cultivo por lote y alimentado

8/17/2019 Cultivo Por Lote y Alimentado

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALUnidad Profesional Interdisciplinaria De Ingeniería Campus

Guanajuato

LABORATORIO DE BIORREACTORES

5MB1

Práctica: 4

Cultivo por Lo te y Lote Al imentado

PROFESORES:

Rosa Isela Jiménez Castillo

Juan Carlos Rodríguez Sierra

Guillermo Garibay Benítez

Equipo 1 Sección 1

Integrantes:

Lozano Ramírez Yadira Elizabeth

Méndez Viramontes Claudia

Marmolejo Pérez Omar Marmolejo Pérez Viridiana

Morales Carmona Estefanía

Yáñez Retes Flor Angélica

Fecha:




Guanajuato

Resumen

Introducción

Baci l lus subt i l is

Bacillus subtilis es una bacteria gram positiva, estas bacterias producen endosporas

las cuales proporcionan mayor resistencia a factores ambientales como por ejemplo

la temperatura, esta bacteria puede sobrevivir en un límite de temperaturas de 55°C

a 70°C y puede soportar pH hasta de 2 a 3 (Lisboa, 2003).

B. subtilis es una de las 40 especies reconocidas del género Bacillus que tiene la

capacidad de moverse. Esta bacteria produce enzimas hidrofílicas extracelulares

que degradan polisacáridos, ácidos nucleicos y lípidos, los que utiliza como fuente

de energía. (Sierra, 2008).B subtilis presenta una mayor resistencia al final de la fase exponencial debido a la

formación de endosporas, y el grado de resistencia de éstas depende de las

condiciones ambientales en las que se encuentre (León, 2001).

Una de las sustancias producidas por las endosporas, es el ácido dipicolínico, el

cual se localiza en el núcleo de la endospora, además también de este compuesto

también son ricas en iones Ca+ las cuales forman un complejo el cual representa el

10% del peso seco de la endospora (León, 2001).

Cultivo por lote

Un cultivo por lote es un sistema de cultivo cerrado en el que existe una cantidad

inicial limitada de nutriente. El inoculo pasa por 4 diferentes fases, la de adaptación

o fase lag, una fase de crecimiento exponencial o fase log, otra en la que la

velocidad de muerte y la de crecimiento son iguales, fase estacionaria, y una fase

de muerte, en la que la velocidad de muerte es mucho mayor que la de crecimiento.

La fase exponencial puede describirse por la siguiente ecuación:

=




Guanajuato

Donde:

= ó =

Para determinar la concentración de biomasa en un intervalo específico de tiempo,

la ecuación anterior se puede integrar, de tal forma que:

=+

El incremento o decremento en la velocidad de crecimiento está dado por el

agotamiento de la concentración de sustrato, observándose en una gráfica que

relacione μ con la concentración de sustrato limitante residual, representado por la

siguiente ecuación (Monood):

= +

Donde:

= á

= 12

Una manera de determinar estos parámetros cinéticos mediante los datos

experimentales de un quimiostato es con la linealización de la ecuación de Monood:1 =

max + 1

Realizando un análisis similar al de biomasa, es posible expresar el cambio de la

concentración del producto microbiano, en función de la concentración de biomasa:

= y = +

Donde:

= í ó = í ó

Los patrones o modelos de flujo de sustrato en células que sintetizan productos

dependen de si la formación de producto se encuentra asociada o no al metabolismo

energético. En cultivos donde la síntesis del producto está asociado solo de forma

indirecta al metabolismo energético, la velocidad de consumo de sustrato es función

de 3 factores: la velocidad de crecimiento, la velocidad de formación de producto y

la velocidad de consumo de sustrato necesario para el crecimiento y el

mantenimiento.




Guanajuato

= − (

+ +)

Donde:

=

Cultivo por lote alimentado

La operación por lote alimentado se utiliza con el fin de controlar la concentración

de sustrato en el medio, ya sea para mantenerlo bajo si se desea una baja

concentración de biomasa o para mantenerlo alto ya que grandes cantidades de

sustrato pueden producir vías metabólicas alternas deseadas.En este tipo de operación se comienza con un volumen bajo de medio inoculado,

en el que el sustrato es alimentado y no existe corriente de producto. Por esta razón

el volumen dentro del tanque no es constante y es función del tiempo.

=

Entonces la masa de células en el reactor es igual V*(x) y la variación con respecto

al tiempo considerando una muerte celular despreciable, es igual a:

=+

Integrando y dividiendo entre el volumen, V, toda la expresión se obtiene:

= −

Donde:

= ó ()

La velocidad de consumo de sustrato en un cultivo por lote alimentado dependeademás de las variables ya mencionadas en el cultivo por lote, del factor de dilución:

= − − (

+ +)

Pirt (1979) ha expresado el cambio de la concentración de producto en un reactor

con volumen variable igual que para un reactor en cultivo continuo como se muestra

a continuación:

= −




Guanajuato

Entonces, la concentración de producto cambia de acuerdo a la relación entre la

velocidad de producción y la de dilución.

OBJETIVO GENERAL

OBJETIVO ESPECÍFICO




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MATERIAL Y EQUIPO

Material Equipo

Matraz Erlenmeyer de 250 mL (2)

Autoclave

Micropipeta de 1000 µL (2)

Biorreactor Tanque agitado

Puntas para micropipeta de 1000 µL (1 caja) EZ-Control

Probeta 1000 mL (1)

Potenciómetro

Tubos eppendorf (40)

Parrillas eléctricas

Micropipeta de 100 a 1000 µL (1)

Incubadora rotatoria de temperatura controlada

Frasco de taparrosca de 1 L (1)

Bombas peristáltica (0 a 2 L/h)

Manguera de silicón (varias)

Balanza analítica

Torundas de algodón-alcohol

Electrodos de pH, temperatura y oxígeno disuelto.

Celdas de 1 µL (18)

Espectrofotómetro




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Preparación de Medio inicial e inóculo 2L

Reactivo

Cantidad (g)

Extracto de Levadura 40.0096

Glucosa 10.0093

Sulfato de Magnesio 1.0025

Cloruro de Calcio 0.0208

*Se tomaron 200 ml de ésta solución como medio de inóculo de B. subtillis (2 μl) y se llevó a un pH

7.

Preparación de Medio para lote alimentado 2.85L

Reactivo Cantidad (g)

Extracto de Levadura 57

Sacarosa 14.5

Sulfato de Magnesio 1.425

Cloruro de Calcio 0.0285

*Se preparó por partes y se llevó a un pH de 7.




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Descripción Del Sistema




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Metodología

Preparación de medios de cultivo (Día 1)

Cultivo por Lote (Día 2)

Preparaciónde 1.8 L demedio de

cultivo

(glucosa)inicial y 0.2 Lpara inocular

Esterilizar los200 ml demedio en

autoclave (15min, 121°C y

15 psi)

Dejar enfriare inocular encampana con

2 µL deBacillusSubtillis

Dejar incubarel medioinoculado

por 10 haprox. A 37°Cy 200 rpm

Guardar los1.8 L demedio

glucosa en

refrigeraciónhasta el día

siguiente

Preparar 2.85L de medio

de cultivo(sacarosa)

Dejar enrefrigeració

hasta el díasiguiente

Sellar Biorreactor conmangueras e introducir lossensores de pH y oxígenodejando un escape para la

presión.

Esterilizar Biorreactor conmedio inicial en autoclave(15 min, 121°C y 15 libras)

Dejar enfriar en CampanaVaciar el medio inoculaden Campana cuidando la

condiciones estériles

Conectar Biorreactor a EZ-Control

Monitorear condicionesde medio y establecer una

agitación de 100 rpm

Tomar muestra inicialpara medir densidad

celular en

espectrofotómetro a 600nm

Realizar DNS y Bradfordleyendo

espectrofotómetro a 540y 595 nm respectivament

Tomar muestra cada horay realizar Bradford, DNS ydensidad celular a cada

muestra

Realizar curva deproteínas, azúcares

reductores y densidadcelular




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Resultados

Se realizaron toma de muestras cada hora, y a cada una de las muestras se le hicieron mediciones debiomas, azucares reductores y proteína total, los datos obtenidos se muestran en la tabla 1.

El comportamiento de los datos experimentales con respecto al tiempo, y modo de operación se muestran

en la figura 1.

Figura 1.- Cambio de concentración de biomas, azucares reductores y proteína total con el tiempo

Azucares

reductores

A= 540nm

Proteina

A= 595nm

Biomasa

A= 660 nm

Azucares

reductores

(μg/mL)

Proteina

(μg/mL)

Biomasa

(Células/mL)

1

2 0.157 0.197 0.047 24.40 107.89 9907

3 0.208 0.16 0.073 24.40 87.33 10928

4 0.268 0.213 0.15 8.71 116.78 13951

5 0.742 0.267 0.203 6.68 146.78 16031

6 0.138 0.266 0.408 2.96 146.22 24080

7 0.126 0.232 0.267 2.49 127.33 18544

8 - 0.053 0.127 0.215 2.43 69.00 16503

9 3 0.208 0.205 2.09 114.00 16110

10 0.201 0.213 0.217 1.94 116.78 16581

11 0.047 0.243 0.012 1.93 133.44 8533

12 3 0.312 0.028 1.85 171.78 9161

13 0.137 0.46 0.159 1.23 254.00 14304

14 1 0.733 0.523 0.44 405.67 28595

Cultivo por Lote

Alimentado

Tabla 1.- Datos experimentales de absorbancia y concentración para cultivo por lote y lote alimentado de B.

Absorbancia Concentracion

Tiempo

(h)Configuración

Cultivo por Lote




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Por definición la constante Ks es numéricamente igual a la concentración de

sustrato necesaria para llegar a ½ de μmax, entonces se graficaron las μ con

respecto a la concentración de sustrato consumido y se ajustó un modelo para

determinarla.

Sustituyendo el valor de la μmax/2 en el modelo y despejando x se obtuvo Ks.

= 6.026 /

Figura 2.- Determinación gráfica de parámetros cinéticos A) determinación de la velocidad especifica de crecimiento μ. B) Determinación de la

velocidad máxima de crecimiento μmax.

y = 0.0638x

R² = 0.9379

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 2 4 6 8

L n ( X / X o )

Tiempo (h)

Determinación de μ0.0746

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0 2 4 6 8

μ

( h -

1 )

Tiempo (h)

μ max (h-1)

Figura 3.- Obtención de la constante de sustrato Ks.




Guanajuato

Mediante los parámetros cinéticos obtenidos con los datos experimentales, serealizó una simulación del lote alimentado y se calculó el % de error absoluto para

cada una de las mediciones tal como se muestra en la tabla siguiente:

Posteriormente se graficaron estos datos y se observó el comportamiento de la

concentración de los compuestos

2 2.089 2.009 4.0 114.00 114 0.0 16109.9 16109.90 0.0

2.194 1.940 1.666 16.4 116.78 138.44 15.6 16581.02 19907.82 16.7

2.372 1.932 1.356 42.5 133.44 165.48 19.4 8532.72 24144.87 64.72.538 1.845 1.122 64.5 171.78 195.33 12.1 9160.88 28848.10 68.2

2.693 1.225 0.939 30.5 254.00 228.22 11.3 14303.94 34044.90 58.0

2.84 0.440 0.795 44.6 405.67 304.08 33.4 28594.58 39763.00 28.1

Cultivo por

Lote

Alimentado

Simulación %Error

Configura

ción

Factor de

dilución D

(h-1) Simulación %Error Simulación %Erro

Azucares reductores (μg/mL) Proteina (μg/mL) Biomasa (Células/mL)

ExperimentoExperimento Experimento

Tabla 2.- Datos experimentales y simulados de concentración de biomasa, proteína y azucares reductores durante la alimentación.

0.00

50.00

100.00

150.00

200.00

250.00

300.00

350.00

400.00

450.00

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

7 8 9 10 11 12 13 14

C o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a t o t a l

μ g / m L

C

o n c e n t r a c i ó n d e a u c a r e s r e d u c t o r e s

μ g / m L

Tiempo (h)

Datos experimentales vs Simulación

Lote alimentado

Azucares reductores Azucares reductores simulación Proteína Proteina simulacion

Figura 4.- Simulación de la concentración de proteína y de azucares reductores durante el tiempo de alimentación.




Guanajuato

Discusión

Conclusión

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

7 8 9 10 11 12 13 14

C o n c e n t r a c i ó n d e b i o m a s a

C é l u l a s / m L

Tiempo (h)

Datos experimentales y simulación

Lote alimentado

Biomasa Biomasa (simulación)

Figura 5.- Simulación de la concentración de la concentración de biomasa durante el tiempo de alimentación.




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CUESTIONARIO.

1. Investigue y explique algunas alternativas para controlar el pH, que no

sean las mencionadas durante la práctica (p.e. sales amortiguadoras,

producción de metabolitos secundarios, etc.).

2. Realiza un diagrama de flujo para obtener ron con el uso de un

biorreactor empleando un sustrato seleccionado por usted.

3. Menciona 5 modificaciones que le realizarías al biorreactor para mejorar

el proceso.

Anexos




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Referencia

cultivo por lote y alimentado

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