Citoquímica eritrocitaria Siderocitos y sideroblastos Derivados de la hemoglobina

Citoquímica eritrocitaria Siderocitos y sideroblastos Derivados de la hemoglobina

Los siderocitos son hematíes que contienen gránulos de hierro no hemo; fueron descritos originalmente por Gruneberg1 en pequeñas cantidades en la sangre de embriones normales de ratas, ratones y humanos, y en grandes cantidades en ratones con anemia congénita. Los gránulos están formados por un complejo insoluble en agua de ion férrico, lípidos, proteínas e hidratos de carbono. Este material siderotico (o hemosiderina) reacciona con el ferrocianuro de potasio para formar un compuesto azul: el ferriferrocianuro.Esta reacción es la base de una reacción positiva al azul de Prusia (Perls). El material se tine también con los colorantes de Romanowsky, apareciendo entonces como granulos basofilos, que reciben el nombre de “cuerpos de Pappenheimer” (fig. 13.1)2. En contraposicion, la ferritina, que es un compuesto soluble en agua del hierro no hemo con la proteina apoferritina, no es detectable con la reacción de Perls. La ferritina se encuentra en todas las células del organismo, mientras que, en los sujetos sanos, la hemosiderina se encuentra principalmente en los macrófagos de la medula ósea, en el hígado (células de Kupffer) y en el bazo; cuando el organismo está sobrecargado de hierro, como en la hemocromatosis o en la hemosiderosis transfusional, dicho hierro en exceso se encuentra tambien en otros tejidos.El hierro viaja en plasma unido a una globulina β, la transferrina, y pasa selectivamente a la medula osea, donde el complejo hierro-transferrina se une a los receptores de la transferrina en la superficie del eritroblasto; el hierro se libera de la transferrina y penetra en la célula. La mayor parte del hierro se convierte rápidamente en hemo: parte en el citosol y parte en las mitocondrias. El residuo no hemo se encuentra en forma de ferritina. La degradación de la ferritina la transforma parcialmente en hemosiderina, que se visualiza bajo el microscopio óptico en forma de partículas refringentes amarillo oro en las células fagocitarias; al tenirse con la reacción de Perls, la hemosiderina se tiñe de color azul.En los sujetos sanos, los gránulos sideroticos se observan, en las preparaciones tenidas mediante la reacción de Perls, en el citoplasma de muchos de los eritroblastos de la medula ósea humana y en los reticulocitos medulares3. Sin embargo, no se observan habitualmente en los hematíes de la sangre periférica humana. Tras la esplenectomía, se pueden encontrar en todo momento siderocitos en sangre periférica, a menudo en grandes cantidades. Probablemente la razón se deba a que los reticulocitos, tras su salida de la medula, son secuestrados normalmente durante un tiempo en el bazo y alli completan la sintesis del hemo, utilizando, para este fin, el hierro almacenado en el interior de los gránulos sideroticos en su citoplasma. Tras la esplenectomía, esta fase de la maduración reticulocitaria tiene que desarrollarse en la corriente sanguínea, pudiendo observarse un pequeño porcentaje de siderocitos en la sangre periférica de personas por lo demás sanas. Probablemente, el bazo sea capaz de eliminar grandes gránulos sideroticos de los hematíes (como los que pueden encontrarse en la enfermedad) por un proceso de extraccion4, y, en su ausencia, tales gránulos persisten en los hematies durante toda su vida.Método de tinción de los gránulos sideróticosSecar al aire las extensiones de sangre periferica o de medula osea y fijarlas con metanol durante 10-20 min. Cuando estén secas, colocar los portaobjetos en una solucion de 10 g/l de ferrocianuro potasico en 0,1 mol/l de HCl preparado mediante la mezcla de volumenes iguales de 47 mmol/l (20 g/l) de ferrocianuro potasico y 0,2 mol/l de HCl inmediatamente antes de su utilizacion.Dejar los portaobjetos en la solucion durante cerca de 10 min a unos 20 °C. Lavar bien durante 20 min con agua del grifo, aclarar minuciosamente en agua destilada y contratenir con 1 g/l de rojo neutro acuoso o de eosina durante 10-15 s. Hay que tener cuidado para evitar la contaminación con el hierro que pueda haber en los portaobjetos o en los platillos de tincion. Preparar el material de cristal sumergiéndolo en HCl, 3 mol/l, antes de lavarlo (v. pag. 592).Para controlar la calidad, se debe tenir siempre una extensión de medula osea positiva junto con las extensiones de prueba.Se pueden tenir con azul de Prusia las extensiones que fueron previamente tenidas con los colorantes de Romanowsky, incluso despues de varios anos de almacenamiento.Es aconsejable dejar las extensiones en metanol durante toda la noche para eliminar la mayor parte de los colorantes de Romanowsky. Hay que examinar la extensión antes de realizar la reaccion de Perls para comprobar que no quede nada de colorante azul residual que pudiera oscurecer la tincion con el azul de Prusia. Sundberg y Bromann describieron una tecnica por medio de la cual las extensiones se tenian primero con un colorante de Romanowsky (tincion

de Wright) y despues se sobretenian con el metodo del ferrocianuro acido5. De esta forma se pueden obtener hermosas fotografias, pero los pequenos granulos que contienen el hierro tenido de azul tienden a enmascararse como eritroblastos jovenes por la basofilia general del citoplasma celular. Hayhoe y Quaglino describieron un metodo que combinaba el acido peryodico de Schiff (PAS) y la tincion de hierro6. Dicho metodo puede ser de utilidad para investigar la eritropoyesis anomala en la que los eritroblastos dan una reaccion positiva al PAS.Se ha descrito un metodo rapido para demostrar los granulos sideroticos mediante la tincion con azul bromoclorofeno al 1% durante 1 min7. Los granulos con contenido ferrico se tinen de purpura oscuro.Significado de los siderocitosLos siderocitos contienen uno o dos granulos (raramente muchos) con contenido ferrico, pequenos y desigualmente distribuidos, que se tinen con el color azul de Prusia. Hay normalmente unos cuantos granulos sideroticos muy pequenos y repartidos al azar en cerca del 40% de los eritroblastos tardios3. Se tinen debilmente y pueden ser difíciles de ver con el microscopio optico. El porcentaje de eritroblastos reconocibles como sideroblastos aumenta en las anemias hemoliticas y en las megaloblasticas asi como en las hemocromatosis y en las hemosiderosis, en proporcion al grado de saturacion de la transferrina (es decir, a la cantidad de hierro disponible). Se produce un incremento desproporcionado en el porcentaje de eritroblastos que son sideroblastos cuando la sintesis de hemoglobina esta alterada, en cuyo caso los granulos sideroticos son mas numerosos y mayores de lo normal (fig. 13.2). Cuando hay un defecto en la síntesis del hemo, los granulos se depositan en las mitocondrias y suelen aparecer dispuestos en circulo alrededor del nucleo(fig. 13.3) formando los caracteristicos “sideroblastos en anillo” de las anemias sideroblasticas. En cambio, la distribución de los granulos dentro de las celulas tiende a ser normal en aquellos trastornos en los que solo hay afectacion de la síntesis de la globina (p. ej., en la talasemia) o cuando hay una sobrecarga de hierro.Hay varios tipos de anemia sideroblastica. Entre ellas se encuentran el tipo congenito (hereditario), el deficit (raro) de piridoxina (vitamina B6), la anemia sideroblastica causada por antagonistas de la vitamina B6 (p. ej., los farmacos utilizados en la terapia antituberculosa) y la anemia sideroblastica secundaria al alcoholismo y a la intoxicacion por plomo.La presencia de sideroblastos en anillo es una característica definida de la anemia refractaria con sideroblastos en anillo8 y de la citopenia refractaria con displasia de varias lineas y con sideroblastos en anillo, dos de las categorias de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del sindrome mielodisplasico (SMD). Pueden tambien presentarse en otras categorías de SMD. Los sideroblastos en anillo no son infrecuentes en otras neoplasias hematologicas, como son la mielofibrosis idiopatica y la leucemia mieloide aguda (LMA), sobre todo la eritroleucemia y las categorias de la OMS de la LMA relacionada con el tratamiento y de la LMA con displasia multilinea.En las neoplasias hematologicas que tienen como característica una anemia sideroblastica, los eritroblastos pueden estar cargados con granulos sideroticos en todas las etapas de maduracion, mientras que en las anemias sideroblasticas secundarias y en los tipos hereditarios, las células mas maduras parecen ser las mas afectadas.Ademas de los granulos sideroticos dentro de los eritroblastos, en condiciones normales se puede observar hemosiderina en las extensiones medulares en forma de agregados de granulos pequenos, libres, o bien en el interior de los macrófagos en los grumos medulares9. La cantidad de hemosiderina aumenta notablemente en aquellos pacientes con depósitos elevados de hierro, y no se observan en la anemiaferropenica (fig. 13.4). En la práctica, la tincion para poner de manifiesto los depositos de hierro en los grumos medulares y los granulos sideroticos en los eritroblastos es un procedimiento diagnostico sencillo y valioso que deberia realizarse en las extensiones medulares de forma rutinaria.En las infecciones cronicas, y en otros ejemplos de “anemia de las enfermedades crónicas”, los depositos de hierro pueden estar aumentados, con mucho material siderotico en los macrofagos pero poco o ninguno visible en los eritroblastos. El exceso marcado de hierro en los macrófagos es tambien una caracteristica de las talasemias intermedia y mayor y de algunas anemias diseritropoyeticas.En cambio, la ausencia de hierro es diagnostica del déficit de hierro o de la deplecion de hierro (este último término indica el estado en el cual el hierro de depósito está ausente pero la anemia no se ha manifestado todavía).

Un estudio ha demostrado que para establecer la ausencia de hierro tingible, se deben examinar al menos siete grumos y, si es necesario, utilizar más de una extensión con este objetivo10. No hay un método citoquimico para demostrar la ferritina; los métodos de análisis se describen en el capitulo 7.Cuerpos de Heinz en los hematíesHeinz en 1890 fue el primero en describir en detalle las inclusiones en los hematíes que se desarrollaban como resultado de la acción de la acetilfenilhidrazina en la sangre11. Actualmente se sabe que los cuerpos de Heinz pueden producirse por la acción sobre los hematíes de un amplio rango de compuestos aromaticos nitrogenados y aminados, así como por agentes oxidantes inorgánicos como el clorato potásico. También se producen cuando alguna de las cadenas de globina de la hemoglobina es inestable. En el ser humano, el hallazgo de los cuerpos de Heinz es un signo de intoxicación química, intoxicación farmacológica, déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) o de la presencia de una hemoglobina inestable (p. ej., la Hb Koln).Cuando el origen es quimico o farmacologico, es probable que los cuerpos de Heinz sean visibles en los hematies únicamente si el paciente ha sido esplenectomizado previamente o si se han tomado dosis masivas del producto químico o del farmaco. Cuando se deben a una hemoglobina inestable, son raramente visibles en los hematies recien extraidos, excepto tras una esplenectomia. No obstante, pueden desarrollarse in vitro en la sangre previamente a una esplenectomia si se incuba durante 24-48 h12. Los cuerpos de Heinz son un signo tardio del dano oxidativo y representan un producto final de la degradacion de la hemoglobina.Entre las revisiones realizadas sobre los cuerpos de Heinz se encuentran las de Jacob13 y White14.Demostración de los cuerpos de HeinzPreparaciones sin teñirLos cuerpos de Heinz pueden verse como objetos refringentes en extensiones secas y sin tenir si la iluminación se reduce disminuyendo la intensidad del condensador del microscopio; también pueden verse por iluminación con fondo oscuro o con microscopia de contraste de fases. Sin embargo, es preferible buscarlos en las preparaciones tenidas (v. mas adelante). Su tamaño varía de 1 a 3 μm. En una única célula puede haber uno o mas de uno. Habitualmente están próximos a la membrana celular y pueden causar protrusión de la misma; en las preparaciones húmedas, pueden desplazarse dentro de las células con un movimiento browniano lento.El producto de degradación de una hemoglobina inestable (p. ej., la Hb Koln) presenta una fluorescencia verde al ser excitada por la luz azul a 370 nm en un microscopio defluorescencia15.Preparaciones teñidasDisolver aproximadamente 0,5 g de violeta de metilo en 100 ml de NaCl, 9 g/l y filtrar. Anadir 1 volumen de sangre (en cualquier anticoagulante) a 4 volumenes de la solución con violeta de metilo y dejar reposar la solución durante cerca de 10 min a temperatura ambiente. A continuación, preparar las extensiones y dejarlas secar u observar la suspensión de las celulas entre el portaobjetos y el cubreobjetos.Los cuerpos de Heinz se tiñen de un purpura intenso(fig. 13.5).Los cuerpos de Heinz tambien se tinen con otros colorantes basicos. El verde brillante los tine bien y el colorante no es captado por el resto de los componentes del eritrocito16.El azul Rhodanile (solucion de 5 g/l en 10 g/l de NaCl) los tine rapidamente17 (es decir, en 2 min); en ese momento los reticulocitos solo estan tenidos debilmente.En comparación con el violeta de metilo, los cuerpos de Heinz se tinen menos intensamente con el azul de cresil brillante o con el nuevo azul de metileno. Sin embargo, pueden ser vistos inmediatamente como cuerpos azul palido en una preparacion de reticulocitos bien tenida, si no se ha contratenido la preparacion.Si se necesitan preparaciones permanentes, fijar las extensiones tenidas vitalmente mediante la exposicion al vapor de formalina durante 5-10 min. A continuacion, contratenir las extensiones fijadas con 1 g/l de eosina o de rojo neutro, tras lavarlas minuciosamente en agua. Si se fijan las extensiones en metanol, los cuerpos de Heinz se decoloran.En la talasemia β mayor, la tinción con violeta de metilo de la medula ósea pondrá de manifiesto las cadenas α precipitadas. Aparecen como grandes inclusiones irregulares en los normoblastos tardios, generalmente únicas y en estrecho contacto con el núcleo. Si se esplenectomiza a estos pacientes, se pueden encontrar las inclusiones en los reticulocitos y en los hematíes maduros.

Demostración de las inclusiones H de la hemoglobinaLos pacientes con talasemia α, que forman hemoglobina H (β4), presentan hematies en los que se desarrollan inclusiones esfericas multiples azul-verdosas al exponerlos al azul de cresil brillante o al nuevo azul de metileno como en las preparaciones de reticulocitos18 (fig. 13.6). Esta característica corresponde, sobre todo, a la enfermedad de la hemoglobina H, pero se pueden observar pequenas cantidades de celulas similares en el rasgo talasemico α, sobre todo, aunque no exclusivamente, en el rasgo talasemico α0.MétodoMezclar conjuntamente en un tubo pequeño, como para la tinción de reticulocitos (v. pag. 34), volúmenes iguales de sangre fresca o de sangre con acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) y 10 g/l de azul de cresil brillante o 20 g/l de nuevo azul de metileno en tampon fosfato isoosmotico a pH 7,4. Mantener la preparación a 37 °C durante 1-3 h haciendo extensiones a intervalos. Dejar que se sequen las extensiones y examinarlas sin contratenirlas. La hemoglobina H precipita en forma de cuerpos multiples, casi esféricos, de diverso tamaño, que se tinen de un color azul-verdoso pálido (fig. 13.7) y que pueden diferenciarse claramente del material reticulofilamentoso, que se tiñe de oscuro, de los reticulocitos (fig. 13.8).El número de células que contienen inclusión varía de acuerdo con el tipo de talasemia α. En el rasgo talasemico α0, solo el 0,01-1,0% de los hematies contiene inclusiones, pero este hallazgo proporciona una clave importante para el diagnostico. Como regla, en la enfermedad de la hemoglobina H (p. ej., la que resulta de la heterocigosidad compuesta talasemia α0/talasemia α+, – –/–αα), al menos el10% de las células desarrollan inclusiones y, en algunos casos, el porcentaje es considerablemente mayor.Cuando solo hay unas cuantas células afectadas, su detección será más fácil en una preparación enriquecida19.Llenar 2-3 tubos capilares con la sangre y centrifugarlos durante 5 min en una centrifuga de microhematocrito.Después, marcar los tubos justo por debajo de la capa de leucocitos y tambien 1 cm más abajo; romperlos por las marcas indicadas y transferir cuidadosamente los segmentos rotos a un tubo pequeño. Anadir 1 gota de colorante e incubar a 37 °C durante 3 h antes de hacer una extension.Hay que recordar que cuando se necesita un diagnostico preciso del tipo de rasgo talasemico α (p. ej., para el diagnostico prenatal), no está indicada la preparacion de la hemoglobina H. En ese caso lo indicado es el análisis del ADN.Carboxihemoglobina y metahemoglobinaLas células que contienen carboxihemoglobina y metahemoglobina pueden ponerse de manifiesto por medios citoquimicos.Estos métodos fueron descritos por Kleihauer20.Tienen poco valor práctico en la practica actual.Hemoglobina fetalEl método citoquímico de elución acida, introducido por Kleihauer y cols.21, es un procedimiento sensible para identificar las células individuales que contienen hemoglobina F incluso cuando hay pocas. Su detección en la circulación materna ha proporcionado información valiosa en la patogénesis de la enfermedad hemolítica del recién nacido.La identificación de las células que contienen hemoglobinaF se basa en el hecho de que son resistentes a la elución acida en mayor grado que las celulas normales; asi, en la técnica descrita a continuación, aparecen como células aisladas, tenidas de oscuro en un trasfondo de células fantasma pálidamente tenidas. Las celulas ocasionales que se tiñen en un grado intermedio son menos faciles de evaluar; algunas de ellas pueden ser reticulocitos porque resisten tambien a la elucion acida en alguna medida. Recomendamos el método siguiente22, en el que la elucion se realiza a pH 1,5.ReactivosFijador. Etanol al 80%.Solución de elución. Solución A: 7,5 g/l de hematoxilina en etanol al 90%. Solución B: FeCl3, 24 g; 20 ml de HCL, 2,5 mol/l; agua bidestilada hasta 1 l.Para su utilizacion, mezclar correctamente 5 vol. de A y 1 vol. de B. El pH es aproximadamente 1,5. La solución puede utilizarse durante alrededor de 4 semanas; si se forma un precipitado, hay que filtrar la solucion. Contratinción. 1 g/l de eritrosina acuosa o 2,5 g/l de eosina acuosa.MétodoPreparar extensiones nuevas secadas al aire. Inmediatamente despues de su secado, fijar las extensiones durante 5 min en etanol al 80% en una cubeta de Coplin. A continuación, aclarar

las extensiones rápidamente en agua y dejarlas verticalmente sobre un papel secante durante unos 10 min para que se sequen. Después, disponer las extensiones durante 20 s en una cubeta de Coplin con la solución de elución. Posteriormente, lavarlas minuciosamente con agua y, por último, colocarlas para contratenirlas durante 2 min. Aclarar en agua del grifo y dejarlas secar al aire. Las celulas fetales se tinen de rojo y las celulas fantasma del adulto de rosa palido (fig. 13.9). Como controles positivo y negativo deben tenirse al lado de las extensiones problema extensiones preparadas a partir de: a) una mezcla de sangre del cordón umbilical y de sangre de adulto, y b) sangre de adulto normal.Se han propuesto diversas modificaciones al método de Kleihauer. En una de ellas se incorpora nuevo azul de metileno a la solución tampón, el tiempo de reaccion se alarga y el tampon se utiliza para lavar las extensiones23. La ventaja de esta tecnica es que los reticulocitos se tinen de azul, mientras que las celulas que contienen hemoglobina F lo hacen de rosa.Se ha desarrollado un metodo de tincion immunofluorescente basado en la utilizacion de un anticuerpo específico contra la hemoglobina F, que no reacciona con la hemoglobinaA24. Utilizando un procedimiento de doble marcaje, con anticuerpo marcado con rhodamina contra la globina y un anticuerpo marcado con fluoresceina contra la globina , es posible detectar la presencia de hemoglobinaF y de hemoglobina A en la misma celula25.Hemoglobina S y otras variantes de la hemoglobinaSe ha utilizado la inmunodifusion con anticuerpos específicos para la identificacion de la hemoglobina S, la hemoglobina A2 y la hemoglobina F en los hematies26,27. Un método alternativo consiste en la deteccion de las células tras etiquetar estas con isotiocianato de fluoresceina (FITC)26. Mediante un método de doble marcaje, similar al descrito anteriormente, es posible identificar la hemoglobina S así como cualquier otra hemoglobina en las celulas individuales.