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Contribución de la Ingeniería Genética al mejoramiento de cultivos en sus características de tolerancia a sequía,
salinidad, heladas y rendimiento.
El largo camino desde el laboratorio al campo
Instituto de Agrobiotecnología del Litoral
Edificio del IAL en construcción- octubre de 2013
Calor Frío
Patógenos
Herbívoros
Salinidad
Sequía
Estímulo externo
Modificación
del
Metabolismo
Percepción
Modificación
de la
Expresión Génica
Estímulo externo
Abiótico
Biótico
(Adaptado de Wang y Chen, 2010)
Las vías de señales son redes complejas
Estructura de ADN
El dogma central de la Biología
(Adaptado de Raven y Johnson, 2002)
Se puede insertar un fragmento de ADN de cualquier origen en un plásmido bacteriano utilizando una ligasa
Plásmidos como vectores de clonado Transformación
Hasta 1972 se consideró que E coli era refractaria a la transformación.
Luego se pensó que solo eran transformables las cepas recBC-
Actualmente hay numerosos métodos de transformación química, fisiológica y
mediante pulsos eléctricos.
¿Qué es un gen? ¿Qué es el ADN?
Todo organismo tiene un genoma
El genoma es el conjunto de la información genética que tiene ese organismo
En los organismos eucariotas los genomas están divididos en un número definido de cromosomas
¿Qué es un gen? ¿Qué es el ADN?
Un gen se puede definir como el segmento de ADN necesario y suficiente para generar un ARN o una proteína funcional
Existe un número variable de genes en los distintos organismos
Se conoce la función de unos pocos.
CONICET EN TECNÓPOLIS
¿Qué es un gen? ¿Qué es el ADN?
Conocer la función de un gen nos puede ayudar a conocer el origen de una enfermedad, generar un sistema de diagnóstico y elaborar una posible cura.
Ejemplos: Conocer el gen que codifica la insulina permite hoy en día
tratar adecuadamente a las personas que sufren de diabetes Conocer la función o la presencia de otros genes nos permite
diagnosticar enfermedades prematuramente
CONICET EN TECNÓPOLIS
¿Qué es un gen? ¿Qué es un transgén?
Un transgén es un gen perteneciente a un organismo que se ha introducido en otro organismo distinto.
Los objetivos de introducir genes en organismos homólogos o heterólogos son variados. Entre ellos:
- obtener conocimiento sobre su función - mejorar alguna característica fenotípica del organismo
receptor
CONICET EN TECNÓPOLIS
En el caso de la insulina, el gen de origen humano se introduce en una bacteria. La bacteria es “engañada” y produce la proteína con función hormonal en grandes cantidades como si fuera propia.
En este caso el gen de la insulina se convierte en un transgén en la
bacteria.
Bacteria engañada que fabrica insulina
Hombre/Mujer diabético/o
Hombre/Mujer sano/a dador/a de insulina
Hombre/Mujer tratado/a con insulina humana
Los transgenes en plantas o las plantas transgénicas
En el caso de las plantas la transgénesis se hace para beneficiar al hombre.
El gen puede provenir de cualquier especie inclusive de cualquier planta y ser introducido en otra para generar una nueva planta con una característica distintiva y en general beneficiosa.
Los transgenes en plantas o las plantas transgénicas
Una planta es un organismo eucariota superior y en promedio tiene unos 20000 a 40000 genes distintos.
Con la trangénesis se busca que el agregado de un solo gen exógeno le de una característica particular.
Para esto hay que conocer la función del gen en cuestión, e introducirlo de forma tal de que se exprese en la parte u órgano de la planta que es de interés
CONICET EN TECNÓPOLIS
¿Cómo lo percibe la sociedad?
La genética no es de ahora
El hombre la utilizó desde la
antigüedad, aún sin conocer los mecanismos
involucrados para domesticar plantas
y animales (y microorganismos)
La domesticación del maíz
Laboratorio de Biotecnología Vegetal Instituto de Agrobiotecnología del Litoral
Aislamiento de genes que codifican factores de transcripción en girasol, arroz, Arabidopsis y Medicago truncatula
Estudios funcionales de estos genes Estudios funcionales de sus regiones promotoras Aplicaciones biotecnológicas utilizando estos genes y
sus promotores como herramientas para el mejoramiento de especies de interés agronómico
La regulación de la expresión génica
ARN polimerasa TFIID
GEN TATA
A B C
A B C P
Degradación Modificación Inducción
P Ub
Modificación de la expresión génica
Control transcripcional
Adaptado de Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 2005
Señales de reconocimiento, percepción y transducción
Arabidopsis thaliana
Arroz Medicago truncatula
Girasol
Soja
Maíz
Trigo
Organismos modelo
Preparación de ADN
genómico
Clonado del promotor
Clonado de
genes promotores ADN copia
Selección de
transformantes
Transformación de
Arabidopsis thaliana
Fluorometría e
histoquímica Northern blots.
q RT-PCRs
Clonado del ADNc
Preparación de
ARN
microarreglos
Análisis del fenotipo
Metodología utilizada para determinar la función del gen :”gene discovery”
Las plantas transformadas con la construcción 35S:HAHB4 presentan una marcada tolerancia a estrés hídrico
T WT T WT
Dezar et al., Trans. Res. 2005
24 hs después de regadas
WT T WT T
Dezar et al., Trans. Res.2005
Las plantas de Arabidopsis thaliana que expresan el gen HaHB4 de girasol son tolerantes a condiciones extremas de sequía
WT: plantas no
transformadas
TG: plantas
transformadas con el
gen HaHB4
Cuando la intensidad de luz es baja (en la sombra) las plantas transformadas generan más biomasa
Plantas transgénicas expresando HaHB4 son notablemente menos atacadas por larvas de Bradysia
impatiens
Salvajes Transgénicas
Salvajes Transgénicas
pBI121 35S: HAHB4
Manavella et al., Plant J. 2008
Un largo camino…………….. La historia de las plantas tolerantes a sequía
El camino de laboratorio al campo Representación esquemática y optimista del proceso completo necesario para llegar desde el descubrimiento de la función de un gen hasta un producto de mercado.
Arce et al., 2008 Recent patents in Biotechnology
La historia de los factores de transcripción HD-Zip
En 1994 se logró identificar el primer HD-Zip I de girasol, una planta de genoma no secuenciado hasta la fecha
La presentación de patentes
Los cultivos de interés agronómico
Seguimos en el laboratorio y en la cámara de cultivo
Selección de plantas transformadas de maíz con el herbicida BASTA como marcador de selección
Transgénica, resistente al BASTA Control sensible al BASTA
Eligio Morandi et al., resultados no publicados
Ensayo de estrés hídrico en invernáculo
Eligio Morandi et al., resultados no publicados
Medida de fijación de CO2
Eligio Morandi et al., resultados no publicados
Medida del área foliar después del ensayo de estrés hídrico
plantas
transgénicas
plantas no
transgénicas
La respuesta de defensa contra herbívoros está aumentada en el maíz transgénico que expresa HaHB4
Manavella et al., Plant J. 2008
Tratamiento de estrés hídrico a las plantas de soja transgénicas y null
Línea 2: gm a7H Cabello et al., resultados no publicados
Plantas de trigo que expresan el gen HAHB4 Línea 1 Línea 2
Trigo transgénico
Niv
ele
s d
e e
xp
resi
ón
de H
AH
B4
Null heterocigota homocigota Null heterocigota homocigota
Cabello et al., resultados no publicados
Productividad de trigo transgénico que expresa el gen HaHB4 de girasol
Ensayos en el campo
Construcción UBI::HaHB4 Cosecha en diciembre de 2009
Trigo
Trigo Construcción UBI::HAHB4 Cosecha en diciembre de 2009
Ensayo realizado en Monte Buey, Provincia de Córdoba
Línea salvaje; Cadenza
Línea comercial: BI 3004
Fecha de siembra: junio de 2009
Densidad de siembra: 350 semillas por metro cuadrado
Características del suelo; pH 5,8; materia orgánica: 3,0 %
Total de lluvias durante el período de desarrollo; 594,5 mm
Gerónimo Watson y Federico Trucco (Indear)
Trigo Construcción UBI::HAHB4
Gerónimo Watson y Federico Trucco (Indear)
Cosecha en diciembre de 2009 Villalonga-Bs As Niveles de riego y precipitaciones
Trigo Construcción UBI::HAHB4 Cosecha en diciembre de 2009
Ensayo realizado en Monte Buey, Provincia de Córdoba
Gerónimo Watson y Federico Trucco (Indear)
Trigo Construcción UBI::HAHB4 Cosecha en diciembre de 2009 Villalonga-Bs As
Las diferencias de rendimiento de granos entre los tratamientos de irrigación fueron significativas, siendo un 20 % mayor para las plantas
irrigadas
Las diferencias de rendimiento entre líneas fueron significativas con un p-value de 0,007 y como ejemplo, la línea a12 presentó un
aumento de productividad del 38 %
Trigo Construcción UBI::HAHB4 Cosecha en diciembre de 2009 Monte Buey - Córdoba
Se observaron bajos rendimientos generales que se atribuyen a una cosecha tardía y a las altas temperaturas durante la misma
Rendimientos de maíz en Hugues, provincia de Santa Fe, campaña 2010/2011
Rendimientos de soja en Charata-Chaco, campaña 2010/2011
10/12/2013
Trigo 2011/2012 Villalonga
30% de aumento de la productividad
HaHB4 modificado
10/12/2013
Monte Buey 23% aumento de la productividad
Soja 2011
HaHB4 modificado
10/12/2013
Charata 35% aumento de la productividad
Maíz 2011
HaHB4 modificado
Tecnología HaHB1/AtHB13
Raquel Chan
Julieta Cabello
Agustín Arce
Integrantes del equipo de investigación
Contacto: [email protected]
WT TG-A TG-B TG-C TG-D TG-E
Sobrevivientes (%)
22 ± 3 85± 2 75 ± 4 70 ± 3 65 ± 2 60 ± 5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Control 30´ 2 hs
Leac
hin
g ra
tio
(L)
Period of time at -8 °C
Membrane stability
wt
TG-A
TG-B
a b
c
Tratamiento: 2 hrs at -8 °C Tratamiento: 7 hrs at -8 °C Plantas no aclimatadas
HAHB1 confiere tolerancia a temperaturas de congelamiento (heladas) estabilizando las membranas
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50 100 200
Leac
hin
g ra
tio
(L)
NaCl (mM)
Membrane stability
wt
TG-A
TG-B
WT TG-A TG-B
a
b Treatment: 350 mM of NaCl A: Transgenic plants membranes stability is higher than WT ones. B: illulstrative photograph of transgenic plants tolerating better high salt concentration.
Plants expressing the transcription factor HAHB1 (35S:HAHB1) are more tolerant of salt stress
Treatment: Severe water stress applied to 30-day-old plants (three independent lines) Transgenic plants tolerate better this stress condition. Illustrative photograph showing a typical drought stress experiment applied to mature plants (5-week-old)
WT TG-A
TG-B TG-C
Plants expressing the transcription factor HAHB1 (35S:HAHB1) are more tolerant of drought
Las plantas transformadas con HaHB1/AtHB13 pierden menos rendimiento que las no transformadas en estrés hídrico moderado
HaHB11, un gen que confiere múltiples tolerancias y aumenta el rendimiento
Raquel Chan
Julieta Cabello
Jorge Giacomelli
Grupo de investigación
Contacto: [email protected]
HaHB11 confiere tolerancia a estrés hídrico severo
Illustrative assay performed with 25-day-old trasnsgenic lines (TG-A, -B, -C) and WT plants, water-starved during 15 days. The illustrative photograph was
taken during the assay. Right: a table showing the survival rate of each genotype. Statistical analysis was performed with 64 plants from each genotype.
HaHB11 confiere tolerancia a estrés salino
21-day-old trasnsgenic lines (TG-A, -B, -C) and WT plants were watered with a NaCl increasing concentration up to 400
mM along 21 days. The photograph was taken 7 days after the end of the assay. Statistics was performed with n=32 plants
for each genotype.
TGB TGA TGC
TGA TGB
TGC
TGC
HaHB11 confiere tolerancia a la inundación del suelo
Phenotype in standard
growth conditions
21-day-old trasnsgenic lines (TG-A, -B, -C) and WT plants grown on soil with their
roots submerged during six days. Photograph was taken and survivor’s percentage
was calculated 6 days after recovery.
21-day-old three independent trasnsgenic lines (TG-A, -B, -C) and WT (101) plants grown
on soil and submerged during six days. The photograph was taken six days after recovery at
standard conditions.
HaHB11 confiere tolerancia a la inundación total de la planta
HaHB11 genera mayor masa foliar en las plantas
Phenotype in standard
growth conditions
A: 40-day-old WT and transgenic plants were
grown on soil and normally irrigated during the
whole life cycle
B: with 50-day-old plants
HaHB11 aumenta significativamente el rendimiento
Rendimiento de plantas crecidas en condiciones normales
El rendimiento fue calculado de un experimento hecho con 12 plantas de cada genotipo
TGC TGA TGB
Muchas gracias
Un homenaje a un Grande, el Negro Fontanarrosa
¡Mozo! Hay un transgén en mi sopa
Investigadores
Raquel Chan Karina Ribichich Javier Moreno
Becarios post-doctorales Julieta Cabello Agustín Arce Jorge Giacomelli Doctorandos Delfina Re Matías Capella Jesica Raineri Pamela Ribone
FCA de la UNR Eligio Morandi Carlos Gosparini Carlos Cairo Andrés Quijano
Investigadores Daniel Gonzalez Carlos Dezar
Doctorandos
Claudia Palena Gabriela Gago
Carlos Dezar Mariana Tioni Pablo Manavella Federico Ariel
Del grupo Indear
Gerónimo Watson Federico Trucco Mariana Chiozza
Ezequiel Marchionni
Miembros del grupo actual Miembros que participaron con anterioridad
Endosulfan in the Namoi River, Australia: Bt cotton start 1996-97
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
1991-92 1992-93 1993-94 1994-95 1995-96 1996-97 1997-98 1998-99 1999-00 2000-01
Year
En
do
su
lfa
n C
on
ce
ntr
ati
on
(u
g/L
)
Los problemas a resolver
Responder las preguntas planteadas y otras que surgirán
Mejorar la percepción pública de los transgénicos Problemas con la presentación de patentes Problemas regulatorios Para nuestro país: Desarrollar tecnologías propias y mecanismos que permitan atravesar el pipeline con mayor rapidez y apoyo
¿Qué soluciones puede ofrecer la biotecnología?
Se calcula que en 2050 habrá 3000 millones de personas más en el mundo que demandarán el doble de alimentos y energía
Sólo queda un 5 % de suelo cultivable
En Argentina, los únicos cultivos aprobados para comercialización son Soja tolerante a herbicida
Maíz tolerante a herbicida
Maíz resistente a insectos
Maíz resistente a insectos y tolerante a herbicida
Algodón tolerante a herbicida
Algodón resistente a insectos
Algodón resistente a insectos y tolerante a herbicida