cromatografia de gases

CROMATOGRAFIAModalidades y Clasificación

FM = Líquido

FM = Gas

CromatografiaLíquida

CromatografiaGaseosa (CG)

En CG la FEpuede ser:

Sólida

Líquida

CromatografiaGas-Sólido (CGS)

CromatografiaGas-Líquido (CGL)

CROMATOGRAFIA GASEOSAAplicabilidad

Qué mezclas pueden ser separadas por CG ?

Mezclas cuyos constituyentes sean

VOLÁTILES

la sustancia debe poder ser

“arrastrada” por el flujo de un gas en elque se disuelva - por lo menos parcialmente -

DE FORMA GENERAL:CG es aplicable para separaciones y

análisis de mezclas cuyos constituyentes tengan PUNTOS DE EBULLICION de hasta 300o y que sean térmicamente estables.

Cromatógrafo Gaseoso

1

2

3

4

6

5

1 - Reservorio de Gas y Controles de Presión.2 - Inyector (Vaporizador) de muestra.3 - Columna Cromatográfica y horno.4 - Detector.5 - Electrónica de Tratamiento (Amplificación) de Señal.6 - Registro de Señal (Registrador del Computador).

INSTRUMENTACIONParámetros de Inyección

TEMPERATURA DEL INYECTOR Debe ser suficientemente elevada para que la muestra vaporice inmediatamente sin descomponerse.

Regla Gral: Tiny = 50oC encima de la temperatura de ebulición del componente

menos volátil

VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de columna y del estado físico de la muestra

COLUMNA muestrasgaseosas

muestraslíquidas

empacada = 3,2 mm (1/4”)

0,1 ml ... 50 mL0,2 L ... 20 L

capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 L ... 3 L

Sólidos: convencionalmente se disuelven en un solvente adecuado y se inyecta la solución

INSTRUMENTACIONMicrojeringas para Inyección

LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L

émbolo

cuerpo (pirex)

aguja (inox 316)

Microjeringa de 10 L:

I NSTRUMENTACI ONColumnas: Definiciones

EMPACADA = 3 a 6 mm

L = 0,5 m a 5 mRellena con sólido pul-

verizado (FE sólida o FElíquida depositada sobrelas partículas de relleno)

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m

Paredes internas recubier-tas con un film fino

(fracción de m) de FElíquida o sólida

INSTRUMENTACIÓNTemperatura de la Columna

La interacción con la FE y el tiempo que un analito demora para recorrer la columna

depende de su PRESIÓN DE VAPOR (p0).

p0 = f

Estructura químicadel analito

Temperatura de la columna

Temperaturade

columna

Presiónde

vapor

Velocidadde

migración

EL ANALITO ELUYE MAS RAPIDAMENTE (MENOR

RETENCIÓN)

INSTRUMENTACIONTemperatura de la Columna

TE

MP

ER

AT

UR

A D

E C

OL

UM

NA

EL CONTROL CONFIABLE DE LA TEMPERATURA DE COLUMNA ES ESENCIAL PARA OBTENER UNA

BUENA SEPARACION EN CG

INSTRUMENTACIONHorno de la Columna

Características Deseables de un Horno:

AMPLIO RANGO DE TEMPERATURA DE USO Por lo menos de Tambiente hasta

400oC. Sistemas criogénicos (T < Tambiente)

pueden ser necesarios en casos especiales.

TEMPERATURA INDEPENDIENTE DE LOS DEMAS MÓDULOS No debe ser afectado por la temperatura del inyector y del detector.

TEMPERATURA UNIFORME EN SU INTERIOR Sistemas de ventilación interna muy eficientes para mantener la temperatura homogénea en todo el horno.

INSTRUMENTACIONHorno de la Columna

Características Deseables de un Horno:

FÁCIL ACCESO A COLUMNA La operación de cambio de columna puede ser frecuente.

CALENTAMIENTO Y ENFRIAMIENTO RÁPIDO Importante tanto en análisis de rutina como durante el desenvolvimiento de metodologias analíticas nuevas.

TEMPERATURA ESTABLE Y REPRODUCIBLE

La temperatura debe ser mantenida con exactitud y precisión de ± 0,1°C.

En cromatógrafos modernos (después de 1980),el control de temperatura del horno es totalmente

operado por microprocesadores.

INSTRUMENTACIONProgramación Isotérmica

Mezclas complejas (constituyentes con volatilidades muy diferentes) separadas

ISOTERMICAMENTE:

TCOL BAJA:

- Los componentes más volátiles son separados

- Los componentes menos volátiles demoran en eluir, saliendo como picos mal

definidos

TCOL ALTA:

- Los componentes más volátiles no son separados

- Los componentes menos volátiles eluyen más

rápidamente

INSTRUMENTACIONProgramación Lineal de Temperatura

La temperatura del horno puede modificarse linealmente durante la

separación:

Se consiguen buenas

separaciones de los componentes de la muestra en

menor tiempo

TIEMPO

TE

MP

ER

AT

UR

A

tINI tFIN

TINI

TFIN

R

Parámetros de una programación de temperatura:

TINI Temperatura Inicial

TFIN Temperatura Final

tINI Tiempo Isotérmico Inicial

tFIN Tiempo Final del Programa

R Velocidad de calentamiento

INSTRUMENTACIONProgramación Lineal de Temperatura

Posibles problemas asociados a PLT:

VARIACIONES DEL CAUDAL DEL GAS DE

ARRASTRE La viscosidad de un gas aumenta con la temperatura.

viscosidad caudal

DERIVA DE LA LINEA DE BASE Debido al aumento de volatilización de FE líquida

INSTRUMENTACIONDetectores

Dispositivos que examinan continuamente el material eluido, generando la señal al pasar el

analito

Gráfico Señal x Tiempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada sustancia separada aparece

como un PICO en el cromatograma.

INSTRUMENTACIONDetectores

Más Importantes:

DETECTOR POR CAPTURA DE ELECTRONES

(DCE O ECD) Supresión de corriente causada por la absorción de electrones por eluatos altamente electrófilos.

DETECTOR POR CONDUCTIVIDAD TÉRMICA

(DCT O TCD) Variación de conductividad térmica del gas de arrastre.

DETECTOR POR IONIZACION EN LLAMA ( FID) Iones generados durante la combustión de los eluatos en una llama de H2 + aire.

TEORIA BÁSICAEficiencia de Sistemas Cromatográficos

La migración de un analito por la

columna provoca inevitablemente el

ensanchamiento de su banda:TIEMPO

Efectos del ensanchamiento excesivo de picos:

Separación deficiente de analitos con retenciones

próximas.

Picos más largos y menos intensos = menor

detectabilidad

EFICIENCIA Capacidad de elución con el mínimo de dispersión del analito.

TEORIA BÁSICACuantificación de la Eficiencia

Suponga la columna cromatográfica como una serie de etapas separadas donde ocurre un equilíbrio entre

el analito, la FE y el gas de arrastre:

Cada “etapa” de equilíbrio se denomina

PLATO TEÓRICO

El número de platos teó-ricos de una columna (N) puede ser calculado por:

Columna más eficiente

tR

wb

N

TEORIA BÁSICACuantificación de la Eficiencia

ALTURA EQUIVALENTE A UN PLATO TEÓRI-CO (H) “Tamaño” de cada etapa de equilíbrio

Valores típicos de H e N:

dC df H N

0.10 0.25 0.081 3703700.25 0.25 0.156 1923080.32 0.32 0.200 1500000.32 0.50 0.228 1315790.32 1.00 0.294 1020410.32 5.00 0.435 689660.53 1.00 0.426 704230.53 5.00 0.683 43924

2.16 10% 0.549 36432.16 5% 0.500 4000

Capilares, L = 30 m

Empacadas, L = 2 m

Valores de H para columnas capilares y empacadas son parecidos, pero como L para capilares es

MUCHO mayor tipicamente ellas son más eficientes

(L = longitud de la columna)

TEORIA BÁSICAOptimización de la eficiencia

La altura equivalente de un plato teórico es función de la velocidad lineal media del gas de arrastre ū:

H

uuMAX

HMIN

El valor de H puede ser

minimizado optimizando-

se la velocidad del

gas de arrastre

Relaciones algebraicas entre H y u:

- Columnas Empacadas: Ecuación de van Deemter

- Columnas Capilares: Ecuación de Golay

(A, B, C = constantes)

(B, CM, CS = constantes)

FASES ESTACIONARIASConceptos Generales

LÍQUIDOS depositados sobre una superfície de: só-lidos porosos inertes (columnas empacadas) o de

tubos finos de materiales inertes (columnas capilares)

FElíquida

SOPORTESólido inerte

poroso

Tubo capilar de material inerte

SÓLIDOS Columnas rellenas con material finamente granulado (empacadas) o depositado sobre la

superfície interna del tubo (capilar)

Para minimizar la pérdida de FE líquida por volatilización, normalmente ella es:

Entrecruzada: las cadenas

poliméricas están químicamente

ligadas entre sí

Químicamente ligadas: las cadenas poliméricas

están “ligadas” al soporte por enlaces

químicos

FASES ESTACIONARIASCaracterísticas de una FE ideal

SELECTIVA Debe interactuar diferencialmente con los componentes de la muestra.

Regla gral: la FE debe tener características que permitan la separación de dos solutos a ser

separados (polar, apolar, aromático ...)

FE Selectiva: separación

adecuada de los constituyentes

de

la muestra

FE poco Selectiva: poca resolución aún

con columna de buena eficiencia

FASES ESTACIONARIASCaracterísticas de una FE ideal

AMPLIO RANGO DE TEMPERATURAS DE USO Mayor flexibilidad en la optimización de la separación.

BUENA ESTABILIDAD QUÍMICA Y TÉRMICA Mayor durabilidad de la columna, no reacciona con los componentes de la muestra

POCO VISCOSA Columnas más eficientes (menor resistencia a la transferencia del analito entre fases)

DISPONIBLE EN ELEVADO GRADO DE PUREZA Columnas reproducibles; ausencia de picos “fantasma” en los cromatogramas.

FASES ESTACIONARIASFE Sólidas: Adsorción

El fenómemo físico-químico responsable de la interacción entre el analito + FE sólida es la

ADSORCIÓN

La adsorción ocurre en la interfase entre el gas de arrastre y la FE sólida

ADSORCIÓN

Sólidos con grandes áreas superficiales (partículas finas, poros)

Solutos polares

Sólidos con gran número de sítios activos (hidroxilos, pares de electrones...)

FASES ESTACIONARIASFE Sólidas

Características Generales: - Sólidos finamente granulados (diámetros de par-

tículas típicos de 105 µm a 420 µm).- Grandes áreas superficiales (hasta 102 m2/g).

Más usados:Polímeros Porosos Porapak (copolímero estireno-divi-nilbenceno), Tenax (polióxido de difenileno)

Sólidos Inorgánicos Carboplot, Carboxen (carbones activos grafitizados), Alumina

Columna:Carboxen-1000 60-80 mesh; 15’ x 1/8”TCOL: 35oC a 225oC / 20oC. min-1

Gas de Arrastre: He @ 30 ml.min-1

Detector: TCD

Principales Aplicaciones:- Separación de gases - Compuestos livianos- Series homólogas

FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas

POLIGLICOLES Muy polares; sensibles a la oxidación. Principales: Polietilenglicol (nombres comerciales: Carbowax, DB-Wax, Supelcowax, HP-Wax, etc.)

CH2 CH2OH OH

n

Estructura Química:

AMINAS ALIFÁTICASColumna:4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH

TCOL: 200oC (isotérmico) Gas de Arrastre: N2 @ 20 mL.min-1

Detector: FID Muestra: 0,01 L de mezcla de aminas


Mayor parte de las aplicaciones en CG moderna

Cuatro grandes grupos estructurales:

PARAFINAS No polares; alta inercia química. Principal: escualeno (C30H62)

POLIÉSTERES Ésteres de dialcoholes con di-ácidos. Polares; altamente sensibles a la humedad y a la oxidación.

ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRAsOS

Columna:5%DEGS-PS s/ Supel-coport 100/120 mesh; 6’ x 1/8”TCOL: 200oC (isotérmico)Gas de Arrastre: N2 @ 20 ml.min-1

Detector: FIDMuestra: 0,5 L de solución en cloroformo conteniendo 0,5 g de cada éster

FASES ESTACIONARIASFE Líquidas: Absorción

El fenómeno físico-químico responsable de la interacción analito + FE líquida es la

ABSORCIÓN

La absorción ocurre en el interior del film de FE líquida (fenómeno INTRAfase)

ABSORCION

Films espesos de FE líquida

Interacción fuerte entre la FE líquida y el analito (gran solubilidad)

Gran superficie líquida expuesta al gas de arrastre


SILICONAS (polisiloxanos) Las FE más em-pleadas en CG. Cubren amplia rango de pola-ridades y de propiedades químicas diversas.

Si

CH3

H3C

CH3

O Si

R1

R2

O Si

CH3

CH3

CH3n

R1, R2 = qualquier

radical orgánico

- Unión Si-O extremadamente estable = elevada estabilidad térmica y química de la FE.

- Las siliconas son fabricadas en amplia escala para diversas aplicaciones = minimización del costo del producto + tecnologia de produción y purificación

ampliamente estudiada y conocida.

- Practicamente cualquier radical orgánico o inorgánico puede ser unido a la cadena polimérica =

FE “ajustables” a separaciones específicas + facilidad de inmobilización por entrecruzamiento de uniones

química al soporte


Separación de pesticidas - FE = 100 % PDMS

1 - TCNB2 - Dichloram3 - Lindano4 - PCNB5 - Pentacloroanilina6 - Ronilano7 - Antor8 - pp’-DDE9 - Rovral10 - Cypermetrin11 - Decametrin

Columna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12

m)

TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1)

Gas de Arrastre: He @ 35 cm.min-1 Detector: FID

Muestra: 2L de solución de pesticidas “on-column”

17 min


Separación de piridinas - FE = 100 %CNpropilsilicone

1 - piridina2 - 2-metilpiridina3 - 2,6-dimetilpiridina4 - 2-etilpiridina5 - 3-metilpiridina6 - 4-metilpiridina

3 minColumna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m)

TCOL:110oC (isotérmico)

Gas de Arrastre: N2 @ 16 cm.min-1 Detector: FID

Muestra: 0,1L de solución 1-2% de piridinas en 3-metilpiridina


Separación de fenoles - FE = fenilmetilsiliconas

50% Ph

50% Me

5% Ph

95% Me

FASES ESTACIONARIASFE Quirales

Separación de isómeros ópticos:

FÁRMACOS En muchos fármacos apenas dos isómeros ópticos tienen actividad farmacológica.

PRODUCTOS BIOLÓGICOS Distinción entre productos de origen sintético y natural (natural = normalmente sustancias ópticamente puras; sintético = muchas veces son mezclas racémicas).

Las propiedades físico-químicas de los isómeros ópticos son MUY SIMILARES

Las FE convencionales no interaccionan diferencialmente con isómeros ópticos

La separación de mezclas de isómeros ópticos sólo es posible con FE

opticamente activas

=

FE Quirales


FE ópticamente activas más importantes:

O Si

CH3

CH2

CHCH3

C

O N

H

C*

C

O

H

CH CH3

CH3

NH C

CH3

CH3

CH3

Si

CH3

CH3

O

n

Chiralsil-Val

Derivados de aminoácidos:

Mezclas de compuestos formadores de puentes

de hidrogeno.

Organometálicos:

Separación de enantiómeros formadores

de complejos.

n

O Si

CH3

CH2

Si

CH3

CH3

O

CH2

O

O

Ni

C3F7

/ 2

Chiralsil-Metal


Derivados de ciclodextrinas alquiladas:

-ciclodextrina: oligosacárídos

cíclicos quirales

Chiralsil-Dex

- Introducidas en 1983

- ligadas a cadenas de polisiloxano: su uso es extremamente favorable como FE líquida (viscosidad

baja, estabilidad ...)

- Pueden ser químicamente inmobilizadas en las columnas

- Columnas disponibles comercialmente

FASES ESTACIONARIASFE Quirales: Aplicaciones

Aceite esencial artificial de limón: separación de terpenos primarios

1 - (+/-) -pineno2 - sabineno3 - (+/-) -pineno4 - (+/-) limoneno

Columna: Rt-ßDEXsm (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm)

TCOL: 1 min a 40°C / 2°C min-1 / 3 min a 200°C

Gas de Arrastre: H2 @ 80 cm.min-1 Detector: FID


Aceite esencial natural

Esencia artificial

Aroma de bergamota: distinción entre aroma natural y artificial

Columna: Rt-ßDEXse (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm)

TCOL: 1 min a 40°C / 4°C min-1 / 200°C

Gas de Arrastre: He @ 80 cm.min-1 Detector: MS


Anfetaminas: resolución de isómeros

Columna: Rt-ßDEXcst (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)

TCOL: 1 min a 120°C / 1,5°C min-1 / 3 min A 175°C

Gas de Arrastre: He @ 25 cm.min-

1

Detector: MS

COLUMNAS EMPACADASDefiniciones Básicas

Tubo de material inerte relleno con FE sólida gra-nulada o FE líquida depositada sobre soporte sólido.

MATERIALDEL

TUBO

ø = 3 mm a 6 mm

L = 0,5 m a 5 m

ac. inox

vidro pirex

níquel

TEFLON

Granulometriadel

relleno80 - 100 mesh 149 - 177 m

100 - 120 mesh 125 - 149 m

60 - 80 mesh 177 - 250 m

MESH dp

Eficiencia maximizada con:

- Disminuc. de dC

- Disminuc. de dp

- Relleno regular

Limitados por la resistencia al pasaje de gas de arrastre

COLUMNAS EMPACADASFE Líquidas: Soporte

La FE líquida debe ser dispuesta sobre

un SOPORTE sólido

área superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1

microporos regulares (~ 1 m)

NO interactuar con la muestra

buena resistencia mecánica

Uso casi universal: TIERRA DE DIATOMEAS

Esqueletos fósiles

(SiO2 + óxidos

metálicos) de algas

microscópicas

ChromosorbAnachrom

Supelcoport...

secado

calcinación

fusión con NaOH

lavado con ácido

silanización

COLUMNAS EMPACADASFE Líquidas: Soporte

Chromosorb - características generales

Áre

a S

up

erfi

cial

Den

sid

ade

Ap

aren

te

Tam

anh

o d

e P

oro

% M

áx.

de

FE

NOME m 2 .g -1 g.ml -1 m

Chromosorb P 4,0 0,47 0,4 - 2 30Chromosorb W 1,0 0,24 8 - 9 15Chromosorb G 0,5 0,58 - 5

Ord

en c

resc

ien

ted

e in

erci

a

Tratamientos especiales:

AW Lavado con ácido, para remover metales

HP o DMCS o HDMS Silanizados (menor adsorción)

NAW Sin lavado con ácido

Chromosorb P muy activo.

Chromosorb W mas inerte que el P.

Chromosorb G Similar al W, mayor resistencia mecánica

COLUMNAS EMPACADASFE Líquidas: Carga de FE

TIPICAMENTE % FE = 1 % a 30 % de relleno

Mayores vol. de muestra

Mejor reproducibilidad en la preparación del relleno

Mayor eficiencia (d f = N)Menor sangria de FE con temperatura programada

Separaciones rápidas con temperaturas menores

% FE

df = f (% FE en relleno)

COLUMNAS CAPILARESDefiniciones Básicas

Tubo fino de material inerte con FE líquida o sólida depositada sobre las paredes internas.

MATERIALDEL

TUBO

ø = 0,1 mma 0,5 mm

L = 5 ma 100 m

sílica fundidavidro pirexac. inoxNylon

Silcosteel

Las columnas de sílica están revestidas externamente con película de polímero (poliimida) para aumentar resistencia mecánica y

química

Columnas Capilares vs Empacadas:

CA

PIL

AR

ES L = N más eficientes

FC = 1 ... 10 mL.min-1 Control de elusión más difícil

Vi Dispositivos especiales de

inyecciónFamilias de Columnas Capilares :

PLOT (Porous layer open tube) Película de FE sólida adherida a las paredes internas

SCOT (Support coated open tube) Paredes internas revestidas con material de relleno similar a las columnas empacadas

WCOT (Wall coated open tube) FE liquida depositada (ligada // entrecruzada) sobre las paredes internas.

COLUMNAS CAPILARESDiámetro Interno

dC = Eficiencia

0,10 mm 0,25 mm0,32 mm 0,53 mm

1 2 3

1Columnas de altísima eficiencia (muestras complejas, “Fast GC”); limitada capacidad

volumétrica de procesamiento de la muestra

2Diámetros más comunes; limitada capacidad

volumétrica de la muestra

3Columnas “megabore”: menor eficiencia, pero mayor capacidad de procesamiento, permite el

uso de inyectores convencionales

COLUMNAS CAPILARES“Fast GC”: Columnas Capilares Finas

Destilación simulada de óleo diesel:

Columna: HP-1 (1 m x 0.10 mm x 0.40 µm)

TCOL: 35°C / 40°C min-1 / 0,75 min A 310°C

Gas de Arrastre: He @ 90 ml.min-

1

Detector: FID

Necesario control exacto flujo (control electrónico de presión) y altas velocidades de

calentamiento de la columna.

COLUMNAS CAPILARESColumnas Capilares: Inyección

1

2

3

45

6

1 - Septo;2 - Entrada de gas de arrastre;3 - “Liner” (mezclador);4 - Columna Capilar5 - Purga de gas de arraste;6 - Válvula de control de purga.

Baja capacidad de procesamiento de la muestra (sub-microlitro)

La inyección directa con microjeringa es muy difícil

Inyectores con división (“splitters”)

- Menor sensibilidad (buena parte de la muestra es despreciada)

- División de muestra raramente es uniforme (la fracción purgada de los constituyentes menos volátiles es siempre

menor)

COLUMNAS CAPILARESLarge Volume Injection (LVI)

Separación de PAH con LVI (Viny = 25 L, solución 400 ppb en CH2Cl2)

Columna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)

TCOL: 5 min a 50°C / 20°C min-1 / 2 min A 320°C

Gas de Arrastre: He @ 2 ml.min-1 Detector: FID

COLUMNAS CAPILARESColumnas Multicapilares

“Líneas” paralelas de columnas capilares

con dC convencional

- Eficiencia próxima a las columnas convencionales- Capacidad similar a las columnas empacadas- Columnas más cortas: análisis más rápidos

Separación de explosivos en columna

multicapilar (OV-17, 1000 capilares x 6 m)

1 - 2,6-DNT2 - 2,4-DNT3 - 2,4,6-TNT4 - 3,4,5-TNT5 - 2,3,4-TNT6 - RDX ?7 - tetryl

DETECTORESDefinición General

Dispositivos que generan una señal eléctrica proporcional a la cantidad eluída de un analito

~ 60 detectores usados en CG

~ 15 equipados en cromatógrafos comerciales

4 responden para la mayor parte de las aplicaciones

DCT TCDDetector porCondutividad

Térmica

DIC FIDDetector porIonización en

llama

DCE ECDDetector porCaptura deEletrones

EM MSDetector Es-

pectrométrico de Masas

DETECTORESParámetros Básicos de Desempeño

CANTIDAD MÍNIMA DETECTABLE Masa de un analito que genera un pico con altura igual a tres veces el nível de ruído

SIN

AL

(S

)

RUÍDO (N)

= 3SN

RUIDO cualquier componente de la señal generada por el detector que no es originado por la muestra

Fuentesde

Ruído

Contaminantes en los gases

Impurezas acumuladas en detector

Descarga a tierra deficiente


LIMITE DE DETECCION Cantidad de analito que

genera un pico con S/N = 3 y wb = 1 unidad de tiempo

Mismo detector, nível de ruido y masa de analito PERO diferentes anchos de base:

wb

QMD = f

Detector (señal generada, ruido)

Ancho del pico cromatográfico

Definiendo límite de deteción como:

LD es independente de la eficiencia del sistema cromatográfico !

[QMD] =masa

(ng, pg ...)

[LD] = masa / tiempo

(ng.s-1, pg.s-1 ...)


VELOCIDAD DE RESPUESTA Tiempo recorrido entre la entrada del analito a la celda del detector y la generación de la señal eléctrica.

63,2% FSD

TIEMPO

SE

ÑA

L

Constante de Tiempo, : tiempo necesario para que

la señal llegue a 63,2 % FSD (full scale deflection)

luego de la entrada de la muestra

La constante de tiempo del sistema (detector + dispositivos de registro de señal) igual o menor a 10% del ancho de

banda a media altura (w0.5 ) del pico más estrecho del

cromatograma

>> w0.5

t R medido > t R real

w medida > w real

Deformación del pico

Disminuición del ruido (“damping”)


SENSIBILIDAD Relación entre el incremento de área del pico y el incremento de masa del analito

MASA

ÁR

EA

Factor de Respuesta, S:

pendiente de la recta Área del

pico x Masa del analito

el mismo incremento de masa causa un

mayor incremento de área

SensibilidadS

En ausencia de errores determinados:

A = área del pico cromatográfico

m = masa del analito


RANGO LINEAL DINAMICO Intervalo de masas dentro del cual la respuesta del detector es lineal

MASA

ÁR

EA

A partir de cierto punto la

señal no aumenta

linearmente

El fin de la zona de linearidad puede ser detectado cuando la razón (Área / Masa) diverge en más de 5 %

de la inclinación de la recta en la región lineal:

MASA

ÁR

EA

/ M

AS

A

0,95 S

1,05 S

DETECTORESClasificación

UNIVERSALES:Generan señal para cualquier

sustancia eluida.

SELECTIVOS:Detectan solamente sustancias

con determinada propiedadfísico-química.

ESPECÍFICOS:Detectan sustancias que

poseen determinado elementoo grupo funcional en sus

estructuras

DETECTORESDetector por Condutividad Térmica

PRINCIPIO Variación de la conductividad térmica del gas cuando eluye un analito.

Celda de Detección de DCT:

12

35

4

i

1 Bloque metálico

2 Entrada de gas de arrastre

3 Salida del gas de arrastre

4 Filamento metálico ( W-Re)

5 Alimentación de corriente eléctrica para calentar el filamento

La cantidad de transferencia de calor entre un cuerpo caliente y un cuerpo frio depende de la condutividad térmica del gas en el espacio que

separa los cuerpos

Si la condutividad térmica del gas disminuye, la cantidad de calor transferido también disminuye

- el cuerpo caliente se enfría.


Configuración tradicional del DCT: bloque metálico con cuatro celdas interligadas en par - por dos pasa el efluente de la columna y por dos el gas de arrastre

puro:CELDAS DE MUESTRA

CELDAS DE REFERENCIA

CO

RT

E S

UP

ER

IOR

CELDAS DE

MUESTRA

CELDAS DE REFERENCIA C

OR

TE

LA

TE

RA

L

Cuando eluye un compuesto con condutividad térmica menor que la del gas de arrastre puro:

Diferencia de resistencia

eléctrica entre los

filamentos de la muestra y la referencia

Filamentos de las celdas de la muestra se

enfrian

Resistencia eléctrica de los

filamentos de las celdas de la

muestra aumenta

Filamentos de las celdas de refencia no se

enfrian

Resistencia eléctrica de los

filamentos de las celdas de

referencia se mantiene constante


Los filamentos del DCT están montados sobre un puente de Wheatstone que transforma la diferencia de resistencia

cuando la elución de la muestra produce una diferencia de voltaje:

V Fuente de CC / Bateria (18 V a 36 V, típico)

F Ajuste de la corriente de los filamentosI Medida de la corriente de los filamentos (100 mA - 200 mA, típico)

B1 B2 Ajuste de cero

R1 R2 Filamentos de las celdas de referenciaA1 A2 Filamentos de las celdas de la

muestra

DETECTORESCaracterísticas Operacionales DCT

SELECTIVIDAD Se observa señal para cualquier sus-tancia eluida diferente del gas de arrastre = UNIVERSAL

SENSIBILIDAD / LINEALIDAD Dependiendo de la configuración particular y del analito: QMD = 0,4 ng a

1 ng con linealidad de 104 (ng - decenas de g)

CAUDAL DE GAS DE ARRASTRE La señal es proporcional a la concentración del analito en el gas

de arrastre que pasa por la celda.

CAUDAL DE GAS DE ARRASTRE CONSTANTE DURANTE LA ELUCIÓN

VARIACION DEL CAUDAL DEL GAS DE ARRASTRE DURANTE

LA ELUCION

Fc = 0

Con DCT, el área de los picos cromatográficos es MUy dependiente del caudal del gas de arrastre !!!


FACTORES DE RESPUESTA Cuanto menor es la condutividad térmica del analito, mayor es la señal.

Cantidades iguales de sustancias diferentes generan picos cromatográficos con áreas diferentes !!!

Los factores de respuesta dependen de la condutividad térmica del analito

Mezclas de cantidades equimolares de:

Etano = 17,5

Clorofórmio = 6,0

Etanol = 12,7

C2H6

CHCl3

C2H5OH

X


TEMPERATURAS DE OPERACION Cuanto mayor es la diferencia entre la temperatura de los filamentos y del

bloque metálico mayor es la respuesta.

Temperatura del filamento, TF: entre 300oC y 350oC. Es función de la corriente de alimentación de los filamentos, i.

i TF Señal

Limitaciones:- Corrientes excesivas pueden fundir el filamento

(Ø típicos del filamento = 20 m)- Disminución del tiempo de vida útil de los

filamentos (oxidación por trazas de O2 en gas de arrastre)

Temperatura del bloque, TB: mantenerla tan baja como sea posible

TB Señal

Limitación:- Temperaturas excesivamente bajas pueden provocar a condensación de analitos en las

celdas (error analítico, daños a los filamentos)

DETECTORESDCT: Aplicaciones

1 Separaciones de cuantificación de los compuestos que no generan señal en otros detectores (gases nobles,

gases )

2 Por ser un detector no-destructivo, puede ser usado en CG preparativa o detección secuencial con dos detectores

en “tandem”

Columna: CP Sil 5CB(50 m x 0.32 mm x 5 µm)

Gas de Arrastre: He @ 3 ml.min-

1

TCOL: 40°C Detector: DCT

1 N2 2 CH4

3 CO2 4 n-C2

5 NH3 6 n-C3

7 i-C4 8 n-C4

Separación de Gases y Carbohidratos:

DETECTORESDetector por Ionización en llama

PRINCÍPIO Formación de iones cuando un compuesto se quema en una llama de hidrógeno y oxígeno

El efluente de la columna se mezcla con H2 y O2 y se

quema. Como en una llama de H2 + O2 no existen íones, no

conduce corriente eléctrica.

Cuando un compuesto orgánico eluye, él también se

quema. Como en su combustión se forman íones,

la llama pasa a conducir la corriente eléctrica

DETECTORESDetector por Ionización de llama

Química de la llama de Hidrógeno:

Incandescencia

Reacción

Combustión

Estructura de la llama

tres regiones básicas

Región de combustión Mezcla de los gases, precalentados, inicio de la ruptura de las moléculas de H2, O2 y de los analitos.

Zona de reacción Reacciones exotérmicas con producción y/o consumo de radicales H, O, OH, HO2 (provenientes del H2), CH e C2 (provenientes del analito) e íones CHO+ (analito).

Zona de incandescencia Emisión de luz por decaimiento de especies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visíble).

Combustión de sustancias con

uniones C-H

CH + O CHO+ + e-

1 íon formado de cada ~105 átomos de C quemados

Combustión de H2

Apenas se forman radicales !!!

DETECTORESDetector por Ionización de llama

SELECTIVIDAD Selectivo para sustancias que contienen uniones C-H en su estructura química.

(como virtualmente todas las sustancias analizables por CG son

orgánicas, en la práctica el detector por ionización de llama es UNIVERSAL)

Compuestos que NO producen respuesta:

Gases nobles

H2, O2, N2

CO, CO2, CS2

CCl4, perhalogenados

NH3, NxOy

SiX4 (X = halógeno)

H2O

HCOOH, HCHO *

SENSIBILIDAD / LINEALIDAD QMD típicas = 10 pg a

100 pg com linealidade entre 107 e 108 (pg a mg)

DIC

DCT N2

CH4

CO2

O2

DETECTORESCaracterísticas Operacionales de DIC

FLUJO DE GASES Según el gas de arrastre, las variaciones de alimentación de aire (comburente) e

hidrogeno (combustíble) deben ser optimizadas.

Gráficos Señal x Flujo de Gases típicos:

SE

ÑA

L

150 300 450 600 15 30 45 60

AR H2

La señal se mantiene aproximadamente constante en un amplio rango de flujos de aire e H2

VARIACIONES EN LOS FLUJOS DE AIRE E H2 AFECTAN APENAS MARGINALMENTE LA SEÑAL = MAYOR REPRODUTIBILIDAD Y REPETIBILIDAD

DETECTORESCaracterísticas Operacionales del DIC

TEMPERATURA DE OPERACION El efecto de la temperatura sobre la señal del DIC es despreciable.

TRATAMENTO DE LA SEÑAL Por causa de la baja magnitud de la corriente eléctrica generada (pA a nA) ésta debe ser amplificada para poder ser registrada.

1

23

4

Diagrama eletrónico

simplificado de un DIC

1 Llama / Colector

2 Batería o Fuente de CC Voltajes de operación de no más de 200 V a 300 V

3 Amplificador Electrométrico Debe amplificar una señal y convertir una corriente variable en un

voltaje variable (pA mV).

4 Salida de Registro de Señal

DETECTORESCaracterísticas Operacionales del DIC

FACTORES DE RESPUESTA El factor de respuesta de determinado compuesto es aproximadamente proporcional

al número de átomos de carbono. La presencia de heteroelementos diminuye el factor de respuesta.

Número Efectivo de Carbonos (NEC) Prevée con ~20% de aproximación el factor de respuesta de un compuesto.

Átomo X

C alifático +1,00C aromático +1,00C olefiníco +0,95C carbonila +0,00

O álcool prim. -0,60Cl alifático -0,12

(X = Contribuición de cada átomo al NEC)

C2H6 NEC = 2,00

C2H5OH NEC = 1,40

CH3CHO NEC = 1,00

Mezcla con cantidades equimolares de:

DETECTORESDetector de Nitrógeno - Fósforo

Modificación de un DIC altamente selectiva para compuestos orgánicos nitrogenados y fosforados

cuenta de vidrio que contiene sal de metal alcalino:

RbCl (normal), KCl

Rb2SO4

QMD = 0,4 pg a 10 pg (N) y 0,1 a 1 pg (P)

Pesticidas Triazínicos usando DNP:

1 Desetilatrazina2 Desisopropilatrazina3 Atraton4 Atrazina5 Trietazina6 Secbumeton7 Sebutilazina8 Simetrin9 Dipropretrina10 Dimetametrina11 Metroprotrina

(100 pg cada)

DETECTORESDetector por Captura de Electrones

PRINCIPIO Supresión de un flujo de electrones lentos causada por la absorción de éstos por especies electrofílicas

Un flujo contínuo de electrones lentos se

establece entre un ánodo (fuente radioativa

-emisora) y un cátodo.

Al pasaje de una substancia electrofílica algunos electrones son absorbidos, resultando

una supresión de corriente elétrica.

DETECTORESDetector por Captura de Eletrones

12

3

4

5

1 Anodo (fuente radioativa - emisora)

2 Salida de gases 3 Cátodo

4 Cavidad 5 Columna cromatográfica

DETECTORESDetector por Captura de Eletrones

Mecanismo de Captura de Eletrones

1 Generación de electrones lentos por la interacción entre la radiación moléculas del gas de arrastre G y moléculas de bloqueador Q

- + G G + + e - + e* energia

- + G G* + Q G + e - + Q energia

2 Los electrones lentos son capturados por la especie eletrofílica AB

AB + e - AB - + energía

La disminución de corriente eléctrica que fluye por la celda de detección es proporcional a la concentración

a de la especie absorbente del gas de arrastre

Ib corriente de repuesta

Ie corriente en la elución del analito

K constante de captura

DETECTORESCaracterísticas Operacionales DCE

FUENTE RADIOACTIVA Electrones de alta energía (rayos ) que se emiten desde una lámina delgada

que contiene Ni o H radiactivos

Empleo universal en DCE comerciales:

3H (-, 0,02 MeV)

Con la forma de Ta3H3

Tdet debe ser < 225oC

Mayor sensibilidad

63Ni (-, 0,06 MeV)

Usado como 63Ni 0

Mayor linearidad

útil hasta ~400oC

85Kr, 90Sr, 99Tc, 147Pm, 241Am, 226RaRaramente

usados:

El 63Ni es el preferido en

equipamientos modernos

- Mayor durabilidad (t1/2 = 100 a x 12 a para 3H)

- Mayor estabilidad térmica

- Menor riesgo de uso (radioactividad)


GAS DE ARRASTRE El funcionamiento del DCE es muy dependiente de la natureza del gas de arrastre

MAS USADOS:N2

Ar + 5% CH4

Generan electrones lentos cuando son bombardeados con

-

El gas debe ser lo más puro posible!!!(trazas de H2O y O2 comprometen la señal del DCE)

FLUJO DEL GAS DE ARRASTRE La señal depende directamente del flujo de gas en el detector

SeñalF

!La adsorción de contaminantes sobre los electrodos causa deformación en los

picos


SENSIBILIDAD / LINEAlIDAD QMD = 0,01 pg a 1 pg

(organoclorados), linearidad ~ 104 (pg a ng)

10 fg Lindano (C6H6)-ECD HP-6890

PESTICIDAS 1 tetracloro-m-xileno 2 - BHC 3 Lindano 4 Heptachlor 5 Endosulfan 6 Dieldrin 7 Endrin 8 DDD 9 DDT10 Metoxychlor10 decaclorobifenila

~250 fg cada analito

EL DCE ES EL DETECTOR DE ELECCIÓN PARA ANÁLISIS DE TRAZAS DE ORGANOHALOGENADOS Y

SIMILARES

DETECTORESCaracterísticas Operacionales DCESELECTIVIDAD / FACTORES DE RESPUESTA Valores de S maximizados para compuestos

electrofílicos

hidrocarburos y ésteres alifáticos, dienos

alcoholes, cetonas y aldehídos alifáticos, aminas, nitrilos, mono - Cl, mono - F

enoles, oxalatos, mono - Br, di - Cl, hexa - F

tri - Cl, alquil - Pb, anhidridos

mono - I, di - Br, tri - Cl, mono - nitro, CS2

di - I, tri - Br, poli - Cl, di - nitro, 1,2 - dicetonas, fumaratos, organo - Hg

S típicos (clorobenzeno: S = 1)

Comparandose organoalogenados:

I > Br > Cl > F

Terc > Sec > Prim

Tri > Di > Mono

> >

trans > cis

ANÁLISIS CUALITATIVOConceptos Generales

Fuentes de Información Cualitativas

RETENCIÓN Uso de datos de retención de un analito para su identificación

DETECCIÓN Detectores que generan información estructural sobre las sustancias eluídas

Identificación individual de las especies presentes en la

muestra

Determinación de la identidad de la muestra propiamente

dicha

Aplicaciones cualitativas

de CG

Para un análisis cualitativo confiable por CG se recomienda la combinación de

datos provenientes de por lo menos dos fuentes

ANÁLISIS CUALITATIVOTiempos de Retención

t’R = fInteracciones analito / FE

Presión de vapor del analito

Condiciones operacionales (TCOL, FC ...)

Fijadas las condiciones operacionales, el tiempo de retención ajustado de un analito es una

constante

MUESTRA

PATRÓN

Comparación de

cromatogramas de la muestra y

de una solución patrón

del analito buscado


La identificación por t’R es poco confiable:

Dependencia con FC y TCOL Variaciones en

estas condiciones afectan sensiblemente los t’R

VARIACIÓN DE 1% EN

EL t’R

TCOL = 0,1%

FC = 1%

Sobrecarga en la columna Aumento excesivo en la masa de material eluído deforma el pico

cromatográfico y altera su t’R

MA

SA

Saturación de la columna

cromatográfica con aumento de la

masa eluída provoca “caída

frontal” en el pico


Comparación de t’R usando agregado (“spiking”)

en la muestra del analito sospechado: aumento en la confiabilidad de identificación.

Muestra compleja: incerteza en los t’R

medidos puede llevar a una identificación

errónea

Comparación con cromatogramas de la

muestra con el agregado del analito de

interés permite una identificación más

confiable del mismo

ANÁLISIS CUALITATIVOÍndice de Retención de Kovàts

FUNDAMENTO Los t’R isotérmicos para una serie

homóloga de compuestos dependen logaritmicamente del número de átomos de carbono

de la cadena.

Separación isotérmica de una mezcla de n-alcanos

(n-C4, n-C5, ... n-C16)

Un gráfico de log(t’R) en función del número de átomos de carbono del

analito nC es LINEAL


El índice de retención de Kovàts I para un analito se define por:

t’R (A) Tiempo de retención

ajustado del analito A

t’R (N) Tiempo de retención

ajustado de n-alcano con N carbonos

t’R (n) Tiempo de retención

ajustado de n-alcano con n carbonos (n = N + 1)

Ej.: un analito con I = 874 tendría un tiempo de retención ajustado equivalente al de un n-alcano

hipotético con una cadena de 8,74 átomos de carbono

Interpolación logarítmica de los

t’R


REPETITIBILIDAD - REPRODUCIBILIDAD Los

efectos de TCOL y FC en los índices de Kovàts son

pequeños

ANALITO I/TCHCl3 +0,02 %

CH3CH2OH -0,12 %CH3CHO -0,05 %

CH3(CO)CH3 -0,04 %

Dependencia de I para algunas sustancias en

una columna apolar en el

rango de TCOL = 70oC a

TCOl = 130oC

La identificación por índices de retención es más

confiable que comparaciones basadas en t’R

ÍNDICE DE RETENCIÓN DE KRATZ Para programación lineal de temperatura la relación entre

t’R y nC es lineal: cálculo en los índices de retención

se modifica

ANÁLISIS CUALITATIVORetention Time Locking (RTL)

PRINCIPIO En cromatógrafos con: controles neumáticos y térmicos con microprocesadores,

inyectores automáticos y columnas cromatográficas de calidad excepcional es posible lograr alta

repetibilidad de los t’RCORRIDA #1

TCOL (1)

FC (1)

Columna A

CORRIDA #2

TCOL (2)

FC (2)

Columna BLos software RTL (Hewlett-Packard) automaticamente

ajustan las condiciones operacionales en un segundo CG para reproducir los t’R obtenidos en un primer equipamento

Cromatogramas obtenidos en diferentes

equipamientos y columnas con condiciones

operacionales de la segunda corrida

ajustadas por el software de RTL

ANÁLISIS CUALITATIVOMétodos de Detección Cualitativos

Métodos de detección que aportan informaciones cualitativas sobre los analitos eluídos:

Cromatografía Gaseosa con Detección Espectrométrica por Absorción en el Infra-rojo (CG-EIR)

Cromatografía Gaseosa con Detección Espectrométrica de Masas (CG-EM)

Cromatografía Gaseosa con Detección Espectrométrica por Emisión Atómica (CG-EA)

Identificación confiable cuando se combinan a técnicas de identificación basadas en retención

ANÁLISIS CUALITATIVOEspectrometría de Masas

PRINCIPIO La muestra se fragmenta y ioniza en un patrón característico de la especie química.

1 Moléculas de la muestra son bombardeadas por electrones (electron impact = EI) o íones (chemical ionization = CI):

ABCDE + e- ABCDE.+ + 2 e-

2 El íón formado se fragmenta:

ABCDE.+ AB. + CDE+

ABCDE.+ AB+ + CDE.

ABCDE.+ A+ + BCDE.

3 Los fragmentos iónicos formados son separados magneticamente de acuerdo con sus masas moleculares y contados:

AB

UN

DA

NC

IA

MASA / CARGA

El gráfico del número de íones formados en

función de la razón Masa / Carga de los íones es el

ESPECTRO DE MASAS del analito

ANÁLISIS CUALITATIVOEspectrómetro de Masas

1

2

3

4

1 Cámara de Ionización Los electrones generados por un filamento enriquecido bombardean la muestra. Los fragmentos ionizados (carga +1) son repelidos por el electrodo positivo y conducidos al separador magnético.

2 Salida de Vacío Todo el interior del EM debe estar con alto vacío.

3 Separador Magnético La acción del campo magnético deja íones con determinada relación Masa / Carga atravesar esta zona del equipo.

4 Detector Una válvula fotomultiplicadora o un fotodiodo genera una señal eléctrica proporcional al número de íones que incide sobre el elemento.

ANÁLISIS CUALITATIVOEspectro de Masas

m/Z = 118

m/Z = 80

m/Z = 79

- CO

- (CO + H)

m/Z = 90

20 40 60 80100

120

0

m / Z

ANÁLISIS CUALITATIVOAcoplamiento CG - EM


2,2,4-trimetilpentano2,2,4-trimetilpentano

n-octanon-octano


2,3-dimetilbutano2,3-dimetilbutano

dodecanododecano


naftalenonaftaleno

etilbencenoetilbenceno

cromatografia de gases

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