COMPARACIÓN DE PROCEDIMIENTOS PARA ELABORAR COLECCIONES

NÚCLEO EN ACCESIONES DE RAIGRÁS INGLÉS E ITALIANO DEL NORTE DE

ESPAÑA

J. E. LÓPEZ 1 Y J.A. OLIVEIRA 1 2.

1 Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo (CIAM). Apartado 10, 15080 A Coruña

(España). Correo-e: ciala036@igatel.igape.es. 2 Departamento de Producción vegetal, EPS,

27002 Lugo. Universidad de Santiago de Compostela. (España). Correo-e:

oliveira_ciam@igatel.igape.es

RESUMEN

Durante dos años se caracterizaron agromorfológicamente 74 accesiones de raigrás

inglés y 43 de raigrás italiano, pertenecientes a la colección de gramíneas pratenses del Centro

de Investigaciones Agrarias de Mabegondo (CIAM). Las variables significativas en el análisis

de varianza se utilizaron en una clasificación ascendente jerárquica mediante el método de

Ward. Basándose en tamaños de colecciones núcleo del 12% y 16% respectivamente para

raigrás inglés e italiano sobre las colecciones base, se compararon diversas estrategias para

crear dichas colecciones núcleo (“core collection”). Estos métodos incluyeron muestreos

estratificados y aleatorios basados en la clasificación jerárquica, en el índice de diversidad de

Shannon y en la máxima contribución a la varianza en un análisis de componentes

principales. Ninguna de las colecciones núcleo creadas mostró diferencias en las medias y en

las varianzas mediante el test de Wilcoxon. Las colecciones núcleo seleccionadas en la

estrategia de mayor contribución a la varianza fueron las que presentaron un mayor porcentaje

de retención de los rangos de variación, por lo que se consideran la más adecuadas para el

mantenimiento de la diversidad de las colecciones base.

Palabras clave: colección núcleo, Lolium perenne, Lolium multiflorum, recursos

fitogenéticos, bancos de germoplasma.

INTRODUCCIÓN

En los últimos años el incremento en el número de accesiones conservadas en los

bancos de germoplasma ha motivado un creciente interés por el desarrollo de métodos de

conservación de la diversidad almacenada en los mismos. Los objetivos son facilitar el acceso

de los recursos fitogenéticos a los mejoradores y hacer más manejable el uso de tales recursos.

Sin embargo el manejo y mantenimiento de un número elevado de muestras, es precisamente

la limitación práctica más frecuente a la que se enfrentan la mayoría de las colecciones, y casi

siempre el proceso de regeneración es el factor más limitante, siendo éste más costoso en los

ecotipos silvestres que en los cultivados (Brown et al., 1997). Por estas razones, algunos

autores han propuesto el concepto de colección núcleo (Frankel, 1984; Brown, 1989b), que

consiste en una fracción manejable de accesiones, seleccionadas por conservar la mayor parte

de la diversidad del conjunto. La selección debe basarse en criterios de muestreo que

garanticen la conservación de la diversidad de la colección total con un número mínimo de

accesiones, eliminando la redundancia producida por genotipos semejantes. Brown (1989b)

sugirió que una muestra al azar del 10% de la colección base conservaría un 70% de la

variación total. No obstante, según Brown, (1989a), sería más efectivo organizar la colección

base en una estructura estratificada basada en grupos de características similares y tomar

muestras aleatorias basándose en diferentes criterios: una fracción constante de cada grupo

(estrategia C), una proporción del grupo (estrategia P) o bien una proporción logarítmica del

grupo (estrategia L). Posteriormente Schoen y Brown (1993 y 1995) propusieron dos nuevas

estrategias de agrupación (H y M) basadas en marcadores e índices de diversidad genética.

Estos mismos autores evaluaron la efectividad de las cinco estrategias anteriores concluyendo

que la retención esperada de alelos, en orden de mayor a menor es: M>H>P>L>C>R.

Las estrategias basadas en procedimientos multivariantes conllevan la agrupación de

las accesiones en base a descriptores de pasaporte, datos ecogeográficos, geoestadísticos,

marcadores moleculares e isoenzimáticos, y caracteres fenotípicos. Sin embargo requieren el

empleo de información preexistente que es inviable en algunas colecciones por el elevado

número de accesiones que deberían caracterizarse. Peters y Martinelli (1989) compararon

diferentes procedimientos de agrupación jerárquica multivariante, obteniendo como resultado

que no sólo eran herramientas muy útiles para agrupar las entradas de colecciones de

germoplasma, sino que además permiten estimar el potencial de segregación de las accesiones

en cruzamientos. En los últimos 10 años se ha comparado la efectividad de los métodos

multivariantes frente a los métodos aleatorios para crear colecciones núcleo en diferentes

cultivos (Spagnoleti y Qualset, 1993; Basigalup et al., 1995; Bisht et al., 1999), y en el

desarrollo de colecciones núcleo de raigrás inglés por diferentes autores (Casler, 1995;

Balfourier et al., 1999). Una revisión puede observarse en Hamon et al. (1998) y en Ortiz et

al. (1998). Casi todos los estudios citados se refieren a colecciones de tamaño considerable, y

debido a la amplia distribución de las accesiones, suelen tener en cuenta el origen geográfico

del germoplasma. Sin embargo no existen muchos datos en colecciones reducidas de cultivos

locales. Casler (1995), encontró que la presión de cultivo y las condiciones climáticas pueden

influir en los ecotipos silvestres de las especies cultivadas. A menudo las prácticas de cultivo

están delimitadas territorialmente por divisiones administrativas, de modo que muchos

autores tienen en cuenta el factor país como fuente de variación genética en la creación de

colecciones núcleo. Según Balfourier et al., (1998 y 1999) las estructuras espaciales

identificadas por procedimientos geoestadísticos en L. perenne son el resultado de una presión

selectiva del ambiente. Monestiez et al., (1994) encontraron estructuras espaciales en, al

menos 6 variables agronómicas de L. perenne en dimensiones de 120-300 km de distancia. En

nuestro caso casi todas las accesiones que componen ambas colecciones base se distribuyen

por el norte de España. El objetivo de este trabajo es comparar la eficacia de técnicas

utilizadas habitualmente en el muestreo de accesiones para crear colecciones núcleo de raigrás

inglés e italiano en germoplasma recogido principalmente en el norte de España.

MATERIAL Y MÉTODOS

Durante dos años se evaluaron un total de 74 accesiones de raigrás inglés y 42 de

Lolium multiflorum pertenecientes a la colección de gramíneas pratenses conservada en el

CIAM, y que ya ha sido objeto de varios estudios (Oliveira et al., 1997a, 1997b; López y

Oliveira, 2000). La distribución geográfica del material se representa en la Figura 1. El

estudio se inició en 1998 en el CIAM de A Coruña, situado en Mabegondo (43º 15’ N, 8º 18’

O) a 100 m de altitud. Las semillas utilizadas fueron sometidas a un tratamiento de calor (Nott

y Latch, 1993) para eliminar el hongo endofito y evitar sus posibles interacciones con las

accesiones en la evaluación agronómica. El material vegetal se sembró en bandejas de

plástico y germinó bajo condiciones de invernadero, transplantándose al campo al cabo de 8

semanas de crecimiento. Como abono se aplicaron 800 kg/ha de NPK 8:15:15 y previamente

se aplicaron 1.500 kg/ha de cal a la superficie del ensayo (90% CaCO3, 45% CaO). El control

de malas hierbas se efectuó mediante el uso de herbicidas de contacto y residuales. El diseño

experimental consistió en dos bloques completos al azar con 10 individuos por accesión y

bloque separados en líneas de 50 cm de distancia. Como testigos se introdujeron en el ensayo

de raigrás inglés las variedades comerciales ‘Brigantia’, ‘Arion’, ‘Vigor’, ‘Talbot’, ‘Cropper’

y la experimental ‘Ciam1’, creada a partir de ecotipos locales. En el raigrás italiano se

introdujeron los cultivares ‘Promenade’, ‘Finul’, ‘Exalta’ y ‘Vitesse’. En cada planta

individual se tomaron datos de las variables agronómicas siguientes: fes (fecha de espigado):

nº días a partir del 1 de enero de cada año, cri, crp, cre, crv (producción en g de materia seca

en invierno, primavera, en espigado y en verano), ain (nº de inflorescencias por planta), alp

(altura en espigado medida en cm), lhb (longitud de la hoja bandera en cm), ahb (anchura de

la hoja bandera en mm). También se tomaron dos caracteres cualitativos: enf (tolerancia a

enfermedades, desde 1 = sensible hasta 5 = resistente), y hcr (hábito de crecimiento desde 1 =

postrado hasta 5 = erecto). Debido al carácter anual del raigrás italiano, el ensayo se repitió

completamente en el segundo año, mientras que en raigrás inglés las plantas permanecieron

en el campo durante los dos años de evaluación. Por esta razón el modelo de análisis de

varianza (ANOVA), siguiendo un modelo de efectos fijos fue distinto en cada ensayo, siendo

en el raigrás inglés:

Yijkl= μ + αi + βj + (αβ)ij + γk + (αγ)ik + εijkl

y en el raigrás italiano:

Yijkl= μ + αi + β(α)ij + γk + (αγ)ik + εijkl

donde μ es la media general, αi es el efecto del año, βj es el efecto del bloque, (αβ)ij es la

interacción entre año y bloque, γk es el efecto de la accesión, β(α)ij es el efecto del bloque

jerarquizado a año, y finalmente εijk es el error. Los datos cualitativos se analizaron mediante

el test no paramétrico de Kruskal-Wallis. Todos los datos se analizaron mediante el programa

informático SAS (SAS Institute, 1994).

Los valores medios de variables significativas en el ANOVA se utilizaron en un análisis de

componentes principales (ACP). Con las componentes de autovalor mayor que 1, se realizó

una clasificación ascendente jerárquica utilizando el método de agregación de Ward

(Romersburg, 1984). Éste método minimiza las varianzas dentro de los clusters y las

maximiza entre los clusters, y ha sido aplicado en el desarrollo de otras colecciones núcleo

(Johnson et al., 1999; Bisht et al., 1999). Debido a que la zona de recolección es

relativamente pequeña, no se tuvo en cuenta el origen geográfico de cada accesión en la

clasificación. Como tamaño de la colección núcleo (CN), se fijó el 12% de la colección base

(CB) para raigrás inglés y el 16% para raigrás italiano, en exceso del 10% propuesto como

mínimo por Brown (1989b). Por tanto se estableció el número de grupos de la clasificación

jerárquica en 9 en el caso de raigrás inglés y en 7 en el caso del raigrás italiano. Basándose en

este tamaño de muestra y para cada CN se diseñaron seis métodos de selección de

poblaciones (Figura 2). Los métodos seleccionados fueron:

MÉTODO 1, muestreo al azar: se generaron 200 muestras independientes de tamaños 9 y 7,

respectivamente para raigrás inglés e italiano, a partir de las CB, mediante un generador de

números aleatorios que sigue una distribución uniforme (0-1).

MÉTODO 2, criterio de máxima diversidad: se seleccionaron las poblaciones con mayor

diversidad media en la CB (Bekele y Bekele, 1996; Bisht et al., 1999). La medida de la

diversidad se calculó como la media del índice H de Shannon-Weaver en cada variable según

la expresión:

i

n

iij PPH 2

1log∑

=

−= , (Shannon y Weaver, 1963)

donde j es la variable agronómica, Pi es la frecuencia de aparición de cada valor en cada

variable, i es el número de valores que toma dicha variable.

MÉTODO 3, azar dentro de cada clúster: se generaron 200 muestras independientes de

tamaño 1 en cada clúster, mediante un generador de números aleatorios que sigue una

distribución uniforme (0-1).

MÉTODO 4, mayor similaridad media en el clúster: se calcula la media de cada clúster para

cada una de las variables. Los valores medios así obtenidos se consideran como si fuera una

nueva población y se repite el análisis de componentes principales y el análisis clúster. Se

selecciona la población que presente una mayor proximidad con respecto a la “población” de

valores medios, determinada por el valor SPR (semipartial R-square) de la clasificación

ascendente jerárquica mediante el método de Ward.

MÉTODO 5, criterio de máxima diversidad dentro del clúster: se selecciona la población con

mayor diversidad media de entre las posibles dentro de cada clúster, utilizando el índice H del

método 2.

METODO 6: máxima contribución a la inercia de la nube de puntos en el espacio factorial del

ACP: la suma generalizada de cuadrados de un grupo de N individuos en un espacio factorial

de K variables estandarizadas (media=0, varianza=1) e independientes (coeficiente de

correlación=0) es igual al producto N x K. La contribución Pi de cada individuo a la inercia

de la nube de puntos es:

2

1ij

K

ji xP ∑

=

=

y la contribución relativa CRi de cada individuo i a la inercia de la nube de puntos está dada

por:

NKP

CR ii = , (Noirot et al., 1996; Hamon et al., 1998)

Los individuos con mayor CRi son los que más contribuyen a la inercia de la nube de puntos.

Seleccionando estos individuos se obtiene una subcolección con varianzas elevadas.

Los métodos 2, 4, 5 y 6 son determinísticos, ya que la metodología empleada especifica qué

accesiones se van a seleccionar según los datos de evaluación agronómica. Para cada método

se obtuvo la media, varianza y rango de las 10 variables agronómicas medidas para comparar

cada CN con la CB. Las comparaciones de medias y varianzas se realizaron mediante el test

no paramétrico de Wilcoxon, mediante el procedimiento NPAR1WAY del programa

estadístico SAS (SAS Institute, 1994). Adicionalmente se obtuvo una medida del porcentaje

de retención de los rangos de variación de las variables para cada método, según la expresión:

tCBRCNR

retencion

t

i n

n∑== 1% , (Diwan et al., 1995)

donde RnCN es el rango de la variable n en la CN, RnCB es el rango de la variable n en la CB,

y t es el número de variables comparadas.

La CN más representativa de la colección base se podría considerar aquella con medias

inalteradas, mayores varianzas y mayores porcentajes de retención (Malosetti et al., 2000)

RESULTADOS

Raigrás inglés

El ANOVA para cada variable mostró diferencias significativas en todos los casos

(Tabla 1). El test de Kruskal-Wallis también mostró diferencias significativas para las dos

variables cualitativas. Por lo tanto las 10 variables se utilizaron para el análisis multivariante.

El ACP sobre la CB explicó un 72% de la varianza con tres componentes extraídas de

autovalor mayor que 1. En la Tabla 2 se muestran las correlaciones de las variables con cada

una de las componentes extraídas del ACP. La clasificación ascendente jerárquica basada en

las componentes estableció nueve grupos de accesiones explicando un 76% de la varianza

(Figura 3a). En la figura 3b se representan las accesiones con un símbolo de pertenencia a sus

grupos respectivos, en el espacio factorial del ACP.

Las medias y varianzas para cada método de muestreo se pueden observar en la Tabla 2. En

dicha tabla se resaltan las varianzas que han resultado mayores en las CN formadas que en la

CB. Los métodos basados en selección por diversidad (2 y 5) extraen accesiones con alta

dispersión en los datos. Debido a esto, las colecciones creadas presentan la mayor parte de sus

varianzas superiores a las de la CB, ya que contribuyen en mayor proporción a la CN que a la

colección total. El método 6 extrae las accesiones que más contribuyen a la inercia de la nube

de puntos en el ACP, y por eso casi todas las varianzas son superiores a la colección total. Los

métodos basados en extracción al azar (métodos 1 y 3) y y el método 4, extraen accesiones

con menor número de varianzas superiores. El test de comparación de Wilcoxon (Tabla 7) no

reveló diferencias significativas para medias y varianzas en ningún método, sin embargo los

coeficientes de retención fueron notablemente inferiores en los métodos de selección al azar

(métodos 1 y 3), que alcanzaron sólo el 34 y 23% respectivamente, y resultó máximo en el

método 6 (87%). El resto de métodos mantuvieron coeficientes de retención aceptables. En la

Figura 4a se puede observar las distribuciones de los rangos para cada método. Como era de

esperar, ninguna de las colecciones extraídas llega al 100% de retención, y se puede observar

una mayor efectividad de los métodos multivariantes en general en la conservación de los

rangos. La Figura 4b muestra las varianzas medias expresadas como % de las varianzas de la

colección base. Los métodos 2 y 6 son los que presentan varianzas medias relativas más altas.

Los métodos de selección al azar se mantienen en porcentajes cercanos al 100% y con

intervalos de confianza cortos. En general se observaron mayores varianzas medias en los

procedimientos multivariantes.

Raigrás italiano

El ANOVA mostró diferencias significativas en todas las variables. El test de Kruskal-

Wallis también fue significativo para las dos variables cualitativas (Tabla 4). El ACP sobre la

CB explicó un 82% de la varianza con tres componentes extraídas de autovalor mayor que 1

(Figura 5b). La Tabla 5 muestra las correlaciones entre las variables agronómicas y las

componentes extraídas en el ACP. La clasificación ascendente jerárquica basada en las

componentes estableció siete grupos de accesiones explicando un 78% de la varianza (Figura

5a). En la Tabla 6 se muestran las medias y varianzas para cada método. De nuevo los

métodos basados en diversidad (métodos 2 y 5) y el método 6 seleccionan colecciones con

varianzas más altas. Nuevamente se observa una mayor eficacia de los métodos multivariantes

en general en la conservación de los rangos (Figura 6a). Los métodos de selección al azar

obtuvieron los coeficientes más bajos de retención (46 y 22% respectivamente), mientras que

el método más conservativo volvió a ser el método 6. En cuanto a las varianzas, los métodos

basados en diversidad (métodos 2 y 5) y el método 6 son los que más incrementaron las

varianzas en las colecciones núcleo creadas (Figura 6b). El test de Wilcoxon (Tabla 7) no

mostró diferencias significativas en ninguna comparación.

DISCUSIÓN

Según Brown (1989b), la diversidad de las colecciones de germoplasma no está

distribuida al azar, y dicha diversidad presenta una estructura que puede ser representada por

un modelo jerárquico (Hamon et al., 1994). Por tanto los métodos de selección aleatoria no

parecen ser adecuados cuando se conocen datos cuantitativos de la CB, aunque sí pueden

utilizarse cuando no se dispone de datos de evaluación/caracterización. La mayor efectividad

de los métodos multivariantes en la creación de colecciones núcleo de raigrás inglés también

ha sido observada por Casler (1995) y por Balfourier et al., (1998). En nuestro caso, aunque

las comparaciones de medias y varianzas no hayan sido significativas para ningún método de

muestreo, parece obvio descartar los métodos de selección aleatoria por los bajos coeficientes

de retención de los rangos. Las retenciones observadas en los rangos son, por término medio,

inferiores a las observados por Malosetti et al. (2000) en un estudio de cebada, debido

probablemente al menor tamaño relativo de las CN frente a las CB (en nuestro caso un 12% y

un 16%, frente a un 19,5% seleccionado sobre la colección de cebada). Si se representa la

contribución acumulada relativa de cada accesión a la inercia de la nube de puntos en el ACP

(Fig. 7), se observa cómo al aumentar el tamaño de la colección núcleo se obtienen dos

patrones distintos para cada especie. En L. perenne el incremento es gradual, y se alcanza el

50% de la varianza total con un 27% de la CB, mientras que en L. multiflorum el incremento

es mayor en el origen, alcanzando con sólo un 16% de la CB la mitad de la inercia de la nube

de puntos. Hamon et al. (1998), obtuvieron curvas distintas en colecciones núcleo de cuatro

cultivos diferentes, mostrando que la complejidad y la organización de las estructuras

genéticas en las colecciones base dependen del propio cultivo. En el caso de L. multiflorum el

incremento rápido en el origen parece motivado por una distribución bimodal de los datos,

provocado por una clara distinción de la colección base en dos grupos de precocidad: un

grupo precoz, con altas producciones concentradas en fechas tempranas, y un grupo tardío,

con producciones concentradas en fechas más tardías. La figura 8 muestra la distribución de

frecuencias de las fechas de espigado para cada especie. Como se puede observar, en L.

multiflorum tanto la colección base como la colección núcleo seleccionada por el método 6

presentan una distribución bimodal, y tal distribución contribuye a aumentar las varianzas de

manera sustancial. La figura 9 muestra la disposición de las accesiones seleccionadas por éste

método en la Península Ibérica.

Si el propósito de una colección núcleo es conservar la diversidad de una colección de

germoplasma, el uso de métodos basados en selección al azar aumenta el riesgo de pérdida de

genotipos poco representados. El método 6 parece ser el más indicado para la formación de

colecciones núcleo con base en la caracterización agromorfológica realizada en las accesiones

de raigrases del CIAM. Las razones de ello son el no alterar las medias y varianzas de la

colección base y conservar un porcentaje elevado de los rangos de variación en las variables

estudiadas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se ha realizado mediante la financiación aportada en el proyecto RF 99-

018-C1 del Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación.

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COMPARISON AMONG PROCEDURES TO ELABORATE CORE COLLECTIONS

IN PERENNIAL AND ITALIAN RYEGRASS ACCESIONS OF THE NORTH OF

SPAIN

ABSTRACT

Seventy-four accessions of perennial ryegrass and 43 of Italian ryegrass were

characterised by agronomic traits during a two-year period. The accessions are conserved into

the Germplasm Bank of forage grasses in the Research Agrarian Center of Mabegondo

(CIAM). The significant variables in the ANOVA were used for a hierarchical cluster

classification using the Ward method. Diverse strategies were compared to create a core

collection in each species, with samples of 12% and 16% respectively in perennial and italian

ryegrass. These methods included stratified and random samplings based on the hierarchical

classification, in the Shannon diversity index and in the maximum contribution to the variance

in a principal component analysis. Wilcoxon test did not show significative differences in the

means and variances among cores and base collections. Core collections selected by the

strategy of the highest contribution to the variance in the principal component analysis

presented the best percentage of retention in ranges of variation, and it was considered the

most appropriate method for the maintenance of diversity in the base collection.

Keywords: core collection, Lolium perenne, Lolium multiflorum, genetic resources,

germplasm banks.

TABLAS

Tabla 1. Cuadrados medios del análisis de varianza y test de Kruskal-Wallis para

variables cualitativas en L. perenne; FV: fuente de variación; GL: grados de libertad;

Blq: bloque; Acc: accesión; X2: valor del test chi-cuadrado; fes: fecha espigado; cri, crp,

cre: crecimientos en invierno, primavera y en espigado; alp: altura de la planta; enf:

tolerancia a enfermedades; lhb y ahb: longitud y anchura de la hoja bandera; hcr:

hábito de crecimiento; ain: nº inflorescencias; *: significativo al nivel 0,05; **:

significativo al nivel 0,01.

Table 1. Mean squares of the analysis of variance and test of Kruskal-Wallis for

qualitative variables in L. perenne; FV: source of variation; GL: degrees of freedom;

Blq: block; Acc: accession; X2: chi-squared value; fes:

heading date; cri, crp, cre: growths in winter, spring and in heading; alp:

height of the plant; enf: tolerance to diseases; lhb and ahb: longitude and

width of the flag leaf; hcr: habit of growth; ain: number of inflorescences; *: significant

at 0,05 level; **: significant at 0,01 level.

FV GL

Año 1

Blq 1

Año*Blq 1

Acc 73

Acc*Año 73

Cuantitativas fes 82172,79** 78,02 190,98* 1864,56** 193,23** cri 23485,94** 1921,04** 992,08* 857,19** 613,04** crp 46221,98** 3092,51 52,64 5496,46** 2603,07** cre 14998511,85** 32928,88* 24587,77 43513,98** 35935,21** alp 379806,14** 755,36 44,64 1696,99** 1076,49** lhb 4580,57** 110,94** 0,02 55,22** 44,29** ahb 248,63** 57,14** 33,53** 5,90** 2,60** ain --- 117,08 --- 5046,87** ---

Cualitativas X2 enf 314,63** hcr 190,18**

Tabla 2. Correlaciones entre las variables agronómicas y las componentes extraídas del

análisis de componentes principales en L. perenne; fes: fecha espigado; cri, crp, cre:

crecimientos en invierno, primavera y en espigado; alp: altura de la planta; enf:

tolerancia a enfermedades; lhb y ahb: longitud y anchura de la hoja bandera; hcr:

hábito de crecimiento; ain: nº inflorescencias; % var. acum.: % de varianza acumulada;

*: significativo al nivel 0,05; **: significativo al nivel 0,01.

Table 2. Correlations between agronomic traits and the components extracted

in the principal component analysis in L. perenne; fes:

heading date; cri, crp, cre: growths in winter, spring and in heading; alp:

height of the plant; enf: tolerance to diseases; lhb and ahb: longitude and

width of the flag leaf; hcr: habit of growth; ain: number of inflorescences; % var.

acum.: % of cumulative variance; *: significant at 0,05 level. **: significant at 0,01 level.

FACTOR 1 FACTOR 2 FACTOR 3

fes 0,547(**) -0,592(**) -0,119

0,875(**) 0,032 -0,026 cri

crp 0,901(**) 0,177 0,122

cre 0,849(**) 0,209 -0,059

0,240(*) 0,665(**) 0,519(**) alp

enf 0,716(**) -0,097 0,074

lhb 0,026 0,902(**) -0,059

0,1 0,871(**) -0,09 ahb

hcr -0,088 0,018 0,904(**)

ain 0,477(**) -0,178 0,438(**)

3,482 2,483 1,261 Autovalor

34,82 59,65 72,26 % Var. acum.

Tabla 3. Medias, varianzas y rangos de las variables estudiadas para cada método de

muestreo, colección base, y para el testigo ‘Brigantia’ en L. perenne. En negrita se

resaltan aquellas varianzas superiores a las de la colección base; fes: fecha espigado; cri,

crp, cre: crecimientos en invierno, primavera y en espigado; alp: altura de la planta;

enf: tolerancia a enfermedades; lhb y ahb: longitud y anchura de la hoja bandera; hcr:

hábito de crecimiento; ain: nº inflorescencias.

Table 3. Means, variances and ranges of the traits studied for each

sampling method, base collection, and the control ‘Brigantia’ in L. perenne. In bold

letter are marked the variances that have been bigger than in the base collection; fes:

heading date; cri, crp, cre: growths in winter, spring and in heading; alp:

height of the plant; enf: tolerance to diseases; lhb and ahb: longitude and

width of the flag leaf; hcr: habit of growth; ain: number of inflorescences.

fes cri crp cre alp enf lhb ahb hcr ain Media 140,13 18,53 48,42 150,89 91,95 3,40 13,48 5,17 2,80 121,34 Brigantia Varianza 43,75 222,27 940,41 12305,88 559,15 0,88 18,91 2,64 0,89 5105,25 Media 135,89 16,03 41,14 141,18 84,46 3,42 14,12 5,08 2,97 104,09 Varianza 91,91 194,14 1019,41 16109,80 476,31 1,18 18,29 1,37 0,78 2275,63 Colección

Base Rango 38,43 26,63 68,16 261,66 40,13 2,27 9,43 2,89 2,07 100,09 Media 136,03 15,96 41,14 141,05 84,22 3,41 14,09 5,06 2,97 103,95 Varianza 91,39 191,38 1016,54 16241,88 481,32 1,20 18,35 1,37 0,78 2319,02 Metodo 1 Rango 13,66 9,09 23,81 64,25 14,34 0,73 3,73 1,10 0,72 37,49 Media 134,34 17,60 43,87 139,72 85,69 3,45 14,96 5,24 2,80 92,719 Varianza 110,29 228,5 1118,06 17118,77 495,80 1,38 23,37 1,79 1,01 1491,97 Metodo 2 Rango 24,67 11,01 38,20 92,49 22,68 0,97 7,76 2,46 0,81 27,09 Media 137,82 16,49 41,80 145,61 82,36 3,46 13,90 5,02 2,88 103,94 Varianza 86,75 208,08 1023,31 17301,92 465,68 1,18 17,64 1,30 0,79 2236,25 Metodo 3 Rango 9,64 5,10 15,49 52,99 8,35 0,69 2,10 0,65 0,45 27,99 Media 138,92 17,99 44,01 150,58 83,24 3,34 14,04 4,91 2,93 100,05 Varianza 88,46 295,93 1164,85 17995,86 516,37 1,19 16,95 1,14 0,66 1852,75 Metodo 4 Rango 32,00 19,34 44,35 91,32 29,26 1,40 5,86 1,33 1,13 54,61 Media 139,36 17,79 40,70 137,52 81,68 3,37 13,78 4,88 2,94 96,07 Varianza 91,67 250,29 947,55 16997,33 497,51 1,32 20,12 1,49 0,98 1817,51 Metodo 5 Rango 10,67 13,69 33,53 114,13 28,35 1,77 5,37 2,29 1,40 47,44 Media 138,84 18,35 47,06 165,29 80,52 3,58 14,86 5,29 2,57 102,90 Varianza 97,15 258,49 1160,82 21132,91 553,16 1,32 19,35 1,47 0,99 2210,81 Metodo 6 Rango 30,79 26,63 68,16 261,66 34,16 2,21 7,84 2,28 1,36 82,87

Tabla 4. Cuadrados medios del análisis de varianza y test de Kruskal-Wallis para

variables cualitativas en L. multiflorum. FV: fuente de variación; GL: grados de

libertad; Blq: bloque; Acc: accesión; X2: valor del test chi-cuadrado; fes: fecha

espigado; crp, cre, crv: crecimientos en primavera, en espigado y en verano; alp: altura

de la planta; enf: tolerancia a enfermedades; lhb y ahb: longitud y anchura de la hoja

bandera; hcr: hábito de crecimiento; ain: nº inflorescencias; *: significativo al nivel

0,05; **: significativo al nivel 0,01.

Table 4. Mean squares of the analysis of variance and test of Kruskal-Wallis for

qualitative variables in L. multiflorum; FV: source of variation; GL: degrees of

freedom; Blq: Block; Acc: accession; X2: chi-squared value. fes:

heading date; crp, cre, crv: growths in spring, in heading and in summer; alp:

height of the plant; enf: tolerance to diseases; lhb and ahb: longitude and

width of the flag leaf; hcr: habit of growth; ain: number of inflorescences; *: significant

at 0,05 level; **: significant at 0,01 level.

FV GL

Año 1

Blq(Año) 1

Acc 42

Acc*Año 42

Cuantitativas fes 24318,93** 361,64** 17032,92** 182,56** crp 559973,94** 8972,67** 2379,36** 2382,69** cre 573160,06** 33418,53** 45143,78** 8610,61** crv 5283,26** 6208,62** 10641,24** 1143,27** ahb 329,51** 12,29** 38,23** 6,58** lhb 3541,02** 12,64 487,35** 80,35** ain 925,80 136389** 8745,78** 5066,97 alp 4592,43** 61,75 18757,80** 1997,47**

Cualitativas X2 enf 192,66** hcr 222,77**

Tabla 5. Correlaciones entre las variables agronómicas y las componentes extraídas del

análisis de componentes principales en L. multiflorum; fes: fecha espigado; crp, cre, crv:

crecimientos en primavera, en espigado y en verano; alp: altura de la planta; enf:

tolerancia a enfermedades; lhb y ahb: longitud y anchura de la hoja bandera; hcr:

hábito de crecimiento; ain: nº inflorescencias; % var. acum.: % de varianza acumulada;

*: significativo al nivel 0,05; **: significativo al nivel 0,01.

Table 5. Correlations between agronomic traits and the components extracted

in the principal component analysis in L. multiflorum; fes:

heading date; crp, cre, crv: growths in spring, in heading and in summer; alp:

height of the plant; enf: tolerance to diseases; lhb and ahb: longitude and

width of the flag leaf; hcr: habit of growth; ain: number of inflorescences; % var.

acum.: % of cumulative variance; *: significant at 0,05 level. **: significant at 0,01 level.

FACTOR 1 FACTOR 2 FACTOR 3

fes 0,935(**) -0,005 0,064

0,493(**) 0,582(**) 0,053crp

cre 0,892(**) 0,277 0,253

crv 0,870(**) 0,241 0,248

0,316(*) 0,788(**) -0,274ahb

lhb 0,777(**) 0,531(**) 0,052

ain 0,777(**) 0,011 0,336(*)

0,875(**) 0,326(*) 0,018alp

enf 0,308(*) 0,054 0,883(**)

hcr -0,078 0,861(**) 0,310(*)

5,85 1,49 0,97 Autovalor

58,58 73,50 82,65 % Var. acum.

Tabla 6. Medias, varianzas y rangos de las variables estudiadas para cada método de

muestreo, colección base, y para el testigo ‘Vitesse’ en L. multiflorum. En negrita se

resaltan aquellas varianzas superiores a las de la colección base; fes: fecha espigado;

crp, cre, crv: crecimientos en primavera, en espigado y en verano; alp: altura de la

planta; enf: tolerancia a enfermedades; lhb y ahb: longitud y anchura de la hoja

bandera; hcr: hábito de crecimiento; ain: nº inflorescencias.

Table 6. Means, variances and ranges of the traits studied for each

sampling method, base collection, and the control ‘Vitesse’ in L. multiflorum. In bold

letter are marked the variances that have been bigger than in the base collection; fes:

heading date; crp, cre, crv: growths in spring, in heading and in summer; alp:

height of the plant; enf: tolerance to diseases; lhb and ahb: longitude and

width of the flag leaf; hcr: habit of growth; ain: number of inflorescences.

fes crp cre crv ahb lhb ain alp enf hcr Media 132.32 19.98 119.47 33.97 10.10 25.27 72.36 108.11 3.19 3.91Vitesse Varianza 63.80 1213.87 8858.65 686.93 1.25 22.46 2607.50 173.20 1.28 1.02Media 112,36 20,00 67,14 17,74 7,96 17,19 72,63 84,64 3,30 3,02Varianza 74,64 925,90 3022,53 382,23 2,52 23,31 2134,07 346,36 1,27 1,24Colección

Base Rango 63,40 37,54 142,57 60,69 6,55 18,06 89,49 69,13 2,28 2,34Media 111,93 20,06 66,83 17,58 7,96 17,14 72,54 84,32 3,30 3,02Varianza 74,12 926,82 3006,53 382,81 2,54 23,31 2138,33 343,99 1,27 1,24Metodo 1 Rango 42,52 17,26 66,25 35,50 2,11 7,39 32,89 44,38 0,94 0,77Media 129,53 26,35 106,84 36,96 8,08 19,73 84,03 100,68 3,51 2,98Varianza 100,93 1386,19 7421,18 1043,01 3,31 34,39 2781,06 603,75 1,25 1,44Metodo 2 Rango 21,94 30,71 90,51 39,54 1,32 5,69 61,97 32,19 0,59 1,29Media 116,32 21,66 70,34 18,08 8,46 18,31 72,19 89,96 3,16 2,98Varianza 65,21 1042,96 3086,95 364,08 2,50 21,90 2146,20 342,37 1,23 1,25Metodo 3 Rango 13,85 10,98 27,71 13,92 1,19 3,85 22,87 15,67 0,62 0,44Media 113,86 21,33 78,07 17,27 8,29 18,35 71,56 91,48 3,24 3,02Varianza 60,98 941,82 2789,80 218,96 2,70 24,60 2218,39 276,84 1,43 1,19Metodo 4 Rango 61,03 20,45 99,44 33,88 4,49 16,78 33,38 67,73 1,54 1,84Media 118,47 19,88 70,69 16,03 8,33 18,56 73,09 87,15 3,24 2,94Varianza 98,00 795,30 2882,45 370,37 3,52 27,10 2709,35 488,24 1,44 1,61Metodo 5 Rango 37,32 20,46 89,98 35,06 4,39 15,03 21,86 59,20 1,54 1,84Media 118,26 24,96 86,96 26,29 8,68 19,73 73,31 91,51 3,38 3,35Varianza 54,97 1499,80 6026,97 690,99 3,08 21,92 2304,39 360,35 1,14 1,08Metodo 6 Rango 62,10 37,54 142,57 60,69 6,55 16,11 89,49 64,78 1,08 2,34

Tabla 7. Test de Wilcoxon y porcentajes de retención para los métodos comparados. P:

probabilidad; SIG: significación; ns: no significativo.

Table 7. Wilcoxon test and retention percentages for the

compared methods. P: probability; SIG: significance; ns: not significant.

L. perenne L. multiflorum

METODO COMPARACION P SIG. P SIG. Medias 0,8501 ns 0,8501 nsVarianzas 1,0000 ns 1,0000 ns 1 % retencion 34,69% 46,62%Medias 0,9698 ns 0,9698 ns Varianzas 0,7337 ns 0,7337 ns 2 % retencion 52,98% 49,35%Medias 1,0000 ns 0,9698 ns Varianzas 0,9698 ns 0,9698 ns 3 % retencion 23,29% 22,72%Medias 0,9698 ns 0,8501 ns Varianzas 0,9698 ns 0,9097 ns 4 % retencion 60,78% 71,92%Medias 0,8501 ns 0,9698 ns Varianzas 0,9097 ns 0,8501 ns 5 % retencion 57,18% 64,07%Medias 0,9097 ns 0,002 ns Varianzas 0,7913 ns 0,160 ns 6 % retencion 87,31% 92,82%

Figura 1. Distribución de los puntos de muestreo de las accesiones de raigrás

ingles e italiano (74 y 43 respectivamente). Los círculos corresponden al raigrás inglés y

los triángulos al raigrás italiano.

Figure 1. Distribution of the sampling points of perennial and Italian ryegrass accessions

(74 and 43 respectively). Circles correspond to the

perennial ryegrass and the triangles to the Italian ryegrass.

Figura 2. Esquema de las metodologías de muestreo empleadas en la formación de las

colecciones núcleo.

Figure 2. Diagram of the sampling methodologies used in the formation of

the core collections.

Análisis clúster método de Ward

M4 Selección

al azar

COLECCIÓN BASE

74 accesiones de L. perenne 43 accesiones de L. multiflorum

M5 Máxima

diversidad

M6 Máxima

Inercia en ACP

M1 Selección

al azar

M2 Máxima

diversidad

M3 Media del

clúster

Figura 3. Encima (3a): diagrama de la clasificación ascendente jerárquica en 74

accesiones de Lolium perenne, utilizando el método de agregación de Ward sobre las

tres primeras componentes. Debajo (3b): representación factorial de la clasificación

ascendente jerárquica sobre las tres primeras componentes.

Figure 3. Upper (3a): diagram of hierarchical cluster analysis in 74

accessions of Lolium perenne, using the Ward aggregation method with the first three

components.

Below (3b): factorial representation of the hierarchical classification

of the first three components.

Cluster

7

1

3

8

4

9

6

2

5

32

1

factor 30

4 3

-2

-12

-1

factor

2

1factor 1

0

0-2-1

1

-2

2

3

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Sem

ipar

tial R

Squ

ared

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Número de clúster

Fig. 4. Lolium perenne. Izquierda (4a): rangos medios para las 10 variables agronómicas,

expresados como % del rango de la colección total. Derecha (4b): varianzas medias para

las 10 variables agronómicas, expresados como % de la varianza de la colección total.

Las barras de error representan intervalos de confianza al 95%.

Fig. 4. Lolium perenne. Left (4a): mean ranges for the 10 agronomic

traits, expressed as % of the range of the total collection. Right (4b): mean

variances for the 10 agronomic traits, expressed as % of the

variance of the total collection. The error bars represent confiance intervals of 95%.

Método

M6M5M4M3M2M1

130

120

110

100

90

80

7095%

IC v

aria

nzas

L. p

eren

ne

Método

M6M5M4M3M2M1

95%

IC p

ara

L. p

eren

ne

120

100

80

60

40

20

0

Fig. 5. Encima (5a): diagrama de clasificación ascendente jerárquica en 43 accesiones de

Lolium multiflorum utilizando el método de Ward basado en las 3 primeras

componentes. Debajo (5b): representación factorial de la clasificación ascendente

jerárquica de las tres primeras componentes.

Figure 5. Upper (5a): diagram of hierarchical cluster analysis in 74

accessions of Lolium multiflorum, using the Ward aggregation method.

Below (5b): factorial representation of the hierarchical classification

of the first three components.

CLUSTER

1

2

4

3

7

6

5

32

10

factor 3-1

32

-3

-2

1

-2

factor 10

-1

fact

or

2

-3-1

0

-2

1

2

3

4

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Sem

ipar

tial R

Squ

ared

1 2 3 4 5 6 7 Número de clúster

Fig. 6. Lolium multiflorum. Izquierda (6a): rangos medios para las 10 variables

agronómicas, expresados como % del rango de la colección total. Derecha (6b):

varianzas medias para las 10 variables agronómicas, expresados como % de la varianza

de la colección total. Las barras de error representan intervalos de confianza al 95%.

Fig. 6. Lolium multiflorum. Left (6a): mean ranges for the 10 agronomic

traits, expressed as % of the range of the total collection. Right (6b):

mean variances for the 10 agronomic traits, expressed as % of the

variance of the total collection. The error bars represent confiance intervals of 95%.

Método

M6M5M4M3M2M1

95%

IC v

aria

nzas

L. m

ultif

loru

m

220

200

180

160

140

120

100

80

60

Método

M6M5M4M3M2M1

95%

IC ra

ngos

L. m

ultif

loru

m

120

100

80

60

40

20

0

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Tamaño relativo de la CN sobre la CB (%)

Con

trib

ució

n re

lativ

a (%

acu

mul

ado)

L. multiflorum L. perenne

Figura 7. Curva de contribución relativa (CRi) de cada accesión a la varianza total de la

nube de puntos en el análisis de componentes principales.

Figure 7. Curve of relative contribution (CRi) of each accession to the total variance of

the cloud of points in the principal component analysis.

Figura 8. Distribución de frecuencias de la variable fecha de espigado (fes) en Lolium

perenne (izquierda) y en Lolium multiflorum (derecha). CB: distribución de frecuencias

en la colección base. M6: distribución de frecuencias en la colección núcleo seleccionada

por el método 6. El eje de abscisas representa el número de días desde el 1 de enero.

Figure 8. Distribution of frequencies of the variable heading date (fes) in

Lolium perenne (left) and Lolium multiflorum (right). CB: distribution of frequencies in

the base collection. M6: distribution of frequencies in the core collection selected by

method 6. The X axis represents the number of days from January 1.

fes - L. perenne

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

100 110 120 130 140 150 160 170 180

Fecha de espigado

Frec

uenc

ia re

lativ

a

CB M6

fes - L. multiflorum

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Fecha de espigado

Frec

uenc

ia re

lativ

a

CB M6

Figura 9. Distribución de las accesiones seleccionadas por el método 6 en la Península

Ibérica. Los círculos corresponden al raigrás inglés y los triángulos al raigrás italiano.

Figure 9. Distribution of the selected accessions by method 6 in the Iberian Peninsula.

Circles correspond to the

perennial ryegrass and triangles to the Italian ryegrass.