cromatografia[2]

8/7/2019 cromatografia[2]

http://slidepdf.com/reader/full/cromatografia2 1/22

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA

OBJETIVOS:

Emplearemos la cromatografía, como un método para separar los compuestos

presentes en una mezcla.

Utilizaremos a la cromatografía, para la purificación y posible identificación de los

compuestos orgánicos.

Aprenderemos una de las 2 distintas técnicas de cromatografía, así como saber

identificar en qué momento es ideal utilizar cada una.

OBSERVACIONES:

Se trabajo con cuatro distintos compuestos por el método de capa fina, los primeros

tres no se realizaron adecuadamente, dichos compuestos fueron, tinta de gel verde y una

mezcla de bugambilias y hojas de dicha planta, el último de estos compuestos fue tinta rosa

fluorescente, el cual fue favorable. Además que se realizo una segunda seria de capafina pero

ahora con un saborizante para preparar agua con un color morado, el cual también resulto

satisfactorio.

En el método de columna no tuvimos el tiempo suficiente para terminarla y por lo

tanto no obtuvimos nuestras fases pues no alcanzaron a bajar. En columna trabajamos con

alumina, mas no con gel de sílice como otros compañeros.

RESULTADOS:

En el método de cromatografía por capa fina probamos con una muestra de tinta de

pluma color rosa, con la cual nuestra muestra corrió pero de una forma un poco lenta pero con

un Rf de 0.7, cuyo eluyente fue 70% acetato de etilo-30% etanol.

También se utilizó una muestra de saborizante de uva la cual corrió y presento 3 colores.

El eluyente con que corrió exitosamente nuestra cromatografía fue con una mezcla 50%

etanol, 50% acetato de etilo.

Cuando se tuvo la cromatografía en capa fina, posteriormente se desarrollo por

cromatografía en columna, montando esta con alumina. Le agregamos esta vez el eluyente,con las combinaciones siguientes:

Acetato de etilo Etanol

50% 50%

40% 60%



30 % 70%

20% 80%

10% 90%

0% 100%

La primera solución ayudo a bajar un poco los colores por separado pero no fue suficiente, así

que se utilizó agua, dando como resultado los siguientes eluyentes:

Etanol Agua

90% 10%

80% 20%

70% 30%

60% 40%

Al término del último eluyente, comenzó a bajar los colores por separado, pero debido a la

falta de tiempo no alcanzamos a terminar nuestra cromatografia.

ANALISIS DE RESULTADOS:

Se comprobó que por medio de las mezclas de disolventes (eluyentes), pudo ir separando

a una distancia distinta cada componente de nuestro compuesto, dando a saber que en verdad

se utiliza la polaridad para separar dichos componentes, ya que vamos jugando con la

polaridad ya sea aumentándola o disminuyendo, pero simpre a lo mismo tratar de separar o

mover un componente con respecto de otro, sin llegar a mover todos los componentes.

CONCLUSIONES:

Obtuvimos la separación de fases por medio del método de capa fina y observamos que

tuvimos 3 compuestos distintos en nuestra mezcla, los cuales son solubles en agua.

Estos nos presentan 3 colores los cuales fueron claramente observados en nuestra placa.

Y en el caso de la columna la fase que bajaba primero era la de color rosa



Cromatografía de gases

La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra sevolatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se

produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de

cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su únicafunción es la de transportar el analito a través de la columna.

Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC) yla cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza másampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). En laGSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se producemediante el proceso de adsorción. Precisamente este proceso de adsorción, que no eslineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación limitada,ya que la retención del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picosde elución con colas. Su única aplicación es la separación de especies gaseosas de bajo

peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido

inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte.

La GC se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases. Éste consta de diversoscomponentes como el gas portador, el sistema de inyección de muestra, la columna(generalmente dentro de un horno), y el detector.

Diagrama de un cromatógrafo de gases

Gas portador

El gas portador cumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de lamuestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones:



-Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la faseestacionaria)-Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa-Fácilmente disponible y puro-Económico-Adecuado al detector a utilizar

El gas portador debe ser un gas inerte, para prevenir su reacción con el analito o lacolumna. Generalmente se emplean gases como el helio, argón, nitrógeno, hidrógeno odióxido de carbono, y la elección de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado. El almacenaje del gas puede ser en balas normales o empleando ungenerador, especialmente en el caso del nitrógeno y del hidrógeno. Luego tenemos unsistema de manómetros y reguladores de flujo para garantizar un flujo estable y unsistema de deshidratación del gas, como puede ser un tamiz molecular.

Generalmente la regulación de la presión se hace a dos niveles: un primer manómetro sesitúa a la salida de la bala o generador del gas y el otro a la entrada del cromatógrafo,donde se regula el flujo. Las presiones de entrada varían entre 10 y 25 psi, lo que da

lugar a caudales de 25 a 150 mL/min en columnas de relleno y de 1 a 25 mL/min encolumnas capilares. Para comprobar el caudal se puede utilizar un rotámetro o un simplemedidor de pompas de jabón, el cual da una medida muy exacta del caudal volumétricoque entra a la columna.

La pureza de los gases es sumamente importante, se requieren niveles 4.5 o mayores esde cir 99.995 % de pureza. Sin embargo, debido al cuidado que se debe tener con la faseactiva de la columna, se hace completamente necesario la instalación de trampas a laentrada del Gas carrier, estas trampas obviamente tienen una capacidad limitada, peroson importantísimas al momento de usar el Cromatografo. Estas trampas evitan elingreso de Hidrocarburos, agua, CO entre otros.

Sistema de inyección de muestra

La inyección de muestra es un apartado crítico, ya que se debe inyectar una cantidadadecuada, y debe introducirse de tal forma (como un "tapón de vapor") que sea rápida

para evitar el ensanchamiento de las bandas de salida; este efecto se da con cantidadeselevadas de analito. El método más utilizado emplea una microjeringa (de capacidadesde varios microlitros) para introducir el analito en una cámara de vaporizacióninstantánea. Esta cámara está a 50 °C por encima del punto de ebullición delcomponente menos volátil, y está sellada por una junta de goma de silicona septa o

septum.



Inyect de muest para un GC

Si es necesar ia una reproduci ilidad del tamaño de muestra inyectado se puede usar una

válvula de seis vías o válvula de inyecci n, donde la cantidad a inyectar es constante y

determinada por el tamaño del bucle de dicha válvula.

Un muestreador automático para emplear la t cnica de Espacio de Cabeza o Head Space

para GC (accesor io).

Si la columna empleada es rellena, el volumen a inyectar será de unos 20L, y en el caso de las columnas capilares dicha cantidad es menor, de 1L, y dependiendo del ti po

de columna capilar (ya que existen columnas con distinto diámetro interno) es que si seutiliza todo el volumen de muestra inyectado. Para obtener menor cantidad de volumen,



se utiliza un divisor de flujo (la inyección se conoce como modo "Split") a la entrada dela columna que desecha parte del analito introducido. Si se utiliza todo el volumen demuestra la inyección es de tipo "Splitless". El modo Splitless, se empleó más paradeterminar pequeñas cantidades o trazas (determinaciones ambientales).

Si se inyecta 1 microlitro de solvente, por ejemplo agua al pasar a la fase vapor su

volumen se multiplicará por mil. Es decir, un microlitro de agua pasaría a ser 1 mL deagua en gas, como el volumen del puerto de inyección es limitado, se emplean split

pulsado u otras configuraciones para garantizar el ingreso adecuado de las muestras.

En caso de muestras sólidas, simplemente se introducen en forma de disolución, ya queen la cámara de vaporización instantánea el disolvente se pierde en la corriente de purgay no interfiere en la elución.

Según las curvas de Van Demter (HEPT vs. Velocidad Lineal), el mejor gas a usar en lacolumna cromatográfica como portador de los analitos es el hidrógeno, sin embargodada su peligrosidad, es más usado como gas de encendido en el detector FID, junto conel aire. Luego vienen, respectivamente, helio y nitrógeno. El gas hidrógeno es el mejor carrier , pero los flujos que manejan los cromatógrafos no son peligrosos, además a lasalida de ellos existen restrictores de llama que evitan la propagación de un posibleincendio. Por eso siempre se recomienda el uso de hidrógeno, primero por su bajo

precio respecto a los otros gases y por la resolución de los picos que se muestran en loscromatogramos. Los riesgos de peligrosidad son mínimos si se CONOCE que larelación para la ignición entre aire e hidrógeno es 10 a uno (por cada 10 mL de H2, 1 deAire), y se tiene que estar en presencia de una chispa o zona de calentamiento alta.

Columnas y sistemas de control de temperatura

En GC se emplean dos tipos de columnas: las empaquet ada s o d e r elleno y las tubul ar es

abier t a s o ca pil ar es. Estas últimas son más comunes en la actualidad (2005) debido a sumayor rapidez y eficiencia. La longitud de estas columnas es variable, de 2 a 60 metros,y están construidas en acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón. Debido a sulongitud y a la necesidad de ser introducidas en un horno, las columnas suelenenrollarse en una forma helicolidal con diámetros de 10 a 30 cm, dependiendo deltamaño del horno.

La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado deseparación de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisión dedécimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de ebullición del analito oanalitos, como también la máxima temperatura de funcionamiento de la columna (faseestacionaria), y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente superior a él. Para

estos valores, el tiempo de elución va a oscilar entre 2 y 30-40 minutos. Si tenemosvarios componentes con diferentes puntos de ebullición, se ajusta la llamada rampa de

temperatura con lo cual ésta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. Enmuchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o nolos diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la elución yaque aunque a mayor temperatura la elución es más rápida, se corre el riesgo dedescomponer el analito.



Detectores

El detector es la par te del cromat rafo que se encarga de determinar cuándo ha salido

el analito por el f inal de la columna. Las caracter ísticas de un detector ideal son:

y Sensibilidad: Es necesar io que pueda determinar con precisi n cuándo saleanalito y cuando sale sólo el gas por tador. Tienen sensi bilidades entre 10-8 y 10-

15g/s de analito.

y R espuesta lineal al analito con un rango de var ios órdenes de magnitud.

y Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal de salida.

y Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por e jemplo desde temperatura

ambiente hasta unos 350-400 °C, temperaturas tí picas traba jo.

y Estabilidad reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales de analito debe

dar salidas de señal iguales.

y Alta fiabilidad mane jo sencillo, o a prueba de operadores inexper tos.y R espuesta seme jante para todos los analitos, o

y R espuesta selectiva altamente predeciblepara un reducido número de

analitos.

Algunos ti pos de detectores:

y Detector de ionización de llama (FID, Flame Ionization Detector).

y Detector de conductividad t rmica (TCD, Thermical Conductivity Detector).y Detector termoiónico (TID, ThermoIonic Detector).

y Detector de captura de electrones (ECD, Electrón-Capture Detector).y Detector de emisión atómica (AED, Atomic Emission Detector).

Vista de un detector GC del ti po FID (desmontado).

Otros detectores minor itar ios son el det ect r f t ¡ étr ico de lla ¡ a (PFD), empleado en

compuestos como pesticidas e hidrocarburos que contenganfósforo o azufre. En estedetector se hace pasar el gas eluido por una llama hidrógeno/oxígeno donde par te del

fósforo se convier te en una especie HPO, la cual emite a = 510 y 526nm, ysimultáneamente el azufre se convier te en S2, con emisión a = 394 nm. Dicha

radiación emitida se detecta con un fotómetro adecuado. Se han podido detectar otros

elementos, como algunos halógenos, nitrógeno, estaño, germanio y otros.

En el det ect or de f ot oionización (PID), el gas eluido al f inal de la columna se somete a

una radiación ultravioleta con energías entre 8,3 y 11,7 eV, correspondiente a una =

106-149 nm. Mediante la aplicación de un potencial a la celda de ionización se genera

una corr iente de iones, la cual es amplif icada y registrada.



Columnas y tipos de fases estacionarias

y Columnas de relleno

Las columnas de relleno o empacadas consisten en unos tubos de vidrio, metal (inerte aser posible como el acero inoxidable, Niquel, Cobre o Aluminio) o teflón, de longitudde 2 a 3 metros y un diámetro interno de unos pocos milímetros, típicamente de 2 a 4.El interior se rellena con un material sólido, finamente dividido para tener una máximasuperficie de interacción y recubierto con una capa de espesores entre 50 nm y 1 m.Para que puedan introducirse en el horno, se enrollan convenientemente.

El material de relleno ideal consiste en pequeñas partículas, esféricas y uniformes, conuna buena resistencia mecánica, para tener una máxima superficie donde interaccionar la fase estacionaria y el analito. La superficie específica mínima ha de ser de 1 m²/g.Como todos los componentes de columnas para GC, debe ser inerte a altas temperaturas(~400 °C) y humectarse uniformemente con la fase líquida estacionaria durante el

proceso de fabricación. El material preferido actualmente (2005) es la tierra de

diatomeas natural, debido a su tamaño de poro natural. Estas especies, ya extinguidas,utilizaban un sistema de difusión molecular para tomar nutrientes del medio y expulsar sus residuos. Por tanto, debido a que el sistema de absorción superficial del analito y lafase estacionaria es parecido, son materiales especialmente útiles.

El tamaño es crítico a la hora de darse el proceso de interacción del analito, y a menorestamaños la eficacia de la columna es mejor. Pero existe el problema de la presiónnecesaria para hacer circular un caudal estable de gas portador por la columna, ya quedicha presión es inversamente proporcional al cuadrado del diámetro de dichas

partículas. Así, el tamaño mínimo para usar presiones máximas de 50 psi es de 250 a149 m.

y Columnas capilares

Las columnas capilares son de dos tipos básicos: las de pared recubierta (WCOT) y lasde soporte recubierto (SCOT). Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la

pared interna se ha recubierto con una finísima capa de fase estacionaria. Las columnasSCOT tienen en su parte interna una fina capa de material absorbente como el empleadoen las columnas de relleno (tierra de diatomeas) donde se ha adherido la faseestacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad decarga de esta última, ya que en su fabricación se emplean mayores cantidades de faseestacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en primer lugar están las WCOT, luego las SCOT y por último las columnas de relleno.

Las columnas WCOT se fabrican a partir de sílice fundida, conocidas como columna stubul ar es abier t a s d e síl ice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir desílice especialmente pura, sin apenas contenido de óxidos metálicos. Debido a lafragilidad inherente a este material, en el mismo proceso de obtención del tubo serecubre con una capa de poliimida, de esta forma la columna puede enrollarse con undiámetro de unos pocos centímetros. Estas columnas, con propiedades como bajareactividad, resistencia física y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clásicas.



Las columnas FSOT tienen diámetros internos variables, entre 250 y 320 m (paracolumnas normales) y 150-200 m para columnas de alta resolución. Estas últimasrequieren menor cantidad de analito y un detector más sensible, al eluir menor cantidadde gas. Existen asimismo columnas macr oca pil ar es con diámetros de hasta 530 m, queadmiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores

prestaciones.

En estas columnas existe un problema debido a la absorción del analito sobre lasuperficie de la sílice fundida, adsorción debida a la presencia de grupos silanol (Si-OH), los cuales interaccionan fuertemente con moléculas polares orgánicas. Esteinconveniente se suele solventar inactivando la superficie por sililación condimetilclorosilano (DMCS). La absorción debida a los óxidos metálicos se ve paliada engran parte por la elevada pureza de la sílice empleada.

y La fase estacionaria

Las propiedades necesarias para una fase estacionaria líquida inmovilizada son:

1. Características de reparto (factor de capacidad ' y factor de selectividad )adecuados al analito.

2. Baja volatilidad, el punto de ebullición de la fase estacionaria debe ser al menos100 °C mayor que la máxima temperatura alcanzada en el horno.

3. Baja reactividad.4. Estabilidad térmica, para evitar su descomposición durante la elución.

Existen como mucho una docena de disolventes con estas características. Para elegir uno, debe tenerse en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor polaridad delanalito, mayor polaridad deberá tener la fase estacionaria. Algunas fases estacionariasutilizadas actualmente (2005) son:

y Polidimetilsiloxano, fase no polar de uso general para hidrocarburos,aromáticos, polinucleares, drogas, esteroides y PCB.

y Poli(fenilmetildifenil)siloxano (10% fenilo), para ésteres metílicos de ácidosgrasos, alcaloides, drogas y compuestos halogenados.

y Poli(fenilmetil)siloxano (50% fenilo), para drogas, esteroides, pesticidas yglicoles.

y Poli(trifluoropropildimetil)siloxano , para aromáticos clorados,nitroaromáticos, bencenos alquilsustituidos.

y Polietilenglicol,sirve para compuestos polares, también para compuestos comoglicoles, alcoholes, éteres, aceites esenciales.

y Poli(dicianoalildimetil)siloxano , para ácidos grasos poliinsaturados, ácidos

libres y alcoholes.

Generalmente, en columnas comerciales, la fase estacionaria se presenta enlazada yentrecruzada para impedir su pérdida durante las operaciones de elución o lavado. Deesta forma se obtiene una monocapa adherida químicamente a la superficie de lacolumna. La reacción implicada suele ser la adición de un peróxido al líquido a fijar,iniciándose una reacción por radicales libres que tiene como resultado la formación deun enlace carbono-carbono que además incrementa su estabilidad térmica. Otra forma esla irradiación con rayos gamma.



Otro tipo de fase estacionaria son las quirales, lo cual permite resolver mezclasenantioméricas. Este tipo de fases suelen ser aminoácidos quirales o algún derivadoadaptado al trabajo en columna.

El grosor de la película varía entre 0,1 y 5 m; el grosor depende de la volatilidad delanalito. Así, un analito muy volátil requerirá una capa gruesa para aumentar el tiempo

de interacción y separar más efectivamente los diferentes componentes de la mezcla.Para columnas típicas (diámetros internos de 0,25 o 0,32 mm) se emplean grosores de0,25 m, y en las columnas macrocapilares el grosor sube hasta 1 m. El grosor máximo suele ser de 8 m

Aplicaciones

La GC tiene dos importantes campos de aplicación. Por una parte su capacidad paraseparar mezclas orgánicas complejas, compuestos organometálicos y sistemas

bioquímicos. Su otra aplicación es como método para determinar cuantitativa ycualitativamente los componentes de la muestra. Para el análisis cualitativo se suele

emplear el tiempo de retención, que es único para cada compuesto dadas unasdeterminadas condiciones (mismo gas portador, rampa de temperatura y flujo), o elvolumen de retención. En aplicaciones cuantitativas, integrando las áreas de cadacompuesto o midiendo su altura, con los calibrados adecuados, se obtiene laconcentración o cantidad presente de cada analito.

Montaje de técnicas

El montaje de una técnica analítica de CG es netamente empírica, el perfil de losanalitos que se quiera determinar, la elección de la fase móvil, los tiempos de retención(elución) estarán dados exclusivamente por las condiciones particulares de la columna(fase estacionaria) frente al equipo. Las rampas de temperatura a seleccionar bien

pueden isotérmicas o escalonadas.

La elección del gás dependerá del tipo de detector, la elección de la columna (faseestacionaria) dependerá de la polaridad de los compuestos a separar, el detector dependerá del tipo de compuestos a detectar.

Usualmente una técnica analítica de GC consumirá muchas horas de un cromatografistaen ser desarrollada e instalada por el método del ensayo y error antes de ser validadacomo real.

La elección de los estándares es fundamental en el desarrollo de la técnica. La

estabilización de la línea base de la fase móvil en la fase estacionaria ( posterior alfrente del solvente) a través del tiempo es fundamental para establecer un método. Unalínea de base (solvente) poco estable o irregular que cambia de intensidad frente aldetector a medida que eluye debe ser afinada y estabilizada antes de introducir losanalitos.

El layout de los parámetros del rango de temperatura del horno, la adecuada elección dela columna y su fase estacionaria (incluye, tipo, largo y diámetro), la elección adecuadadel tipo de detector, las temperaturas del detector e inyector, los volúmenes de analito,



deberán ser establecidas de modo tal que se obtenga la mayor eficacia en separar losanalitos, y con la mejor resolución posible. La pureza de la muestra dependerá de la

preparación previa de la misma.

La CG es una metodología altamente efectiva y su perfomance permite una ampliagama de posibiidades para la química analítica en compuestos orgánicos. Una

derivación de esta técnica es la Cromatografía HPLC que funciona en base a la afinidaddel analito por la fase móvil líquida en vez de gaseosa.

La sensibilidad de la técnica GC puede incluso detectar microgramos del analito si está bien montada. La cuantificación se basa en cálculos del área bajo la curva que es proporcional a la concentración del analito. Comúnmente se usa en estándar inter no detrabajo.



ÍNDICE

1.- Introducción..................................................................................................2

2.- Cromatografía de Gases..............................................................................6

2.1.- Componentes básicos de un cromatógrafo Gas - Líquido ...............7

2.2.- Aplicaciones de la Cromatografía de Gases...................................13

3.- Cromatografía de Líquidos........................................................................15

3.1.- Componentes básicos de un equipo de HPLC...............................16

4.- Métodos cromatográficos en HPLC..........................................................22

4.1.- Cromatografía de Reparto..............................................................22

4.1.1.- Cromatografía en Fase Reversa.......................................22

4.1.2.- Cromatografía en Fase Normal.........................................23

4.1.3.- Aplicaciones de la Cromatografía de Reparto...................24

4.2.- Cromatografía Iónica........................ ...............................................24

4.2.1.- Aplicaciones de la Cromatografía Iónica...........................25

4.3.- Cromatografía de Exclusión por Tamaños......................................26

4.3.1.- Aplicaciones de Cromatografía Exclusión por tamaño......26

5.- Comparación entre Cromatografía de Gases y HPLC.............................27

6.- Aplicaciones de la Cromatografía de Gases y de HPLC.........................29

7.- Glosario.......................................................................................................31

8.- Bibliografía..................................................................................................32

1.- INTRODUCCIÓN: MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS.

¿ Qué es la Cromatografía?

La cromatografía es un conjunto de técnicas que permiten identificar, separar y determinar compuestosquímicos en mezclas complejas.

Cabe destacar desde un principio que en todas las técnicas cromatográficas hay:

y Una Fase estacionaria y una Fase móvil.

y En Cromatografía de gases, la fase móvil es un gas, el cual se hace pasar a través de una faseestacionaria.

y En Cromatografía Líquida, la fase móvil es un líquido que se hace pasar a través de una faseestacionaria.



y Un Cromatografía de Fluidos Supercríticos la fase móvil es un fluidos supercrítico que tambiénpasa a través de una fase estacionaria.

Una de las características fundamentales en las cromatografías es que los componentes de la mezcla quequeremos separar / identificar / cuantificar, se separan cuando sus velocidades de migración son distintas.

Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos clásicos como son la

precipitación, destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos por conocer más sobre la composición yfunción de las proteínas han obligado a los científicos a buscar técnicas, cada vez, más precisas. Fue elbotánico ruso Mikhail Tswett quien inventó la cromatografía a principios del siglo XX. Tswett hizo pasar soluciones que contenían pigmentos vegetales, como clorofilas y xantofilas, a través de columnas devidrio empacadas con carbonato de calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecían comobandas coloridas sobre la columna, lo cual explica el nombre que se escogió para el método, chroma quesignifica color en griego y graphein que significa describir.

Para elegir una técnica de separación además de tener en cuenta los criterios económicos y deaccesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedadesfísicas estructurales de las moléculas que se pretende separar, o de las características de la matriz enque se encuentran; otras se derivan de los objetivos del análisis (sensibilidad, resolución, tiempo deanálisis, necesidad de una detección específica).

El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación y posible

fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técnica analítica adecuada y el tratamiento de los datosobtenidos.Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos:técnicas de separación y técnicas espectroscópicas.

Las técnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja,relacionada con sus características estructurales específicas, por otro lado las técnicas de separación seutilizan para resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con finesanalíticos cuantitativos o cualitativos.

Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por cromatografía y electroforesis.

La cromatografía comprende un conjunto importante y diverso de métodos que permite a los científicosseparar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasionesresulta imposible por otros medios. Se pueden separar moléculas en función de sus cargas, tamaños y

masas moleculares. También a través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc...

La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también suidentificación y cuantificación.

El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes deretención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picoscromatográficos que se relacionan con la concentración. La columna cromatográfica y la forma con la quese diseña, constituye el corazón de la separación. El detector, situado al final de la columna es el quegarantiza la respuesta de los componentes que se separan.En todas las separaciones cromatográficas la muestra se desplaza con una fase móvil, que puede ser ungas, un líquido o un fluido supercrítico. La fase móvil puede pasarse a través de una fase estacionaria,con la que es inmiscible y que se fija a una columna o a una superficie sólida. Las dos fases se eligen deforma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la faseestacionaria.

Aquellos componentes que son fuertemente retenidos, por la fase estacionaria se mueven lentamente conel flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria,se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra seseparan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Estosresultados se recogen en forma de gráficos llamados cromatogramas.

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la situación de la fase estacionaria en:

y Cromatografía en columna



y Cromatografía plana.

O bien según la Fase móvil en:

y Cromatografía de gases.

y Cromatografía líquida.

y Cromatografía de Fluidos Supercríticos.

Relacionando estas dos clasificaciones entre sí, sólo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarseacabo en columna o sobre superficies planas. Por otra parte, tanto la de gas como la de fluidossupercríticos están restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de lacolumna contienen la fase móvil.

La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC por su sensibilidad, fáciladaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad parala separación de especies novolátiles o termolábiles y su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria, como son losaminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros.

2.- CROMATOGRAFÍA DE GASES.

En esta técnica cromatográfica, la muestra se inyecta y volatiliza en la cabeza de una columnacromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte y a diferencia de lamayoría de las técnicas cromatográficas la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; suúnica misión es transportar el analito a través de la columna.

Existen dos tipos de cromatografía de gases:

y Cromatografía Gas - Sólido: La fase estacionaria es un sólido de gran área superficial sobre elque se adsorbe el analito. Actualmente sólo se aplica a la separación de especies de bajo pesomolecular (CO2, O2, N2 e hidrocarburos). Los compuestos más polares son retenidos en la faseestacionaria de manera semipermanente.

y Cromatografía Gas - Líquido: La fase estacionaria es un líquido no volátil inmovilizado sobre la

superficie de un soporte sólido inerte. La velocidad de migración de un analito está determinadapor su distribución entre la fase líquida inmovilizada y la fase gaseosa. La temperatura, lavolatilidad del analito (Peb) y su solubilidad en la fase estacionaria son los factores que regulansu retención.

En la cromatografía de gases (que uno de los objetos de estudio en este trabajo: Cromatografía Gas -Líquido), se usa como fase estacionaria un compuesto orgánico polimérico de baja volatilidad, establetérmicamente y con adecuadas características de disolvente. Es preciso señalar que deben usarse fasesestacionarias, similares funcionalmente al compuesto a analizar.



¢ i £ ¤ ¥ Al ¦

§ ¨ © j l ©

f t i © ¨ i © §

¨ ̈ © t © ¦ fí ¦ lí § i

© .

. ¤ . ! " # m $ # % & %

'

& ( ) 0 ( i 1 # ( 2 & 3 % " 4 # m 5

'

6 £ 4 5

7

# 8 5 ( ! 9 í @ 3 i 2 # ¥

A

f © § B

§

C

ti ©

© §

i l© ̈ :

D

© t

© Si t

I ̈ B

iE

̈

§

t F

© l§ ¨

A

t t © G

¦ i t

©

H

t

I

iP

̈ © © i ̈

i t i ¦ ¨ :

¢ i

£

: E

§

F

© tE

¦ f ©

¦ .

V © Q l © © © ¨ ¨ t § ¨ © § ¨ © :

D

AS PH

G

R

AA

H

G

El ¦ © t

©

I

i¨ t B

lt §

S

T

U

, A ,V W

,F H

W

,U

W X

. S§ l iE

̈ Q ̈

C

t i ¨

© l ti ©

t t © §

§ . E t ¦ t

C

̈ l I

© t ll

¦ © t

© §

© ̈ I

© t ll © ̈ ̈

§

§ t © ©

© ̈ t © l l §

l.

SISR

EMAA

E IV

YEF F

IÓV

A

E M Y ESR

G AS.



Las ̀ a

b

stc

as b

std

e f f c ̀

adas g f c a e disol h

b e t b , i

ompuestos h

old

tiles p

analito) q i

ompuestos no h

old

tiles p

suciedad).

El método más común de inyeccir

n de muestc

a implica el uso de una micro jer inga s

ue inyecta la muestra lís

uida o gaseosa a través de un septum de goma de silicona en una cámara de vapor i t

acir

n instantánea situada en la cabeza de la columna. Esta cámara normalmente está a unos

u

0 ºv

por encima del punto de ebullici

r

n del componente menos volátil de la muestra.

Al inyectar con micro jer ingas el sistema debe asegurar :

y Que la muestra se vapor ice en la cabeza de la columna sin distorsir

n del gas por tador .

y Que la muestra ocupe la mínima longitud posible de la columna.

w

ambién se encuentra el inyector en columnas empaquetadas es una cámara de vidr io o cuarzo denominada g l

x y y i

y t , colocada en un bloque termostatizado a

00

00 º

. El gas por tador circula a través del bloque, penetra caliente en el inyector por una par te lateral y arrastra la muestra vapor izada alinter ior de la columna.

tro tipo de inyector es el usado en columnas capilares donde la muestra vapor izada debe ser mucho más pequeña. Se inyectan volúmenes similares a los de las columnas empaquetadas que, o bien de jan pasar sólo una pequeña f racción de la muestra inyectada a la cabeza de la columna

inyección Split), o bien reconcentra el analito gas en la cabeza de la columna

inyección Splitness), o bien vapor izan los analitos una vez que lo ha hecho el disolvente

inyección on column).

i

Inyector en columnas empaquetadas.

i

Inyector usado en columnas capilares



COLU

NAS

Las columnas cromatográficas varían en longitud desde menos de 2 hasta 6

metros. Se construyen deacero inoxidable, vidrio, sílice fundida, o teflón. A fin de poder ser colocadas en el interior del hornotermostatizado, normalmente son configuradas como helicoides con diámetros de 1

a 3

cm.

La temperatura de trabajo es una variable importante para realizar un trabajo preciso, por ello sonintroducidas dentro de un horno termostatizado.

La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado deseparación requerido. Normalmente con una temperatura igual o ligeramente superior al punto deebullición promedio de la muestra, se obtienen tiempos de elución razonables (2 a 3

minutos).

En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas, las empaquetadas y las capilares.

En las columnas empaquetadas la fase estacionaria se impregna en un soporte sólido poroso. Estesoporte sólido debe mantener inmóvil la fase líquida proporcionándole la máxima superficie. Estossoportes sólidos suelen ser tierra de Diatomeas que son fuertemente adsortivas.

Las columnas Capilares son de sílice fundida con una capa protectora exterior de poliamida. Su longitudvaria entre los 1

y 6

metros. Su diámetro interior oscila entre

,1 -

,32 mm. Su fase estacionariarecubre las paredes internas de la sílice y permiten conseguir mejores eficiencias que las empaquetadas

aunque su uso es más complicado. Este tipo de columna requiere sistemas especiales de inyección demuestra y detectores más sensibles.

En ambas columnas, su fase estacionaria está unida químicamente al soporte sólido, lo que las lleva a ser más estables frente a la temperatura y pérdida de fase estacionaria que aquellas en las que la faseestacionaria está inmovilizada por adsorción física.

DETECTORES

La función básica de un detector es que debe producir respuestas muy rápidas a pequeñasconcentraciones de soluto.

Las características ideales de un detector en cromatografía de gases son:

1. Adecuada sensibilidad. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en elintervalo de 1

-8 a 1

-15 g de analito/s.

2. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios órdenes de magnitud.

3. Buena estabilidad y reproducibilidad

4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos4

°C.

5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal.

6. Alta fiabilidad y fácil manejo. Hasta el punto de estar a prueba de la impericia de operadores inexpertos.

7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva y altamentepredecible para una o más clases de analitos.

8. No sea destructivo de la muestra.

Actualmente no existe el detector que reúna todas esas características, y tampoco parece probable quepueda llegar a diseñarse nunca.

Los detectores más generalizados son:



y Detector de conductividad térmica (TCD): Es totalmente universal y muy sencillo, aunque no esmuy sensible. Se emplea básicamente en el análisis de gases. Su baja sensibilidad impide usarlocon columnas capilares. Los gases que salen de la columna entran en un compartimiento en elque se encuentra un filamento caliente, cuya temperatura depende de la capacidad del gas quele rodea en disipar calor, esto es, su conductividad térmica. En el momento en que se eluye de lacolumna un compuesto con diferente conductividad térmica que el gas portador, la temperaturadel filamento varía, y por tanto su resistencia eléctrica, lo que es registrado en forma de aumentoo disminución de la corriente.

y Detector de ionización a la llama (FID): Es como detector, el más usado. Esto se debe porque esprácticamente universal para los compuestos orgánicos, donde es bastante sensible y tiene uncomportamiento excelente. Los gases que efluyen de la columna son introducidos en una llamaformada por H2 y aire cuya conductividad eléctrica está permanentemente registrada. En elmomento es que un compuesto de carbono se eluye de la columna, se quema y durante lareacción de combustión se generan electrones y otras especies cargadas que alteran laconductividad eléctrica de la llama.

y Detector de captura de electrones (ECD): Este detector es selectivo para las moléculas quecontienen átomos electronegativos, como peróxidos o halógenos e insensible a compuestoscomo aminas, alcoholes, o hidrocarburos. Por lo que se emplea en el análisis de pesticidashalogenados. Se trata de un detector tremendamente sensible y en algunos casos hastainestable. El efluyente de la columna se hace circular entre un pequeño núcleo de un metalradiactivo que emite electrones (partículas ), y un electrodo

cargado positivamente que los recibe. En el momento en que de la columna eluye una especiede átomos electronegativos, capaces de capturar a dichos electrones, se detecta unadisminución de la corriente del electrodo.

y Detector Termoiónico (TID): Se trata de un detector selectivo de los compuestos orgánicos quecontienen fósforo y nitrógeno. En comparación con un FID, el TID es 5

veces más selectivopara los compuestos continentes de fósforo y 5

veces más con los compuestos continentes denitrógeno. Un detector termoiónico tiene una configuración similar al detector de llama. Elefluente de la columna se mezcla con hidrógeno, pasa a través de la llama y se quema. El gascaliente fluye alrededor de una bola de silicato de rubidio calentada eléctricamente, la cual semantiene a unos 18

con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza unatemperatura de 6

a 8

°C. Esto provoca que se produzcan una gran cantidad de iones apartir de las moléculas que contienen fósforo o nitrógeno, lo que resulta en una gran corriente deiones, la cual se utiliza para la determinación de compuestos que contienen esos dos elementos.

y Detector de Emisión Atómica (AED): Es el detector más reciente y se encuentra a la venta. Eneste detector el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido por microondas que seacopla a un espectrofotómetro de emisión con series de diodos. El plasma es suficientementeenergético como para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarlos, y así obtener losespectros de emisión. Estos espectros son recogidos en un espectrómetro.

2.2.- Aplicaciones de la Cromatografía de Gases.

La cromatografía de gases se puede aplicar a gases y cualquier compuesto que pueda ser volatilizado oconvertido en un derivado volátil.

Con carácter general se puede aplicar en los siguientes casos:

y Para separa muestras analíticas complejas.

y En el análisis cualitativo: Por ejemplo para determinar el criterio de pureza, la presencia oausencia de compuestos, el número de átomos de carbono en una serie homóloga...

y En el análisis cuantitativo: para realizarlo se requiere es uso de patrones o estándares.

Centrándonos en el tema que nos compete que son los alimentos, podemos destacar las siguientesaplicaciones o ejemplos:



y Aminas aromáticas heterocíclicas (H AA) formadas durante la cocción de alimentos proteicos

(carne y pescados ). Donde estos compuestos son mutagénicos potentes bien conocidos yalgunos de ellos son carcinógenos. Se han formado en alimentos cocinados, y también se handetectado en las muestras ambientales (aerotransportadas partículas, aire de interior, humo delcigarrillo...) y en las muestras biológicas (orina, plasma). Por lo tanto, el aislamiento y la medidade HAA son muy importantes para el gravamen de riesgo para la salud humana.

y C ontrol de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial : Se identifica ycuantifica, mediante cromatografía en fase gaseosa aquellos componentes que definen lacalidad básica de los orujos y cuyo control exige la administración: grado alcohólico, acidez total,

acetato de etilo, metanol, acetaldehido, acetal y alcoholes superiores.

y Determinación de enantiomeric de compuestos chiral en aceites de mesa ( aceites de oliva,avellana, cacahuete y nuez) haciendo uso de HPLC inversa y CG.

y Estudio de vinos monovarietales.

y Caracterización de avellanas por su composición en ácidos grasos.

y Identificación d compuestos volátiles en granos de cacao.

y Determinación del perfil del ácido graso, acidez y valor del peróxido en la calidad del aceite deoliva contra el almacenaje.

y Determinación cuali y cuantitativa de componentes volátiles en hierbas y especias.

y Separación de compuestos volátiles del queso.

y Análisis de compuestos terpénicos de la uva de la variedad albariño.

y Estudio de compuestos azufrados volátiles pesados es vinos tintos de la denominación de origenribeira sacra.

***** Se adjuntan al final del trabajo los artículos que corresponden a cada aplicación aquí expuesta *****

5.- COMPARACIÓN ENTRE CROMATOGRAFÍA DE GASES Y HPLC:

Como características de ambos métodos:

y Son eficientes, muy selectivos, ampliamente aplicables.

y Sólo se requiere una muestra pequeña.

y Pueden utilizarse sin destruir la muestra.

y Se adapta fácilmente al análisis cuantitativo.

Ventajas de la HPLC:

y Puede acomodar muestras no volátiles e inestable térmicamente.

y Es aplicable a iones inorgánicos.

Ventajas de la CG:

y Se trata de un equipo sencillo y barato en comparación con HPLC.



y Es rápido.

y Tiene resolución en paralelo (columnas capilares).

y Se conecta fácilmente con la espectroscopia de masas, (

S).

La CG, ofrece la ventaja de la velocidad y simplicidad del equipo, pero la HPLC es aplicable a sustancias

no volátiles y materiales térmicamente inestables.

Algunas diferencias instrumentales:

y En HPLC no existen detectores tan aplicables universalmente, ni tan tampoco tan fiables comoen CG.

y El detector en HPLC no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande detemperaturas.

y El detector usado en HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir elensanchamiento de banda.

6.- APLICACIONES DE CG Y HPLC

En el desarrollo del trabajo, cuando han sido descritos de cada uno de los métodos, tanto CG como HPLC(en todas sus variantes), se han incluido sus aplicaciones correspondientes. Algunas van a ser renombradas y otras, van a ser incluidas y descritas en este apartado. Se han recogido artículos que sonadjuntados en este apartado del trabajo.

Aplicaciones en Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) : Como aplicaciones de lacromatografía de reparto en productos de alimentación : edulcorantes artificiales, antioxidadntes,aflatoxinas, aditivos, colorantes, aminoácidos, proteinas, carbohidratos, lípidos.

Las aplicaciones de la cromatografía iónica está el análisis de drogas y sus metabolitos, sueros,conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azúcares, y preparaciones farmacéuticas.

Respecto a las aplicaciones referidas a productos alimenticios en cromatografía por exclusión detamaños: separación de ácidos grasos, determinación de glucosa fructosa y sacarosa en zumosenlatados.

Aplicaciones de La cromatografía de Gases. Se pueden destacar las siguientes aplicaciones oejemplos.

y Aminas aromáticas heterocíclicas (H AA) formadas durante la cocción de alimentos proteicos(carne y pescados ). Donde estos compuestos son mutagénicos potentes bien conocidos yalgunos de ellos son carcinógenos. Se han formado en alimentos cocinados, y también se handetectado en las muestras ambientales (aerotransportadas partículas, aire de interior, humo delcigarrillo...) y en las muestras biológicas (orina, plasma). Por lo tanto, el aislamiento y la medidade HAA son muy importantes para el gravamen de riesgo para la salud humana.

y C ontrol de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial : Se identifica y

cuantifica, mediante cromatografía en fase gaseosa aquellos componentes que definen lacalidad básica de los orujos y cuyo control exige la administración: grado alcohólico, acidez total,

acetato de etilo, metanol, acetaldehido, acetal y alcoholes superiores.

y Determinación de enantiomeric de compuestos chiral en aceites de mesa ( aceites de oliva,avellana, cacahuete y nuez) haciendo uso de HPLC inversa y CG.

y Estudio de vinos monovarietales.

y Caracterización de avellanas por su composición en ácidos grasos.



y Identificación d compuestos volátiles en granos de cacao.

y Determinación del perfil del ácido graso, acidez y valor del peróxido en la calidad del aceite deoliva contra el almacenaje.

y Determinación cuali y cuantitativa de componentes volátiles en hierbas y especias.

y Separación de compuestos volátiles del queso.

y Análisis de compuestos terpénicos de la uva de la variedad albariño.

y Estudio de compuestos azufrados volátiles pesados es vinos tintos de la denominación de origenribeira sacra.

***** A continuación adjunto los artículos encontrados de las aplicaciones en alimentos de CG y HPLC *****

7.- GLOSARIO.

CONTRAI

N: (Termino usado en HPLC, cromatografía iónica), Un contraión es un ión que se combina

con el ión analito para formar una pareja de iones, que es una especie neutra que es retenida por elrelleno de la fase inversa.

CRO ATOGRA

A: Es una gráfica de alguna función de concentración de soluto contra el tiempo o el

volumen de elución.

EFECTIVIDAD O SELECTIVIDAD DE UNA COLU

NA CRO ATOG RÁFICA: Se dice que una columna

es efectiva cuando las especies a separar se eluyen a velocidades relativas suficientemente diferentes(los picos están suficientemente separados).

EFICACIA DE UNA COLU

NA CRO ATOGRÁFICA: Se dice que una columna es tanto más eficaz

cuanto menos sea el ensanchamiento de los picos. La eficacia será mayor cuanto más pequeña sea laaltura de plato y mayor sea el número de platos.

ELUCI

N: Es un proceso en el cual los solutos son lavados a través de una fase estacionaria por elmovimiento de una fase móvil.

ELUYENTE: Se trata de un disolvente que se usa para llevar los componentes de una mezcla a través deuna fase estacionaria.

RESOLUCI

N DE UNA COLU

NA: Parámetro que proporciona una medida cuantitativa de su capacidadpara separar dos solutos. Debe ser mayor a 1,5 para que se considere buena.

TIE

PO DE RETENCI

N:( TR ) Es el tiempo entre la inyección de una muestra y la aparición de un picode soluto en el detector de una columna cromatográfica.

TIE

PO

UERTO: ( T

) Es el tiempo que tarda en salir de la columna una sustancia no retenida.

8.- BIBLIOGRAFÍA.

LIBROS:

³Análisis Instrumental´ Skoog / Leary - 4ª Ed. c Graw Hill

³

uímica Analítica´ Skoog / West / Holler - 6ª Ed. c Graw Hill

³Análisis químico cuantitativo´ D.C. Harris. Grupo editorial Iberoamérica,

éjico, 1992.



Apuntes de la asignatura ³

uímica Analítica´ de la E.U.I.T.I.Z.

INTERNET:

www.altavista.com

www.google.com

www.eurojai.com

www.ig.csic.es

Término definido en el glosario, al final del trabajo.



Tiempo de retención: Ver definición en el glosario.

Tabla recogida de ³ Análisis Instrumental´ Skoog / Leary.

Recogida del libro Análisis Instrumental : Skoog / Leary. 4ª Ed.

c Graw - Hill.

Fig 2: Tomada de los apuntes de química analítica de la EUITIZ.

Fig 3 : Tomada de los apuntes de química analítica de la EUITIZ.

Término definido en el glosario.


Imagen tomada del libro ³

uímica Analítica´ 6ª Ed. Skoog / West / Holler.

Tabla tomada del libro ³ Análisis Instrumental´ 4ª Ed.. Skoog / Leary.


Dibujo sacado de los apuntes de la asignatura ³

uímica Analítica´ de la EUITIZ.


3

beteta

cromatografia[2]

Documents