadro infeccioso leve.78 – 88
Normal88 – 100
Interpretación niños y adultos(**)Rango (%)
Expresión de HLA-DR en Monocitos
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Inmunofenotipo de Leucemias y Linfomas
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Hematopoiesis
PLURIPOTENTSTEM CELL
COMMITTEDPROGENITOR
CELL
RECOGNIZABLE BONE MARROW
PRECURSOR CELL
MATURE BLOOD CELL
myeloblastmonoblast
pronormoblast red cellneutrophilmonocyte
basophil
platelet
CFU-Baso
CFU-Eos
CFU-GM
BFU-E/CFU-E
eosinophil
pre-T
pre-B
myeloidprogenitor
cell
lymphoidprogenitor
cell
lymphoblast
lymphoblast
T-cell
B-cell& plasma cell
MIXED PROGENITOR
CELL
CFU-Meg megakaryocytepluripotent
stem cell
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CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)
•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg
•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb
•LMA :-LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)
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Colon normal
Crohn
Crohn
C.U.
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ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINALEspectro de presentación.
Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn
Alteración de la inmunoregulaciónde mucosa intestinal
Inflamación persistente y/o recurrente
Congestión ulcerativa Granulomatosa
Cáncer
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ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn
Estudios celulares de mucosa intestinal:
• Células epiteliales Presentadoras de antígenos.
• Macrófagos Moduladores
• Linfocitos: TCD4 Perpetuación
Induction and Modulation of Gastrointestinal InflamationFALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.
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Mahida YR et al. Gut.1989;30:826-34
Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Acad. Publishers 1999 pps.:111-113
Mucosa
• HLA-DR• CD16
• CD54
• CD25
• CD68• CD80, CD86• CD11b
Normal
20-30%Ausente
7%
Ausente
AusenteAusente
5%
EII
PresentePresente
C.U. 70%Crohn 46%
C.U. PresenteCrohn ausente
PresentePresentePresente
Inmunofenotipo de Macrófagos Intestinales (Histológicamente normales)
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> 5 %> 30 %Inflamación crónica activa
< 5 %> 30 %Inflamación crónica con escasa actividad
> 5 %< 30 %Inflamación Aguda
< 5 %< 30 %Normalidad
CD16HLA-DRSituación
Ejemplo de alteraciones del Inmunofenotipode Macrófagos Intestinales
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Ejemplo de Macrófagos Intestinales
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Ploidía de ADN y Ciclo celular
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Células cancerosas difieren de las normales
1. Pérdida de funciones diferenciadas.2. Expresión de “neo antígenos” no
típicos del estado diferenciado.3. Capacidad de invadir tejidos no
nativos.4. Metabolismo diferente.5. Inestabilidad genética elevada.6. Morfología anormal.7. Progresión hacia malignidad.
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ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR
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Bert Vogelstein’s model of colorectal cancer
Teoría de mutaciones acumuladas
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Displasia de bajo grado
V/SSin displasiaDisplasia indefinida
0.46
Displasia de alto gradoV/SSin displasiaDisplasia indefinida
Displasia de bajo grado
0.7
Concordancia interobservador (0-1)
Histopathology 2004; 45: 312-334
Definición del Grado de Displasia
Aneuploidía precede a la displasia
Aneuploidía algunos la consideran un marcador prediplásico y/o preneoplásico
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“Según la teoría de mutaciones acumuladas, el cáncer es producido por mutaciones de genes específicos,
llamados oncogenes y genes supresores de tumores.”Science 194:23-28 (1976)Nature 289:353-357 (1981)Science 285:210-211 (1999)Science 285:251-254 (1999)
“Diversos estudios han evidenciado que un gen mutado o la combinación de ellos no es suficiente para
transformar una célula normal en neoplásica”Science 267:1407-1408 (1995)Biochem J. 340:621-630 (1999)Cell cycle 3:823-828 (2004)Nature Biotechnol 21:13-14 (2003)Science 284:2089 (1999)Science 297:544-546 (2002)
Teoría de la aneuplodía
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“Propone que el cáncer es causado por la dosificación anormal de miles de genes normales”
“Esta dosificación anormal de genes es generada por la ganancia o pérdida de cromososmas específicos o segmentos de cromosomas, alias aneuploidía”
Proc Natl Acad Sci USA 94:14506-11 (1997)Biochem J 340:621-30 (1999)Proc Natl Acad Sci USA 97:3236-4 (2000)Cell Motil Cystoskel 47:81-107 (2000)Cell cycle 2:202-10 (2003)IUBMB life 56:65-81 (2004)Nature Biotechnol 21:13-14 (2003)GENES VII (Lewin B.)
Teoría de la aneuplodía
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Hipodiploidía Indice de ADN 0.75 – 1.0
Límite para viabilidad
HiperdiploidíaIndice de ADN mayor a 1.01.5 = triplodía2.0 = tetraploidía
Cytometry 22:307-316 (1995)Biochem J. 340:621-30 (1999)
Teoría de la aneuplodía
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La inestabilidad genómica puede ser identificada por citometría de flujo.
Núm
ero
de c
é lu l
as
DNA/Célula
Normal Tetraploide Aneuploide
Diploide
2N 4N 2N 4N 2N> 6%< 6%
Teoría de la aneuplodía
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Relevancia Clínica de la Aneuploidía en cáncer:
1. Si el cáncer es causado por la aneuploidía, la malignidad será proporcional al grado de aneuplodía.
2. La aneuploidía precede el cáncer, por lo que este debiera ser prevenible detectando y eliminando aneuploidías precancerosas.
Teoría de la aneuplodía
Cell cycle 3:823-828 (2004)
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Teoría de la aneuplodía
• 104 carcinomas de mama• En base a proliferación celular:
• Near diploid baja malignidad• Near diploid alta malignidad
• Tetraploide baja malignidad• Tetraploide alta malignidad
La proliferación celular permite clasificar adenocarcinomas de mama (near diploid, tetraploides y aneuploides) en neoplasias de alta y baja malignidad.
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• En la carcinogénesis colorectal y cervical, esta transición es
reflejada por la displasia.
• La inestabilidad genética, medida por la aneuplodía, aumenta
progresivamente con el grado de la displasia hasta el desarrollo
de un carcinoma.
Teoría de la aneuplodía
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Teoría de la aneuplodía
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Barrett’s EsophagusTetraploidy, Aneuploidy (>2.7N) Predict Cancer
Prob
abili
ty o
f Can
cer
Years
Neither
Aneuploidy
Tetraploidy
Both Tetraploidy & Aneuploidy
Barrett MT, Sanchez CA, Prevo LJ, Wong DJ, Galipeau PC, Paulson TG, Rabinovitch PS, Reid BJ. Evolution of Neoplastic Cell Lineages in Barrett’s Esophagus. Nature Genetics, 22:106-109, 1999
Teoría de la aneuplodía
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Tetraploidía predispone a la Aneuploidía en EB
Citometría de flujoNormal
Tetraploide
Progresando a aneuploidía8/74 (11%)
11/16 (69%)
N= 90 pacientes
P < 0.0001
Intervalo promedio entre tetraplodía y aneuploidía: 17 meses
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p53/Flow Cytometric Combinations (1995-2002) N = 240 patients
p53 mut and/or LOH, normal flow
normal p53, normal flow
p53 mut and/or LOH andaneuploid and 4N
p53 mut and/or LOHand aneuploid or 4N
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ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SÓLIDOS
ANEUPLOIDIA
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ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SÓLIDOS
ANEUPLOIDIA• Grado de malignidad
• Pronóstico
InvasiónMetástasisEvolución naturalRespuesta a tratamiento
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
PROLIFERACION CELULAR
• Tiempo libre de enfermedad.
• Sobrevida.
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0.95 - 1.05Índice de ADN
%0.78 - 17.34Fase S + Fase G2M
%0.33 - 11.03Fase S (**)
%0.45 - 8.72Fase G2M
%82.66 - 99.21Fase G0G1
Rango Referencia (*)Parámetro
Fases del Ciclo Celular en epitelios (tejido fresco)
(*) Análisis modelando fase S con modelo trapezoidal y tres compartimentos.
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Mujer, 64 años.Pólipo colon Yamada II a 25 cm.
Biopsia: Adenoma con atipía moderada a severa.
Ejemplo de alteraciones de plodía y ciclo celular
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CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias
• Estallido Respiratorio en Granulocitos y Monocitos
• HLA-DR en monocitos.
• Inmunofenotipo de macrófagos intestinales
• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas
• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular
• Microbiología
• Estudio de HLA-B27
• Estudio de Células Progenitoras (CD34)
• Estudio de Citokinas Intracelulares
• Cuantificación de moléculas
• Degranulación de basófilos
• Resistencia a drogas.
• Cuantificación de citokinas circulantes
2006
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“De la Investigación a la Clínica: Aplicaciones de Citometría de Flujo en la Práctica Clínica”
T.M. MsC Juan Luis Castillo N.Citometría de Flujo
Hospital del Trabajador Concepción,Facultad de Medicina
Universidad de Concepción
Lunes 24 de Abril de 2006
www.oncoinmun.co.cl