clase 9 inmovilización_ppt [modo de compatibilidad]
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inmovilizacion de bacteriasTRANSCRIPT
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inmovilizacin
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Una estrategia metodolgica interesante que sepresenta como alternativa al empleo de clulas ensuspensin es la inmovilizacin de clulas vegetales.
El primer trabajo publicado en 1966 fue sobre laespecie Umbilicaria pustulata y se emplearon gelesde poliacrilamida.
Toda la tecnologa de inmovilizacin de clulasviables se ha desarrollado sobre la base de losconocimientos existentes de inmovilizacin deenzimas.
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El empleo de clulas enteras inmovilizadas presenta una serie de ventajas frente a las enzimas aisladas:
Se evita los procesos de aislamiento y purificacinenzimtica.
Las enzimas de inters se hallan en su ambiente celularnatural con lo que aumenta su estabilidad y consecuentementela vida til del sistema permitiendo la reutilizacin del materialcataltico.
El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores, coenzimas y dems compuestos necesarios para asegurar una ptima actividad, adems de brindar buenas condiciones de temperatura y pH.
Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones multienzimticas.
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Inmovilizacin celular
Condiciones bsicas que debe reunir un mtodo
Sencillez de preparacin Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de preparacin Bajo costo Alta resistencia mecnica Baja o nula interferencia en los procesos de purificacin de productos Posibilidad de alternar ciclos de crecimiento y ciclos de produccin y/o biotransformacin
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Inmovilizacin celular
Por adsorcin Por entrampamiento
Adsorcin a soportes inertes
Entrampamiento en matricespolimricas
Inclusin en estructuras preformadas
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Inmovilizacin celular
Adsorcin a soportes inertes
Inclusin en estructuras preformadas
Bolillas de vidrio Virutas de madera, etc
Biorreactores de fibra hueca Espumas de poliuretanoMembranas de nylon
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Inmovilizacin celular
Entrampamiento en matrices polimricas
Matrices que polimerizan por reacciones de radicales libres (Geles de poliacrilamida)
Matrices que polimerizan por enfriamiento (Agar)
Matrices que polimerizan por cross-linking (Alginato, Carragenanos, Celulosas, etc)
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Las matrices que polimerizan por enfriamientocomo el agar pueden ser quebradasmecnicamente y colocadas en una fase lquidahidrfoba.
El problema fundamental de los mtodos queutilizan poliacrilamida es la toxicidad de losiniciadores y agentes de entrecruzamientoutilizados en el proceso de polimerizacin queen muchos casos han sido causantes de unabaja viabilidad celular.
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El k-carragenano
Heteropolisacrido no txico aislado de algas marinas.
Esta compuesto por sulfato de b-D-galactosa y 3,6-anhidro-a-D-galactosa
Gelifica por enfriamiento o en solucin con algn agente inductor como K+, NH4+, Ca++, Cu++, Mg++ o Fe+++, aminas o solventes orgnicos miscibles con agua.
Matrices que polimerizan por cross-linking
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Inmovilizacin celular:en esferas de celulosa-polidimetilpirrolidilamonio
OO
OO
OSO4-
O
-O4SO
n
Sulfato de celulosa
N
Cloruro de polidimetilpirrolidilamonio
n
+
OO
O
OSO4-
O
-O4SO
OO
O
OSO4-
O
-O4SO
OO
OO
OSO4-
O
-O4SO
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
OO
O
OSO4-
O
-O4SO
OO
O
OSO4-
O
-O4SO
OO
OO
OSO4-
O
-O4SO
Matrices que polimerizan por cross-linking
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Inmovilizacin celular: en esferas alginato
OO
OO
OH
O
OH
n
Alginato (Acido manurnico b 1,4)
O
O
CaCl2+
OO
O
O-
O
O-
O
O
OO
OO
O-
O
O-
O
O
OO
O
O-
O
O-
O
O
OO
OO
O-
O
O-
O
O
CaCa
CaCa
Ca Ca
Matrices que polimerizan por cross-linking
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Inmovilizacin celular: Metodologa de trabajo
Mezcla de solucin de alginatoY cultivo celular en medio libre De agentes complejantes de Ca++
Solucin de Ca++
Perlas de alginato
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Perlas de alginato
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Esponjas de poliuretano
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Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesinmovilizadas
Especie Matriz Producto ComentariosCatharanthus roseus Agarosa Catelamina Suministro de
ajmalicinaCatharanthus roseus Alginato Alcaloides
indlicosProlonga capacidad biosinttica
Catharanthus roseus Alginato Ajmalicina Prolonga estabilidad ycapacidad biosinttica(220 dias con cambiode medio)
Catharanthus roseus Xantanos/poliacrilamida
Serpentina Prolonga estabilidad ycapacidad biosinttica(180 dias con cambiode medio)
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Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesinmovilizadas
Daucus carota Alginato 5-b-hidroxidigi-toxigenina
Tcnica: Suministro de precursor
(digitoxigenina)Daucus carota Alginato fenoles No hay variaciones con
respecto a cultivosno inmovilizados
Especie Matriz Producto Comentarios
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Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesinmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Digitalis lanata Alginato b-metildigoxina Suministro de precursor:b-metildi-gitoxina
Digitalis lanata Alginato digoxina Suministro de precursor:digitoxina
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Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesinmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Beta vulgaris Nylon Betacianina Incrementaacumulacin
Capsicum frutescen Espuma de
poliuretano
Capsaicina Incrementarendimiento
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Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesinmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Morinda citrifolia Alginato Antraquinonas Incrementa acumulacinintracelular
Talictrum minus Alginato Berberina Incrementa liberacin
Solanum surretense Alginato Solasodina Incrementa liberacin
Lithospermunerithrorhysum
Fibrahueca
fenoles Incrementa rendimiento.
Solanum
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Mtodologas para inmovilizar por entrampamiento
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Parmetros a controlar en un sistema inmovilizado:
viabilidad crecimiento celular capacidad biosinttica
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Mtodos para evaluar la viabilidad de un cultivo inmerso en una matriz inerte
Colorimtricos: azul de Evans y diacetato de fluorescena
Medicin de parmetros de crecimiento como consumo de O2 y produccin de CO2 con electrodos selectivos en cultivos no continuos.
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Se basa en la determinacin de la dilucin diferencial de dos molculas marcadas radioactivamente.
Una de ellas no debe penetrar a las clulas y la otra debe difundir libremente
La primera es manitol u otro polialcohol no metabolizable marcado con 14C y la otra es agua marcada con 3H.
El mtodo determina el "volumen viable" expresado como el espacio porcentual que excluye manitol pero no agua expresado de otra manera las clulas viables se sacan de la relacin entre el 3H y el 14C puesto que excluyen al manitol y utilizan el agua.
Mtodo no destructivo de Parr et al., que permite determinar y expresar de manera porcentual el volumen ocupado por clulas viables en una matriz de inmovilizacin.
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Tambin pueden monitorearse por RMN lacantidad de metabolitos fosforilados comondice de actividad metablica
este es un mtodo no invasivo que se basa encuantificar la cantidad de ATP o el uptake defosfatos por medio de 31P-RMN.
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Capacidad biosinttica: Debe ser evaluadaespecficamente de acuerdo con elpropsito del sistema en particular
ya sea en su capacidad de producir unmetabolito determinado por sntesis denovo, o a partir de precursores sistemas obien en su actividad enzimtica especficapara producir reacciones de bioconversin.
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El empleo de clulas inmovilizadas ofrece una serie de ventajasvinculadas al estado fisiolgico y al diseo y modo de operacin del proceso fermentativo.
El entrampamiento en matrices inertes permite un gran contacto intercelular y la generacin de gradientes fsicos y qumicos que conducen a un mayor grado de diferenciacin.
Al estar minimizada la tasa de reproduccin celular la inestabilidad gnica se disminuye notablemente.
Se alcanzan fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante cuando la produccin esta asociada a la idiofase o al final de la etapa exponencial
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Estos sistemas permiten desacoplar las fases de crecimiento y produccin facilitando el empleo de estrategias como la elicitacin bitica y abitica o la permeabilizacin para incrementar la produccin
Es posible realizar ciclos alternantes de rejuvenecimiento/crecimientopara mantener la viabilidad y capacidad biosinttica.
las clulas inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a altas velocidades de disolucin sin riesgo de lavado de los cultivos
Es posible controlar el tamao de los agregados celulares en caso de ser importante esa variable para la acumulacin y/o produccin de metabolitos.
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Con la biomasa entrampada es ms sencillo trabajar con procesos en dos fases, lo ms comn es realizar una de crecimiento previo a la inmovilizacin y la segunda de produccin inmovilizando cuando el cultivo ha llegado a su etapa estacionaria.
En cultivos inmovilizados se facilita la remocin de inhibidoresmetablicos
se protege a las paredes celulares de las fuerzas de corte
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Con inmovilizacin es posible lograr: sistemas de produccin de metabolitos de una vida til prolongada puesto que se puede reutilizar la biomasa y realizar una recuperacin continua de los productos.
Es posible inducir la liberacin al medio extracelular los metabolitos de inters que naturalmente no son excretados mediante el empleo de agentes permeantes, especialmente DMSO
El empleo de estos sistemas se encuentra limitado a la produccin de compuestos secundarios y la realizacin de procesos de bioconversin dnde los productos de inters se liberen al medio de cultivo.