contenido página
TRANSCRIPT
i
CONTENIDO
Página
1.INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1
2.ANTECEDENTES ................................................................................................ 5
2.1 Guanábana (Annona muricata L.) ..................................................................... 6
2.1.1 Descripción botánica ...................................................................................... 7
2.1.2 Actividad polifenólica de Annona Muricata L. ................................................. 9
2.2 Compuestos fenólicos ..................................................................................... 11
2.2.1 Estructura y clasificación de los compuestos polifenólicos........................... 12
2.2.2. Fenoles totales ............................................................................................ 12
2.2.3 Flavonoides .................................................................................................. 13
2.2.4 Saponinas ................................................................................................... 17
2.3 Determinación de compuestos metabolitos secundarios ................................ 18
2.3.1 Antioxidantes ................................................................................................ 21
2.4 Vermicomposta ............................................................................................... 21
2.5 Roca fosfórica. ................................................................................................ 24
2.6 Lixiviado .......................................................................................................... 27
3.JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 29
4.OBJETIVOS ....................................................................................................... 30
4.1 General............................................................................................................ 30
4.2 Específicos ...................................................................................................... 30
5.MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 31
5.1 Material vegetal ............................................................................................... 31
5.2 Obtención de extractos.................................................................................... 32
5.2.1 Extracto metanólico ...................................................................................... 32
5.3 Analisis de los datos iniciales .......................................................................... 32
5.4 Análisis de metabolitos secundarios en extractos de Annona Muricta L. ........ 33
ii
5.4.1 Estimación de fenoles totales ....................................................................... 33
5.4.2 Estimación de Flavonoides ........................................................................... 34
5.4.3 Estimación de taninos condensados (Proantocianidinas) ............................ 34
5.4.4 Estimación de saponinas .............................................................................. 35
5.4.5 Análisis estadístico ....................................................................................... 35
6.RESULTADOS Y DISCUSION .......................................................................... 36
6.1 Análisis de parámetros .................................................................................... 37
6.2 Estimación del contenido de fenoles totales. ................................................... 38
6.3 Estimación del contenido de flavonoides......................................................... 39
6.4 Estimación del contenido de taninos condensados (Proantocianidinas) ......... 40
6.5 Estimación del contenido de saponinas. ......................................................... 41
7.CONCLUSIONES ............................................................................................... 43
8.RECOMENDACIONES ...................................................................................... 45
9 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 46
ANEXOS ............................................................................................................... 55
iii
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Annona Muricata L...............................................................................9
Figura 2. Ácidos Fenólicos: Benzoicos (hidroxibenzoicos), cinnámicos
(hidroxicinámicos) y derivados (estilbenos)………………………......13
Figura 3. Esqueleto comun difenil-pirano de flavonoides.................................14
Figura 4. Síntesis de naringenina; precursor de algunos grupos de
flavonoides.........................................................................................15
Figura 5. Clases de taninos …………...............................................................16
Figura 6. Forma glucosilada de flavonoides……..............................................16
Figura 7. Estructura de una saponina...............................................................17
Figura 8. Complejos formados entre un flavonoide y un AlCL3........................20
Figura 9. Grafica de contenido de fenoles totales por tratamiento...................38
Figura 10. Grafica de contenido de flavonoides por tratamiento.......................39
Figura 11. Grafica de contenido de taninos por tratamiento..............................40
Figura 12. Grafica de contenido de saponinas por tratamiento..........................41
iv
LISTA DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de Annona Muricata L. .............................. 8
Cuadro 2 Resumen estadístico para altura ...................................................... 32
Cuadro 3 Resumen estadístico para hojas ...................................................... 33
Cuadro 4 Analisis efectos significativo altura,numero de hojas y clorofila ....... 37
Cuadro 5 Analisis efectos significativo metabolitos secundarios ..................... 37
v
RESUMEN
Annona Muricata L. es una planta perenne que se encuentra en varios países con
clima tropical o subtropical, que ha sido tradicionalmente empleada para el
tratamiento de dolor, insomnio, gripa, y otros padecimientos. Se ha correlacionado
la propiedad medicinal de muchas plantas con su contenido de metabolitos
secundarios, por lo que en este trabajo se planteó el objetivo de evaluar el efecto
de los insumos orgánicos sobre el contenido compuestos fenólicos en hojas de
guanábana.
Por lo tanto el estudio del efecto de los niveles de metabolitos secundarios sobre
la evaluación de diferentes tratamientos y concentraciones mediante el uso de
vermicomposta, roca fosfórica, y lixiviados de vermicomposta como fuentes de
insumos orgánicos aun nose ha reportado tanto para el crecimiento de plantas de
guanábana (Annona Muricata L.), y en la producción de metabolitos secundarios
en las hojas de las plantas. En este proyecto se realizaron datos estadísticos de
altura y numero de hojas por cada tratamiento, en cuanto al estudio de
metabolitos se inicio con la obtencion de éstos, mediante un método de extracción
metanólica y se analizaron el contenido de fenoles, flavonoides, taninos y
saponinas por métodos de colorimetría.
Durante el desarrollo de este proyecto en las muestras recolectadas se observó
diferencias significativas en el contenido de clorofila en hojas adicionadas con
vermicomposta. Sin embargo ninguno de los diferentes tratamientos de abonos
aplicados (vermicomposta, roca fosfórica, y lixiviados de vermicomposta) tuvieron
influencia estadística significativa sobre la altura de planta, y número de hojas
evaluado en las plantas de guanábana. Como finalización del estudio los
resultados obtenidos determinaron que hay una influencia estadística significativa
en el contenido de los metabolitos secundarios evaluado en las extracciones
metanolicas de hojas de guanábana del cual se presentaron mayor contenido de
fenoles totales y flavonoides, que en taninos y saponinas.
1
1.INTRODUCCIÓN
La alimentación aporta las sustancias necesarias para el metabolismo humano
(azúcares, proteínas, grasas, etc.), pero al mismo tiempo como resultado del
proceso metabólico, se pueden producir daños al organismo mediante los
radicales libres (RL) y las especies reactivas de oxígeno (ERO) que se liberan en
el proceso. Los radicales libres son moléculas derivadas ya sea por el
metabolismo celular normal o por un estímulo medioambiental como rayos
ultravioletas (UV-A/B), contaminación o una alimentación rica en grasas saturadas,
entre otros. Entre los daños que pueden causar estas especies se cita la
alteración al ADN, provocando mutaciones, inactivación de enzimas y
peroxidaciones lipídicas sobre la membrana celular, incluso como respuesta
inmune en tejidos vegetales, provocan lisis celular (Ali et al., 2008).
El daño celular es consecuencia de un estrés oxidativo; estado del organismo en
el que el equilibrio entre antioxidantes y pro-oxidantes se inclina hacia los últimos.
Para contrarrestar el daño, la célula cuenta con dos mecanismos de protección:
uno endógeno (compuesto por los enzimas superóxido dismutasa, ascorbato
peroxidasa, glutatión reductasa y catalasa) y otro exógeno. El último es el más
extenso, y está formado por compuestos que pueden disminuir y/o eliminar la
actividad reactiva de los compuestos oxidantes (ERO o RL). A este grupo se le
conoce como antioxidantes e incluye a las vitaminas (A, E, C), carotenoides y
polifenoles.
La importancia del grupo de los polifenoles aumentó en la última década debido a
las investigaciones que relacionan su consumo con la disminución de
padecimientos varios, demostrando actividad antioxidante y antiradical.
Estos compuestos se hallan en las plantas, y se obtienen por el consumo de
vegetales en la dieta y por el uso coloquial de plantas medicinales; consumidas en
forma de bebidas tradicionales aromáticas o alcohólicas (cerveza, vino, café y té)
(Chung et al, 1998; Wong et al., 2006).
2
El interés por el cultivo de esta planta se ha incrementado porque se ha
descubierto que en diversos órganos contiene compuestos de interés
farmacológico tales como acetogeninas en hojas (Geum-Soog et al., 1998;
Regasa et al., 2012) y ciclopéptidos (Chao-Ming et al., 1998), encontrados en
semillas. En hojas y raíces se ha detectado la presencia de acetogeninas (Geum-
Soog et al, 1998). En A. muricata se han aislado más de 300 acetogeninas
diferentes (Gleye et al., 1999). Las acetogeninas son moléculas que tienen
interesantes propiedades biológicas que incluyen la citotoxicidad, lo que sugiere
que tienen potencial para usarse como agentes anti-tumorales (Álvarez-González
et al., 2008).
Con respecto a las necesidades nutricionales de las plantas de guanábana, no se
han reportado estudios que clarifiquen como las plantas podrían responder al
fertilizarse tanto con macro nutrimentos como micro nutrimentos, sin embargo, en
algunas regiones del mundo, la guanábana crece en suelos calcáreos que
generalmente tienen un bajo contenido de materia orgánica, pH de 7.5–8.5, y una
alta concentración de bicarbonatos (Ojeda et al., 2004).
Las prácticas comunes utilizadas en la agricultura tales como el uso excesivo de
fertilizantes, degrada los suelos, promueve la contaminación de fuentes de agua y
contaminan la atmosfera, por lo que una opción es usar los abonos orgánicos
(Diacono y Montemurro et al, 2010). Los abonos orgánicos se han utilizado como
un substituto parcial para alimentos nutritivos inorgánicos, particularmente
nitrógeno. También se han utilizado los abonos orgánicos para controlar
patógenos originados en el suelo, en diversos cultivos (Rovesti y Romero, 2003);
(Adriano-Anaya et al., 2011). Uno de los abonos orgánicos más utilizados es la
vermicomposta que es producida por la bio-oxidación y estabilización de los
residuos, como resultado de las interacciones entre algunas especies de lombrices
y microorganismos.
Algunas de las ventajas de la vermicomposta son: es un material rico en todos los
nutrimentos esenciales que requieren los vegetales y contienen vitaminas,
enzimas y hormonas, tales como auxinas y giberelinas.
3
Benefician el crecimiento de las plantas fomentando lo re brotes y hojas nuevas,es
un producto fácil de aplicar, manejar y almacenar. Mejora la estructura del suelo,
la textura, la aireación y la capacidad de retención de agua y previene la erosión.
La vermicomposta es rica en microorganismos benéficos tales como los
solubilizadores de fosfato, degradadores de celulosa, fijadores de nitrógeno, etc.
Previene pérdidas de nutrimentos e incrementa el uso eficiente de los fertilizantes
químicos e incrementa la descomposición de la materia orgánica del suelo
(Vennila et al., 2012)
Otro de los insumos que se utilizan para el cultivo orgánico es la roca fosfórica
debido a que el fósforo es uno de los macro nutrientes esenciales más importantes
ya que induce la formación de un activo y potente sistema radicular. Los cultivos
resultan más resistentes a las plagas y enfermedades y responden mejor a los
efectos negativos del granizo, heladas, vientos, alta temperatura y otros factores
estresantes para la planta (Indriyani and Karsinah, 2011). Entre las fuentes de
fósforo que se disponen para la nutrición de plantas se encuentra la roca fosfórica,
la cual se compone principalmente del mineral fosforita. La fosforita es un cristal
amorfo formado por óxidos no metálicos de fósforo. En su forma natural la roca
fosfórica presenta poca solubilidad, sin embargo, el fósforo contenido se libera por
la acción de ácidos presentes en el medio. Así mismo, la acción de la flora
microbiana natural del suelo promueve la biodisponibilidad de fósforo (Arévalo et
al., 2003).
El lixiviado de vermicomposta es el líquido producido en la descomposición de la
materia orgánica y al percolar el agua de lluvia a través de la misma.
Las características del lixiviado en cuanto a cantidad y composición dependen del
tipo de residuo, de la precipitación media y de la evapotranspiración existente en
el emplazamiento, posee nutrientes solubles y microorganismos benéficos, y se ha
reportado su uso como un fertilizante líquido para diversos cultivos tales como
sorgo (Gutiérrez-Miceli et al., 2008), maíz (García-Gómez et al., 2008; Méndez-
Moreno et al., 2012), chile pimiento (Oliva-Llaven et al., 2008), tomate (Oliva-
4
Llaven et al., 2010), rábano (Gutiérrez-Miceli et al., 2011), zacate limón (León-
Anzueto et al., 2011).
No se ha encontrado ningún reporte sobre la evaluación del efecto de la
vermicomposta, roca fosfórica, y lixiviados de vermicomposta en el crecimiento de
plántulas de guanábana y sobre la producción de compuestos fenólicos en las
hojas de las plántulas.
Por lo que el análisis de metabolitos secundarios ha sido implementado por el
consumo de infusiones que son llevadas a cabo en muchas culturas, lo que es
una costumbre importante que existe desde la antigüedad. La variedad de plantas
que se consumen en forma de infusión es variada, y entre ellas se menciona
comúnmente la guanábana (Annona Muricata L.), quien ha llamado la atención
debido al sin número de propiedades medicinales que se le atribuyen. Al hacer
infusión de las hojas se obtiene un efecto sedativo, que además se considera un
analgésico, antiespasmódico y remedio para problemas de: vejiga, catarro e
indigestión, las hojas se usan para aliviar problemas de la piel y reumatismo
(Heninrich, 2005).
Por ello la necesidad de conocer su composición y sobre todo el interés de
analizar cualitativamente y cuantitativamente los distintos productos metabólicos
secundarios obtenidos a partir de un extracto de plantas de guanábana (Annona
Muricata L.), las cuales son cultivadas con el objetivo de ver el efecto que
conlleva las diferentes concentraciones de insumos orgánicos.
5
2.ANTECEDENTES
El reino más amplio en el planeta es el vegetal. La función de las plantas es
variada; para el ser humano es una de las fuentes principales de alimentación
debido a su fruto y productos secundarios. La composición general de las plantas
incluye una variedad de compuestos químicos, entre los que destacan los
metabolitos secundarios, quienes se encargan de proteger a la planta de los
efectos dañinos que puede provocar el medio ambiente a su sistema, la protege
de daño celular y de los depredadores; esto debido a olores, sabores y la
capacidad antimicrobiana y antifúngica que pueden presentar. Ciertas plantas
presentan propiedades medicinales y son las que se utilizan contra padecimientos
como gripa, dolores, insomnio, ciertas infecciones, etc., consumidas directamente
en la dieta o como bebidas; siendo el té, café, vino y cerveza las más populares
(Andrade-Cetto y Heinrich, 2005).
En la mayoría de los casos la función y beneficio de los metabolitos secundarios
aún se desconoce. Algunos de ellos son producidos por razones fácilmente
apreciables, como por ejemplo las toxinas que proveen una defensa contra los
depredadores, compuestos volátiles que atraen a ciertas especies en pro de la
reproducción del organismo, colorantes o como advertencia a otras especies; pero
es lógico asumir que todos y cada uno de ellos juega un papel vital para quien lo
produce (Dewick, 2009).
6
2.1 Guanábana (Annona muricata L.)
El árbol de la guanábana es uno de los primeros que se introdujeron en los
trópicos del viejo mundo. Su origen es de las regiones tropicales de Sudamérica.
Nombre Común.- Guanábana
Especie Botánica.- Annona muricata
Familia.- Fruta de familia de las ANNONACEA.
El árbol es ampliamente conocido en los países tropicales por la exquisitez de sus
frutos, no se conoce a ciencia cierta la región de origen, probablemente sea de las
Antillas de donde se difundió a todos los países tropicales de América y África
Occidental.
Variedades.- Por su sabor se clasifica en:
Semi ácida
Semi dulce
Dulce
Forma.- Su forma ovalada se asemeja mucho a un corazón, le recubre una
cáscara de color verde oscuro con varias espinas pequeñas, suaves y carnosas
que se desprenden fácilmente cuando la fruta ya está madura.
Tamaño y peso.- La fruta alcanza los 10 a 30 cm de longitud y su peso va de 1 a
10 kilos.
Descripción de: Pulpa.- Su textura suave y blanca es muy similar al algodón,
además es cremosa y jugosa, y recubre las semillas negras de un tamaño que va
desde 1.25 a 2cm de largo, cada fruta puede tener hasta 200 semillas. Sabor.- Su
sabor se caracteriza por ser muy similar al de la chirimoya es sub-ácido.
Su uso en la medicina tradicional es amplio, ya que en muchos países es
consumida como bebida. La infusión o decocción de hojas secas se ha utilizado
para tratar diferentes padecimientos: antiespasmódico, anti-hipertensivo, dolor
7
estomacal, relajante y como auxiliar del sueño en pacientes con fiebre (Figueirinha
et al., 2008).
En India es utilizado contra problemas gastrointestinales (Ortiz et al. 2002), en
China como ansiolítico, y en Nigeria y otros países en desarrollo se emplea para
tratar la diabetes mellitus (Adeneye y Agbaje, 2007). Se ha reportado su uso
contra gripa, fiebre, neumonía y contra problemas gástricos, ciertas infecciones en
garganta y contra hongos en los pies (Adeneye y Agbaje, 2007; Negrelle y Gomes,
2007). Estudios de los extractos de C. citratus han demostrado su actividad anti-
inflamatoria, vasodilatadora y diurética (Leite et al., 1986; Ortiz et al., 2002:
Figueirinha et al., 2008). De forma que Leite et al. (1968) reportaron que en Brasil
es usado como relajante, contra insomnio, ansiedad e irritabilidad y posiciona a la
especie como una de las plantas medicinales con más uso en el mundo.
2.1.1 Descripción botánica
El Árbol es casi siempre verde (solo pierde las hojas al florecer), mide 3 a 7 m de
altura, con crecimiento erecto, las hojas son alternadas, simples, enteras, de
superficie exterior coriácea y color verde brillante, muy atractivas y de forma
alargada, al estrujarse despiden un olor característico. El tronco es recto y de color
grisáceo, ramifica a baja altura.7
Flores.- Posee tres sépalos, tiene de tres a seis pétalos y numerosos estambres,
tiene varios pistilos y un solo óvulo. Las semillas son negras, brillantes y se
encuentran diseminadas en la pulpa.
Raíces.- Su sistema radicular extensivo le permite soportar períodos relativamente
largos de sequía, ya que explora y cubre una amplia franja de terreno. En suelos
sin ningún obstáculo, las raíces llegan a penetrar más de un metro de profundidad,
por lo que, al seleccionar un sitio para establecer una plantación comercial, se
deben buscar suelos con esa profundidad mínima efectiva.8
8
Sistema de propagación.- La guanábana es una planta que puede propagarse
tanto por vía sexual (semilla) como por vía asexual o vegetativa por medio de
yemas o estacas.
Propagación sexual.- Esta consiste en la propagación a través de semillas las
cuales son seleccionadas de los mejores frutos de los árboles que previamente
han sido escogidos rigurosamente comparando que tengan mayor resistencia a
las enfermedades, su producción, el tamaño, la textura y sabor de la fruta.
Las semillas se extraen solo de los árboles que hayan completado su madurez
fisiológica. Estas semillas son lavadas, limpiadas, sumergidas en agua por una
hora y finalmente se las pone a secar para su uso final.
Propagación asexual.- Consiste en propagar la guanábana por medio de injertos,
estacas y acodos.
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de Annona muricata L.
Reino: Plantae
Familia: Annonaceae
Orden Ranales
Genero Annona
Especie Muricata
Nombre científico Annona muricata L:
Fuente: (Garcia Soto et al., 2008).
La clasificación taxonómica de la planta se muestra en el cuadro 1. Los nombres
con los que se le conoce a esta especie después de Annona Muricata L. son
Guanábana en México. Otros términos incluyen Guayabano, Guyabano, Yabana,
Guanábano, Graviola, entre otros. Los nombres comunes pueden ser tan variados,
tanto como el número de países donde se emplea como medicina tradicional.
9
Figura 1. Annona Muricata L. a) Crecimiento ramificado; b) Fruto; c) Hojas.
2.1.2 Actividad polifenólica de Annona Muricata L.
Las plantas medicinales son comúnmente ricas en compuestos polifenólicos, tales
como los flavonoides, ácidos fenólicos, estilbenos, taninos, cumarinas, lignanos y
ligninas. Estos compuestos tienen múltiples efectos biológicos, incluyendo
actividad antioxidante (Packer et al.,1999). En experimentos in vitro en un
compuestos antioxidantes en las plantas muestran la forma en que se protegen
contra el daño de la oxidación mediante la inhibición de los radicales libres y
especies reactivas de oxígeno (Ali et al., 2008). El papel de estos compuestos
como antioxidantes puede ser inferido por su similitud con los antioxidantes
sintéticos de estructuras relacionadas.
c
b
a
10
Los compuestos polifenólicos, tales como flavonoides, ácido fenólico y taninos,
poseen propiedades anti-inflamatorias, anti-cancerígenas, anti-ateroscleróticas y
otras propiedades que pueden ser relacionadas a sus actividades antioxidantes
(Chung et al, 1998;Wong et al., 2006). Los flavonoides y flavonoles son dos poli-
compuestos fenólicos que juegan un papel importante en la estabilización la
oxidación de lípidos y están asociados con actividad antioxidante (Yen et al.,
1993). Los compuestos fenólicos pueden contribuir directamente a la acción
antioxidante (Duh et al., 1999).
Los compuestos polifenólicos pueden tener un efecto inhibitorio sobre
mutagénesis y la carcinogénesis en los seres humanos al ingerir hasta 1 gramo,
todos los días de una dieta rica en frutas y verduras-vegetales (Tanaka et al.,
1998). Las actividades antioxidantes observando se pueden atribuir tanto a los
diferentes mecanismos de ingestas ejercidas por diferentes compuestos fenólicos
y para los efectos sinérgicos de diferentes compuestos.
Annona pertenece a la familia de la chirimoya la mayorías de las piezas de la
planta, son usadas en la medicina herbal y se encuentra que es una buena fuente
de antioxidantes naturales sus hojas y constituyentes incluyen varios alcaloides,
por lo que algunos informes han demostrado que especies de Annona presentan
actividad antioxidante en diferentes modelos in vitro debido a la presencia de
flavonoides como la rutina y hiperósido.
De manera que algunos compuestos se presentan en Annona muricata, (Familia
Annonaceae) como Cyclohexapéptidos, acetogeninas, acetogeninas annonaceas
son los principal fitoquímico estudiados de esta planta medicinal. Un análisis
fitoquímico de la planta reveló la presencia de taninos, esteroides y glucósidos
cardíacos que están en los principales compuestos fitoquímicos. La pulpa obtenida
de la planta se muestra la propiedad difusividad térmica. Esta revisión incluye la
aplicación potencial de la planta más arriba en el campo farmacéutico debido a
sus actividades farmacológicas.
11
El fruto es de valor económico y por lo tanto cultivado y utilizado ampliamente
como un alimento comestible y potencial en compuesto medicinales por lo que
esto indica diferentes formas de trabajar en el futuro (Gonzales-Esquinca et al.,
2011).
2.2 Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de sustancias
químicas, considerados metabolitos secundarios en las plantas, con variadas
estructuras químicas y actividad (Martínez-Valverde et al., 2000). Su forma más
frecuente es la de polímeros o lignina insoluble, mientras que su presencia en los
tejidos animales está relaciona con el consumo de alimentos vegetales.
En los vegetales, son metabolitos esenciales para el crecimiento, reproducción y
como agentes protectores frente a la acción de patógenos (secretados como
mecanismo de defensa) y los pigmentos como atrayentes de polinizadores (Dirzo,
1985; Martínez-Valverde et al., 2000; Martínez, 2010). En los alimentos están
directamente relacionados a la calidad sensorial de los productos alimenticios
vegetales, tanto frescos como procesados. Contribuyen a las pigmentaciones de
todos los vegetales, siendo las antociadininas responsables de las coloraciones
roja, azul, violeta, naranja y púrpura de la mayoría de las plantas y sus productos.
Por otro lado, los taninos condensados o proantocianidinas son los que se asocian
con la astringencia que presentan muchas frutas comestibles antes de la
maduración, además del sabor característico que le da a los vinos, en los que
contribuye con el sabor amargo y a la apreciación organoléptica de los mismos,
pudiendo distinguir a un vino tinto de uno blanco.
12
2.2.1 Estructura y clasificación de los compuestos polifenólicos
La clasificación de los polifenoles está basada en la distinción entre compuestos
no flavonoides (ácidos fenólicos, fenoles simples e hidroxicinámicos) y
flavonoides, siendo los últimos quienes poseen una estructura más compleja;
poseen un esqueleto carbonado C6-C3-C6 (Flanzy, 2003).
2.2.2. Fenoles totales
Desde el punto de vista químico, los compuestos fenólicos están caracterizados
por un núcleo bencénico que lleva uno o varios grupos hidroxilos, es decir, están
formados por un esqueleto carbonado C6-C3; esta denominación abarca a los
ácidos fenólicos, que a su vez se dividen en ácidos benzoicos (ácido gálico) (C6-
C1) y ácidos cinnámicos (ácidos cinnámico, caféico y cumárico) quienes portan
una cadena lateral insaturada (C6-C3), pero también incluyen a otros derivados
fenólicos como los estilbenos (Figura 3). La reactividad de este tipo de molécula
es debida tanto a la presencia de la función fenol que, por la movilidad de su
átomo de hidrógeno, presenta un carácter ácido, como al núcleo bencénico que
puede sufrir substituciones electrófilas (Flanzy, 2003).
La naturaleza de los polifenoles varía desde moléculas simples como los ácidos
fenólicos y derivados, hasta compuestos altamente polimerizados como los
taninos condensados o proantocianidinas. Pueden estar también en formas
conjugadas (glucósidos) con uno o más restos de azúcares unidos a grupos
hidroxilo o directamente al anillo aromático; forma más común de hallar a esta
clase de compuestos. Los azúcares asociados a los polifenoles pueden ser
monosacáridos, disacáridos o incluso oligosacáridos. Los azúcares más comunes
son la glucosa, galactosa, arabinosa, ramnosa, xilosa y ácidos glucorónico y
galacturónico.
13
Aunque también pueden encontrarse unidos a ácidos carboxílicos o ácidos
orgánicos (ácidos fenil-acéticos), aminas, lípidos y a otros compuestos fenólicos.
Figura 2. Ácidos Fenólicos: Benzoicos (hidroxibenzoicos), cinnámicos (hidroxicinámicos) y
derivados (estilbenos).
Los polifenoles cumplen ciertas funciones en los alimentos, incluyendo color y
astringencia. La astringencia en frutos inmaduros se relaciona con los compuestos
tánicos; grupo diverso de moléculas con pesos cercanos a 3000 Da que se forman
de ácidos carbocíclicos, fenólicos y azúcares. Suelen agruparse de acuerdo a su
estructura química (Harborne, 1986; Flanzy, 2003), aunque también a su forma de
extracción (Martínez, 2010).
El segundo grupo de los polifenoles está integrado por los flavonoides; la familia
más amplia entre los polifenoles, con cerca de 5000 diferentes compuestos
(Martínez-Valverde et al., 2000).
2.2.3 Flavonoides
Los flavonoides (del latín flavus; amarillo) constituyen el grupo más importante
dentro de la clasificación de los polifenoles. Son sustancias de origen vegetal que
se hallan en forma libre (aglucona) o glucosilada en el líquido vacuolar,
cloroplastos y membranas celulares. Son responsables de la coloración (rojo, azul
y amarillo) en flores y en las hojas en otoño, y protegen al organismo del daño
producido por agentes oxidantes como los rayos UV, la contaminación ambiental y
contra depredadores (Martínez-Flórez, 2002).
14
Figura 3. Esqueleto común difenil-pirano de flavonoides (Burda y Oleszek, 2002).
Fueron descubiertos por el premio Nobel Szent-Györgyi, quien en 1930 aisló la
citrina de la cáscara de limón; sustancia que regulaba la permeabilidad de los
capilares. En un principio, los flavonoides fueron denominados como vitamina P
(por permeabilidad), hecho que no pudo comprobarse y alrededor de 1950 se
abandonó dicha denominación (Martínez-Flórez, 2002).
Su estructura está formada por un esqueleto difenil-pirano (C6-C3-C6); dos anillos
(A y B) que provienen ya sea de la ruta del acetato o la del shikimato, unidos a
través de un anillo pirona o pirán heterocíclico (C) (Figura 4). Hasta ahora, esta
familia incluye 13 tipos de flavonoides: chalconas, dihidrochalconas, uronas,
flavonas, flavonoles, dihidroflavonoles (flavononoles), flavanonas, flavanoles,
flavonodioles o leucoantocianidinas (4-flavanoles y 3,4-flavanodioles),
antocianidinas (antocioanidoles), isoflavonoides, biflavonoides y proantocianidinas
o taninos condensados (Pérez-Trueba, 2003); algunos de estos grupos tienen
como precursor a la naringenina, que a su vez proviene de una chalcona formada
por la elongación del ácido 4-hidroxicinámico y 3 unidades de malonil-CoA(Figura
5) (Dewick, 2009). Las diferencias entre grupos es debida al grado de oxidación
(sustituyentes —OH), naturaleza y número de alquilaciones, sustituyentes
glucósidos y el grado de polimerización de la estructura carbonada.
15
Estructuras más complejas de estos compuestos forman polímeros conocidos
como taninos, las cuales se clasifican ya sea como taninos condensados o taninos
hidrolizables.
Figura 4. Síntesis de naringenina; precursor de algunos grupos de flavonoides
(Dewick, 2009).
Ambos grupos pueden ser hidrolizados, la diferencia radica en los productos de
diferente índole que se genera al hidrolizar cada uno. Los taninos condensados
son los derivados de la estructura flavan-3,4-diol o proantocianidinas, mientras que
los taninos hidrolizables son polímeros de ácido gálico esterificado a glucosa y
fenoles simples, pudiendo formar galotaninos (polímero de ácido gálico) o
elagitaninos (polímero de ácido elágico) (Fig. 6) (Dewick, 2009). El término tanino
hace referencia a su capacidad de interactuar con las proteínas, antiguamente
empleado en el curtido de pieles (Flanzy, 2003).
16
Figura 5. Clases de Taninos (Dewick, 2009)
En las plantas superiores, los flavonoides se hallan comúnmente en su forma
glucosídica, esto quiere decir que están ligados con uno o más azúcares a un
grupo hidroxilo (O-glucósidos) o directamente a uno de los carbonos del esqueleto
común (C-glucósidos), lo que los hace solubles en agua, solventes orgánicos y
mezclas alcohólico-acuosas (Martínez-Valverde et al., 2000; Andersen y Markham,
2006). Ejemplos de flavonoides glucosilados son la rutina, en la que un disacárido
[3-O-rutinosa o ramnosíl-(α16)-glucosa] se une a la quercetina, y la naringenina
en el que el disacárido (7-O-neohesperidosa) se une a la naringina (Figura 7)Figura
6. Forma glucosilada de flavonoides (Dewick, 2009)..
Figura 6. Forma glucosilada de flavonoides (Dewick, 2009).
17
El grado de saturación es lo que define las características que presentan todos los
compuestos fenólicos. Su solubilidad está definida por el tipo de sustituyentes en
la cadena carbonada; es más soluble en su forma glucosilada que en la respectiva
aglucona. Además, estudios han revelado que su actividad antioxidante y
antiradical depende también de ello; grupos hidroxilo libres en posición C-3 dan a
los flavonoles elevada actividad antioxidante, mientras que el doble enlace en C2-
C3 y sustituyentes –OH libres en C-3’ aumentan las características antiradicales
(Burda y Oleszek, 2001).
2.2.4 Saponinas
Las saponinas son metabolitos secundarios que pertenecen al grupo de los
glicósidos, donde se incluyen a las sustancias constituidas por azúcares en forma
de acetales. Consisten de un núcleo lipofílico que puede presentar una estructura
esteroide o triterpenoide, con una o más cadenas de carbohidratos (Figura 7). Al
núcleo lipofílico se le denomina aglicón, por ser el grupo que está enlazado a un
átomo de carbono anomérico, que es el átomo de carbono enlazado a dos
oxígenos,o a un oxígeno y cualquier otro heteroátomo, como nitrógeno (Wade,
2004). La naturaleza química del aglicón definirá la clasificación de la saponina
como esteroidal o triterpenoide.
Figura 7. Estructura de una de saponina triterpenoide de Quillaja saponaria (Kimet al .,
2006).
18
El aglicón proporciona un grupo hidroxilo para la formación de un acetal, un
derivado que surge de la reacción entre un grupo funcional cetona o un aldehído, y
dos moléculas de alcohol, con la pérdida de una molécula de agua. Los
carbohidratos que se unen al aglicón deben estar en forma de un hemiacetal
(derivado de un aldehído o cetona resultante de la adición de una molécula de
alcohol al grupo carbonilo) (Kirk y Othmer, 1969; Wade, 2004). Los carbohidratos
también se pueden unir mediante una función éster (Meesapyodsuket et al., 2007).
Dependiendo del número de cadenas de azúcares que contenga la molécula se
aplican los términos monodesmósido, bidesmósido y tridesmósido, para una, dosy
tres cadenas respectivamente (en griego ―desmos‖ quiere decir cadena)
(Oleszek,2002).Cuando se separan los carbohidratos del aglicón, por vía
enzimática o hidrólisis ácida, la porción lipofílica generada recibe la denominación
genérica de―sapogenina‖ (cuando una saponina se hidroliza, se cambia la
terminación –ina por –genina, por ejemplo, dioscina se vuelve diosgenina).
Las saponinas están ampliamente distribuidas en las plantas, sin embargo no son
exclusivas de los vegetales, ya que también se han encontrado en algunas
bacterias y en animales marinos inferiores del filum Echinodermata, como las
estrellas (clase Asteroidea) y los pepinos de mar pertenecientes a la clase
Holothuridea (Oleszek, 2002)
2.3 Determinación de compuestos metabolitos secundarios
Para la identificación de estos compuestos, muchos autores citan el uso de
equipos avanzados como son el cromatógrafo de gases o el de líquidos de alta
resolución. Estos equipos son costosos, pero precisos y confiables. Sin embargo,
el uso de técnicas colorimétricas es de uso común en la fase inicial de un estudio
fitoquímico, sobre todo si se trata de determinar concentraciones totales de
familias de compuestos.
19
Para la elucidación de estructuras y cuantificación de estos compuestos se
requiere el uso de variadas técnicas. Por ejemplo, para el análisis de polifenoles
en propóleo se han empleado métodos colorimétricos, cromatografía en capa fina
(TLC), cromatografía de gases (CG), espectrometría de masas acoplado a
cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta resolución (Chang et al.,
2002); de esta manera, en los últimos años la mayoría de trabajos sobre análisis
de polifenoles se basan en dichos métodos cromatográficos. El equipo más
empleado para separar y cuantificar estos compuestos es el HPLC (Martínez,
2010). Por supuesto, existe una amplia variedad de soportes y fases móviles
disponibles, tanto para flavonoides, proantocianidinas, ácidos benzoicos y otros.
Esta metodología es habitualmente empleada en la identificación y cuantificación
de polifenoles presentes en sistemas acuoso-orgánicos de alimentos sólidos o
bebidas. Sin embargo, la cuantificación de taninos condensados o
proantocianidinas de alto peso molecular y polifenoles hidrolizables, principales
compuestos polifenólicos presentes en los residuos de extracción, se ha basado
hasta ahora en el empleo de métodos espectrofotométricos (Martínez, 2010). Así,
la técnica colorimétrica empleada para determinar compuestos polifenólicos, se
basa en la reacción que se da entre las estructuras que posean un anillo
aromático y el reactivo de Folin-Ciocalteau (Singleton et al., 1999), nombre con el
cual se denomina la técnica. Los resultados suelen expresarse comparándose con
un estándar como el ácido gálico, tánico o algún ácido benzoico similar,
dependiendo la muestra analizada. El método se basa en la reducción del reactivo
de Folin-Ciocalteau, mezcla formada por óxido de tungsteno y molibdeno. El
producto reducido del reactivo genera un complejo con coloración azul que
presenta un pico de máxima absorción a 765 nm, cuya intensidad es proporcional
a la concentración de los fenoles que reaccionan. El desarrollo de color tras la
reacción es lento, pero el proceso se puede acelerar mediante el calentamiento de
la mezcla, sin embargo, si el calentamiento es excesivo la pérdida de coloración
es inevitable, provocando que los resultados sean difíciles de reproducir
(Waterhouse, 2002).
20
El método colorimétrico con tricloruro de aluminio (AlCl3) y el de 2,4-
Dinitrofenilhidrazina (2,4-DNFH) fue empleado por Chang et al. (2002) para la
determinación complementaria de flavonoides. El tricloruro de aluminio forma
complejos ácidos estables con el grupo ceto en C-4 o en grupos hidroxil libres en
C-3 o C-5 de flavonas y flavonoles, y aunque también puede reaccionar con el
grupo hidroxilo C-5 de flavanonas, las absorbencias de los complejos generados
son casi insignificantes. Además, el tricloruro forma complejos ácido-lábiles con
los grupos orto-dihidroxilo en los anillos A o B de los flavonoides; estos complejos
muestran un máximo de absorbencia entre 415-440 nm; producto del efecto
batocrómico del complejo con tricloruro de aluminio (Figura 8).
Los flavonoides en general poseen una coloración amarilla, cuya intensidad está
relacionada al pH de la solución; mientras más básica sea ésta, la coloración será
más intensa; característica que se aprovecha en su determinación. Una
característica de los flavonoides que es de gran utilidad en su análisis, es la
presencia del anillo aromático. Éste es un excelente cromóforo, y por
consiguiente, absorbe en la región UV del espectro electromagnético,
proveyéndonos de valiosa información estructural, con lo que se distingue el tipo
de fenol y grado de oxidación en su estructura (Andersen y Markham, 2006).
Figura 8. Complejos formados entre un flavonoide y el AlCl3. (Chang, 2002)
21
2.3.1 Antioxidantes
Un compuesto antioxidante, es cualquier substancia capaz de neutralizar a los
radicales libres y sus reacciones (Davasagayam et al., 2004). Impiden que otras
moléculas se unan al oxígeno al reaccionar-interactuar más rápido con los
radicales libres del oxígeno que con el resto de moléculas presentes en un
ambiente determinado (Durán y Padilla, 1993) y su acción se puede realizar tanto
en medios hidrofílicos como hidrofóbicos. Compuestos como los ácidos fenólicos y
flavonoides actúan como eliminadores (Scavengers) de radicales libres como los
peróxidos, hidroperóxidos o peroxilos (producto de la oxidación de lípidos) con el
fin de mantener el equilibrio pro-oxidante/antioxidante a favor de estos últimos
(Durán y Padilla, 1993; Venereo, 2002; Vidal, 2008). Las fuentes principales de
antioxidantes son los granos, frutas y vegetales. Los antioxidantes naturales
protegen al organismo, mientras los agregados químicos protegen de la
degeneración o rancidez a los alimentos.
Se denominan suplementos antioxidantes a las vitaminas (carotenos, vitaminas A,
E y C), polifenoles, enzimas (catalasas, peroxidasas y dismutasa
superperoxidasas) y minerales necesarios para que el sitio activo enzimático lleve
a cabo la catálisis (selenio, magnesio, zinc y cobre, entre otros) (Benezer-Benezer
et al., 2007; Vidal, 2008).
2.4 Vermicomposta
La palabra composta proviene del latín componere, juntar; por lo tanto composta
es la reunión de un conjunto de restos orgánicos que sufren un proceso de
fermentación y da un producto de color marrón oscuro, con olor a humus.Este
abono orgánico resultante contiene materia orgánica (parte de la cual es
semejante al humus de la tierra), así como nutrientes: nitrógeno, fósforo, potasio,
magnesio, calcio, hierro y otros oligoelementos necesarios para la vida de las
plantas. Es un producto con vida, con una gran variedad y densidad de
microorganismos que sintetizan enzimas, vitaminas, hormonas, etc. y que
repercuten favorablemente en el equilibrio biótico del suelo.
22
Esta técnica fue iniciada por Sir Alfred Howar en la India en 1925, quien procesaba
residuos orgánicos como basuras, pajas y hojas, con capas alternadas con
estiércol y fango cloacal. Este proceso tiene diversidad de variantes, pero siempre
manteniendo el mismo principio; el proceso fue modificado por el Consejo de
Investigación Agronómicas de la India para acelerar la acción aerobia y reducir los
malos olores. La composta realizada con basuras debe dar un producto de grano
fino, no debe llevar materiales inertes como vidrio y plástico, y ha de estar
pasteurizado para no contener gérmenes patógenos, ni semillas sin germinar.
Debido a su materia orgánica y al humus que se deriva de ella, la composta posee
la facultad de enmendar las características físicas del suelo: contribuyendo a la
estabilidad de las estructuras de sus agregados (los suelos compactados se
sueltan bajo la acción de la materia orgánica y los suelos arenosos se compactan
por la misma acción), aumentando la capacidad de retención de agua; mejorando
su porosidad, lo que facilita su aireación. La acción química de la composta se
manifiesta por su capacidad de intercambio catiónico superior a la de cualquier
arcilla, suministra directamente a las plantas los tres elementos básicos N, P, K y
hace una importante aportación de oligoelementos tales como hierro, manganeso,
zinc, boro, cobre, etc. Además, por efecto de su oxidación lenta, produce gas
carbónico, que contribuye a solubilizar algunos elementos minerales del suelo,
facilitando su asimilación por las plantas (Cegarra, 1996).
La actividad biológica del suelo se ve favorecida por el aporte de un número
importante de bacterias que se encuentran en la composta, pero es sobre todo su
riqueza en materia orgánica lo que favorece el desarrollo de los microorganismos
del mismo suelo, que con su actividad estimulan el crecimiento vegetal,
especialmente para las raíces. Esta acción biológica favorece la descomposición
de los componentes minerales insolubles, como los fosfatos, que son necesarios
para el desarrollo de las plantas; y el nitrógeno soluble, que puede desaparecer
fácilmente por lixiviación, es transformado en nitrógeno orgánico en el cuerpo de
los microorganismos. De forma que cuando éstos mueren, quedan de nuevo
disponibles para las raíces de las plantas y mientras tanto es menos probable que
se pierdan por lixiviación o como amoníaco en el aire (Cegarra, 1996).
23
El compostaje y el vermicompostaje (lombricompostaje) son procesos aeróbicos
de transformación de residuos orgánicos, animales y vegetales, que ocurren
constantemente en la naturaleza bajo la acción de lombrices, bacterias y hongos
de la materia orgánica. El aprovechamiento de estos residuos orgánicos cobra
cada día mayor importancia como medio eficiente de reciclaje racional de
nutrientes, que ayuda al crecimiento de las plantas y devuelven al suelo muchos
de los elementos extraídos durante el proceso productivo (Cegarra, 1996).
Asimismo, mejoran las características físicas y previenen la erosión del suelo,
reducen la dependencia de insumos externos de alto costo económico y
ambiental, enfocado a una agricultura sostenible, en donde se disminuye y elimina
el empleo de agroquímicos a fin de proteger el ambiente, y la salud animal y
humana. La fracción líquida que se obtiene del proceso de compostaje del
estiércol se conoce como lixiviados de composta, extractos de composta y té de
composta y presenta como ventaja una densidad más uniforme. Los lixiviados de
composta se producen directamente de las pilas, son ricos en elementos nutritivos
y contienen microorganismos y se caracterizan por una coloración negruzca. Los
lixiviados han sido considerados, tradicionalmente, como un fertilizante líquido
orgánico (Cegarra, 1996).
Además, estos materiales están siendo utilizados para el control de plagas y
enfermedades, puesto que tienen una gran abundancia y diversidad de
microorganismos benéficos, por lo que no son considerados pesticidas. Otros
contienen químicos antimicrobianos que inhiben el crecimiento de hongos; dada la
gran variedad de lixiviados es muy difícil determinar el número de
microorganismos benéficos presentes. La composición física de los residuos
sólidos vegetales de tipo agroindustrial y agropecuario, se deben aprovechar para
disminuir en gran medida la presión sobre el medio ambiente como soporte de
actividades antrópicas; y con ello, estos se reincorporarán en forma de nutrientes
para fertilidad de los suelos agrícolas, así como una alternativa de control
biológico de plagas y enfermedades de los mismos, disminuyendo el uso y
aplicación de agroquímicos.
24
Este aprovechamiento conduce de manera directa a la disminución de impactos
ambientales y sociales generados, en especial, en el componente de disposición
final, lo cual es competencia de la gestión y manejo ambiental (Cegarra, 1996).
2.5 Roca fosfórica.
Roca fosfórica es un nombre colectivo utilizado para denominar todos los
minerales que contienen fosfatos. Las rocas fosfóricas constituyen un recurso
natural finito, no renovable y los depósitos geológicos de diferente origen se
encuentran en todo el mundo. En la actualidad son explotados pocos yacimientos
de roca fosfórica y cerca del 90 por ciento de la producción mundial es utilizada
por la industria para la fabricación de fertilizantes fosfatados, mientras que el resto
se emplea para la producción de alimentos para animales, detergentes y otros
productos químicos.
Sin embargo, muchos yacimientos de roca fosfórica que se encuentran en las
zonas tropicales y subtropicales no son explotados. Una razón es que las
características de estas rocas fosfóricas, si bien son adecuadas para la aplicación
directa, no reúnen las normas de calidad requeridas para producir fertilizantes
fosfatados solubles en agua utilizando la tecnología convencional de
procesamiento industrial. Otra razón es que los depósitos son demasiado
pequeños para justificar las inversiones necesarias para su explotación minera y
procesamiento.
Las rocas fosfóricas son la materia prima básica para la producción de los
fertilizantes fosfatados. El compuesto fosfatado en las rocas fosfóricas es algún
tipo de apatita. Según el origen del depósito de la roca fosfórica y su historia
geológica, las apatitas pueden presentar propiedades físicas, químicas y
cristalográficas diferentes. Con las rocas fosfóricas se hallan asociados grupos
definidos de minerales accesorios de diversos orígenes y edades geológicas. Por
lo tanto, es imperativo establecer procedimientos simples para la caracterización
normalizada de las rocas fosfóricas, definir las normas de calidad para fines de la
aplicación directa y luego clasificarlas.
25
Las fuentes de roca fosfórica de calidad conocida pueden ser utilizadas como
materiales de referencia para los fines de comparación.
Las características mineralógicas, químicas y texturales de los minerales de
fosfatos y sus concentrados determinan: i) su conveniencia para los diversos tipos
de procesos de «beneficio» o enriquecimiento para mejorar la calidad de los
minerales y eliminar las impurezas, ii) su adecuación a los varios tipos de
procesamiento químico y, iii) su capacidad para ser utilizada como roca fosfórica
para la aplicación directa. Los factores más importantes en su evaluación para la
aplicación directa son: el grado o ley, la conveniencia para el beneficio y la
reactividad de la apatita. Una matriz completa de caracterización basada en la
integración de todos los datos obtenidos por varios métodos analíticos determina
el potencial de beneficio y los mejores usos posibles de la roca fosfórica en la
producción de los fertilizantes fosfatados solubles o como fertilizante de aplicación
directa.
La aplicación de roca fosfórica al suelo como fuente de fósforo requiere de un
ambiente apropiado que facilite el proceso de disolución de la misma.
En este orden de ideas se ha sugerido que la aplicación de diversos materiales
orgánicos, el estiércol de diversos orígenes, entre éstos, en forma conjunta a la
roca fosfórica (RF) permite incrementar los niveles de fósforo liberados por ésta,
con relación a eso He et al. (1997) muestran resultados según los cuales la
solubilidad de la roca se incrementó notablemente con la aplicación de celulosa;
efecto que sería posible cuando se incorpora estiércol de bovino dado sus
elevados contenidos de celulosa. Una de las teorías propuestas para explicar tal
efecto supone que, el calcio liberado por la roca durante su proceso de disolución
puede ser quelatado por los compuestos orgánicos (CO) gracias a grupos
funcionales o aniones como el citrato y el oxalato.
26
Amberger y Singh (1994), señalan que en el caso de la materia orgánica (MO)
estable del suelo, la fracción correspondiente a los ácidos fúlvicos es, en gran
medida, responsable de los procesos de quelación. Este mecanismo, sea mediado
por la MO estable o por productos orgánicos de incorporación reciente, permite
―eliminar‖ del sistema uno de los productos de la reacción de disolución de la RF,
ello conducirá a un desplazamiento de los equilibrios y en consecuencia al
incremento de la disolución de la misma. La producción de este fenómeno
requiere, según estimaciones hechas, periodos de dos a cuatro semanas.
Otro enfoque importante es aquel que sostiene que es la producción de ácidos
orgánicos de cadena corta, durante las primeras etapas de descomposición de los
CO añadidos (Christ y Davies, 1996; Baziramakenga y Simard, 1998), la
responsable del incremento del proceso de disolución. En este caso se considera
que los mencionados ácidos suministran los H+ necesarios para el ataque de
fosfatos altamente insolubles tales como la RF Fox et al., 1990; Gerke et al.,
2000). Es evidente que existe la posibilidad de que ambos fenómenos ocurran y
que el predominio de uno u otro dependerá de la combinación de suelo, clima y
CO incorporados, así como de las características de la roca utilizada. Existe, no
obstante otro enfoque, que de acuerdo a nuestro punto de vista no ha sido
considerado, y es el hecho de que el estiércol constituye un inóculo rico en un
gran número de cepas bacterianas que han sido señaladas como solubilizadoras
de fósforo, tal es el caso de bacterias de los géneros Bacillus y Xanthomonas (De
Freitas et al., 1997; Sahn y Jana, 2000).
27
2.6 Lixiviado
Debido al creciente interés en el cultivo de la guanábana debido a la identificación
de metabolitos de alto valor agregado, es necesario que los agricultores tengan
alternativas de cultivo diferentes a los tradicionales donde suelen aplicarse
fertilizantes químicos y el cual se ha demostrado que no son sustentables con el
medio ambiente.
Es necesario promover el uso de abonos orgánico, algunos de los cuales pueden
ser producidos por los mismos agricultores y otros pueden ser adquiridos a bajo
costo(Gómez et al 2013).
Una justificante científica es que no se tienen reportes del uso de vermicomposta,
lixiviados de vermicomposta y de roca fosfórica y su efecto sobre el crecimiento de
las plántulas de guanabana y la producción de metabolitos secundarios.
El humus de lombriz ha sido considerado en los últimos años el mejor fertilizante
orgánico. El humus de lombriz puede almacenarse durante mucho tiempo sin que
sus propiedades se vean alteradas, pero es necesario mantenerlas bajo
condiciones óptimas de humedad (40%).Los beneficios más significativos son
entre otros lo siguientes:
Los hongos y las bacterias que se encuentran inmersos en el humus de lombriz,
facilitan de gran forma a las plantas a controlar ciertas plagas, debido a que dichas
plantas poseen la potestad de absorber los nutrientes por medio de los estomas,
los cuales se hallan en la parte superior de sus hojas.
El humos de lombriz liquido puede fácilmente emplearse como fertilizante liquido
en los denominados o conocidos sistemas de fertirrigación, a su vez puede
utilizarse como abono foliar, en tanto a que este se caracteriza por ser un producto
completamente natural, lo cual acarrea las beneficios de ser más eficiente y
mucho menos dañino o perjudicial para el campo y la floricultura.
Es suma importancia mencionar que el humos de lombriz liquido posee los
elementos de carácter soluble con más importancia, los cuales se encuentra
contenidos en el humus de lombriz sólido, en los cuales están los humatos de gran
28
vitalidad como lo son los ácidos fúlvicos, úlmicos, húmicos. Seguidamente es
conocido que el alto contenido de ácidos fúlvicos y húmicos aumenta la
reabsorción de los minerales que se encuentran en el suelo, como los son fosforo,
nitrógeno, potasio, hierro, magnesio, molibdeno, entre otros. Siendo este producto
entonces, muy apropiado para cualquier tipo de cultivos, sean extensivos o
intensivos. (Escobar Carbaja,l 2013)
El humus de lombriz posee una elevada carga microbiana del orden de los 20 mil
millones de grano seco, contribuyendo a la protección de la raíz de bacterias y
nemátodos sobre todo, para el cual está especialmente indicado. Produce además
hormonas como el ácido indol acético y ácido giberélico, estimulando el
crecimiento y las funciones vitales de las plantas. Los excrementos de la lombriz
contienen: 5 veces más nitrógeno, 7 veces más fósforo, 5 veces más potasio y 2
veces más calcio que el material orgánico que ingirieron.‖ (Silvimart, 2007)
Al ser el humus un fertilizante puede estar en el suelo por cinco años,
manteniendo que el suelo posea un ph neutro, esto ayuda para que no existan
problemas de dosificación y mucho menos de fitotoxicidad, el tiempo ideal o las
estaciones para suministrar el humus es en otoño y primavera; éste se debe
suministrar sobre la superficie debido a que las bacterias del humus necesitan del
oxígeno para poder cumplir con sus principales funciones
29
3. JUSTIFICACIÓN
El uso de alternativas medicinales ha ido cada vez en aumento.O sólo por el uso
indiscriminado de químicos contra ciertos padecimientos, sino por el hecho de que
los microorganismos generan, eventualmente, una resistencia hacia estos. Ambos
factores hace menos viable su uso en un futuro no lejano y por ende la necesidad
de búsqueda de nuevos compuestos para el tratamiento o cura de las variadas
dolencias humanas en cuestión de salud.
El empleo de elementos naturales como remedio a algunas dolencias humanas ha
existido desde la antigüedad. Las plantas medicinales fueron durante mucho
tiempo (y en muchos pueblos y regiones aún lo es) la fuente directa de elementos
curativos de ciertos problemas de salud; dolores, amibiasis, gastritis, entre otros.
La composición de las plantas es muy compleja, sobresaliendo los compuestos
conocidos como polifenoles, que han mostrado capacidad antioxidantes e incluso
inhibidores de crecimiento de ciertos microorganismos patógenos para el ser
humano.
Debido al creciente interés en el cultivo de la guanábana se han identificado
metabolitos de alto valor agregado, es necesario que los agricultores tengan
alternativas de cultivo diferentes a los tradicionales que usan fertilizantes químicos
y que se ha demostrado que no son sustentables con el medio ambiente. Es
necesario promover el uso de abonos orgánico, algunos de los cuales pueden ser
producidos por los mismos agricultores y otros pueden ser adquiridos a bajo costo.
Una justificante científica es que no se tienen reportes del uso de vermicomposta,
lixiviados de vermicomposta y de roca fosfórica y su efecto sobre el crecimiento de
las plántulas y la producción de metabolitos secundarios.
30
4. OBJETIVOS
4.1 General
Determinar el contenido de metabolitos secundarios en extractos de diferentes
tratamientos de guanábana (Annona Muricata ) cultivadas con insumos orgánicos.
4.2 Específicos
Evaluar la influencia de la adición de los insumos orgánicos en los parámetros
de crecimiento de plántas de guanábana (Annona muricata L.).
Determinaciones del efecto de concentraciones de vermicomposta, roca
fosfórica y lixiviada de vermicomposta sobre el contenido de metabolitos
secundarios (fenoles, flavonoides, taninos y saponinas) de las hojas de
plántulas de Guanábana.
Analizar el resultado del contenido de metabolitos secundarios producidos a
partir de cada uno de las diferentes concentraciones de los tratamientos de
insumo orgánico aplicados en las plántas de Guanábana.
31
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Material vegetal
El material vegetal fue colectado dentro de las instalaciones del Instituto
Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez, en las áreas de invernadero, fue ahí donde
primeramente se adicionaron los abonos orgánicos, a los diferentes lotes de
plantas, las cuales fueron divididas en cinco grupos de nueve plantas, este lugar
se encuentra a una altura promedio de 600 msnm.
Se realizó una siembra de cien semillas de las cuales noventa plántulas
germinaron, para la realización de este proyecto eran necesarias un mínimo de
cuarenta y cinco plántas, al obtener tener noventa se optó por hacer un duplicado
de cada lote, se procedió con el tratamiento de insumos orgánicos que fueron la
vermicomposta, la roca fosfórica y el lixiviado de vermicomposta, haciendo cinco
lotes con nueve plántas cada uno, estos lotes con su duplicado.
Cada bolsa se marcó con la cantidad que se añadió de vermicomposta las cuales
fueron de 50g y 100g, roca fosfórica con 1g, 2g y 3g y lixiviado de vermicomposta
50ml, 33.33ml y 25ml con diluciones en agua, antes de la aplicación de los
tratamientos se miden datos como altura de la planta y número de hojas.
La parte colectada, se lavó con agua de la llave y un poco de detergente líquido
para eliminar los rastros de suciedad. Para su secado, se mantuvo a 40+2 °C
durante 120 horas en un horno incubadora y luego de ser triturada en una
licuadora común, se conservó protegido de la luz en un frasco de vidrio color
ámbar.
En el muestreo, se descartó cualquier hoja que estuviera maltratada, seca o
contaminada con algún tipo de microorganismo. Las hojas colectadas poseían una
coloración verde característica, sin ningún tipo de magulladura.
32
5.2 Obtención de extractos
5.2.1 Extracto metanólico
La muestra vegetal seca se maceró inmersa en metanol (1:13 p/v) a temperatura
ambiente durante 2 horas en un sonicador. La materia orgánica recuperada se
macero una vez más de la misma forma. Ambas extracciones se mezclaron,
filtraron a través de papel Whatman #2, y centrifugaron por 10 minutos a 4000 rpm
para luego recuperar el sobrenadante, al que se le eliminó el exceso de solvente
mediante un rotavapor (<40 °C). El producto se re suspendió en metanol grado
HPLC y se conservó, protegido de la luz, a -20 °C hasta su análisis.
5.3 Analisis de los datos iniciales
Como factor importante de referencia se tomaron previo a la aplicación de los
insumos orgánicos los datos y medidas de la altura y numero de hojas de cada
una de las plantas que se sometieron a estudio, para tener datos de comparación
del antes y después de los tratamientos con insumos orgánicos y así evaluar la
influencia de estos en las plantas.
Cuadro 2 Resumen estadístico para altura.
Recuento 45
Promedio 9.08444
Desviación Estándar 1.83092
Coeficiente de Variación 20.1544%
Mínimo 4.2
Máximo 13.0
Rango 8.8
Sesgo Estandarizado -0.120277
Curtosis Estandarizada 0.416073
En el Cuadro 2 se muestra los datos estadísticos del número de muestras que se
estudiaron, los valores máximos y mínimos de las alturas de las plantas e Incluye
el promedio de las alturas. Los rangos de alturas iniciales de las plántulas fueron
desde 4.2cm a 13.0cm.
33
Cuadro 3 Resumen estadisitico para numero de hojas.
Recuento 45
Promedio 5.44444
Desviación Estándar 1.25328
Coeficiente de Variación 23.0194%
Mínimo 2.0
Máximo 8.0
Rango 6.0
Sesgo Estandarizado -2.71654
Curtosis Estandarizada 1.9621
En el Cuadro 3 se muestra los datos estadísticos del número de muestras que se
estudiaron, los valores máximos y mínimos del número de hojas, donde los rangos
de número de hoja iniciales de las plántulas fueron desde 2.0 a 8.0
5.4 Análisis de metabolitos secundarios en extractos de Annona Muricta L.
5.4.1 Estimación de fenoles totales
El análisis del contenido de fenoles totales se determinó de acuerdo al método
colorimétrico de Folin Ciocalteau (Singleton et al., 1999), empleando ácido gálico
como estándar. Una alícuota de 100 µL de muestra se transfirió a un tubo de
ensaye junto a 4.2 mL de agua y 500 µL mL del reactivo de Folin Ciocalteau (1N).
La mezcla se agitó vigorosamente durante 1 minuto para luego agregar 1.0 mL de
una solución acuosa de carbonato de sodio al 20% y 4.2 mL de agua destilada. La
mezcla se dejó en reposo cubierto de la luz durante 1 hora, para luego leer su
absorbencia a 765 nm en un espectrofotómetro HACH DR 5000. Los resultados se
expresaron como mg equivalentes de ácido gálico por gramo de hoja seca (mg
EAG/g) empleando una curva estándar de ácido gálico de 0.0 a 1000 mg·mL-1
(ANEXO I).
34
5.4.2. Estimación de Flavonoides
El análisis del contenido de flavonoides se determinó mediante el método
colorimétrico del tricloruro de aluminio (Chang et al., 2002).Una alícuota de 0.5 mL
de muestra se mezcló con 1.5 mL de etanol al 95% y 100 µL de tricloruro de
aluminio (AlCl3 6·H2O) al 10%, luego de agitar se agregó 100 µL de acetato de
potasio 1M y 2.8 mL de agua destilada. La mezcla se dejó en reposo 30 minutos
para luego medir su absorbencia a 415 nm en un espectrofotómetro. El volumen
de tricloruro de aluminio fue reemplazado por agua destilada en la preparación del
blanco. Los resultados se expresaron como mg equivalentes de quercetina por
gramo de hoja seca (mg EQ/g) empleando una curva estándar de quercetina de
0.0 a 100 µg·mL-1 (ANEXO II).
5.4.3. Estimación de taninos condensados (Proantocianidinas)
La determinación de taninos condensados (proantocianidinas) se llevó a cabo de
acuerdo al método de vainillina-H2SO4 con las modificaciones de Sun et al. (1998).
Dicho método cuantifica monómeros de taninos condensados obtenidos después
de una hidrólisis ácida del material a analizar (García, 2004), basándose en la
reacción de condensación entre los monómeros de taninos y la vainillina. En tubos
de ensaye se hizo reaccionar 1.0 mL del extracto o estándar junto a 2.5 mL del
reactivo vainillina (1% en MeOH) y 2.5 mL de ácido sulfúrico (10.5%), luego de 20
minutos de reacción a ~30 °C en una habitación con luz tenue, se midió la
absorbencia de las muestras en un espectrofotómetro HACH DR 5000 a 500 nm.
Los resultados se expresaron como mg equivalentes a (+)-catequina por gramo de
hoja seca (mg EC/g). (ANEXO III).
35
5.4.4. Estimación de saponinas
La cuantificación de saponinas esteroidales se llevó a cabo de acuerdo al método
descrito por Qin et al. (2009). Brevemente, se construyó una curva de estándar de
diosgenina, para lo cual se preparó una solución patrón de diosgenina disuelta en
cloroformo (1 mg/mL) y se tomaron volúmenes de 200, 400, 600, 800, 1000, 1200,
1400, 1600 y 1800 μL, los cuales fueron diluidos con el correspondiente volumen
de cloroformo para obtener concentraciones de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8
y 0.9 mg/mL. Se tomaron muestras de 20 μL de cada concentración, las cuales
fueron colocadas en tubos de ensayo, entonces a cada tubo se agregaron 200 μL
de vainillina al 5% en metanol y 800 μL de ácido perclórico. Los tubos fueron
agitados en un vortex y posteriormente calentados en una parrilla a 70°C por 15
minutos para desarrollar color. Transcurrido dicho tiempo, los tubos fueron
enfriados a 0°C por 2 min y se agregaron 1480 μL de ácido acético glacial. Se dejó
estabilizar la reacción por 30 minutos. La absorbancia de las muestras se leyó en
un espectrofotómetro a una longitud de onda de 454 nm. La medición del
contenido de saponinas esteroidales en los extractos se llevó a cabo siguiendo el
procedimiento descrito arriba, tomando 20 μL de extracto en vez de la solución de
diosgeniana. El blanco fue sometido al mismo tratamiento que las demás
muestras, colocando 20 μL de ácido acético glacial en vez de solución de
diosgenina (Wagner & Bladt, 1996), (ANEXO IV).
5.4.5 Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo mediante el paquete estadístico Stat-
Graphics-Centurion XV, empleando un análisis de varianza simple (ANOVA) y la
prueba de Tukey de rangos múltiples (P=0.05). Mediante correlación se determinó
las relaciones entre parámetros de crecimiento y metabolitos secundarios(fenoles,
flavonoides, taninos y saponinas).
36
6. RESULTADOS Y DISCUSION
En el presente proyecto después de haber hecho los análisis de parámetros de
crecimiento, con respecto a la altura de la planta y número de hojas no hubo un
valor significativo; es decir que indicaran que hubo efecto por parte de las
diferentes concetraciones de tratamiento a las plántulas, en el que cada sujeto de
estudio tuviese mayor contenido de hojas que otros o mayor altura sin embargo
estos análisis se hicieron hasta en periodos determinados y monitorearon duantes
ciertos meses en lo cual no mostraron contenido variable.
De acuerdo a González Fresneda et al. (2001) las catequinas (y los flavonoides)
son fuente de protección debidas a su propiedad. Es decir, la actividad que
presentan ciertas muestras se relaciona con su composición fitoquímica o su
composición polifenólica: flavonoides, ácidos fenólicos, catequinas, taninos, etc.
La presencia de estos metabolitos se suelen relacionar con la actividad medicinal,
nutricional u organoléptica (Sun et al., 1998) que una determinada muestra pueda
presentar. Por lo que Gavamukulya et al., 2014 demostraron que A. muricata son
fuentes de agentes anticancerígenos y capacidades antioxidantes.
37
6.1 Análisis de parámetros
Cuadro 4. Analisis de efectos significativo altura,numero de hojas y clorofila
Fertilizante orgánico Aplicación Altura Numero de hojas Clorofila
1 9.7 a 4.6 a 30.46 a
roca fosfórica 2 8.1 a 4.5 a 34.7 a
3 8.8 a 4.6 a 34.9 a
0 9.7 a 4.9 a 33.56 a
vermicomposta 50 8.9 a 4.3 a 34 b
100 8.6 a 4.5 a 32.66 a
1 8.1 a 4.7 a 34.7 a
lixiviado 2 8.7 a 4.5 a 31.4 a
3 9.8 a 4.5 a 33.9 a
*valores con letras diferentes presentan diferencias significativas entre los rangos de aplicación
de cada tratamiento.
Cuadro 5. Analisis de efectos significativo metabolitos secundarios
Fertilizante orgánico Aplicación Fenoles totales Flavonoides Taninos Saponinas
1 0.39 a 1.39 a 0.23 a 1.32 a
roca fosforica 2 0.50 b 1.83 b 0.23 b 1.21 b
3 0.47 c 1.56 c 0.23 b 1.14 c
0 0.46 a 1.26 a 0.23 a 1.27 a
vermicomposta 50 0.40 b 1.20 b 0.24 b 1.04 b
100 0.49 c 2.33 c 0.23 a 1.36 c
1 0.45 a 1.54 a 0.23 a 1.00 a
lixiviado 2 0.47 b 1.86 b 0.23 a 1.22 b
3 0.43 b 1.39 c 0.23 a 1.45 c
*valores con letras diferentes presentan diferencias significativas entre los rangos de aplicación
de cada tratamiento.
38
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
A B C D E F G H I
Fenoles Totales
Tratamientos.
6.2 Estimación del contenido de fenoles totales.
La variación del contenido polifenólico en los diferentes extractos de guanábana
para el contenido de fenoles totales se presenta en la Figura 9, en donde se
observa que la mayor composición de estos metabolitos la presentó el extracto de
la muestra ―E‖, donde se obtuvo 0.58 mg de EAG por gramos de muestra seca.
Figura 9. Contenido de fenoles totales en extractos de Annona Muricata L. con 9 diferentes
tratamientos.
Donde el tratamiento E con concentraciones (100g vermicomposta, 2g de roca
fosfórica y dilución 1:2 lixiviado de vermicomposta) se obtienes mejor contenido
fenólico seguido del tratamientos F (100g roca fosfórica, 3 g de roca fosfórica y
dilución 1:1 lixiviado de vermicomposta) y observándose con menor contenido
fenólico se ubica el tratamiento C (50g vermicomposta, 1g de roca fosfórica y
dilución 1:1 lixiviado de vermicomposta).
Gavamukulya et al., 2014 desmostraron que hay contenido fenólico en otra
especie de Annona y que todos los resultados fueron expresados como EAG. Es
decir los compuesto de fenolicos típicos que posen actividad antioxidante han sido
caracterizados como los ácidos fenólicos donde obtuvo asi 37.6 mg/ml de este
compuestos con el mismo método que aquí se evaluo.
39
Es el caso que los fenoles están entre los compuestos poco enzimáticos y pueden
ser obtenidos a partir de fuentes naturales y por lo cual han recibido un gran
enfoque en su obtención.
En el cuadro observamos los datos estadísticos realizados y analizados con el
programa ― statgraphics‖ viéndose como el valor-P es menor de 0.05, es decir que
indica que los tratamientos aplicados tienen un efecto significativo sobre la
cantidad de fenoles totales de las hojas en la plantas con un 95.0% de nivel de
confianza.
6.3 Estimación del contenido de flavonoides
La variación del contenido de flavonoides en extractos de hojas de guanábana se
observa en la Figura 10. El mayor contenido de estos compuestos se halló en el
tratamiento de la muestra E(100g de vermicomposta, 2g de roca fosfórica y
dilución 2:1 de lixiviado) con 2.93 mg EQ/g seguido de la muestra A con 2.88 mg
EQ/g y por ultimo la muestra H(50g de vermicomposta, 3g de roca fosfórica y
dilución 3:1 de lixiviado) con 1.06 mg EQ/g.
Figura 10. Contenido de flavonoides en extractos de Annona Muricata L. con 9 diferentes tratamientos
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
A B C D E F G H I
Flavonoides
TRATAMIENTOS
40
Viéndose que hay buen contenido de este tipo de compuesto metabolico con esta
especie de planta con lo que comparado al utilizar la misma metodología con lo
reportado en plantas del continente Asiatico (Yu-Ling, 2012) donde obtuvieron
valores de 1.2 a 7 mg EQ/g.
En el cuadro observamos que con los datos estadísticos obtenidos con valor-P es
menor que 0.05, es decir que los tratamientos aplicados tienen un efecto
significativo sobre la cantidad de flavonoides de las hojas en la plantas con un
95.0% de nivel de confianza.
6.4 Estimación del contenido de taninos condensados (Proantocianidinas)
La mayor concentración de estos metabolitos se halló en el tratamiento C(50g de
vermicomposta, 1g de roca fosfórica y dilución 2:1 de lixiviado) con 0.24 mg
equivalentes de (+)-catequina por gramo de hojas (mg EC/g).
Figura 11. Contenido de Taninos Condensados (Proantocianidinas) en extractos de Annona
Muricata L. en 9 diferentes tratamientos
0.2360.2365
0.2370.2375
0.2380.2385
0.2390.2395
0.240.2405
A B C D E F G H I
Taninos
TRATAMIENTOS
41
0
0.5
1
1.5
2
A B C D E F G H I
Saponinas
TRATAMIENTOS
La variación entre extracciones del contenido tánico puede deberse a la polaridad
de los mismos compuestos, ya que al no ser glúcidos tienden a ser menos
solubles en agua, pero se ha reportado su presencia cualitativa en extracciones
alcohólicas (Ojo et al., 2010; Hindumathy, 2011; Sha’a et al., 2011) y acuosas
(Negrelle y Gomes, 2007; Ojo et al., 2010; Hindumathy, 2011; Sha’a et al., 2011),
y cuantitativa en una extracción metanólica (Pansera et al., 2003)
Los datos de la composición de taninos presentados en esta investigación pueden
sólo dar una idea del contenido total, así como secundar el hecho de la existencia
de éstos en las extracciones analizadas, ya que de acuerdo a Sun et al. (1998) es
recomendable separar catequinas de proantocianidinas en la muestra a analizar,
de lo contrario el método es menos preciso. De acuerdo a los resultados de éste,
factores como la acidez del medio, el tiempo de reacción y la cantidad de agua
disminuyen la estabilidad del color de reacción (estabilidad de coloración).
6.5 Estimación del contenido de saponinas.
Figura 12. Contenido de saponinas en extractos de Annona Muricata L. en nueve
tratamientos diferentes.
42
Por otro lado, la mayor concentración de estes tipo de metabolitos se halló en el
tratamiento de la muestra A(100g de vermicomposta, 1g de roca fosfórica y
dilución 3:1 de lixiviado) con 1.66 mg equivalentes de (+)-diosgenina por gramo
de hojas (mg ED/g). seguido del tratamiento G del cual se obtuvo 1.5 mg
equivalentes de (+)-diosgenina por gramo de hojas (mg ED/g) y con un bajo
contenido de saponina en el tratamiento de la muestra B(50g de vermicomposta,
2g de roca fosfórica y dilución 1:1 de lixiviado).
Dentro de lo que cabe las saponinas son compuestos metabólicos que
normalmente se hayan en diferentes partes de las plantas, por ello las saponinas
son los compuestos del bioactivo más notables que demuestran muchas funciones
biológicas, si bien la variación de este compuesto puede hallarse en diferente
partes de la plantas. (Jau-Tien, 2007).
43
7 CONCLUSIONES
La presencia de metabolitos secundarios se vío influenciada por las diferentes
tipos de concentraciones de cada uno de los insumos organicos.
El contenido total de metabolitos secundarios en hojas se vio afectado
significativamente por lixiviado, roca fosfórica y vermicomposta desmostrado en
estudios anteriores sobre la aplicación de insumos organicos (Lujan-hidalgo et al
2016).
Para fenoles totales y flavonoides mostraron diferencias significativas entre los
tres tratamientos de roca fosfórica, sin embargo la roca fosfórica tiene un efecto
negativo sobre los compuestos de metabolitos secundarios ya que al
incrementarse la cantidad de roca fosfórica hubo menos concentración de fenoles,
flavonoides y saponinas en las hojas de guanabana. Comparando resultados con
estudios anterios también se vio afectado la concentración de metabolitos al
incrementar la cantidad de roca fosfórica(Lujan-hidalgo et al 2016).
La mayor concentracion lo presento los flavonoides, después saponinas y fenoles
totales en estos tres metabolitos las presencia de la vermicomposta con 100g fue
la que marco los tratamientos mas altos y en cuanto a taninos el compuesto del
que se obtuvo menor contenido, ya que el tratamiento que mas presento
concetracion de taninos solo contenia 50g de vermicomposta pero con una
concentracion de lixiviado 2:1 desmostrando que con un lixiviado menos diluido
fue el tratamiento que mas contenido obtuvo.
El nivel de compuestos fenólicos en las plantas depende de su estado de
madurez, variedad, almacenamiento y factores genéticos entre otros y puede estar
presente en diferentes niveles en la misma planta cultivada en diferentes
condiciones del suelo. Los compuestos fenólicos antioxidantes, especialmente los
flavonoides, neutralizan las especies de oxígeno reactivo antes de que puedan
dañar las células y la práctica de cultivo puede interferir con la cantidad de estos
compuestos (Upadhyaya, Khatiwora y Lakhi 2010).
44
La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos puede depender de factores
tales como las condiciones de crecimiento, calidad y origen (ubicación geográfica)
de las plantas, así como los métodos de extracción y purificación (tipo y polaridad
de los disolventes y condiciones de extracción (Moure et al. 2000).
El lixiviado tuvo diferencias significativas en sus tres tratamientos siendo la
dilución 2:1 en combinacion con la vermicomposta la que aporto mayor
concetración de fenoles totales y flavonoides, descartando la dilución 3:1 ya que
reduce la concetración de estos metabolitos. Sin embargo para las saponinas tuvo
un mejor efecto la dilucion 3:1 de lixiviado.
Una alternativa para disminuir los costos y la dependencia de fertilizantes
sintéticos, es la utilización de algunos materiales orgánicos líquidos como el
lixiviado de vermicomposta (Pant et al., 2009; Preciado et al., 2011), el cual puede
ser aplicado en sistemas de riego presurizado (Shrestha et al., 2012) por lo que es
de utilidad en sistemas de producción intensiva en ambientes protegidos, además
de que promueve el reciclaje de residuos orgánicos.
La mayor concentración obtenida se ve reflejada en los tratamientos donde hubo
mayor cantidad de vermicomposta, considerando esto el insumo que mas aporto
para las concetraciones de metabolitos secundarios. El suelo enriquecido con
vermicomposta provee substancias adicionales que no son encontradas en los
fertilizantes quimicos (Ansari and Ismail 2008).
Se ha demostrado que la acumulación de estos diversos metabolitos secundarios
está influenciada por las interacciones entre el genotipo de la planta (especie y
variedad dentro de la especie) y los factores ambientales, incluyendo la técnica de
cultivo, la estación, el estrés abiótico y biótico y el estado nutricional (Downey et
al., 2013).
Demostrando que la vermicomposta, roca fosfórica y lixiviado como insumos
organico tiene aportaciones significativas al contenido de metabolitos secundarios
en plantas de Guanabana.
45
8 RECOMENDACIONES
La experiencia obtenida durante el desarrollo de este trabajo de investigación,
aunada a la literatura revisada durante el mismo proceso, permite dar las
siguientes recomendaciones:
Un punto de gran interés sería el conocer la composición de metabolitos
secundarios en extracción con solventes de diferente polaridad (no polar):
acetato de etilo, éter de petróleo, acetona, entre otros. Esto permitiría una
estimación con mayor precisión de la composición polifenólica de la planta.
Debido a que la etapa fenológica juega un papel importante en la
composición metabólica secundaria, sería un factor importante a controlar
muestras con la misma edad de maduración, al igual que analizar distintas
etapas.
Se tiene poca información en la composición cuantitativa de taninos en esta
especie vegetal, tema de sumo interés, ya que estos metabolitos son
compuestos que se emplean de forma industrial.
46
9 BIBLIOGRAFÍA
Adeneye A & Agbaje E (2007). Hypoglicemic and hypolipidemic effects of fresh
leaf aqueos extract of Cymbopogon citratus Stapf. in rats. Journal of
Ethnopharmacology 112, 440-444.
Andersen ØM & Markham KR (Eds.) (2006). Flavonoids: Chemistry, Biochemistry
and Applications. USA: Taylor & Francis Group.
Andrade-Cetto, y Heinrich M. (2005). Mexican plants with hypoglycaemic effect
used in the treatment of diabetes. Journal of Ethnopharmacology 99: 325-348.
Ansari, A. A., and S. A. Ismail. 2008. Reclamation of sodic soils through
vermitechnology. Pakistan Journal of Agricultural Research 21:92–97
Benezer-Benezer M, Castro-Mercado E & García-Pineda E (2008). La producción
de especies reactivas de oxígeno durante la expresión de la resistencia a
enfermedades en plantas. Revista Mexicana de Fitopatología, 26, 56-61.
Burda S & Oleszek W (2001). Antioxidant and antiradical activities of flavonoids.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49 (6), 2774-2779.
Cabrera Silva M, Lissi Gervaso E & Honeyman Mauro J (2006). Radiación
Ultravioleta y Salud. Santiago de Chile: Universitaria.
Castañeda C, Ramos LE & Ibáñez V (2008). Evaluación de la capacidad
antioxidante de siete plantas medicinales peruanas. Revista Horizonte Médico 8,
56-72.
Cegarra, J. (1996). Compostaje de desecho orgánicos y criterios de calidad de
compost. Ed Palmira
47
Chang CC, Yang MH, Wen HM & Chern JC (2002). Estimation of total flavonoid
content in propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of Food
and Drugs Analysis, 10 (3), 178-182.
Cheel J, Theoduloz C, Rodríguez J & Schmeda-Hirschmann G (2005). Free radical
scavenger and antioxidants from lemongrass (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf.).
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 2511-2517.
Dawidowicz AL & Olszowy M (2010). Influence of some experimental variables and
matrix components in the determination of antioxidant properties by β-caroteno
bleaching assay: experiments with BHT used as standard antioxidant. European
Food Research and Technology, 231, 835-840.
Devasagayam T, Tilak J, Boloor K, Sane KS, Ghaskadbi SS & Lele R(2004). Free
radicals and antioxidants on human health: current status and future prospects.
JAPI, 52, 794-804.
Dewick PM (2009). Medicinal Natural Products: A biosynthetic Approach (3rd ed.).
UK: Wiley.
Dirzo R (1985). Metabolitos secundarios en las plantas ¿Atributos panglossianos o
de valor adaptativo? Ciencia (36), 137-145.
Downey, P. J., L. H. Levine, M. E. Musgrave, M. McKeon-Bennett, and S. Moane.
2013. Effect of hypergravity and phytohormoneson isoflavonoid
accumulationinsoybean(Glycine
max.L.)callus.MicrogravityScienceandTechnology25:9–15
Duarte-Almeida JM, Dos Santos RJ, Genovese MI & Lajolo FM (2006). Avaliação
Da Atividade Antioxidante Utilizando Sistema β-caroteno/Ácido Linoléico E Método
De Seqüestro De Radicais DPPH▪. Ciéncia e Tecnologia de Alimentos , 446-452.
48
Durán RM & Borja Padilla R (1993). Actividad antioxidante de los compuestos
fenólicos. Instituto de la Grasa y sus Derivados (C.S.I.C), Consejo Superior de
Investigaciones Científicas, Sevilla, España.
Escobar Carbajal A.(2013) Usos potenciales del humus (abono organico lixiviado y
solido) en la emperesa fertilombriz.
Ferreira IC, Baptista P, Vilas-Boas M & Barros L (2007). Free-radical scavenging
capacity and reducing power of wild edible mushrooms from northeast Portugal:
Individual cap and stipe activity. Food Chemistry, 100, 1511-1516.
Figueirinha A, Paranhos A, Pérez-Alonso JJ, Santos-Buelga C & Batista MT
(2008). Cymbopogon citratus leaves: Characterisation of flavonoids by HPLC-PDA-
ESI/MS/MS and an approach to their potential as a source of bioactive
polyphenols. Food Chemistry (110), 718-28.
Flanzy C (2003). Enología: fundamentos científicos y tecnológicos (2 ed.). (Gómez
AL, Quevedo JM, Vicente AM y Cenzano AM, Trads) París: Mundi-Prensa.
Fuentes, Yague, Joseluís. (2007). La crianza de la lombriz roja. Servicio de
extensión agraria Madrid.Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación.
Gavamukulya Y., Abou-Elella F., Wamunyokoli F., AEl-Shemy H.,. (2014).
Phytochemical screening, anti-oxidant activity and in vitro anticancer potential of
ethanolic and water leaves extracts of Annona muricata (Graviola). Asian Pacific
Journal of Tropical Medicine. 10.1016/S1995-7645(14)60258-3
Garcia Soto (2008) Evaluacion del metodo de propagacion y tipo de fertilizacion
sobre la calidad fisico-quimicia de frutos de guanabana. (Annona muricata L.).
García DE (2004). Los metabolitos secundarios de las especies vegetales. Pastos
y Forrajes, 27 (1), 1-12.
49
Gómez R. S., Angeles M., Antonio Méndez J. Et al. (2013) Uso de lixiviados de
humus de lombrizpara la producción de forraje verde. INIFAP
Gonzales-Esquinca A.R., Lunas-Cazares L.M., Gutiérrez-Jimenez J., et al., (2011).
Anonáceas plantas antiguas, estudios recientes, UNICACH
González Fresnada Y, Peña Sánchez M, Sánchez Álvarez R & Santana JL (2001).
Taninos de diferentes especies vegetales en la prevención del fotoenvejecimiento.
Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas , 20, 16-20.
Hindumathy CK (2011). Invitro Study of Antibacterial Activity of Cymbopogon
citratus. World Academy of Science, 74.
Jau-Tien L., Deng-Jye Y. (2007). Determination of steroidal saponins in different
organs of yam (Dioscorea pseudojaponica Yamamoto). ELSEVIER. Food
Chemistry 108 :1068–1074
Kruawan K & Kangsadalampai K (2006). Antioxidant activity, phenolic compound
contents and antimutagenic activity of some water extract of herbs. Journal of
Pharmaceutical Sciences, 30, 28-35.
Kulisic T, Rodonic A, Katalinic V & Milos M (2004). Use of different methods for
testing antioxidative activity of oregano essential oil. Food Chemistry (85), 633-
640.
Kumar A, Abrol E, Koul S & Vyas D (2012). Seasonal low temperature plays an
important role in increasing metabolic content of secondary metabolites in Withania
somnifera (L.) Dunal and effects the time of harvesting. Acta Physiologiae
Plantarum, 34, 2027-2031.
50
Kuskoski EM, Asuero AG, Troncoso AM, Mancini-Filho J & Fett R (2005).
Aplicación de diversos métodos químicos para determinar actividad antioxidante
en pulpa de frutos. Ciéncia e Tecnologia de Alimentos, 25 (4), 726-732.
Leite JR, V. Seabra ML, Maluf E, Assolant K, Suchecki D, Tufik S, Klepacz S, Calil
H y Carlini EA (1986). Pharmacology of lemongrass (Cymbopogon citratus stapf).
III. Assessment of eventual toxic, hypnotic and anxiolytic effects on humans.
Journal of Ethnopharmacology, 17, 75-83.
Luján-Hidalgo María Celina, Gómez-Hernández, Villalobos-Maldonado, Abud-
Archila, Montes-Molina, EncisoSaenz,Ruiz-Valdiviezo & Gutiérrez-Miceli (2016):
Effects of Vermicompost and Vermiwash on Plant, Phenolic Content, and Anti-
oxidant Activity of Mexican Pepperleaf (Piper auritum Kunth) Cultivated in
Phosphate Rock Potting Media, Compost Science & Utilization
Martínez SA (2010). Compuestos polifenólicos (extraíbles y no extraíbles) En
alimentos de la dieta española: Metodología para su determinación e
identificación. Memoria Doctoral, Universidad Complutense De Madrid; Facultad
de Farmacia, Nutrición y Bromatología II, Madrid.
Martínez-Flórez S, González-Gallego J, Culebras JM & Tuñón MJ (2002). Los
flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutrición Hospitalaria, 17 (6),
271-278.
Martínez-Valverde I, Jesús Periago M & Ros G (2000). Significado nutricional de
los compuestos fenólicos de la dieta. Archivos Lationamericanos de Nutrición, 50
(1).
Miean KH & Mohamed S (2001). Flavonoid (Myricetin, Quercetin, Kaempferol,
Luteolin, and Apigenin) content of edible tropical plants. Journal of Agricultural
Food Chemistry, 49 (6), 3106-3112.
51
Molyneux P (2004). The Use of the stable free radical diphenylpicryl-hidrazyl
(DPPH) for estimating antioxidant activity. Journal of Science and Technology, 26
(2), 211-219.
Moraes-de-Souza RA, Oldoni TL, Regitano-d'Arce MA & Alencar SM (2008).
Actividad antioxidante y compuestos fenólicos en infusiones herbarias consumidas
en Brasil. Ciéncia e Tecnologia de Alimentos, 6 (1), 41-47.
Moure, A., D. Franco, J. Sineiro, H. Dom ınguez, M. L. Nu~nez, and J. M. Lema.
2000. Evaluation of extracts from Gevuina avellana hulls as antioxidants. Journal
of Agricultural and Food Chemistry 48:3890–3897
Negrelle R & Gomes E (2007). Cymbopogon citratus (DC:) Stapf: Chemical
composition and biological activities. Revista Brasileira de Plantas Medicinais,
Botucatu, 91, 80-92.
Peñarrieta JM, Alvarado JA, Akesson B & Bergenstahl B (2007). Separation of
phenolic compounds from foods by reversed-phase high performance liquid
chromatography. Revista Boliviana de Química, 24 (1).
Ojo O, Anibijuwon I & Ojo O (2010). Studies on Extracts of Three Medicinal Plants
of South-Western Nigeria: Hoslundia opposita, Lantana camara and Cymbopogon
citratus. Advances in Natural and Applied Sciences, 4 (1), 93-98.
Pant, A. P., T. J. K. Radovich, N. V. Hue, S. T. Talcott, and K. A. Krenek. 2009.
Vermicompost extracts influence growth, mineral nutrients, phytonutrients and
antioxidant activity in pakchoi (Brassica rapa cv. Bonsai,Chinensis group) grown
under vermicompost and chemical fertilizer. J. Sci. Food Agric. 89: 2383-2392
Pansera MR, Santos ACA, Paese K, Wasum R, Rossato M, Rota LD, Pauletti GF
& Serafini LA (2003). Análise de taninos totais em plantas aromáticas e medicinais
52
cultivadas no Nordeste do Rio Grande do Sul. Revista Brasileira de
Farmacognosia. 13 (1), 17-22.
Pereira RP, Fachinetto R, Prestes A, Puntel RL, Santos da Silva GN, Heinzmann
BM, et al. (2009). Antioxidant effects of different extracts from Melissa officinalis,
Matricaria recutita and Cymbopogon citratus. Neurochemistry Research, 34, 973-
983.
Pérez-Trueba G (2003). Los flavonoides: antioxidantes o pro-oxidantes. Revista
Cubana de Investigaciones Biomédicas, 22 (1), 48-57.
Preciado R., P., M. Fortis H., J. L. García H., E. Rueda P., J. R. Esparza R., A.
Lara H., M. A. Segura C. y J. Orozco V. 2011. Evaluación de soluciones nutritivas
orgánicas en la producción de tomate en invernadero. Interciencia 36: 689-693
Rubio D, Gobbo-Neto L, Sakamoto HT, Peprine Lopes N & Callegari JL (2012).
Seasonal variation of the major secondary metabolites present in the extract of
Eremanthus mattogrossensis Less (Ateraceae: Vernonieae) LEAVES. Química
Nova, 35 (11), 2139-2145.
Sha'a KK, OgucheS & Ajayi JA (2011). The in vivo analgesic activity of aqueous
and ethanolic extracts of Anacardium Occidentale Linn and Cymbopogon citrates
DC. Journal of Medicine in the Tropics, 13 (2), 115-118.
Shah G, Shri R, Panchal V, Sharma N, Singh B & Man A (2011). Scientific basis
for the therapeutic use of Cymbopogon citratus, stapf (Lemon grass). Journal of
Advanced Pharmaceutical Technology & Research, 2 (1), 3-8.
Sharma OP & Bhat KT (2009). DPPH antioxidant assay revisited. Food Chemistry
(113), 1202-1205.
53
Singleton V, Orthofer R & Lamuela-Raventós R (1999). Analysis of total phenols
and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu
reagent. Methods of Enzymology, 299, 152-178.
Shrestha, K., K. Walsh, and D. Midmore. 2012. Microbially enhanced compost
extract: Does it increase solubilisation of minerals and mineralisation of organic
matter and thus improve plant nutrition. J. Biorem. Biodegrad. 3: 2155-6199.
Sun B, Ricardo-da-Silva JM & Spranger I (1998). Critical factors of vanillin assay
for catechins and proanthocyanidins. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
46, 4267-4274.
Suryanto E & Katja DG (2008, Octubre). Singlet oxygen quenching activities of
phenolic extract from lemon grass leaves (Cymbopogon citratus Stapf). The
International Seminar on Chemistry , 500-506.
Szöllösi R & Szöllösi Varga I (2002). Total antioxidant power in some species of
Labiatae (Adaptation fo FRAP method). 7th Hungarian Congress on Plant
Physiology, 46 (3-4), pp. 125-127. Hungary.
Thaipong K, Boonprakob U, Crosby K, Cisneros-Zevallos L & Byrne DH (2006).
Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating antioxidant
activity from guava fruit extracts. Journal of Food Composition and Analysis, 19,
669-675.
Upadhyaya, S., E. Khatiwora, and R. S. Lakhi. 2010. Comparison of total phenol
and flavonoid content in Adhatoda vasica Nees.: Grown using different organic
manure. Journal of Pharmacy Research 3:2408–2409
Venereo Gutiérrez JR (2002). Daño oxidativo, radicales libres y antioxidantes.
Revista Cubana Médica Militar, 2 (31), 126-133.
54
Vidal Quintanar RL (2008). Protección antioxidante en los alimentos. Revista
Universidad De Sonora , 26-28.
Waterhouse AL (2002). Determination on total phenolics. Wiley.
Yoo KM, Lee CH, Lee H, Moon B& Lee CY (2007). Relative antioxidant and
cytoprotective activities of common herbs. Food Chemestry, 106, 926-936.
55
ANEXOS
ANEXO I. Curva Estándar de Ácido Gálico (Método de Folin Ciocalteau).
Cuantificación de Fenoles Totales.
y = 0.0009x - 0.0159 R² = 0.9922
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 200 400 600 800 1000
Ab
sorv
anci
a(7
65
nm
)
Concentracion (ppm)
56
ANEXO II. Curva estándar Quercetina (Método de Cloruro de Aluminio):
Cuantificación de de Flavonoles y Flavonas.
y = 0.0004x + 0.0255 R² = 0.9901
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 500 1000 1500 2000
Ab
sorv
anci
a (4
15
nm
)
Concentración (ppm)
57
ANEXO III. Curva Estándar de (+)-Catequina. Determinación de Taninos
Condensados (proantocianidinas) de acuerdo a Sun et al.
(1998).
y = 0.0001x + 0.0019 R² = 0.9906
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
0.045
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Ab
sorv
anci
a (
50
0 n
m)
Concentracion (ppm)
58
ANEXO IV. Curva Estándar de diosgenina. Determinación de Saponinas
esteroidales de acuerdo al método descrito por Qin et al. (2009).
y = 0.0003x - 0.0387 R² = 0.9909
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Ab
so
rvan
cia
(453n
m)
Concentracion (ppm)