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Informe de laboratorio: Prctica Microscopa ElectrnicaLab Report: Practice of Microscopy Electronic

Catalina Orozco, Cristian Serna, Daniela Jaramillo

Resumen: Un microscopio es un instrumento que permite ver la imagen ampliada de un objeto o muestra. El microscopio electrnico es el instrumento que ha permitido la evolucin del conocimiento de ciencias como la Biologa. Su mayor ventaja es una gran amplificacin; un poder de resolucin de hasta mil veces mayor que el ptico. Hay dos tipos bsicos de microscopios electrnicos: Los microscopios electrnicos de transmisin (TEM) forman imgenes con los electrones que se transmiten a travs de un espcimen, mientras que los microscopios electrnicos de barrido (SEM) utilizan los electrones que rebotan en la superficie del espcimen.[5] La Universidad de Caldas cuenta con un equipo FEI QUANTA 250, que puede alcanzar magnificaciones de hasta 1000.000X, con resoluciones que varan desde los 3nm hasta los 10nm. Su principal ventaja es que cuenta con tecnologa de sistema ambiental (Environmental Scanning Electron Microscope - ESEM). Una herramienta importante para futuras investigaciones.Palabras Clave: Microscopio, electrn, potencia amplificadora, resolucin, microscopio SEM.

Abstract: A microscope is an instrument that allows seeing the enlarged image of an object or shows. The electron microscope is the instrument that has allowed the evolution of the knowledge of Sciences such as biology. Its biggest advantage is a high magnification, a resolution of up to a thousand times greater than the optical power. There are two basic types of electron microscopes: the transmission electron microscopes (TEM) form images with electrons that are transmitted through a specimen, while the scanning electron microscopes (SEM) use electrons that bounce off the surface of the specimen.[5] The University of Caldas has a FEI QUANTA 250 equipament, which can reach magnifications of up to 1000. 000 X, with resolutions ranging from the 3nm to the 10nm. Its main advantage is that it has environmental system (Environmental Scanning Electron Microscope - ESEM) technology. An important tool for future research. Key words: Microscope, electron, power amplifier, resolution, SEM microscope.

Introduccin La microscopa es la ciencia que se ocupa de la observacin, examen y el estudio de objetos muy pequeos con la ayuda del microscopio. Un microscopio es una herramienta, un instrumento que permite ver la imagen ampliada de un objeto o muestra. Existen bsicamente dos tipos de microscopios: pticos y Electrnicos. La microscopa ptica se basa en el uso de la luz para crear una imagen aumentada del objeto que se observa, su poder de resolucin se deriva entonces de la naturaleza ondulatoria de la luz. La potencia amplificadora de un microscopio ptico est limitada por la longitud de onda de la luz visible. [5] Por su parte, el microscopio electrnico usa electrones para obtener una imagen de la muestra; pero Puede verse con electrones? Evidentemente no; solo puede verse con la luz. Esta, las vibraciones luminosas, cuando parten de un punto de un objeto son un mensaje de ese punto; estas vibraciones tiene un color, una intensidad y una fase capaces de informarnos sobre las propiedades de ese punto. () Los electrones no son visibles; pero pueden impresionar la placa fotogrfica o producir luz en aquellos puntos de una pantalla fluorescente contra los cuales chocan. [6] Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. La longitud de onda ms corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 (1 = 0,0000000001 m). La longitud de onda de los electrones utilizados en los microscopios electrnicos es de alrededor de 0,5 . [5]A finales del siglo XIX el ingls J.J. Thompson descubri el electrn; ste demostr que los rayos emitidos por el ctodo de electrodos estn formados de partculas cargadas negativamente. Partculas que en 1924 le sirvieron a Louis de Broglie para sustentar su tesis doctoral donde demuestra que los electrones, como los fotones en la luz, presentan propiedades de onda y partcula. En1926, Bush demostr que las radiaciones elctricas podan ser enfocadas por medio de campos magnticos con simetra axial y que estos funcionan como lentes. En 1927 Gabor construye la primera lente electrnica consistente en un solenoide de hierro dulce. En 1931, Max Knoll y Ernst Ruska, crean el primer microscopio electrnico; rudimentario, con un poder de resolucin menor al del microscopio ptico. En 1933 presentaron un segundo modelo. -A pesar de los hechos, la invencin del microscopio electrnico, algunos la atribuyen a Reinhold Rdenberg debido a que fue la primera persona que registr la patente de invencin, quien curiosamente no hizo aporte alguno al desarrollo del instrumento.- [1] En 1934 E. Briest y H. O, muller, modifican el microscopio de Ruska y Knoll, y logran sobrepasar el poder de resolucin del microscopio fotnico. [4]

Marco Terico El microscopio electrnico es el instrumento que ha permitido la evolucin del conocimiento de ciencias como la Biologa. Su mayor ventaja es una gran amplificacin; un poder de resolucin de hasta mil veces mayor que el ptico, dado que emplea un haz de electrones en lugar de un haz de fotones. Los microscopios electrnicos cuentan con varios elementos bsicos: Un can de electrones que emite los electrones que chocan contra el espcimen, creando una imagen aumentada. Lentes magnticas, las cuales crean campos que dirigen y enfocan el haz de electrones. Una lente convencional como la utilizada en los microscopios pticos no funcionan con los electrones. El sistema de vaco. Es una parte importante del microscopio electrnico dado que los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, debe hacerse un vaco casi total en el interior del microscopio. Un sistema que registra o muestra la imagen que producen los electrones.

Figura 1. Se observan los tipos de microscopio electrnico: A la izquierda el de transmisin o MET, y a la derecha el de barrido o tipo SEM

Recuperado de: http://datateca.unad.edu.co/contenidos/358010/exe/leccin_10_microscopa_ptica_y_electrnica.htmlPrincipio de funcionamientoEn una cmara al vaco, el filamento (pieza de metal, una especie de alambre fino) se carga con un potencial negativo (ctodo) y se aplica un fuerte campo electrosttico entre el filamento y otra superficie contigua positiva (nodo). Al aplicar electricidad, los electrones acelerados se desprenden del ctodo hacia el nodo. La velocidad con la que viajan los electrones depende de la fuerza del campo magntico entre el ctodo y el nodo. La cantidad de electrones desprendidos est determinada por la temperatura con que es calentado el filamento, que a su vez depende de la cantidad de corriente que pasa por el mismo. As se forma un haz de electrones libres, paralelos entre s (colimados) que viajan a gran velocidad.[1]Si los electrones no son afectados por fenmenos como campos magnticos o electrostticos, as como molculas de aire presentes entre el ctodo y el nodo, viajarn en lnea recta en el vaco. El dimetro del haz producido, vara dependiendo de los siguientes factores: El haz tiende a ensancharse puesto que los electrones se repelen por su carga negativa; a mayor intensidad del haz (mayor nmero de electrones), tendr un dimetro mayor. Para obtener un haz con mayor definicin, es necesario modificar la divergencia de este. La lente electromagntica concentra el haz formando un campo electromagntico que concentra los electrones, reduciendo as el dimetro del hazHay dos tipos bsicos de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrnico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM).Un microscopio electrnico de transmisin (MET): permite la observacin de muestra en cortes ultrafinos. ste dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar, una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espcimen.Un microscopio electrnico de barrido (SEM): crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto; explora la superficie de la imagen punto por punto. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, similar al barrido de un haz de electrones de una televisin.Los microscopios electrnicos de transmisin (TEM) forman imgenes con los electrones que se transmiten a travs de un espcimen, mientras que los microscopios electrnicos de barrido (SEM) utilizan los electrones que rebotan en la superficie del espcimen.[3]

ProcedimientoLa prctica estuvo enfocada a conocer las diferentes partes y el funcionamiento del microscopio electrnico que posee la Universidad de Caldas, as como a familiarizarse con tcnicas de microscopa avanzada. Por grupos se acudi a la sala de microscopa electrnica; Gustavo Bolaos, encargado del manejo del equipo, ense detalladamente el microscopio. La Universidad de Caldas cuenta con un equipo FEI QUANTA 250, que puede alcanzar magnificaciones de hasta 1000.000X, con resoluciones que varan desde los 3nm hasta los 10nm. Su principal ventaja es que cuenta con tecnologa de sistema ambiental (Envaironmental Scanning Electron Microscope - ESEM) que permite observar muestras no conductoras o hidratadas sin necesidad de ser tratadas con una preparacin especial. As que con este microscopio, se puede observar cualquier tipo de muestra utilizando sus tres modos de operacin: 1) alto vaco (HV), 2) bajo vaco (LV) y 3) ambiental.[2] El microscopio posee tres tipos de detectores, denominados detectores SEM: Detector de electrones secundarios (Secundary Electron Image - SEI): Permiten obtener imgenes de alta resolucin y contraste, obteniendo detalles de la morfologa y topografa de la muestra. Esto hace posible identificar caractersticas de tamao, forma, espesor, defectos entre otros. Detector de electrones retrodisoersados (Backscattered Electron Image - BEI): Permite obtener imgenes de la composicin y topografa de la superficie. Dichos electrones proceden en su mayor parte del haz que incide, y rebota en el material despus de diferentes interacciones. Detector de energa dispersiva (Energy Disperse Espedtrometer): Hace referencia a una tcnica que permite detectar todos los elementos qumicos con nmero atmico mayor a 4, de manera cualitativa y semicuantitativa. La sonda EDAX produce rayos X que inciden en la muestra, dando una idea de la composicin de la muestra analizada, proporciona entonces informacin de tipo morfolgico y de composicin qumica.

Figura 2. Se observan los diferentes detectores del microscopio referenciados.Recuperado de: http://iies.ucaldas.edu.co/sem/El principio de funcin se basa en que se formatea la muestra que queremos analizar con un haz de electrones que salen de un filamento de tungsteno, el cual se calienta a 2.000C, de donde salen los electrones que viajan por medio de un can; el can est compuesto por bobinas, que son lentes objetivas condensadoras. As, obtenemos la morfologa de la muestra analizada.Este instrumento posee otro aparato, el metalizador. Es utilizado para recubrir la muestra y hacer que esta sea ms conductora (pues a mayor conductividad mayor calidad de la imagen), una muestra biolgica por ejemplo. Esta cobertura puede hacerse con oro-paladio o grafito; se diferencian de acuerdo con el fin ltimo de su uso: Una cobertura con oro-paladio, gracias a que sus partculas son muy pequeas, nos brinda una menos calidad en la definicin de la imagen. Una cobertura con grafito, me brinda la posibilidad de determinar mejor la composicin qumica de la muestra.

ResultadosEsta prctica de laboratorio se enfoc netamente en lo terico, no se realiz ninguna actividad que incluyera procedimientos y su uso. Ms sin embargo se observaron algunos trabajos ya realizados con el microscopio y disponibles con fin de docencia como la comparacin de micro-algas entre imgenes de referencia bibliogrfica con las del microscopio, Igualmente se plante la posibilidad de su uso para futuras investigaciones que involucren un anlisis detallado de muestras.

Figura 4. Comparacin material bibliogrfico con el observado en el microscopio de microalgas

Figura 3. Microscopio ESEM- U Caldas

Figura 5. Metalizador

Anlisis de resultadosEl microscopio de Barrido electrnico se postula como un instrumento y una herramienta de gran ayuda en el avance cientfico, con gran atencin en el rea de la biologa. Por tal motivo resulta viable la su uso como herramienta para futuras investigaciones y proyectos como tesis de grado, tomando en cuenta la facilidad de acceso y la calidad del equipo.

Bibliografa:[1] Departamento de ciencias morfolgicas - Ctedra de Histologa. (2005). Histologa Medicina - U.L.A. Universidad de Los Andes. Facultad de Medicina. Venezuela. http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo5.htm [2] Instituto de investigaciones en estratigrafa (2013) Microscopa electrnica de barrido (SEM) Universidad de Caldas. Colombia. Recuperado de: http://iies.ucaldas.edu.co/sem/[3] Karp, G. (2009). Biologa celular y molecular, conceptos y experimentos. Quinta edicin. Mxico: Mc Graw-Hill[4] Lux A. (No registra). Manual de microscopa electrnica, Ultraestructura y Citologa Vegetal. Universidad Autnoma de Nuevo Len: Facultad de Ciencias Biolgicas. Mxico. San Nicols de los Garza, N.L.: UANL. Recuperado de: http://cdigital.dgb.uanl.mx/la/1020111630/1020111630.PDF[5] Raisman, J., Gonzalez, A. M. (1998-2013). Hipertextos del rea de la biologa. Universidad Nacional del Nordeste: Fac. Ciencias Agrarias, Corrientes. Repblica Argentina. http://www.biologia.edu.ar/microscopia/meb.htm[6] Terren, J. (1953). De la lupa al microscopio electrnico. Barcelona, Espaa: Salvat