clase_ingeniería de proteinas
TRANSCRIPT
INGENIERIA DE PROTEINAS
Jaime Eyzaguirre
INGENIERÍA: Ciencia o arte que realiza aplicaciones prácticas a partir de los conocimientos que nos dan lasciencias básicas
EN EL AREA BIOLOGICA: Bioingeniería, ingeniería genética, ingeniería de proteínas.
OBJETIVOS DE LA INGENIERÍA DE PROTEINAS: Construir nuevas proteínas o modificar proteínas ya existentes con el fin de obtener productos con propiedadesnuevas o diferentes.
OBJETIVOS A NIVEL DE CIENCIAS BASICAS
-Ampliar nuestros conocimientos sobre la relaciónentre estructura y función de proteínas
OBJETIVOS A NIVEL DE CIENCIAS APLICADAS
- Producir proteínas más efectivas y más estables confines industriales o terapéuticos.
PROPIEDADES DE ENZIMAS QUE PUEDEN SER MODIFICADAS
- Propiedades cinéticas (KM y kcat)- Termoestabilidad y temperatura óptima- Estabilidad y actividad en solventes no acuosos- Especificidad de sustrato- Requerimiento de cofactores- pH óptimo- Resistencia a proteasas- Regulación alostérica- Tamaño y estructura de sub-unidades
METODOS PARA LLEVAR A CABO INGENIERIA DE PROTEINAS
Genéticos (los más utilizados): Síntesis total de genes nuevos Mutagénesis al azar Mutagénesis sitio-dirigida
(óptimo: combinación de los dos últimos)
Químicos: Modificación química de proteínas Síntesis total de péptidos (Merrifield) Semi-síntesis
MUTAGENESIS SITIO-DIRIGIDA(diseño racional)
- Modificaciones en la secuencia nucleotídica (reemplazo de una base por otra) (el más común)- Deleciones- Inserciones
Ventajas: se puede planificar el lugar y tipo de mutación que se desea realizar.
Desventajas: ¿dónde realizar la mutación? Se requiere conocimiento PREVIO de propiedadesde la proteína (estructura; mecanismo de acción).Purificación de la enzima mutada y determinaciónde sus propiedades.
MUTAGENESIS AL AZAR
- Química (nitrosoguanidina)- Por radiaciones (ultravioleta, rayos X)- Evolución dirigida (errores introducidos por Taq polimerasa)
Ventajas: - Permite seleccionar por aquella propiedad que se deseamejorar (por ej.: estabilidad térmica).- No requiere conocimiento previo de la estructura y mecanismo- Las mutantes se pueden mejorar en mutagénesis sucesivas
Desventajas: - Requiere el análisis de muchos clones. - Se necesita un método de selección sensible y eficiente.
Caso particular: “DNA shuffling” (DNA barajado)
BIODEGRADACION DE LA LIGNOCELULOSA
- Madera (blanda o dura)
- Plantas anuales (cultivos: gramíneas, etc.)
- Desechos agrícolas (paja, corontas de choclo, etc.)
¿POR QUE ES VALIOSA LA LIGNOCELULOSA?
¿DONDE HAY LIGNOCELULOSA
- Material renovable
- Producido por la fotosíntesis en las plantas verdes
¿DE QUE ESTA COMPUESTA LA LIGNOCELULOSA?
-Dos polisacáridos:celulosa (polímero de glucosa)hemicelulosas (polímeros de manosa o xilosa)
-Un polifenol:la lignina
¿COMO ESTA ESTRUCTURADA¿COMO ESTA ESTRUCTURADALA LIGNOCELULOSA (MADERA)?LA LIGNOCELULOSA (MADERA)?
¿QUE ES LA BIODEGRADACION (OSACARIFICACION) DE LA LIGNOCELULOSA?
- El tratamiento biológico de la lignocelulosa, preferentemente por enzimas, para obtener (por hidrólisis) sus componentes fundamentales (monosacáridos de azúcares)
¿QUE PUEDE HACERSE CON LOSPRODUCTOS DE HIDRÓLISIS?
- Materias primas para la síntesis química- Fermentación para producir alcohol (combustible)- Alimento de animales
¿DONDE SE OBTIENEN LAS ENZIMASPARA LA SACARIFICACION DE LA
LIGNOCELULOSA?
- Estas enzimas son producidas por numerosos bacterios
y hongos.
- Microorganismos del suelo (aerobios) y del rumen de losrumiantes (anaerobios)
- En su mayor parte son secretadas al medio(los componentes de la lignocelulosa son muypoco solubles o insolubles)
¿QUE NOS INTERESA A NOSOTROS?
- Biodegradación del xilano
- Enzimas participantes: purificación, caracterización¿Qué función desempeñan?
- Uso de un hongo como modelo
Xylp: -D-xilopiranosa, Araf: -L-arabinofuranosa, -D-Me-GluA: ac.4-O-metil--D-glucurónico, Ac: ácido acético, Ph: ácidos cinámicos
1 endoxilanasas, 2 -L-arabinofuranosidasas, 3 glucuronidasas, 4 acetil xilano
esterasas, 5 cinamoil esterasas
ESTRUCTURA Y BIODEGRADACION DEL XILANO
MODELO DE ESTUDIOMODELO DE ESTUDIO
Penicillium purpurogenumPenicillium purpurogenum: hongo de pudrición: hongo de pudriciónblanda aislado de suelo de bosques del sur de Chileblanda aislado de suelo de bosques del sur de Chile
Se han purificado y caracterizado:
- endoxilanasas A y B- acetil xilano esterasas I, II y III- arabinofuranosidasas 1, 2 y 3- -xilosidasa- feruloil cumaroil esterasa
LAS ACETIL XILANO ESTERASAS
32
- Hidrolizan enlaces éster entre grupos acetato y xilosa de la cadena principal
Conteo de esporas y posterior inoculación (2 x 107 por 500 ml)
Agar papa-dextrosa 28 ºC x 6 días
Filtración
NaCl al 9%
¿CÓMO SE CULTIVA EL HONGO?
Mandels-xilano acetilado 1%
28 ºC x 8 días a 200 rpm
Filtración
Sobrenadante de cultivo
Influencia de la fuente de carbono sobre la producción de acetil esterasas y acetil xilano
esterasas por Penicillium purpurogenum
Ultrafiltración
Precipitación con (NH4)2SO4
corte 40% y 90%
Unión a celulosa
Cromatografía de intercambio catiónico
(CMC50 Sephadex)
Cromatografía de interacción hidrofóbica(Fenil agarosa)
Cromatoenfoque rango pH 7-4
Cromatografía de filtración molecular (G 75 Sephadex)
¿CÓMO SE PUEDEN PURIFICAR LAS ENZIMAS?
Cromatografías
BOMBA PERISTALTIC
AA
COLECTOR
COLUMNA
Perfil de elución de CMC50 Sephadex
• Amortiguador citrato 10 mM pH 4,0.• Lecho de la columna 20 ml (8 x1,8 cm)
Lavado buffer: 7 Vol. de columna Lavado 0,1 M sal: 11 Vol. columna
Gradiente 0,1 - 0,3M sal: 10 Vol. de columna Lavado 0,3 M: 3 Vol. columna
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171 181
Fracciones
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Abs 230 nmAbs 280 nmAbs 405 nm
0,1 M NaCl
0,3 M NaClI
II
III
IV
A 2
30 y
280
nm
A 4
05 n
m
Zimograma de la actividad acetil esterásica
AXEII
AXEI
Días de cultivo 1 2 3 4 5 6 7
Zimograma de CMC50
II III IV
AXE I
AXE II
Determinación del punto isoeléctrico
pH 4,75
B
AXE I
AXE III
1 2 3 4
B: Zimograma, pista 1: AXE I, pista 2 y 3: AXE III, pista 4: Estándar preteñido IEF
pH
A
1 2 3 4
5,1
5,85
7,0
4,75
9,6
A: Gel de isoelectroenfoque, pista 1 y 4: Estándar IEF, pista 2: Anhidrasa carbónica, pista 3: AXE III.
Propiedades de las acetil xilano esterasas de P. purpurogenum.
AXE I AXE II AXE IIIPeso molecular 48 000 23 000 85 700 Punto isoelectrico 7,5 7,8 6,35 pH óptimo 5,3 6,0 5,3 Temperatura óptima 50º 60º 20°
Unión a celulosa si no no
Unión a xilano no no
Especificidad de sustrato de las AXE Sustrato Actividad U/mg proteina
AXE I AXE II AXE III
α-Naftil acetato (C2) 24,2 7,72 3,09α-Naftil butirato (C4) 0,036 0,11 0,08α-Naftil caprato (C10) n.d. n.d. n.d.α-Naftil miristato (C14) n.d. n.d. n.d.Hemicelulosa de abedul 3,87 0,824 22,77Xilano acetilado de avena 2,85 0,67Xilosa tetraacetato 3,33 0,844Metil ferulato 0,0156 0,0059 n.d.: no detectado
Secuencia aminoacídica de AXE II
M H S K F F A A S L L G L G A A A I P L 20E G V M E K R S C P A I H V F G A R E T 40T A S P G Y G S S S T V V N G V L S A Y 60P G S T A E A I N Y P A C G G Q S S C G 80G A S Y S S S V A Q G I A A V A S A V N 100S F N S Q C P S T K I V L V G Y S Q G G 120E I M D V A L C G G G D P N Q G Y T N T 140A V Q L S S S A V N M V K A A I F M G D 160P M F R A G L S Y E V G T C A A G G F D 180Q R P A G F S C P S A A K I K S Y C D A 200S D P Y C C N G S N A A T H Q G Y G S E 220Y G S Q A L A F V K S K L G 234
Péptido señal Triada catalítica
Alineamiento de AXE II con AXE de Trichoderma reesei
Espectro de difracción de AXE II
Derivado yodado de AXE
II
ESTRUCTURA DE LA AXE II DE P. purpurogenum
MUTAGENESIS SITIO-DIRIGIDA POR DELECION
Alteración de la especificidad de sustrato de la acetil xilanoesterasa II (AXE II) de Penicillium purpurogenum.La enzima hidroliza grupos acetilo unidos a la cadena principal del xilano.
ANTECEDENTES- La enzima muestra una gran especificidad por ésteres de ácidos grasosde cadena corta (acetato).- Se conoce la secuencia y estructura tridimensional de la enzima.- Interés biotecnológico por enzimas que sinteticen ésteres de ácidos grasos de cadena larga.- La cutinasa, una enzima que hidroliza ésteres de cadena larga, tiene una estructura tridimensional similar.
¿Cómo modificar la estructura de la AXE II para que utilice ésteres de acidos grasos de cadena larga?
M H S K F F A A S L L G L G A A A I P L1 AXEIIL P T S N P A Q E L E A R Q L G R T T R1 CUTINASA
E G V M E K R S - - C P A I H V F G A R21 AXEIID D L I N G N S A S C A D V I F I Y A R21 CUTINASA
E T T A S P G Y G S S S T V V N G V L S39 AXEIIG S T E T G N L G T L G P S I A S N L E41 CUTINASA
A Y P G S T A E A I N Y P A C G G Q S S59 AXEIIS - - A F G K D G V W I Q G V G G A Y R61 CUTINASA
C G G A S Y S S S V A Q G I A A V A S A79 AXEIIA T L G D N A L P R G T S S A A I R E M79 CUTINASA
V N S F - - - N S Q C P S T K I V L V G99 AXEIIL G L F Q Q A N T K C P D A T L I A G G99 CUTINASA
Y S Q G G E I M D V A L C G G G D P N Q116 AXEIIY S Q G A A L A A A S I - - - - - - - -119 CUTINASA
G Y T N T A V Q L S S S A V N M V K A A136 AXEII- - - - - - E D L D S A I R D K I A G T131 CUTINASA
I F M G D P M F R A G L S Y E V G T C A156 AXEIIV L F G - - - Y T K N L Q N R G - - - -145 CUTINASA
A G G F D Q R P A G F S C P S A A K I K176 AXEII- - - - - - R I P N Y P - - - A D R T K158 CUTINASA
S Y C D A S D P Y C C N G - S N A A T H196 AXEIIV F C N T G D L V C T G S L I V A A P H169 CUTINASA
Q G Y G S E Y G S Q A L A F V K S K L -215 AXEIIL A Y G P D A R G P A P E F L I E K V R189 CUTINASA
- - - - - G234 AXEIIA V R G S A209 CUTINASA
ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA DE AXE IICON LA CUTINASA DE Fusarium solani
La triada catalítica se indica en color azul
Cutinasa Acetil xilano esterasa IIFusarium solani Penicillium purpurogenum
NATIVAS MUTANTE DE DELECION (Δ 104-114)
CUTINASA AXE II
Especificidad de sustrato de AXE II nativa y mutante
Sustrato AXE IIU/mg
AXE II 104-114
U/mg
-naftil acetato(C 2)
27,4 26,8
-naftil butirato(C 4)
12,4 3,3
-naftil caprato(C 10)
1,42 11,26
-naftil miristato( C 14)
0,67 11,97
Ensayo realizado con enzimas expresadas en Aspergillus nidulans