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Universidad Nacional Mayor de San MarcosUniversidad del Perú (DECANA DE AMÉRICA)

Facultad de Farmacia y BioquímicaEscuela Académico Profesional de Farmacia y Bioquímica

Cátedra de Bromatalogía

VITAMINAS HIDROSOLUBLES Y

LIPOSOLUBLES

ESTUDIANTE: TACUNAN RIVEROS ERIKA LUCIA

CURSO: BROMATOLOGÍA

GRUPO: LUNES 10am – 2pm

CICLO: 2016-I

2016

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CUESTIONARIO

1. DIBUJO ESTRUCTURAL DEL HPLC

Fig.1 Esquema estructural de HPLC.

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Fig.2 Esquema estructural de HPLC.Componentes principales del HPLC

Sistema de suministro y almacenamiento de fase móvil: Garantiza la disponibilidad de fase móvil al sistema en condiciones apropiadas, de modo que se evite la contaminación y la degradación de la misma.

Sistema de bombeo: Todos los sistemas HPLC incorporan un sistema de bombeo, con las siguientes características:

Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta 400 atm. Mantener un flujo libre de pulsos Proporcionar caudales constantes y reproducibles Permitir cambios de disolvente de modo simple y rápido Ser químicamente inerte y resistente a la corrosión

Sistema de inyección de muestra: La inyección de un volumen de muestra preciso, y muy pequeño (5-500 μL), debe hacerse a la entrada de la columna en un breve periodo de tiempo para perturbar lo menos posible el régimen de circulación de la fase móvil y evitar el ensanchamiento de banda.

Columna cromatográfica: Son columnas rectas, fabricadas habitualmente de acero, aunque también se emplean columnas construidas de vidrio y materiales poliméricos. La mayoría de ellas tienen una longitud entre 5 y 30 cm, y su diámetro interno varía entre 3 y 10 mm.

Detector: A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores universales tan fiables como lo son el detector FID o el TCD. Sus características (sensibilidad, estabilidad, reproducibilidad, respuesta lineal, tiempo de respuesta corto, fácil manejo) son similares a éstos, aunque no es necesario que sean sensibles en un intervalo de temperaturas tan elevado y

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deben tener un volumen interno mínimo para reducir el ensanchamiento de banda extracolumna.

2. MÉTODOS PARA DETERMINAR VITAMINAS HIDROSOLUBLES Y VITAMINAS LIPOSOLUBLES.

VITAMINAS LIPOSOLUBLES MÉTODO DE DETERMINACIÓN VITAMINA A

Se determinaba la vitamina A mediante una reacción colorimétrica de retinol con tricloruro de antimonio (reacción de Carr-Price). El retinol obtenido después

de saponificar y extraer los componentes no saponificables tenía que ser purificado utilizando cromatografía de columna abierta con el fin de

eliminar los componentes interferentes.

VITAMINA E El método utilizado para la determinación de la vitamina E en los alimentos es una reacción de cloruro

férrico que se reducira a iones ferrosos, los que forman un complejo de color rojo con ajaMipiridina, o

batofenantrolina (4,7-difenil-1,10-fenantrolina).

VITAMINA D Antiguamente, la única manera relevante de determinar la actividad de la vitamina D era por medio de pruebas biológicas en las cuales se administraban extractos liposolubles a animales. Alrededor de 1970, se desarrollaron los procedimientos de cromatografía de gas que incluían una saponificación, extracción del material no saponificable, remoción de las interferencias mediante precipitación seguida por una cromatografía en alúmina, Sephadex y Florisil, luego la conversión de la vitamina D a la isovitamina previa a la formación del derivado trimetilsililado y cromatografía de gas. La HPLC ofrece actualmente el método de análisis más adecuado para la determinación de vitamina D en un amplio rango de alimentos incluso a bajos niveles de concentraciones naturales.

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VITAMINA K Los métodos desarrollados en años recientes para la determinación de la vitamina K1 se basan principalmente en procedimientos HPLC. Los problemas relacionados a la cuantificación son bajas concentraciones e interferencias con las matrices de los alimentos. Por lo tanto, no es sorprendente que el método más reciente utilice el mismo enfoque: prepurificación con HPLC semipreparativo seguida por HPLC analítico para la cuantificación.

VITAMINAS HIDROSOLUBLES MÉTODO DE DETERMINACIÓNTiamina. Vitamina B1 El método más ampliamente utilizado para la

determinación de la vitamina B1, incluye una hidrólisis ácida seguida por una defosforilación enzimática de los èsteres y la cuantificación de la tiamina liberada. La medición de la vitamina B en el extracto final se realiza mediante fiuorometría después oxidar a tiocromo que es un compuesto fluorescente. Más recientemente, se han publicado procedimientos por HPLC que se utilizan para cuantifícar, el propio tiocromo o a través de una derivatización postcolumna.

Riboflavina. Vitamina B2 Debido a sus propiedades físico-químicas, la riboflavina puede determinarse fluorométricamente. Se han utilizado diferentes métodos en el pasado que incluyen la irradiación de un extracto de muestra purificada con luz lo que lleva a la formación del llamado lumicromo. Este es un compuesto que tiene fuertes propiedades fluorescentes y puede cuantificarse fácilmente. Sin embargo, el procedimiento de trabajo requiere tiempo y trabajo. Por lo tanto, los ensayos microbiológicos son utilizados rutinariamente además de los métodos HPLC lo que permite una preparación más simple de la muestra que el método del lumicromo.

Piridoxina. Vitamina B6Debido a la múltiple presencia de la vitamina B6 en los alimentos es imposible determinar su actividad midiendo un sólo componente. Por lo tanto, en este momento se recomienda un método microbiológico para la determinación de la actividad de la vitamina B6.

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Vitamina B12

El nivel presente en los alimentos es muy bajo y el método microbiológico es la única manera de estimar la vitamina B12 en forma satisfactoria.

Vitamina C ácido L-ascórbico Las soluciones de extracción más comúnmente utilizadas son las de los ácidos metafosfórico, oxálico y acético y mezclas de ellos. Se puede agregar EDTA en ciertos procedimientos para complejar los iones de los metales así como también agentes reductores como ditiotreitol (DTT)+ Todos los métodos que utilizan las propiedades reductoras de la molécula de ácido ascórbico pertenecen a la primera categoría. Se pueden utilizar muchos reactivos y de todos ellos, el 2,6-diclorofenolindofenol (DCFI) es ciertamente el más utilizado debido a que su uso es simple y los resultados son en general confiables.

3. DATOS DE SIERRA EXPORTADORA RESPECTO A LOS PRODUCTOS QUE TIENEN VITAMINAS EN MACRO.

Los productos andinos cobran protagonismo en el Perú y el mundo. Debido a ello, Sierra Exportadora, programa de la Presidencia del Consejo de Ministros (PCM), viene brindando apoyo a los productores andinos para que estos alimentos ingresen a nuevos mercados y sean mejor pagados.

Dentro de este grupo se encuentran: frambuesas, aguaymantos, fresas, quesos madurados, trucha andina, quinua. ( con gran contenido vitamínico)

PAPA (solanum spp.)Es una de las contribuciones más importantes que han ofrecido los Andes a la humanidad. Sus primeros vestigios datan de hace más de 8000 años. De las 5000 variedades existentes de papa, el Perú posee más de 3000. Este alimento, tan apreciado en el mundo por su sabor y versatilidad, goza de cantidades de potasio, además de fósforo, calcio, sodio, hierro, magnesio, sales minerales y vitamina B.

QUINUA (chenopodium quinoa)Para los Incas, la quinua era considerada un alimento sagrado y era empleado además para usos medicinales. Este cereal andino posee elevados valores nutricionales y es el único alimento vegetal que contiene todos los aminoácidos esenciales, oligoelementos y vitaminas.

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CACAO (theobroma cacao)Textualmente, su nombre científico significa «comida de los dioses». Originario de la Amazonía, el cacao es un alimento inigualable. Es el rey del magnesio y, como tal, ayuda al funcionamiento de las neuronas y la salud del corazón. Posee vitaminas y proteínas y tiene un vasto poder antioxidante. Sus alcaloides estimulan el sistema nervioso, son antidepresivos, mejoran la circulación del corazón y hacen del cacao uno de los mejores alimentos para las enfermedades coronarias.

ALCACHOFA (cynara scolymus)Procedente del Mediterráneo esta hortaliza crece en climas templados de la Sierra y la Costa peruana. Posee grandes propiedades curativas para tratar la anemia, la diabetes, regenerar el hígado, favorecer la digestión y regular el sistema cardiovascular, entre otras. Además es muy rica en vitaminas y minerales, como hierro, fósforo, manganeso,magnesio, calcio, potasio, sodio y cobre.

HABA VERDE (vicia faba)Originaria de Oriente Próximo, el haba verde se cultiva hoy en las zonas frías y templadas de la sierra peruana. Sus semillas son ricas en proteínas, vitaminas A, B, C, y E, y en minerales como potasio,fósforo, sodio, calcio, hierro, magnesio y zinc. Tiene componentesantioxidantes, algunos de los cuales ayudan a mejorar los síntomas del Alzheimer.

ARÁNDANO (Vaccinium myrtillus)Es un fruto del bosque que aprecia las zonas altas de montañas. Sus hojas son ricas en hierro y manganesio, así como en ácidos orgánicos. Los infinitos beneficios del fruto se concentran en su poder antioxidante y antiadherente, que ayuda a la zona gastrointestinal.Rico en minerales, vitaminas y fibras, el arándano es también un gran potenciador del sistema inmunológico y reduce el riesgo de enfermedades degenerativas, como el cáncer. Contribuye a la fertilidad, favorece la irrigación sanguínea y la visión, y disminuye de colesterol.

En Apurímac, Sierra Exportadora promueve el desarrollo del anís procesado, la palta Hass, la tara procesada, las fibras de camélidos sudamericanos procesadas y sus confecciones, la quinua procesada y los quesos madurados.En Ayacucho se está cultivando la palta Hass, la quinua, el haba verde y la tara en tres corredores económicos.En Huancavelica se está trabajando también la palta Hass y la quinua.

4. ADEMAS DEL HPLC, QUÉ OTROS METODOS EXISTEN PARA LA CUANTIFICACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES Y LIPOSOLUBLES.

Análisis sensorial:

La evaluación se realiza en el laboratorio de análisis sensorial. Éstas se realizan sobre los atributos como: color, sabor ácido, sabor dulce, sensación grasa, dureza, jugosidad y aceptación global.

Esto se realiza mediante: Estándares de referencia

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- La vitamina A acetato es un polvo de color amarillo a parduzco, de fluidez libre y alta disponibilidad biológica. Generalmente viene diluido en una matriz de gelatina o carbohidrato y está estabilizado con antioxidantes (etoxiquina).

- El retinol (la forma alcohólica) se presenta como un aceite viscoso, levemente coloreado, muy termolábil y sensible a la oxidación por aire.

- El β-caroteno es un polvo cristalino de color naranja y más estable al calor y la oxidación que el retinol.

- Las formas de vitamina A son insolubles en agua y solubles en lípidos y solventes orgánicos.

- La vitamina D3 es un compuesto cristalino, de color blanco, prácticamente inodoro, insoluble en agua y soluble en grasas y solventes orgánicos.

- El clorhidrato de tiamina es un compuesto cristalizado, incoloro e hidrosoluble. Tiene un olor característico similar al de las levaduras.

Método Físico-Químico

Van bien para la mayoría de las vitaminas, aunque en la mayor parte de ellos nos encontramos con tres problemas fundamentales.1. Son más inestables. Las vitaminas se pueden destruir por calor, ácidos, bases, luz. Por esto, durante todo el proceso (toma de muestras, almacenamiento, procesado y análisis) deben evitarse los factores que provoquen la destrucción de la vitamina.2. Baja concentración de las vitaminas en los alimentos.3. Existencia de diversos vitámeros, que son sustancias con actividad vitamínica y composición diferente.

Desde el punto de vista analítico hay dos tipos de vitaminas: las liposolubles o solubles en disolventes orgánicos y las hidrosolubles o solubles en agua.Esta clasificación es útil porque da idea de los procesos extractivos que hayque realizar. Normalmente, las vitaminas se analizan por técnicas de HPLC.

Dentro de este método se encuentra:

Método titulación Yodométrico: La titulación volumétrica es un método de análisis cuantitativo en el que se mide el volumen de una disolución de concentración conocida (disolución patrón o titulante patrón) necesario para reaccionar completamente con un compuesto en disolución de concentración desconocida. Para determinar cuándo se ha llegado al final de la titulación, en la disolución problema se agrega un indicador que sufre un cambio físico apreciable, como por ejemplo cambio de color, en el punto final de la reacción.Para que una sustancia se oxide es necesario que otra se reduzca y al revés (Reacción de oxidación-reducción; REDOX). Las titulaciones en las que interviene el yodo como agente oxidante se denominan yodimetrías.

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Método colorimétrico: para el caso de la vitamina A se utiliza mediante una reacción de retinol con tricloruro de antimonio (reacción de Carr-Price). El retinol obtenido después de saponificar y extraer los componentes no saponificables tenía que ser purificado utilizando cromatografía de columna abierta con el fin de eliminar los componentes interferentes.

Método espectrofotométrico: en el caso de la vitamina C se basa en la reducción del colorante 2-6 diclorofenolindofenol, por el efecto del ácido ascórbico en solución. El contenido de ácido ascórbico es DP a la capacidad de un extracto de muestra para reducir una solución estándar de colorante determinada espectrofotométricamente.

Método fluorométrico: Se basa en la extracción de la tiamina por un tratamiento enzimático, hidrólisis ácida, seguido de purificación, oxidación a tiocromo (compuesto fluorescente cuya fluorescencia es directamente proporcional a la concentración de tiamina presente en la muestra) y posterior identificación y cuantificación por cromatografía liquida isocrática en fase inversa con detector de fluorescencia, ajustada a una longitud de onda de excitación de 365 nm y de emisión de 436 nm.

Método cromatográfico

Aunque se han utilizado con cierta frecuencia los métodos colorimétricos, espectrofotométricos y fluorométricos, es indudable que desde la aparición de la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) se hayan enfocado todos los esfuerzos para establecer métodos analíticos más sensibles, específicos y rápidos. La ventaja de la cromatografía de líquidos de alta resolución se manifiesta en que es posible separar los derivados de cada vitamina de las sustancias contaminantes. Tienen aplicación tanto la cromatografía de fase reversa como la de fase normal.

Ensayos Microbiológicos

Se basan en cultivos de cepas de microorganismos cuyo desarrollo depende específicamente de una determinada vitamina. Se usan básicamente en vitaminas hidrosolubles. El medio de cultivo donde se realiza la siembra carece de la vitamina en cuestión y ésta es aportada por extractos del alimento donde queremos evaluar la vitamina. Paralelamente se hace un control donde se sembró el microorganismo sin vitaminas y también se siembra el microorganismo en diversos medios con contenido vitamínico diverso. Finalmente se compara el crecimiento.

Métodos Biológicos

Se observan los efectos curativos o fisiológicos de las vitaminas sobre animales de experimentación. Son los que menos se utilizan porque la experimentación animal

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es muy variable, además son ensayos muy largos e influye el factor ético. Además, los microbiológicos son mejores.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. González, H. Arques, J., Font, G. & Mañes, J. (1987). Determinación de vitaminas del grupo B mediante cromatografía líquida de alta resolución. An. Real Acad. Farm. (53), 602-608.

2. Quattrocchi, O.A., Abelaira, S. & Laba, F. (1992). Introducción a la HPLC. Merck Argentina (Buenos Aires), 40-63.

3. Bognar, A. 1981. Determination of thiamine and riboflavin in food by using HPLC. Deutsche Lebensm. (Rundschau 77: 431-436).

4. Deustua, María.Inversión privada en la sierra .Asociación de Gremios Productores Agrarios del Perú. AGAP. Inversión privada de la sierra. 2015