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Contaminación bacteriana de hemocomponentes: Prevención, detección y seguimiento Bqco. Sebastián Oknaian Servicio de Hemoterapia Hospital de Pediatría Prof. Dr. J. P. Garrahan

28 de noviembre de 2012 AAHI

Definición: Presencia de bacterias en los componentes de la sangre a transfundir.

Contaminación bacteriana

Magnitud del Problema

En EEUU la contaminación bacteriana se considera la

segunda causa de muerte por transfusión.

Detección de infección asociada a transfusión.

(Programas de Hemovigilancia)

Detección de la contaminación pre transfusional

1 CP contaminado en 1000 a 3000 unidades

1 sepsis clínica en 20.000 trasfusiones

Fatalidad relacionada 1 en 60.000 transfusiones

1 CGR contaminado en 30.000 a 50.000 unidades

Fatalidad relacionada en CGR 1 en 500.000 transfusiones

Vías de contaminación:

Endógena

Estado persistente o transitorio de

bacteriemia:

Tratamiento odontológico

(Staphylococcus spp,

Streptococcus viridans o Serratia

liquefaciens)

Alteraciones gastrointestinales

(Yersinia o Salmonella)

Vías de contaminación:

Exógena

Flora de la piel normal – Microorganismos

saprofíticos (Staphylococcus

epidermidis, Staphylococcus aureus,

Diphteroides sp, Micrococcus sp,

Sarcina sp, Pseudomonas sp, Bacillus

sp, etc)

Contaminación en el procesamiento

(baños contaminados, centrífugas, etc)

Fallas en la esterilidad de las bolsas o

microfisuras

Sepsis transfusional:

• Fiebre mayor a 38,4°C

• Hipotermia menor a 35,6°C

• Temblores, escalofríos, taquipnea,

perfusión tisular inadecuada

• Hipotensión

• Shock séptico

• Muerte

CGR (almacenamiento entre 2° y 6°C)

Generalmente contaminado por agentes Gram negativos: Yersinia y Pseudomonas. Agentes psicrofílicos

CP (almacenamiento entre 20° y 24°C )

Mayormente contaminados con Gram positivos

PFC (almacenamiento a menos de -30°C)

Componente poco susceptible

Patógeno Reacciones no fatales

Reacciones fatales

Gram + (flora de la piel)

31(65%) 3 (23%)

Gram + (otros) 5 (10%) 1 (8%)

Gram - (enterobacterias)

11 (23%) 9 (69%)

Gram - (otros) 1 (2%) 0 (0%)

Total 48 13

Magnitud del Problema Patógenos asociados a bacteriemia y muerte debido a la transfusión de CP

SHOT (2000-2001) BACTHERM (Transfusion2001;41:862-72)

BACON ((Transfusion2001;41:1493-9)

Estrategias para prevenir la contaminación bacteriana

I) Reducción del riesgo de contaminación

bacteriana.

II) Optimización del procesamiento y

almacenamiento.

III) Reducción de la exposición del receptor.

IV) Introducción de métodos de inactivación

de patógenos.

Reducción del riesgo de contaminación bacteriana:

Mejorando la selección de los donantes Cumplir con las preguntas del cuestionario que tienen como objetivo

diferir un donante con mayor probabilidad de poseer bacterias en su sangre.

Tomar la temperatura del donante

Mejorando la asepsia del sitio de venopunción

Removiendo la primer alícuota durante la extracción

Estrategias I

Factores que afectan la asepsia del pliegue del codo

Tipo de antiséptico (alcohol al 70%, yodo povidona, tintura

de yodo, clorhexidina 2% con alcohol isopropílico 70%).

Concentración del antiséptico.

Múltiples vs. único agente antiséptico.

Procedimiento en 1 o 2 etapas.

Método de aplicación (culminar asepsia con aplicación

en círculo concéntrico)

Tiempo de contacto

Experiencia y capacitación del personal = Estandarización

del procedimiento

Exclusión de la primera alícuota de la donación

Cult +/total cult (%)

EstudioVolumen

deexclusión

SinExclusión

ConExclusión

de Korte (2002) 10 ml63/18257(0.35%)

15/7087(0.21%)

Bos (2002) 20 ml42/4064(1.03%)

7/1447(0.48%)

Schneider (2002) 42 ml14/602(2.32%)

4/409(0.98%)

Bruneau (2001) 15 ml76/3385(2.2%)

55/3385(1.6%)

Exclusión de la primera alícuota de la donación

Intervención % Reducción Tasa de

contaminación

Ninguna 0% 1,5%

Exclusión 1° ml 47% 0,8%

Mejora de la asepsia

57% 0,6%

Exclusión+mejora de la asepsia

77% 0,3%

Vox Sanguinis (2004) 86,178-182

Estrategias II

Optimización del procesamiento y almacenamiento:

Mejorando el proceso de la cadena de frío

Limitando el tiempo de almacenamiento

Leucorreducción

Conservación de Sangre y CGR

Transporte de la sangre pre procesamiento

Almacenamiento

Transporte de sangre después de ser

Procesada o CGR

+20°C a +24°C

+2°C a +6°C

+2°C a +10°C

Menos de 6 hs luego de la extracción

21 días 35 días 42 días

Menor a 24 hs.

Conservación de Concentrados de Plaquetas

Almacenamiento

Sistema Abierto

+20°C a +24°C 5 días

Sistema abierto + Pool 4 horas

+20°C a +24°C 4 horas

+20°C a +24°C

Transporte +20°C a +24°C Menor a 24 hs.

Uso de Placas de Butanodiol: Transporte de Sangre entera pre-procesamiento y Concentrado de Plaquetas (+20°C a +24°C)

Transporte de CGR (+2°C a +10°C)

Estrategias III

Reducción de la exposición del receptor:

Reducción de los umbrales para la transfusión

Uso de CP obtenidos por aféresis

Estrategias IV

Introducción de métodos de inactivación de patógenos

Amotosaleno HCl (S59) + UVA (Sistema Intercept Cerus)

Sistema PCT (photochemical treatment) para plaquetas resuspendidas en plasma (35%) y una solución aditiva (InterSol).

Las plaquetas se ponen en contacto con el S59 (compuesto aminopsoralélenico) y se las irradia con una dosis de 3 J por cm2 con UVA (320-400 nm) 3 a 6 min.

Posteriormente se eliminan los residuos de amotosaleno y sus fotoproductos por medio de un equipo de adsorción de compuestos (CAD).

Sistema Intercept

Estudio de inactivación de patógenos

Riboflavina + luz (Mirasol PRT - Terumo BCT)

Se agrega Riboflavina (30M) a GR y luego se irradia con luz visible.

Para plasmas y plaquetas se utiliza luz UV.

No es necesaria la remoción de la vitamina.

Se han comprobado reducciones del orden de los 6 log10 de bacterias

y virus.

Bolsa con riboflavina:

Fotoiluminador:

Riboflavina + luz (Mirasol PRT – Terumo BCT)

Theraflex UV-Platelets (Macopharma)

Sistema Theraflex para plaquetas resuspendidas en

plasma (35%) y una solución aditiva (SSP+).

Las plaquetas se irradian con luz UVC (254 nm) en

agitación por un minuto.

No es necesario eliminar ningún residuo.

Sistema Theraflex UV

Métodos de Detección Rápidos: Observación directa del componente. • Ausencia del Remolino Perlado o “Swirling” (Sensibilidad de 108 UFC/ml) (1)

Examen Microscópico. • Tinción de Gram (Sensibilidad de 107 UFC/ml) • Coloración de Naranja de Acridina (Sensibilidad de 105 UFC/ml) (1)

Tiras reactivas. • Determinación de pH y concentración de glucosa (Sensibilidad de 107 UFC/ml) (1)

Marcación con Antibióticos • Unión de antibióticos marcados con una molécula fluorescente y detección por citometría de flujo (Sensibilidad de 105 UFC/ml) (1)

(1) Blajchman MA and col. Transfusion Med Rev 18:11-24,2004.

ESTRATEGIAS PARA DETECTAR LA CONTAMINACIÓN BACTERIANA (TAMIZAJE DE TODOS LOS CP)

DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN BACTERIANA

Métodos Moleculares: Hibridización • Sonda universal de ARN ribosómico bacteriano (16 S) marcado con Acridina. Detección por quimioluminiscencia (Sensibilidad de 1 a 2 103 UFC/ml) Brecher M and col. Transfusion 33S:S154, 1993. • Sonda universal de ARN ribosómico bacteriano (4.5 S)

PCR • Especie específica. • Amplificación de fragmentos conservados del ARN 16 S


Métodos de Cultivo: • Bact/Alert (Biomerieux) Utiliza la producción de CO2 como marcador de crecimiento bacteriano. Seguimiento continuo (hasta 7 días). Medio de cultivo para especies aerobias y anaerobias. (Sensibilidad < 102 UFC/ml) (2)

(2) Yomtovian R. Transfusion 44:450-459, 2004.

Sistema Bact/Alert (Biomerieux)


Métodos de Cultivo:

• Pall-BDS (Medsep Corp) Utiliza la reducción del contenido de O2

como marcador de crecimiento bacteriano. Medición única. Detecta especies aerobias. (Sensibilidad < 102 a 103 UFC/ml) (2) (2) Yomtovian R. Transfusion 44:450-459, 2004.

Sistema Pall-BDS (Medsep Corp)


Métodos Rápidos Nuevos:

Sistema “Pan Genera Detection” (Verax Biomedical) Inmunoensayo de flujo lateral, con Oro coloidal como agente cromogénico. Detecta bacterias gram negativas y positivas Tiempo de realización 20 min - Sensb >103 a 104 UFC/ml

Está aprobado por la FDA para ser utilizado dentro de las 24 horas antes de usar un concentrado de plaquetas de aféresis


Métodos Rápidos Nuevos:

Sistema “BacTx Bacterial Detection System” (Immunetics) Ensayo colorimétrico. Detecta la presencia de proteoglicanos de bacterias gram negativas y positivas Tiempo de realización 45 min - Sensb >103 a 104 UFC/ml

Está aprobado por la FDA para ser utilizado dentro de las 4 horas antes de usar un pool de hasta 6 concentrado de plaquetas

Alcances de los métodos de detección

La selección del método de detección de contaminación bacteriana debe basarse en la combinación de su sensibilidad, especificidad, costo y tiempo de realización.

Cuanto más temprano se realiza, más sensible debe ser.

Los métodos de detección rápidos se deben realizar previo a la transfusión (en servicios de transfusión)

El método de mejor sensibilidad hasta el momento es el cultivo, pero los períodos pre y post toma de muestra disminuyen la disponibilidad de las unidades de plaquetas si el vencimiento de las mismas no es extendido.

Detección de contaminación bacteriana en todos los CP – Experiencia en el Hospital Garrahan

Aerobico Anaerobico

Escherichia coli 5 9,1 8,9 2,5

Staphylococcus epidermidis 12 22,1 13,9 2,5

Staphylococcus aureus 7 8,9 8,9 2,5

Bacillus strophacus 14 11,3 12,5 2,1

Serratia marcescens 12 6,5 7,2 2,3

Streptococcus viridans 13 17,5 16,3 2,6

Volúmen de

inoculación (mL)Microorganismo UFC/ml

Tiempo (horas)

Validación del método de cultivo automático BacT/ALERT

Escherichia coli

Todos los microorganismos fueron detectados antes de las 24 horas de incubación por los frascos BPN y BPA


Toma de muestra para la evaluación de los CP

Dentro de las primeras 24 horas, con los concentrados de plaquetas random (CP), se preparan pooles de 3 o 4 U ABO idénticos a través de conexiones estériles. Luego se leucorreduce por filtración. La muestra para cultivo se toma punzando la bolsita satélite que posee la bolsa de filtración (8 mL)

Dentro de las 24 horas todos los concentrados plaquetarios de aféresis (AFR) se leucorreducen y la muestra para cultivo se toma de la misma forma (4 mL) A los CP que quedan fuera de la preparación de pooles, individualmente se los conecta en forma estéril a una bolsa transfer. De ésta se toma la muestra para el cultivo (2,5 mL)


Procedimiento

Todas las alícuotas obtenidas se inoculan en frascos aerobios (BPA- Biomerieux) Se incuban 7 días en el equipo BacT/ALERT 3D Todos los componentes son liberados para su uso El personal verifica la negatividad de los resultados previo despacho de la unidad (pantalla amarilla en el equipo) Ante un resultado positivo se bloquean todos los componentes disponibles relacionados y se los re-cultiva. Al frasco originalmente positivo se le realizan pruebas de identificación y antibiograma del microorganismo


Criterio de interpretación de los resultados

No realizado

(TRF)

N/A-+Re-cultivo de

unidad original

(BacT/ALERT)

+- *++Prueba de

identificación

++++Cultivo inicial

(BacT/ALERT)

Resultado

Indeterminado

(RI)

Resultado Falso Positivo (RFP)

Resultado

Verdadero

Positivo (RVP)

No realizado

(TRF)

N/A-+Re-cultivo de

unidad original

(BacT/ALERT)

+- *++Prueba de

identificación

++++Cultivo inicial

(BacT/ALERT)

Resultado

Indeterminado

(RI)

Resultado Falso Positivo (RFP)

Resultado

Verdadero

Positivo (RVP)

N/A: No aplica

TRF: Unidad transfundida

* Sin desarrollo


Resultados obtenidos en el tamizaje

Tamizaje de

rutina de

plaquetas

Resultados

inicialmente

positivos

Resultados

falso

positivos

Resultado

indetermin

ado

Resultado

verdadero

positivo

Plaquetas

random (CP) 1428 6 4 2 1

Pool de

plaquetas

1757 =

6089 CP 12 9 3 0

Aféresis 4185 17 11 6 0

Total

unidades

colectadas

11702 35

(0.30%)

24 *

(0.21%)

11

(0.11%)

1

(0.008%)

* 11 (0,09%) Resultados positivos sin desarrollo bacteriano o por falla del equipo


Resultados obtenidos en el tamizaje

Resultado verdadero positivo: Staphylococcus coag. neg. (Detectado a las 19,5 h) Microorganismos detectados inicialmente:

Staphylococcus coag. neg

Micrococcus sp

Propionibacterium acnes

Bacillus sp

Flarimones spp

Enterobacter cloacae

Corynebacterium sp

Proteus mirabilis

Facklamia ssp

Pseudomona stutzerii

50 % de todos los componentes que presentaron un cultivo positivo con un microorganismo identificado ya habían sido transfundidos

Mediana del tiempo de detección = 25,7 h

Recomendaciones Nacionales:

Resolución 865/2006 MSyA Anexo N°1 Punto H15: La temperatura axilar no deberá exceder los 37° C.

Resolución 865/2006 MSyA Anexo N°1 Punto H24: Recolección de la sangre del donante. La extracción deberá ser realizada en condiciones asépticas mediante una sola venopuntura empleando un sistema de recolección cerrado y estéril.

Normas de Medicina Transfusional 1997 5ta edición AAHI Punto B.2.2; Protección contra la contaminación. El área elegida para la venopuntura será sometida a una cuidadosa limpieza y a una correcta asepsia. La vena a punzar no deberá ser palpada luego de la preparación del área a punzar. Todo el material a utilizar deberá ser estéril. Si fuese necesario efectuar mas de una punción, se deberá cambiar el equipo en cada una.

Recomendaciones Internacionales:

Standard for Blood Banks and Transfusion Services 26th edition

Reference Standard 5.4.1A Punto 4: Temperatura menor o igual a 37,5°C si se mide oral o equivalente si se mide por otro método.

Punto 5.1.5.1 El banco de sangre o servicio de transfusiones debe tener métodos para limitar y detectar contaminación bacteriana en todos los componentes plaquetarios.

Punto 5.1.5.1.1 Los métodos de detección deben ser aprobados por la FDA o deben ser validados para probar que poseen la misma sensibilidad que los métodos aprobados por la FDA.

Punto 5.6.2.1 Deben ser usados sistemas con bolsas de derivación para la colecta de plaquetas, incluyendo sangre entera que se utilizará para preparar plaquetas.

Muchas gracias por su atención! e-mail: [email protected] o [email protected]

mailto:[email protected]

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