curso “microscopÍa Óptica y lÁser … · objetivos de inmersión en aceite ... enfocar con...
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CURSO “MICROSCOPÍA ÓPTICAY LÁSER CONFOCAL”
SSTTI – UAOctubre 2011
PRÁCTICA
CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO
DM IRE2
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1. PARTES DEL MICROSCOPIO
VISTA DESDE LA IZQUIERDA
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Ocular
Detector de luz transmitida
Columna de iluminación con luz transmitida
Lente condensadora
Platina galvanométrica
Cubos de filtros de fluorescencia
Rueda de foco
Rueda de ajuste de la intensidad de la lámpara
halógena
Panel de control del microscopio
VISTA DESDE LA DERECHA
Posición torreta de condensadora Descripción Correspondencia con objetivosBF Vacío
(Para campo claro)Todos
Ph1 Anillo de fase Todos20 Prisma condensadora DIC 20X40/63 Prisma condensadora DIC 40X - 63X100 Prisma condensadora DIC 100X
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Lámpara halógena
(Luz transmitida)
Filtros(vacío)
Rueda de selección del
detector de luz transmitida
Torreta de la condensadora
Lámpara de fluorescencia
Revolver de los objetivos
Módulo de laslentes de tubo
(lente de Bertrand)
Movimiento x-y de la platina
Rueda de foco
TORRETA DE LOS OBJETIVOS
Posición torreta de los prismas DIC Descripción Correspondencia con objetivosBF Vacío
(Para campo claroo contraste de fases)
Todos
C Prisma objetivo DIC 20XD Prisma objetivo DIC 100XE Prisma objetivo DIC 40X – 63X
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Revólver de los objetivos
Torreta de los prismas DIC
Diafragma de iluminación de
epifluorescencia (Controla la
intensidad de la iluminación)
Diafragma de campo de
epifluorescencia (Controla el área
iluminada)
Torreta de los cubos de filtros
de fluorescencia
Analizador(Luz polarizada y DIC)
PANEL DE CONTROL DEL MICROSCOPIO
El microscopio tiene tres cubos de filtros de fluorescencia:
I3: excitación azul, BP 450-490; emisión LP 515. Para FITC, Cy2, etc.
N2.1: excitación verde, BP 515-560; emisión LP 590. Para TRITC, Cy3, etc.
A: excitación UV, BP 340-380; emisión LP 425. Para AMCA, DAPI, etc.
La posición SCAN se usa para imagen confocal y para la observación de luz transmitida a
través de los oculares.
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Display LCD
La luz roja indica el filtro de
fluorescencia que está seleccionado
Botones del display LCD
I3 N2.1 A
Botones de cambio de filtros
Botones de selección de la
recogida de imagen:
VIS = OcularSIDE = ConfocalBOTTOM = Vacío
Obturador de la lámpara de
fluorescencia.Cuando está en rojo indica que el obturador está puesto y que no
pasa luz
Botones de cambio de las lentes del tubo
LCD DEL PANEL DE CONTROL DEL MICROSCOPIO
No se debe presionar nunca el botón LEARN ya que se entraría en el modo de
programación del microscopio.
Si accidentalmente se presiona aparecerá parpadeando la opción EXIT. Se debe pulsar
de nuevo LEARN para salir del modo de programación.
El resto de botones, excepto STEP, tampoco se deben tocar.
STEP se utilizará cada vez que sea necesario cambiar el paso del foco.
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Indica la posición z relativa al límite
superior
Indica el paso del foco fino.
S0: el paso menorS3: el paso mayor
Las flechas indican que se ha
establecido un límite superior y/o
inferior
Objetivo en uso Prisma DIC requerido
Prisma DICen uso
Bloque de fluorescencia
Modo seco = DInmersión = I
Cambio del paso de foco
CAMBIO DE OBJETIVOSPara el cambio de objetivos se usan los botones de del lado izquierdo del microscopio.
Botón superior para subir
de aumentos
Botón inferior para bajar
de aumentos
El objetivo que se está usando aparece en el LCD del panel de control.
Objetivos secos: 10X y 20X
Objetivos de inmersión en aceite: 40X, 63X, 100X
Objetivo de inmersión en glicerina: 63X (naranja)
Para evitar el riesgo de pasar accidentalmente de un objetivo de inmersión a uno seco el
microscopio no permite hacer el cambio de forma automática usando los botones arriba
indicados.
Cuando se vaya a hacer un cambio entre objetivo seco y de inmersión o viceversa, se
deberán pulsar simultáneamente los botones de límite superior e inferior del panel de
control:
Aparecerá entonces parpadeando “CHANGE OBJECTIVE” y ya se podrá cambiar de
objetivo usando los botones de la parte izquierda del microscopio.
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AJUSTE DE LA INTENSIDAD DE LA LUZ DE LA LÁMPARA HALÓGENASe utiliza la rueda de la parte izquierda del microscopio:
Cuando se ajusta la intensidad de la lámpara el voltaje utilizado se muestra
automáticamente en el LCD del panel de control.
Para apagar la iluminación de luz transmitida se gira el dial disminuyendo el voltaje hasta
que aparezca 0 V.
Para encenderla se gira en la dirección opuesta.
ENFOQUEEl foco se ajusta utilizando las ruedas a ambos lados del microscopio.
También se puede ajustar con los botones de la parte derecha:
Si se ha establecido un límite superior
para el objetivo (estará indicado por
una flecha en el display del LCD del
panel de control) no se podrá mover el
objetivo usando estos botones más allá
de ese límite. Se usarán las ruedas de
foco de los laterales.
Es una medida de seguridad para evitar que accidentalmente se dañen los objetivos al
subir usando estos botones.
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El foco es electrónico y tiene cuatro pasos:
S0 paso de foco fino
S1 paso de foco medio
S2 paso de foco medio-grueso
S3 paso de foco grueso
Se puede cambiar de un paso de foco a otro pulsando el botón STEP del panel de control.
Cuando se selecciona un objetivo por primera vez la configuración por defecto es:
10X – S3
20X – S2
40X – S1
63X – S0
100X – S0
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2. AJUSTES PREVIOS
COLOCACIÓN DEL PORTAOBJETOS CON LA MUESTRAEl microscopio es invertido de modo que se colocará la muestra con el cubreobjetos boca
abajo.
El cubreobjetos debe tener un grosor de 0,17 mm para evitar aberraciones.
Antes de colocar la muestra se debe bajar el objetivo usando los botones del lado derecho
del microscopio.
Se retiran los clips metálicos de la platina hacia los lados tal como se muestra en la
imagen.
Se coloca el portaobjetos (1) y se ajustan los clips sobre la muestra (2).
AJUSTE DE LA DISTANCIA INTERPUPILARSe ajusta la distancia interpupilar de los oculares juntándolos o separándolos lateralmente
de forma que al mirar se observe un único círculo.
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1
2 2
SELECCIÓN DEL DETECTOR DE LUZ TRANSMITIDAPara cualquier modo de observación de
luz transmitida se coloca el botón en
posición VIS.
CONFIGURACIÓN PREVIASe ajusta la cantidad de luz de la lámpara halógena con la rueda de la parte izquierda del
microscopio.
En la parte frontal del microscopio, donde pone MAG, se selecciona 1X.
Se retiran el Polarizador y el Analizador.
Se selecciona un objetivo de bajos aumentos y se comprueba que está en su posición de
apertura numérica más abierta.
Se seleccionan (manualmente) BF en la torreta de la condensadora y BF en los prismas
de la torreta de los objetivos.
Se enfoca la muestra.
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3. OBSERVACIÓN EN CAMPO CLARO
Observación en modo de luz transmitida sin utilizar ninguna técnica de aumento de
contraste (ni contraste de fases ni interferencial ni luz polarizada)
Se gira la torreta de la condensadora a la posición BF
Se gira la torreta de los prismas DIC (bajo los
objetivos) a la posición BF.
Se selecciona en el panel de control la posición
del filtro de fluorescencia SCAN (sin filtro).
AJUSTE DE LA ILUMINACIÓN KÖHLER
En una imagen microscópica, sólo puede reproducirse una zona determinada de una
muestra (campo de imagen). La iluminación Köhler permite iluminar con precisión dicha
zona. El fondo para la precisa iluminación del campo de imagen es el siguiente:
Cuando la zona iluminada es menor que el campo de imagen, el cono de luz que percibe
el objetivo y la apertura numérica también son menores. Dado que el poder resolutivo
óptico depende directamente de la apertura numérica, al reducirse la iluminación también
se reduce el poder resolutivo, lo cual no es deseable en la mayoría de los casos.
Cuando la zona iluminada es mayor que el campo de imagen esto amplía la luz parásita.
Esto, a su vez, conlleva una disminución del contraste de la imagen, lo que puede
provocar que no se observen las estructuras de la imagen microscópica analizada
ópticamente.
La iluminación Köhler alcanza un punto intermedio entre el contraste máximo y el poder
resolutivo máximo. Los objetivos de microscopios más potentes alcanzan con frecuencia
su mejor comportamiento óptico sólo cuando la iluminación Köhler se ajusta con precisión
Consiste en igualar el diámetro del diafragma de campo con el diámetro del campo de
visión.
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1. Abrir el diafragma de apertura de la condensadora, hacia la derecha.
2. Enfocar con nitidez una zona de la muestra que parezca interesante. Aún no es
necesario tener en cuenta la calidad de la imagen.
3. Cerrar el diafragma de campo, hacia la izquierda.
De esta forma se oscurecen la mayor parte de las zonas del campo de la imagen.
Se ve un foco luminoso impreciso y desenfocado. Si este foco luminoso
desaparece del campo de visión al cerrar el diafragma de campo, debe centrase
éste último.
En este caso, se abre el diafragma hasta que pueda ver el foco luminoso del borde
del campo visual.
En el caso de que no pueda ver el foco luminoso, es probable que la condensadora
esté colocada a una altura incorrecta. En ese caso, se ajusta la altura de la
condensadora hasta que se pueda ver el diafragma de campo.
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Diafragma de campo
Rueda de foco de la condensadora
Diafragma de apertura de la condensadora
Tornillos de centrado
4. Enfocar la imagen de la condensadora, es decir, el borde del foco luminoso,
utilizando la rueda de foco de la condensadora hasta que la imagen de la apertura
sea nítida.
5. Centrar en el campo visual el foco luminoso usando los tornillos de centrado. El
centrado es más sencillo si se abre un poco el diafragma de campo para aumentar
el tamaño del foco luminoso.
6. Abrir el diafragma de campo (hacia la derecha) justo hasta que desaparezca del
campo de visión.
7. Cerrar el diafragma de apertura de la condensadora (hacia la izquierda) hasta que
se alcance el contraste deseado.
Si es necesario, bajar la intensidad de la luz con la rueda del lateral izquierdo del
microscopio.
Una apertura de condensadora muy cerrada aumenta el contraste pero disminuye
la resolución, no se debe usar para graduar la cantidad de luz que recibe la
muestra.
La posición más adecuada suele ser 2/3 de apertura.
El ajuste de la iluminación Köhler debe hacerse para cada objetivo.
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4. OBSERVACIÓN EN LUZ POLARIZADA
Útil en muestras que presenten anisotropía óptica.
En primer lugar se hace el mismo ajuste que para la observación en campo claro y se
retira la muestra.
A continuación se introduce el filtro Polarizador
cuidando de que la marca POL esté situada
mirando hacia arriba.
Se gira el porta-filtros hacia la derecha hasta
introducirlo en el camino de la luz.
Después se empuja el Analizador hasta la segunda posición de clic cuidando que la
marca ICT mire hacia arriba.
Se gira el Polarizador ligeramente hasta que se alcance la posición de extinción máxima
(el campo lo más oscuro posible) con el campo de visión vacío, sin muestra.
Por último se introduce la muestra.
Puede ser necesario aumentar la intensidad de la lámpara halógena con la rueda de la
parte inferior izquierda del microscopio.
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5. OBSERVACIÓN EN CONTRASTE DE FASES
Se necesita un objetivo de contraste de fases y un anillo de fases en la condensadora.
Seleccionar el objetivo 10X.
Realizar los mismos ajustes que para la observación de campo claro.
Ajustar la iluminación Köhler.
1. Rotar la torreta de la condensadora y seleccionar el anillo Ph1.
2. Abrir el diafragma de apertura de la condensadora hasta al posición Ph.
2. Enfocar la muestra.
3. Insertar la lente de Bertrand en el camino óptico pulsando los botones de selección
de las lentes de tubo de la parte frontal del microscopio hasta que se ilumine la
posición B.
4. Enfocar el anillo de fase usando la rueda negra del módulo de las lentes de tubo.
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Lente de Bertrand (B)
Rueda de enfoque
5. Centrar el anillo de fase de condensadora (el anillo negro) introduciendo las llaves
de centrado en las aberturas que hay a derecha e izquierda de la etiqueta Ph1 en
la torreta de la condensadora y manipulando hasta que coincidan los dos círculos.
centrado
6. Retirar la lente de Bertrand seleccionando la posición 1X en la parte frontal del
microscopio.
Este ajuste hay que hacerlo para cada objetivo que se vaya a utilizar.
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6. OBSERVACIÓN EN CONTRASTE INTERFERENCIAL (DIC)
Se necesita un objetivo de contraste interferencial, un polarizador y un prisma DIC en la
condensadora, y un analizador y otro prisma DIC después del objetivo.
Seleccionar el objetivo 20X.
Realizar los mismos ajustes que para la observación de campo claro.
Ajustar la iluminación de Köhler y retirar la muestra.
1. Insertar el Polarizador y el Analizador tal como se indica en la observación con luz
polarizada.
2. Insertar la muestra.
3. Seleccionar en la torreta de la condensadora el prisma correspondiente para el
objetivo en uso.
Posición torreta de condensadora Correspondencia con objetivos20 20X40/63 40X - 63X100 100X
4. Seleccionar manualmente en la torreta de los objetivos el prisma correspondiente
para el objetivo (C, D, E) según se requiere en el display LCD del panel frontal del
microscopio.
5. Mover ligeramente a derecha e izquierda el prisma de la torreta de los objetivos
para ajustar el contraste interferencial deseado.
También se puede ajustar el contraste con el diafragma de apertura de la
condensadora.
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7. CAMBIO DE LA PLATINA GALVANOMÉTRICA
El microscopio posee además de la platina galvanométrica dos platinas universales que
pueden acomodar todo tipo de muestras.
Para poder utilizarlas es necesario retirar previamente la platina galvanométrica.
Antes de cualquier manipulación se debe retirar el objetivo hasta su posición más baja
usando los botones de la parte derecha del microscopio.
Para cambiar la platina se sueltan los tornillos que se indican en la imagen:
La platina se dejará boca abajo sobre el cabezal de los láseres que hay a la izquierda del
microscopio.
Es muy importante no hacer presión sobre la platina cuando ésta está fuera del
microscopio ya que el sistema galvanométrico se vería dañado.
Se coloca la platina universal que se desee en el hueco que ha dejado la galvanométrica.
Se debe tener precaución con no tocar el objetivo ni la superficie de la lente
condensadora durante el cambio de la platina.
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8. USO DE LOS OBJETIVOS DE INMERSIÓN
APLICACIÓN DEL ACEITE DE INMERSIÓN1. Limpiar el cubreobjetos de la muestra antes de utilizar un objetivo de inmersión.
2. Aplicar el aceite al objetivo o al cubreobjetos antes de colocar la muestra en la
platina.
3. Utilizar solamente aceite de inmersión libre de fluorescencia.
4. Usar la mínima cantidad de aceite posible.
Si se usa demasiado se extenderá por el lateral del objetivo pudiendo penetrar en
la óptica y dañar irreversiblemente el objetivo ¡y son extremadamente caros!
5. Sumergir el aplicador de la botella de aceite en el aceite.
6. Escurrir en los bordes de la botella de manera que se retire el exceso de aceite.
7. Aplicar el aceite tocando ligeramente sobre la parte metálica al lado de la lente,
NUNCA TOCAR SOBRE LA LENTE.
LIMPIEZA DEL ACEITE DE INMERSIÓN1. Retirar la muestra de la platina.
2. Absorber el aceite ¡sin restregar! con la toalla de Leica o con un papel de limpieza
de objetivos.
3. Repetir esta operación tantas veces como sea necesario usando cada vez una
parte diferente del papel o de la toalla.
4. Limpiar el metal de alrededor de la lente.
Generalmente se requieren dos o tres papeles cada vez para dejar el objetivo libre
de aceite.
5. Poner una gota de etanol en un papel nuevo o en la toalla de Leica y aplicar sobre
el objetivo.
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