clase 16 2014 las plantas como biorreactores.pdf
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Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Agrobiotecnologa Curso 2014
Dra. Alicia M. Zelada
Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Las plantas como biorreactores
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Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Sumario Las plantas como biorreactores
- Sistemas de expresin - Las plantas como sistema alternativo
- Ventajas
- Costos comparativos entre distintos sistemas
Referencias
Elementos a considerar en una estrategia
de expresin
- Nivel de expresin - Sistemas de expresin integrativos
y no integrativos
- Optimizacin de costos de purificacin
Aplicaciones
- Expresin de antgenos para la produccin de vacunas - Produccin de anticuerpos
- Produccin de protenas de inters farmacolgico
- Otras aplicaciones
-
Las plantas como biorreactores
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Bioreactores
Expresin de antgenos para la produccin
de vacunas.
Produccin de anticuerpos y antgenos para
diagnstico.
Produccin de polipptidos de uso
farmacolgico.
Produccin de enzimas de inters industrial, suplementos alimentarios y biopolmeros. Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Sistemas de expresin de protenas recombinantes
Bacterias: E. coli
Levaduras: Saccharomyces - Metilotrficas
Clulas de insectos
Clulas animales
Animales transgnicos
Plantas
Plataformas
establecidas
Plataformas
emergentes
PR
OC
AR
IOTA
E
UC
AR
IOTA
S
-
Limitaciones de las plataformas de produccin en Bacterias, Levaduras y Clulas animales
El plegamiento de protenas de origen eucaritico sintetizadas en bacterias puede ser incorrecto
Los costos para aumentar la escala de produccin son altos en los tres casos
Requieren de personal tcnico especializado
Pueden causar grandes prdidas econmicas por contaminacin en la lnea de produccin
Riesgo biolgico: presencia de contaminantes en el producto final ENDOTOXINAS / PRIONES VIRUS
-
Algunas ventajas de la utilizacin de las plantas como biorreactores
Permiten una alta produccin de biomasa
El aumento en la escala de la produccin es sencillo y requiere bajos costos de inversin
No requieren de personal tcnico especializado
No implican riesgos de contaminacin con patgenos animales o toxinas microbianas
-
Algunas ventajas de la utilizacin de las plantas como biorreactores
Permiten el almacenamiento estable de la protena recombinante en semillas y tubrculos
Los mecanismos de sntesis y secrecin de protenas y las modificaciones post-traduccionales son las clulas eucariotas
Gozan de una mayor aceptacin pblica respecto de la manipulacin de animales.
-
Los costos de produccin de protenas recombinantes en
plantas son potencialmente menores que en otros sistemas
Tomado de: Daniell et. al. Trends in Plant Sci., 2001.
Estimacin de los costos de produccin en funcin
del nivel de expresin de IgA en distintos sistemas.
%
-
Elementos a considerar
en una estrategia de expresin
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
- Obtener altos niveles de expresin.
- Disminuir los costos de purificacin.
- Conseguir un producto de caractersticas idnticas al sintetizado en el sistema de . origen.
La produccin competitiva de protenas recombinantes en plantas requiere el diseo de estrategias de expresin que cumplan con tres premisas fundamentales:
Factores a considerar en el diseo de una estrategia de expresin en plantas
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La expresin de la protena recombinante puede optimizarse mediante diversas estrategias
Eleccin del sistema de expresin: sistemas integrativos y no integrativos.
Eleccin de secuencias promotoras de la transcripcin adecuadas (promotores tejido especficos, inducibles, constitutivos, etc.). Utilizacin de secuencias reguladoras y regiones no traducidas 5 y 3 apropiadas. Eliminacin de secuencias desestabilizantes del ARN mensajero.
Optimizacin del uso de codones (vegetalizacin de la secuencia).
Utilizacin de secuencias seal para la localizacin en distintos espacios subcelulares o extracelulares.
Co-expresin de chaperonas para facilitar el plegamiento proteico.
-
Sistemas de expresin en plantas
-
Sistemas de expresin en plantas Integrativos y no integrativos
Integrativos
Expresin estable heredable a la progenie
No integrativos
Expresin transitoria
Plantas transplantmicas
(cloroplastos)
Plantas transgnicas
nucleares
Vectores
virales
-
Sistemas de expresin integrativos Plantas transgnicas nucleares
-
La estrategia
a elegir debe
considerar
las ventajas y
limitaciones de
cada sistema
de expresin
Sistemas de expresin integrativos
Plantas transgnicas nucleares
Ventajas - Expresin estable heredable por la progenie. - Ausencia de limitaciones importantes en el tamao
de la secuencia a introducir.
- Modificacin postraduccional de protenas propia de clulas
eucariotas (glicosilacin-fosforilacin).
Limitaciones - Niveles de expresin relativamente bajos. - Niveles de expresin afectados por silenciamiento gnico
postranscripcional.
-
Contrucciones utilizadas para transformar
plantas de Arabidopsis thaliana
Nivel de expresin
(% de la protena total soluble)
Adaptado de: Geert De Jaeger, Nat. Biotech. 2002.
La acertada eleccin y combinacin de las secuencias
promotoras y reguladoras de la transcripcin y de la
traduccin puede determinar variaciones importantes
en los niveles de expresin de la protena recombinante
El nivel de
expresin
depende
de la utilizacin
adecuada de
las regiones
reguladoras Parc ss G4 myc 3arc 5UTR ar KDEL
W Parc ss G4 myc 3arc KDEL
Pphas ss G4 myc 3arc 5UTR ar KDEL
P35S ss G4 myc 3arc 5UTR ar KDEL
10%
5%
36%
1%
Parc: promotor de arcelina de Phaseolus vulgaris.
Pphas: promotor de -faseolina de Phaseolus vulgaris.
W: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus.
ss: secuencia seal de envo a retculo endoplsmico.
KDEL: secuencia de retencin en retculo endoplsmico
G4 myc: secuencia que codifica un anticuerpo de simple cadena
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Rizosecrecin en cultivos hidropnicos y secrecin en clulas en cultivo.
Acumulacin en las semillas u otros rganos de almacenamiento para la co-extraccin con
productos convencionales como almidn o
aceites.
Produccin directa en las partes comestibles de la planta.
Protenas de fusin que facilitan su purificacin: oleosinas-liquenasa termoestable
Los costos
de purificacin
pueden
reducirse
explotando
caractersticas
propias
de las plantas
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
La rizosecrecin
permite reducir
los costos de
purificacin
El gen de inters se fusiona a una secuencia seal de . transporte al retculo endoplasmtico para direccionar
. el producto correspondiente a la va de secrecin.
secuencia seal secuencia de inters
Inicio de la traduccin
Sitio de procesado de la seal
La protena recombinante se obtiene por purificacin a partir de la solucin hidropnica que circula en torno
a la rizsfera.
Tomado de: Finer, J. Nat. Biotech., 1999.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Rizosecresin
de la xilanasa
de Clostridium
thermocellum
en tabaco
transgnico
La expresin de la xilanasa de Clostridium thermocellum se utiliz como un
modelo de produccin por rizosecrecin.
p35SCaMV secuencia seal xilanasa
Planta no transformada Planta transgnica
Halo de
degradacin
del sustrato
generado
por la
xilanasa
rizosecretada
Las plantas de tabaco se cultivaron en medio conteniendo
Remazol Brilliant Blue-xilano como sustrato para la xilanasa.
Tomado de: Borisjuk et al. Nat. Biotech., 1999.
Construccin utilizada para la
transformacin de plantas de tabaco
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
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Aumento del rendimiento de rizosecrecin por infeccin
con Agrobacterium rhizogenes
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Las fusiones
a oleosinas
permiten
reducir los
costos de
purificacin
La protena de inters se fusiona a una oleosina, protena que normalmente forma parte de los
cuerpos grasos de las semillas.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Gen de inters
Sitio de reconocimiento
para una proteasa
Oleosina
Adaptado de: www.sembiosys.com
Cuerpos grasos
Cuerpos proteicos
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Purificacin de la protena recombinante
a partir de los cuerpos grasos
La purificacin
a partir de los
cuerpos
grasos es
un proceso
sencillo
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
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La produccin de hirudina fusionada a oleosinas en plantas
de Brassica napus permite purificar la protena activa
Tomado de: Parmenter, et al., Plant Mol. Biol., 1995.
Oleosina Xa HirudinaPromotor de OleosinaXa: sitio de reconocimiento
para el factor Xa
Localizacin por inmunofluorescencia de la
hirudina expresada en los cuerpos grasos aislados
Control
no transgnico
Cuerpos grasos
transgnicos
+ factor Xa
Cuerpos grasos
transgnicos
sin tratar con proteasas
Control
no transgnico
Cuerpos grasos
transgnicos
+ factor Xa
Cuerpos grasos
transgnicos
sin tratar con proteasas
Actividad anti-trombina de la fase
acuosa luego de la purificacin
Xa: tratamiento con factor Xa
NT: planta no transformada
T: planta transgnicaLa hirudina presente en
la fase acuosa inhibe
la actividad de la trombina Luz blanca Luz UV
HIRUDINA: pptido presente en la saliva de la sanguijuela= actividad anticoagulante
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Produccin de protenas fusionada a oleosinas en plantas de crtamo
(Carthamus tinctorius)- Tecnologa patentada por Sembiosys
Porqu crtamo?
CARTAMO: Oleaginosa altamente productiva cuya semilla puede ser almacenada por largos periodos
CARTAMO es poco cultivada por lo cual es fcilmente separada de otras producciones de crtamo
CARTAMO se autopoliniza y no tiene malezas emparentadas
Protenas en desarrollo
INSULINA Diabetes Ensayos clnicos Fase I y II
APOLIPROTENA A Enfermedades cardiovasculares
Ensayos preclnicos en modelos animales
OLEOSOMAS Esttica Comercializacin
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Produccin de insulina humana fusionada a oleosinas en
plantas de crtamo (Carthamus tinctorius)
Arriba: Anlisis comparativo por de insulina humana (hIN)
y de insulina fusionada a oleosina (OB-hIN) obtenidas por
separacin en cromatografa lquida de alto rendimiento.
Abajo: Cambios temporales en los niveles de glucosa en ratones
tratados con placebo salino (cuadrados abiertos), extracto de
plantas no transformadas (crculos llenos), insulina humana
estndar (tringulos y crculos abiertos) e insulina derivada de
plantas que producen fusiones oleosina/insulina (cuadrados llenos).
Izquierda: Separacin en PAGE-SDS de extractos proteicos totales de
plantas transformadas con la fusin oleosina/insulina y de la fraccin de
oleosinas de las mismas plantas. Wt: control no transformados; 4405-4, -
15 y 19: distintas fracciones de purificacin de muestras de plantas
transformadas. La flecha seala la posicin del estndar de insulina.
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Humanizacin
de las
glicoprotenas
recombinantes
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
- Expresin de la (1,4)-galactosiltransferasa humana en plantas
transgnicas.
- Retencin de la protena en el retculo endoplsmatico.
- Inactivacin de la a(1,3)-fucosiltransferasa y la (1,2)-xilosiltransferasa
de plantas.
Los patrones de N-glicosilacin en plantas difieren de los presentes en mamferos.
Esto puede alterar la inmugenicidad, resistencia a la degradacin proteoltica y actividad biolgica de la
protena expresada, particularmente en anticuerpos.
Se estn ensayando diversas estrategias para humanizar las glicoprotenas recombinantes expresadas en plantas:
Glicanos complejos
en plantas
NAcGlc
Asn
NAcGlc
Man Man
Man
NAcGlc NAcGlc
Fuc
Xyl
a -1,3 NAcGlc
Asn
NAcGlc
Man Man
Man
NAcGlc NAcGlc
Fuc
NAcGlc
Gal Gal Gal
AcNeu AcNeu AcNeu
a-1,6
Glicanos complejos
en mamferos
-
La especie a
utilizar debe
seleccionarse
de acuerdo
con las
necesidades
de produccin
de la protena
a sintetizar
Tabaco
Sistema de transformacin bien establecido.
Produccin de abundante biomasa.
Papa
Disponibilidad de promotores especficos para la expresin en tubrculos.
Procesamiento industrial de los tubrculos bien establecido.
Contenido proteico en tubrculos relativamente bajo.
Tomate
Consumo de los frutos crudos.
Disponibilidad de promotores especficos para la expresin en frutos.
Cultivo en invernaderos a escala industrial bien establecido.
Contenido proteico en frutos relativamente bajo.
Cereales
Tecnologa de produccin ampliamente establecida.
Almacenamiento estable de la protena recombinante en las semillas.
Procesamiento industrial de las semillas bien establecido.
Alfalfa
Alto contenido proteico en hojas.
Produccin de biomasa abundante.
Lemna
Alta eficiencia de proliferacin clonal.
Alta tasa de duplicacin de la biomasa.
Rizosecresin muy eficiente.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
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Sistemas de expresin integrativos
Sistema de expresin en Lemna
Planta acutica comestible (Lemnaceae)
Rpido y flexible Alta productividad debido alta tasa de crecimiento y altos niveles de expresin (35-40% peso seco)
Bajos costos Bioseguridad se realiza en confinamiento y no hay riesgo de contaminacin con patgenos humanos
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Sistemas de expresin integrativos
Sistema de expresin en Lemna
Lemna Gene TM Tecnologa de producin basada en Lemna
Protenas recombinantes para industria veterinaria y farmaceutica
Vacunas recombinantes humanas y animales Anticuerpos monoclonales Aditivos como enzimas y probiticos
IFN-alpha2b
BLX-301, anti-CD20 non-Hodgkin's B-cell linfoma humanizado
BLX-155, a tromboltico
Los productos puede ser producidos:
Puro: el ingrediente activo puede ser purificado
Seco: las plantas pueden ser deshidratadas y presentadas
como cpsulas, tabletas o polvo
Fresco: puede ser utilizadas directamente para alimentacin
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Sistemas de expresin integrativos Plantas transplantmicas
-
La estrategia
a elegir debe
considerar
las ventajas y
limitaciones de
cada sistema
de expresin
Sistemas de expresin integrativos
Plantas transplastmicas (cloroplastos)
Ventajas - Niveles de expresin potencialmente altos. - Expresin estable heredable por la progenie.
- Ausencia de limitaciones importantes en el tamao
de la secuencia a introducir.
- No hay efectos de posicin (transformacin por
recombinacin homloga).
- Ausencia de silenciamiento gnico.
- Introduccin de policistrones.
- Transferencia horizontal del transgn escasa o nula.
- Formacin de puentes disulfuro y menor complejidad de
proteasas
Limitaciones - No existen mecanismos de glicosilacin.
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Sistemas de expresin integrativos
Plantas transplastmicas (cloroplastos)
Protenas terapeuticas y antibiticos producidas en cloroplastos 2008-2011
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Sistemas de expresin integrativos
Plantas transplastmicas (cloroplastos)
Antgenos producidos en cloroplastos 2008-2011
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Sistemas de expresin integrativos
Plantas transplastmicas (cloroplastos)
Limitacin: altos costos de purificacin de las protenas a partir de
extractos de plantas
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Sistemas de expresin no integrativos Vectores virales
-
Ventajas
- Niveles de expresin potencialmente altos
- No se integran al genoma- No tienen efecto de posicionamiento
- Corto tiempo de desarrollo y produccin
- Permite el direccionamiento de protenas a compartimiento
subcelulares o al espacio apoplstico.
- Permite la modificacin postraduccional de protenas
Limitaciones
- Limitaciones en el tamao de la secuencia introducida
- Inestabilidad gentica de la secuencia introducida.
- Silenciamiento gnico
Sistemas de expresin no integrativos Vectores virales
-
2. Movilizacin viral clula a clula
3. Movilizacin sistmica
1. Infeccin inicial PVX
Sistemas de expresin no integrativos Vectores virales
TMV
-
Potexvirus. Potato virus X
-
ARN ARN
Vector viral
recombinante
ADNcADNc
Genoma viral
ADNc del
genoma viral
Transcripcin in vitro
Clonado del ADNc en un
plsmido. Introduccin de
un sitio de clonado mltiple
Obtencin del ADNc del
genoma viral completo
Gen XT7
Clonado del gen de inters
Vector viral ADNcT7
SCM
Infeccin mecnica
con transcriptos de ARN
Vectores virales derivados de virus a ARN. Promotor T7
Expresin transitoria
-
ARN
Amplicn viral
recombinante
ADNc
Genoma viral
ADNc del
genoma viral Clonado del ADNc en un vector binario para expresin en plantas. Introduccin de un sitio de clonado mltiple
Obtencin del ADNc del genoma viral completo
Gen X 35SCaMV t - nos
ADNc
Clonado del gen de inters
Amplicn viral 35SCaMV t - nos
SCM
ARN ARN
Amplicn viral
recombinante
ADNc ADNc
Genoma viral
ADNc del
genoma viral Clonado del ADNc en un vector binario para expresin en plantas. Introduccin de un sitio de clonado mltiple
Obtencin del ADNc del genoma viral completo
Gen X 35SCaMV t - nos
ADNc
Clonado del gen de inters
Amplicn viral 35SCaMV t - nos
SCM
Bombardeo del ADN infectivo
Agroinfiltracin
Agrospray
Expresin transitoria
Vectores virales derivados de virus a ARN. Promotor para expresin en plantas
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Los vectores y
los amplicones
virales
amplifican la
expresin de
los genes
forneos
Esquema
de la expresin
de un gen forneo
a partir de un
vector y de un
amplicn viral
de un virus
a ARN en
comparacin
con la expresin
de un gen forneo
por expresin
nuclear.
-
Genes virales
Genes forneos
*
A B
Virus representativo
Reemplazo gnico
Insercin gnica
Presentacin de epitopes
Complementacin
A: Fusin traduccional de una pequea secuencia dentro del gen de la protena de la cpside.
B: Translectura traduccional de un codn de terminacin mbar (*) en el extremo 3
Se pueden utilizar diferentes estrategias para expresar genes forneos en vectores virales
Reemplazo gnico
Bromovirus
Caulimovirus
Furovirus
Geminivirus
Hordeivirus
Potexvirus
Tobamovirus
Tobravirus
Tombusvirus
Insercin gnica
Caulimovirus
Geminivirus
Potexvirus
Potyvirus
Tobamovirus
Presentacin de epitopes
Comovirus
Tobamovirus
Tombusvirus
Complementacin
Alfamovirus
Caulimovirus
Dianthovirus
Geminivirus
Potexvirus
Tobamovirus
Tombusvirus
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Vectores virales de 1era y 2da generacin
Vectores de 1era generacin o Virus completo
Infecta sistmicamente
Agroinfiltracin o Agrospray
Bioseguridad baja
-
Agroinfiltracin por jeringa
Rpida: la protena recombinante puede
obtenerse en aproximadamente una
semana.
Simple: slo se requiere equipamiento
bsico.
Flexible: puede utilizarse para producir
protenas de membrana, enzimas o virus
quimricos.
Laborioso: no compatible con una
produccin a gran escala
-
Vectores virales de 1era y 2da generacin
Vectores de 2da generacin o Virus desarmado
No infectan sistmicamente
Mtodo de inoculacin: Magnifection
Permite expresar transgenes de mayor tamao
Mayor estabilidad de los transgenes
Bioseguridad alta
-
Magnifection. Agroinfiltracin por vaco.
Rpida
6-10 das.
Eficiente:
1-5 g protena/kg hoja
Escalable
Complejo Se requiere
equipamiento especfico y
standard
Flexible: puede utilizarse
para producir protenas de
membrana, enzimas o
virus quimricos.
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Companias de base biotecnolgica para la produccin de protenas en plantas
Icon Genetics. Alemania.
Vector TMV 2da generacin
Magnifection
-
Companias de base biotecnolgica para la produccin de protenas en plantas
Large Scale Biology Corp. EEUU. 2006 / KBP 2008
Vector TMV 1era generacin
Inoculacin mecnica
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NUCLEAR CLOROPLASTOS VECTORES
VIRALES
Niveles de
expresin
Bajos niveles de
expresin (0,01-0,1 %
TPS)
Altos niveles de expresin
(1-10%)
Altos niveles de
expresin (1-10%)
Tiempo de
evaluacin de
construcciones
Largo
6-24 meses
Mediano
3-12 meses
Corto
1-2 semanas
Efecto
posicionamiento
gnico
Si No No
Estabilidad de las
secuencias
Alta Alta Baja
Plantas en que se
puede expresar
Limitado a la
disponibilidad de
protocolos de
transformacin
Muy limitado a la
disponibilidad de protocolos
de transformacin
Limitado al rango
de hospedante
Silenciamiento
post-transcripcional
Si, PTGS No Si, VIGS
Modificaciones
post-
transduccionales
Si No Si
Bioseguridad Media Alta Baja
-
Expresin de antgenos para la
produccin de vacunas
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Las plantas
constituyen
un sistema
alternativo
para la
produccin
de vacunas a
subunidad
Vacunas a subunidades:
Seguras Poco inmunognicas Inyeccin
Ventajas de las vacunas en plantas:
Bajo costo de produccin.
Eliminacin de la cadena de fro durante el transporte.
Expresin de mltiples antgenos y adjuvantes en un
mismo sistema.
Posibilidad de inmunizacin oral por produccin de
antgenos en plantas comestibles Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Vacunas orales en plantas
Supervivencia del antgeno en el
tracto digestivo
Induccin de una respuesta inmune
Promocin de una proteccin
adecuada
Ausencia de efectos de tolerancia
Ausencia de inmunogenicidad del
vehculo vegetal
Aunque originariamente se pens en emplear el tejido vegetal sin
procesar, actualmente se considera utilizar el tejido liofilizado. Esto
permitira controlar mejor la dosis ingerida y evitar efectos de tolerancia
Menores requerimientos de asistencia
mdica para su administracin.
Menor riesgo de transmisin de
enfermedades asociadas a la indebida
reutilizacin de jeringas y agujas.
Induccin de respuesta inmune a
nivel sistmico y de mucosas.
VENTAJAS DESVENTAJAS
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Vacunas basadas en vectores virales
Partculas virales quimricas son potentes inmungenos (humoral y celular)
Los agregados de protenas virales son buenos adjuvantes
La expresin de epitopes como fusiones a las protenas de cpside permite una abundante produccin.
El proceso de purificacin de las partculas virales quimricas es un proceso simple y de alto rendimiento.
Los viriones purificados pueden ser establemente almacenados.
-
Vacunas en
fase clnica:
hepatitis B
Importancia epidemilogica de la hepatitis B
Es una viremia persistente con 300 millones
de portadores en el mundo.
La vacuna actual se produce en levaduras que expresan
el antgeno de superficie HBsAg. Es efectiva, pero
costosa, por lo que se distribuye poco en los pases
subdesarrollados.
Se ha reportado la expresin de HBsAg en plantas de
tabaco, papa, lechuga y se encuentra en estudio su
expresin en tomates y bananas.
Expresin de HBsAg
en tubrculos de papa.
El antgeno recombinante forma
estructuras vesiculares similares
a las observadas en el suero de
pacientes infectados con HBV.
Tomado de: Kong et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Expresin
de HBsAg
en plantas
transgnicas
de Solanum
tuberosum
TEV:secuencia enhancer traduccional de Tobacco etch virus.
W: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus.
vspaS: pptido seal de la protena VSP de soja.
vspaL: seal de transporte vacuolar de la proteina VSP de soja.
NOS 3: terminador de nopalina sintetasa. VSP 3: terminador de la protena VSP de soja. Pin2 3: terminador del inhibidor de proteinasa II de papa. SEKDEL : seal de retencin en RE.
Se compararon los niveles de expresin de HBsAg
del virus humano de hepatitis B en tubrculos de papa
utilizando distintas construcciones genticas.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
HB103
HB105
HB106
HB107
HB104
HB114
HB111
P35S TEV HBsAg NOS 3
P35S TEV HBsAg NOS 3
P35S TEV HBsAg NOS 3
P35S TEV HBsAg NOS 3
P35S TEV HBsAg VSP 3
P35S TEV HBsAg Pin2 3
P35S W HBsAg NOS 3
SEKDEL
VspaS
VspaL
HBsAg en tubrculos
0,33 g/g
1,25 g/g
0,80 g/g
2,40 g/g
6,50 g/g
16,00 g/g
0,33 g/g
P35S TEV HBsAg NOS 3
P35S TEV HBsAg NOS 3
P35S TEV HBsAg NOS 3
P35S TEV HBsAg NOS 3
P35S TEV HBsAg VSP 3
P35S TEV HBsAg Pin2 3
P35S W HBsAg NOS 3
SEKDEL
VspaS
VspaL
HBsAg en tubrculos
0,33 g/g
1,25 g/g
0,80 g/g
2,40 g/g
6,50 g/g
16,00 g/g
0,33 g/g
Tomado de: Richter et al., Nat. Biotech., 2000.
-
Se suministraron 2 dosis de 150 mg de rHBsAg cada una, en las semanas 0 y 1, y una dosis de 0,5 mg en la sexta semana
(dosis subinmunognica). CT: adyuvante, toxina del clera
Se seala el ttulo del antisuero obtenido. Lnea anaranjada: control de ratones no
inmunizados
Se suministraron tres dosis orales de 5 g de tubrculos de papa transgnica (HB114-16), conteniendo un promedio de 42 mg de HBsAg cada una, antes o despus de una
inmunizacin con 0,5 mg de antgeno purificado de levaduras (rHBsAg). Se sealan los ttulos de los antisueros obtenidos en cada caso. Lnea anaranjada: controles de ratones
alimentados con papas no transgnicas.
La inmunizacin oral con tubrculos HB114-16 es comparable a
la obtenida con la vacuna producida en levaduras
Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.
Imnunizacin oral con rHBsAg
purificado de levaduras
Imnunizacin oral con HBsAg
expresado en tubrculos de papa
Inmunizacin oral con HBsAg
expresado en tubrculos previamente
inmunizados con rHBsAg purificado
de levaduras
-
La respuesta
inmune
disminuye con
la eliminacin
del adyuvante o
la coccin de
los tubrculos
La eliminacin del
adjuvante (CT: toxina
colrica) en los
esquemas de
inmunizacin lleva a
una fuerte disminucin
de la respuesta inmune
La coccin previa de
los tubrculos
disminuye pero no
elimina la respuesta
inmune.
Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Inmunizacin
oral de
humanos
con lechuga
transgnica
que produce
HBsAg
Esquema de
inmunizacin:
Primera dosis:
200 g de hojas
Segunda dosis
(a las 8 semanas):
150 g de hojas
Concentracin del
HBsAg en tejido de
lechuga: 1 a 5 ng/g
tejido fresco
Para conferir proteccin en humanos deben
registrarse en sangre niveles de anticuerpos
anti-HBsAg de al menos 10 mUI/ml
Tomado de: Kapusta et al., FASEB J., 1999.
En 2 de los 3 voluntarios inmunizados con hojas de
lechuga transgnica se detect un ttulo de anticuerpos
anti-HBsAg protectivo luego de la segunda dosis
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Comovirus. Cowpea mosaic virus
-
Presentacin de epitopes de Human Rhinovirus (HRV) en Cowpea mosaic
virus
-
Potexvirus. Potato virus X
-
PVX. Produccin de vacunas contra la tuberculosis
-
Vacuna terapeutica: Produccin de anticuerpos scFV para el
tratamiento del linfoma non-Hodgkins-TMV vector
-
Pathogen or Disease Antigens References
Insertion vectors
Foot and mouth disease virus VP1 protein Wigdorovitz et la. 1999
Hepatitis C virus Hypervariable region I Nemchinov et al. 2000
Bovine herpes virus Glicoprotein D Perez Filgueira et al. 2003
Colorectal cancer Ga733-2 antigen Verch et al. 2004
Human immunodeficiency virus-1 Tat protein Karasev et al. 2005
Human immunodeficiency virus-1 p24 protein Perez Filgueira et al. 2004
Dengue virus Domain III of E protein Saejung et al. 2007
Mycobacterium bovis ESAT6-Ag85 antigens Dorokhov et al. 2007
Replacement vectors
Human papilloma virus E7 protein Massa et al. 2007
Yersinia pestis F1 and V proteins Mett et al. 2007
Bacillus anthracis PA and LF domains Chichester et al. 2007, 2009
Influenza Hemoagglutinin Shoji et al. 2008, 2009
Modular vectors
Yersinia pestis F1 and V proteins Santi et al. 2006
Smallpox virus pBS antigen domain Golovkin et al. 2007
Peptide display vectors
Human immunodeficiency virus-1 Glicoprotein 41 Durrani et al. 1998
Influenza virus HA epitope Sugiyama et al. 1995
Plasmodium falciparum Several epitopes Turpen et al. 1995
Pseudomonas aeruginosa F protein epitopes Staczek et al. 2000
Canine oral papilloma virus L2 protein Smith et al. 2006
Melanoma p15-Trp2 epitopes Mc Cormick et al. 2006a, 2006b
Mycobacterium bovis ESAT6-Ag85 antigens Dorokhov et al. 2007
Pseudomonas aeruginosa F protein epitopes Gilleland et al. 2000
TABLE I Antigens expressed from Tobacco mosaic virus based vectors
Agrobiotecnologa
Vectores basados
en virus vegetales
Vectores
basados en
TMV
-
TABLE I Antigens expressed from Tobacco mosaic virus based vectors
Agrobiotecnologa
Vectores basados
en virus vegetales
Vectores
basados en
PVX
Pathogen or Disease Antigens or Antibodies References
Insertion vectors
Human papilloma virus
E7 protein
Franconi et al. 2002
Avian Influenza A virus M2 protein ectodomain Nemchinov and Natilla 2007
Toxoplasma gondii SAG1 protein Clemente et al. 2005
Toxoplasma gondii Gra4 peptide Ferraro et al. 2008
Hepatitis B virus nucleocapsid protein Mechtcheriakova et al. 2006
Transmissible gastroenteritis virus derivate antibody Monger et al. 2006
Peptide display vectors
Human immunodeficiency virus-1
capside epitopes
Marusic et al. 2001
Plasmodium falciparum Several epitopes Turpen et al. 1995
Human papilloma virus E7 protein Franconi et al. 2002
Classical Swine Fever virus E2 glicoprotein peptides Marconi et al. 2006
Mycobacterium tuberculosis ESAT6 antigen Zelada et al. 2006
Human papilloma virus-16 E7 and L2 epitopes Cerovsk et al. 2008
Newcastle disease virus F protein epitope Natilla et al. 2006
Murine rotavirus VP6 protein O' Brien et al. 2000
-
Ejemplos de antgenos expresados en plantas transgnicas
-
Produccin de anticuerpos
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
La produccin
de anticuerpos
en plantas
transgnicas
permite
ensamblar
molculas de
Ig complejas
Los genes que codifican los cuatro polipptidos de las
inmunoglobulinas secretorias se acumulan en una misma
planta por cruzamientos sucesivos entre plantas
transgnicas individuales y sus descendientes recombinantes
PLANTIBODIES
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Ig dimrica
(dIg)
Componente
Secretorio (SC)
Cadena J
(J)
Ig monomrica
(Ig)
Cadena liviana
()
Cadena pesada
(a)X
X
X
Ig secretoria
(sIg)
Ig dimrica
(dIg)
Componente
Secretorio (SC)
Cadena J
(J)
Ig monomrica
(Ig)
Cadena liviana
()
Cadena pesada
(a)X
X
X
Ig secretoria
(sIg)
Ig dimrica
(dIg)
Componente
Secretorio (SC)
Cadena J
(J)
Ig monomrica
(Ig)
Cadena liviana
()
Cadena pesada
(a)X
X
X
Ig secretoria
(sIg)
-
Expresin
del
anticuerpo
monoclonal
anti-AgI/II en
plantas de
tabaco
La bacteria Streptococcus mutans es uno de los principales
agentes causales de la caries dental. El antgeno de superficie
AgI/II participara en la interaccin hidrofbica entre S. mutans
y un complejo de glicoprotenas de alto peso molecular
presente en la superficie dental.
Estrategia:
Expresar el anticuerpo monoclonal murino anti-AgI/II en
Nicotiana tabacum con el fin de obtener grandes cantidades
del mismo.
Adaptado de: Ma et al., Science, 1995.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
N. tabacum que expresa las
cadenas pesadas y livianas
del anticuerpo monoclonal
anti AgI/II
N. tabacum que expresa la
cadena J murina
N. tabacum que expresa el
componente secretorio de
conejo
Cruzamientos
Se obtuvieron plantas
de N. Tabacum que
expresan las cuatro
protenas juntas.
Estas cadenas se
ensamblan para dar
lugar a una
inmunoglobulina
secretoria funcional
que reconoce al
antgeno nativo AgI/II
-
El anticuerpo
anti Agl/II
actuara
alterando la
dinmica de
repoblacin
de la superficie
dental
Luego del tratamiento con un agente antisptico, la presencia
del anticuerpo anti AgI/II evitara la recolonizacin de los
nichos en la superficie dental por Streptococcus mutans.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Adaptado de: www.planetbiotechnology.com
CaroRxTM
Planet Biotechnology
-
La inmunizacin pasiva local de humanos con anti-AgI/II
producido en plantas otorga proteccin contra S. mutants
Recolonizacin de Streptococcus mutants en la cavidad oral de voluntarios humanos
previamente tratados con gluconato de clorohexidina (CHX) para eliminar la flora oral
Protocolo de inmunizacin: Aplicacin directa en los dientes del anticuerpo secretorio producido en plantas de
tabaco (SIgA/G, lnea roja) durante 3 semanas con 2 tratamientos por semana. Se
realizaron controles con solucin salina (lnea verde claro), con un anticuerpo bovino no
relacionado producido en plantas (lnea azul) y con el anticuerpos murino (Guys 13, lnea verde oscuro). n: nmero de voluntarios
Tomado de: Ma. et al., Nat. Med. 1998 y www.planrtbiotechnology.com
-
RinoRxTM
DoroRxTM
= Fusin ICAM-q a IgA
Tratamiento de efectos secundarios de la quimioterapia con dorocina
IgA monoclonal contra dorocina
Tratamiento preventivo de la gripe causada por Rhinovirus
-
Expresin de protenas heterooligomricas por coexpresin de
vectores no competitivos
Purificacin de mAb por A-Sefarosa Expresin de HC y LC del A5 mAB
TMV-LC
+
PVX-HC
TMV-HC
+
PVX-LC
PAGE
No desnaturalizante
SDS-PAGE
Westen blot
Expresin de anticuerpo moconoclonal A5 por coexpresin TMV y PVX
-
Produccin de protenas de inters
farmacolgico y medicinal
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Produccin de Galactosidasa A humana- Enfermedad de Fabry
TMV vector-Geneware system
Enfermedad de Fabry = deficiencia de la
enzima alfa-galactosidasa A
1: 60000 hombres-ligada a cromosoma
X
-
Produccin de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system
Rpida optimizacin de la expresin del
gen que codifica la GalA
-
Control de calidad del la enzima GalA
producida
Pureza por SDS-PAGE Determinacion del amino-terminal y la secuencia completa por Madi-tof
Esterilidad Endotoxina ADN residual Impurezas residuales de la planta Concentracin proteica Actividad especfica
Produccin de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system
-
Medicin de la eficacia de la
enzima GalA producida
Medicin de la acumulacin de GB3 en ratones wt y en
ratones knockout GalA
Clearance plasmtico Organo blanco
Produccin de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system
-
Construcciones usadas para transformar Nicotiana tabacum:
Cuantificacin por ELISA de los niveles
de hEGF expresado en plantas transgnicas
Versiones
citoplasmticas
p35EGF P 35S CaMV hEGF tNOS
P 35S (L) CaMV hEGF tNOS W p35(L)EGF
Versin
apoplstica ss hEGF tNOS W P 35S (L) CaMV p35(L)APEGF
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Produccin
de factor de
crecimiento
epidrmico
humano en
plantas
de tabaco
Tomado de: Wirth et al. Mol.Breed., 2004.
0,11% protena
total soluble
(33 g/g de hoja)
0,11% protena
total soluble
(33 g/g de hoja)
1
10
102
103
104
-
El hEGF producido en tabaco es biolgicamente activo
Ensayo de expansin de clulas del cumulus de ovocitos bovinos
Ensayo de unin a radioreceptor
Control
Planta no tranformada
hEGF st10ng
Extracto 35S (L) AP EGF
(10ng por ELISA)
Extracto planta infectada
PVX control
Extracto planta infectada con
PVXAPEGF Tomado de: Wirth et al. Mol.Breed., 2004.
-
Protenas
terapeuticas
producidas en
plantas en el
mercado o fase
clnica
-
Otras aplicaciones:
produccin de enzimas de inters
industrial, suplementos alimenticios y
biopolmeros
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
La avidina de
pollo fue la
primera
protena
recombinante
comercializada
obtenida
en plantas
Construccin usada para transformar plantas de maz:
Pr Ubiquitina Intron Ubi a-amilasa ss Pin II 3 avidina
El uso de codones de la secuencia seal de la a-amilasa de cebada y de la
secuencia codificante de la avidina de pollo se optimiz para su expresin en
plantas de maz.
El nivel de expresin de la avidina extrada de semillas de maz fue 2,3% de la protena total
extrada (230 mg/Kg de semillas)
Tomado de: Hood et al, Mol. Breed. 1997.
Grano de maz transgnico
incubado con un anticuerpo anti-
avidina. La interaccin se
evidencia por una reaccin
colorimtrica.
Notar la alta concentracin de
avidina en el embrin (E).
En: endosperma
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Caractersticas
de la avidina
producida
en maz
Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la
estabilidad de la avidina expresada en semillas de maz
Caractersticas fsicas de la avidina
recombinante producida en maz
Tomado de : Hood et al, Mol. Breed. 1997.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
-
Produccin
de brazzena
en plantas
de maz
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Las protenas
edulcorantes tienen gran
demanda para productos
dietticos y para enfermos
de diabetes.
La brazzeina es una
protena producida por la
planta africana
Pentadiplandra brazzeana
que posee un poder
edulcorante 1.200 veces
ms alto que el azcar.
Su produccin en la
planta nativa es
imprctica debido a los
altos volmenes de
produccin requeridos.
Se transformaron plantas
de maz con dos
variantes de la secuencia
de brazzena y se la
expres en las semillas a
nivel del embrin y del
endosperma.
Se obtuvieron niveles de
acumulacin en semilla de
hasta 4% de la PST.
Constitutive w/ intron: promotor de tipo poliubiquitina
Embryo-preferred: promotor de globulina 1 de maz
Endosperm-preferred: promotor de a-zena de 22kD
BAASS: secuencia seal de la a-amilasa de cebada
Pin II: Terminador del inhibidor de proteasas II de Solanum tuberosum
TEV y MDMV: enhancers traduccionales de Tobacco etch virus y Maize
dwarf mosaic virus
Tomado de: Lamphear et al.,
Plant Biotechnology Journal 2005.
-
Produccin
de brazzena
en plantas
de maz
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Niveles de
expresin de
brazzana en
semillas T1
para los
mejores
transformantes
obtenidos con
las
construcciones
1-8 detalladas
en la
transparencia
anterior
Contenido de
brazzena en
fracciones
obtenidas por
molienda seca
de las semillas
de la lnea 5
(promotor para
embrin).
Bra
zze
na
(
g
Bra
zze
na
(%
PS
T)
Construcci n gen tica
Ma z
entero
Grano
molido Germen
Bra
zze
na
(
g/g
de
pe
so
se
co
) B
razze
na
(%
PS
T)
Construcci n gen tica
Grano entero endosperma embrin pericarpio
Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005.
*
* *
*
*
-
Produccin
de brazzena
en plantas
de maz
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Extraccin a pH 4
Tratamiento de calor
Intercambio catinico
Filtracin en geles
Desalado
Freeze Drying
Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005.
Esquema de los pasos de
purificacin seguidos para el
aislamiento de brazzena expresada
en maz (maz transformado con la
construccin 5).
Muestras tomadas en los distintos pasos de
purificacin analizadas por PAGE-SDS. Las
protenas fueron visualizadas por tincin con
Comassie Blue. Se embraron 5 g en todos
los casos.
1: extracto crudo; 2: extracto calentado y
filtrado; 3: fraccin pico de la cromatografa
de intercambio catinico; 4: fraccin pico de
la cromatografa de tamao de exclusin.
-
Sntesis de plsticos biodegradables en plantas
Envases de shamp hechos de un copolmero de polihidroxibutirato
y polihidroxivalerato a 0, 3 y 9 meses de permanecer en compost.
-
Produccin
de PHB en
plantas por
transferencia
de la va
metablica
bacteriana
El polihidroxibutirato o PHB constituye una fuente . renovable de material termoplstico biodegradable.
En Alcaligenes eutrophus la sntesis a partir de acetil CoA . ocurre en tres pasos catalizados por distintas enzimas.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Acetil-CoA
PHB
H3C S CoA
O
C
n
3-cetotiolasa (phbA)
Acetoacetil-CoA-reductasa
(phbB)
PHB sintasa (phbC)
CH2
O
CH3C
S CoA
O
C
CH2
OH
CH3C
S CoA
O
C
C
O
O
CH2
CH3
CH
O
O
CH2
C
CH3
CH
Ruta bioqumica de la sntesis
de PHB en bacteriasAcetil-CoA
PHB
H3C S CoA
O
CH3C S CoA
O
CS CoA
O
C
n
3-cetotiolasa (phbA)
Acetoacetil-CoA-reductasa
(phbB)
PHB sintasa (phbC)
CH2
O
CH3C
S CoA
O
C
CH2
O
CH3C
O
CH3C
S CoA
O
CS CoA
O
C
CH2
OH
CH3C
S CoA
O
C
CH2
OH
CH3C
S CoA
O
CS CoA
O
C
C
O
O
CH2
CH3
CH
O
O
CH2
C
CH3
CHC
O
O
CH2
CH3
CH
O
O
CH2
C
CH3
CH
Ruta bioqumica de la sntesis
de PHB en bacterias
-
Las plantas
de A. thaliana
transformadas
con los genes
phbA, phbB y
phbC
acumulan
grnulos de
PHB en los
cloroplastos
La va completa de sntesis de PHB en Arabidopsis thaliana se obtuvo por transformacin con los genes phbA, phbB y phbC de
Ralstonia eutropha.
Las tres enzimas se fusionaron a pptidos de trnsito a cloroplastos para lograr su acumulacin en estas organelas. Esto se
hizo porque los niveles de acetil-CoA son mucho ms altos en los
plstidos que en el citoplasma.
Tomado de: Bohmert et al, Planta, 2000.
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Microscopia electrnica de una
clula del mesfilo de una hoja
madura de una lnea de A.
thaliana que expresa las enzimas
responsables de la sntesis de
PHB. Se muestra un cloroplasto
conteniendo grnulos de PHB.
phbABC
p35S TPSS NOS 3 phbB p35S TPSS NOS 3 phbA p35S TPSS NOS 3 phbC
-
Enzimas industriales
Avidina: kit de diagnstico
-glucuronidasa: kit de diagnstico
Trypsin: wound care
Cellulasa: produccin de etanol
Xylanasa: procesamiento de biomasa
Fitasa: procesamiento de alimentos
(1-3)(1-4)-glucanasa: Brewing
Lignin peroxidasa: Paper manufacture
Biopolmeros
protenas de la seda de araa
polipptidos tipo elastina
colgeno
-
Companias que utilizan tecnologas para la produccin de
protenas en plantas
Tomado de: Biotecnologa y mejoramiento vegetal II, Cap. 16 2010
-
Tomado de: Biotecnologa y mejoramiento vegetal II, Cap. 16 2010
-
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Aspectos de
bioseguridad Bioseguridad:
En el caso de produccin de protenas teraputicas o con
actividad biolgica, se deben establecer condiciones de
bioseguridad an ms estrictas que las adoptadas para
otros OGMs, ya que stas no deben ingresar bajo ningn
punto de vista a la cadena alimentaria humana.
Recomendaciones:
- Utilizar cultivos que no participen de las cadenas
alimentarias humana o animal.
- Utilizar cultivos de estructura floral cerrada
(autopolinizacin).
- Tener en cuenta el aislamiento temporal
(poca de polinizacin diferente en cultivos
relacionados) y espacial (barreras de cultivos
no transgnicos).
- Si la expresin es en hojas, cosechar las
plantas antes de la floracin.
-
- dispersin de los transgenes por polen, semilla o
frutos
riesgo de contaminacin de la cadena
alimentaria;
- impacto en especies no blanco: pjaros, mariposas, insectos etc.
Reproducibilidad
Uso inapropiado de plant by-products
Regulatory issues
-
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Referencias Xu J, Dolan MC, Medrano G, Cramer CL, Weathers PJ. Green factory: plants as bioproduction platforms for recombinant proteins. Biotechnol Adv. 30(5):1171-84. 2012.
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Stoger, E., Ma, Julian K-C, Fischer, R. and Christou, P. Sowing the seeds of success:
pharmaceutical proteins from plants. Current Opinion in Biotechnology, 16:167-173, 2005.
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Hood, E., Woodard, S., and Horn, M. Monoclonal antibody manufacturing in transgenic plants-
myths and realities. Current Opinion in Biotechnology, 13:630-635, 2002.
Giddings, G., Allison, G., Brooks, D. and Carter, A. Transgenic plants as factories for
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