centro de investigación científica de yucatán, a.c. · a mi familia por todo su amor y apoyo...
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Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias en Energía Renovable
“EVALUACIÓN DE CEPAS DE HONGOS LIGNINOLÍTICOS
NATIVOS DE YUCATÁN EN LA DECOLORACIÓN Y REMOCIÓN DE
FENOLES EN VINAZAS Y EFLUENTE DE SU DIGESTIÓN
ANAERÓBICA”
Tesis que Presenta
IBQ. RUBI DEL ROSARIO CHABLE VILLACIS
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS EN ENERGÍA RENOVABLE
Mérida, Yucatán, México
Noviembre 2015
DEDICATORIA
A mis padres: Ángel Chablé Yerves y María Josefina Villacis Dominguez que siempre me
han brindado su amor, comprensión y su apoyo en todo momento.
A mis sobrinos: Ángel, Leonardo y Pablo, las personitas más maravillosas que he conocido
en mi vida.
A mi hermana Yazmín y a Juan, por demostrarme diariamente lo grandiosa que es la vida
a pesar de los grandes males.
A Silvano, mi compañero de odiseas, quien me ha estado junto a mí en todo momento
incondicionalmente.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Raúl Tapia Tussell por su asesoría, enseñanzas que sirvieron de gran aporte en el
desarrollo del proyecto, por su comprensión y paciencia durante mi estancia.
A la Dra. Daisy Pérez Brito por su co-asesoría, por sus consejos y sugerencias en la
escritura de la tesis, por su paciencia y comprensión.
A la Dra. Sara Solís Pereira por sus enseñanzas y sugerencias durante el desarrollo del
proyecto, así como las facilidades prestadas del laboratorio de Fisiología y Bioquímica
Microbiana del Instituto Tecnológico de Mérida.
A la Dra. Liliana Alzate Gaviria por sus valiosos comentarios y facilidades otorgadas para
la elaboración de la tesis.
Al Dr. Luis Felipe Barahona Pérez y a la Dra. Patricia Lappe Oliveras, por los comentarios
y sugerencias aportados a la tesis.
Al Centro de Investigación Científica de Yucatán, en especial a la Unidad de Energía
Renovable por darme la oportunidad de estudiar la maestría.
A CONACYT por la beca otorgada 365923.
Al MC. Andrés Quijano Ramayo por su apoyo incondicional, sus enseñanzas e impulsarme
en mi desarrollo académico.
A la Biol. Tania Islas Solís y I.B.Q. Luis Felipe Pool Yam por su valiosa instrucción en el
desarrollo de técnicas de laboratorio.
A la MC. Isaura España Gamboa y al MC. Jorge Domínguez Maldonado por facilitarme la
vinaza y efluente, así como información acerca de ellas.
A la L.A.E. Bertha Arely Ramírez González, por su apoyo en el formato electrónico de tesis.
Al MC. Edgar Gamaliel Itza Kuk, MC. Laura Espinosa Barrera, MC. Sara Hernandez
Castellano, MC. Rosa Us Camas y MC. Teresita de Jesus Valencia Yah por sus consejos
muy acertados acerca de lo que implica el posgrado, por compartir conmigo momentos
gratos y por dejar una huella muy importante en mi vida.
Al MC. Edgar Olguin Maciel, Biol. Emy Huchin Poot, QFB. José Silvano Chalé Canul por
compartir conmigo los momentos más dificiles y más emocionantes de ésta experiencia, y
por el intercambio de puntos de vista que nos hicieron crecer juntos.
A mis compañeros de generación MC. Marco Aurelio Ramirez Guardado, IA. Patricia
Aguilar, IQ. Giovani Escobar por su apoyo y opiniones durante los seminarios.
Al MC. Anuar Magaña Álvarez, a la MC. Isabel García Camara, al MC. Erick Aguiera Cauich,
al Ing. Alberto Cortés Velazquez por sus consejos, sugerencia y comentarios tan
imporntantes en los seminarios grupales.
A mis amigos y compañeros del laboratorio GeMBio: Emy, Yaki, Sandy, Rosa, Beto, Erick,
Gama, Abril, Diana, Tere, Anuar, Fanny y Vero.
A mis compañeros del ITM que hicieron más amena mi estancia: Alex, Mariela, Irek y
Wendy.
A mis amigos que siempre han estado al pendiente de mí, Gamaliel, Katia, Rosa.
A mi Familia por todo su amor y apoyo incondicional, a mis padres por depositar en mi toda
su confianza, a mi hermana Yazmín y a Juan por ser una imagen y esperanza de vida, por
demostrarme que a pesar de las circunstancias siempre se puede salir adelante. A
Gabrielito, Leo y Pablo por sus sonrisas, palabras que me alientan cuando más lo necesito.
Al QFB. José Silvano Chalé Canul por el aprendizaje de todos los días, por su paciencia,
por ser mi fortaleza y soporte frente a los días complicados, y por lo que falta por vivir.
i
INDICE
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................. iii
ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................... iv
RESUMEN .......................................................................................................................... vi
ABSTRACT ........................................................................................................................ vii
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1
ANTECEDENTES....................................................................................... 3
1.1. Vinazas ................................................................................................................... 3
1.1.1. Caracterización .................................................................................................... 4
1.1.2. Tratamientos ...................................................................................................... 10
Tratamientos fisicoquímicos .......................................................................... 10
Tratamientos biológicos ................................................................................ 12
Tratamientos anaeróbicos ....................................................................... 12
Tratamientos aeróbicos .......................................................................... 13
1.2. Hongos ligninolíticos .......................................................................................... 15
1.2.1. Enzimas ligninolíticas .......................................................................................... 20
1.2.2. Lacasas ............................................................................................................ 21
Actividad catalítica de las lacasas .................................................................. 22
Aplicaciones de las lacasas ........................................................................... 22
1.3. Justificación ........................................................................................................ 24
1.4. Hipótesis .............................................................................................................. 25
1.5. Objetivo general .................................................................................................. 26
1.6. Objetivos particulares ......................................................................................... 26
MATERIALES Y METODOS .................................................................... 27
2.1. Estrategia experimental ...................................................................................... 27
2.2. Aguas residuales a tratar .................................................................................... 28
2.3. Microorganismos a evaluar ................................................................................ 28
2.4. Propagación de las cepas ................................................................................... 28
ii
2.5. Determinación de actividad enzimática en placa .............................................. 28
2.6. Crecimiento en placa con vinaza y efluente ...................................................... 29
2.7. Preparación del inóculo ...................................................................................... 29
2.8. Tratamientos de Vinaza ...................................................................................... 29
2.9. Tratamientos de Efluentes .................................................................................. 30
2.10. Determinación de remoción de color ............................................................... 30
2.11. Determinación de fenoles ................................................................................. 30
2.12. Actividad Lacasa ............................................................................................... 31
2.13. Determinación de DQO (Demanda Química de Oxígeno) ............................... 31
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 32
3.1. Actividad enzimática en placa ............................................................................ 32
3.2. Crecimiento en placa con vinaza a concentraciones de 5 y 25% (v/v) ........... 33
3.3. Tratamiento de Vinazas...................................................................................... 33
3.4. Crecimiento en placa con efluentes a concentraciones de 5 y 25% (v/v)....... 40
3.5. Tratamiento de efluentes .................................................................................... 41
CONCLUSIONES ............................................................................................................... 48
PERSPECTIVAS ................................................................................................................ 49
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 50
iii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Diferentes resultados de caracterización de Vinazas provenientes de diferentes materias
primas. .............................................................................................................................. 6
Tabla 2. Hongos lignolíticos, ejemplos y procedencia [43] . ............................................................. 16
Tabla 3. Aplicaciones de las Lacasas en diferentes sectores de la industria [41] ............................ 23
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Producción global de etanol en billones de galones .......................................................... 3
Figura 2. Proceso de producción de Etanol . ..................................................................................... 4
Figura 3. Estructura de una melanoidina producto de la reacción glucosa-glicina. ........................... 8
Figura 4. Remoción del color en vinaza por tratamiento químico. a) control, b) tratamiento con
hipoclorito de sodio y c) sedimentación de los sólidos después de 24 h ..................... 11
Figura 5. a) Trametes hirsuta y b) Sclerotium rolfsii. ....................................................................... 18
Figura 6. Esquema de los sitios de cobre T1 (Cu1) y T2/T3 (Cu4/Cu2-Cu3) de la lacasa de Bacillus
subtilis . ........................................................................................................................... 21
Figura 7. Actividad lacasa en placa de los hongos de T. hirsuta (Bm-2 y AHB-6), P. chrysosporium
(Bm-4), A. rolfsii (AT5, AT13 y AT17) y Cochliobollus lunnatus (AHB-1). ...................... 32
Figura 8. Crecimiento de los hongos de T. hirsuta (Bm-2 y AHB-6), P. chrysosporium (Bm-4), A.
rolfsii (AT5, AT13 y AT17) y C. lunnatus (AHB-1) en placa con 5 y 25% (v/v) de vinaza
........................................................................................................................................ 33
Figura 9. Tratamiento 5% (v/v) de Vinaza a las 192h de incubación (a) Porcentaje de decoloración
(ANOVA de medias, p<0.05); (b) decoloración de vinazas. ........................................... 34
Figura 10. Tratamiento 5% (v/v) de Vinaza a las 192h de incubación (a) Remoción de fenoles a las
192h (ANOVA de medias, p<0.05); (b) Cinética de actividad lacasa. ............................ 34
Figura 11. Tratamiento de vinaza al 10% (v/v) (a) Porcentaje de decoloración y (b) remoción de
fenoles con hongos en). ANOVA de medias, p<0.05. .................................................... 35
Figura 12. Tratamiento de vinaza a 10% (v/v) a las 192 h de incubación (a) Cinética de actividad
lacasa; (b) Decoloración de vinaza. ................................................................................ 36
Figura 13. Tratamiento con vinaza al 15% (v/v) (a) Porcentaje de decoloración y (b) remoción de
fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA de medias, p<0.05. ................. 37
Figura 14. Tratamiento de vinaza a 15% (v/v) a las 192 h de incubación (a) Cinética de actividad
lacasa; (b) Decoloración. ................................................................................................ 38
Figura 15. Tratamiento de vinaza al 20% (v/v) a las 192 h de incubación (a) Porcentaje de
decoloración y (b) remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA
de medias, p<0.05. ......................................................................................................... 39
Figura 16. Tratamiento de vinaza al 20% (v/v) a las 192 h de incubación (a) Cinética de actividad
lacasa; (b) Decoloración. ................................................................................................ 40
Figura 17. Crecimiento de los hongos T. hirsuta (Bm-2 y AHB-6), P. chrysosporium (Bm-4), A.
rolfsii (AT5, AT13 y AT17) y C. lunnatus (AHB-1) en medios con efluentes al 5 y 20%
(v/v) al séptimo día de incubación. ................................................................................. 41
v
Figura 18. Tratamiento de efluente al 5% (v/v) a las 192 h de incubación, (a) Porcentaje de
decoloración y (b) Remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA
de medias, p<0.05; (c) Cinética de actividad lacasa; (d) Muestras sin tratar y muestras
tratadas. .......................................................................................................................... 42
Figura 19. Tratamiento de efluente al 10% (v/v) a las 192 h de incubación, (a) Porcentaje de
decoloración y (b) Remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA
de medias, p<0.05; (c) Cinética de actividad lacasa; (d) Muestras sin tratar y muestras
tratadas. .......................................................................................................................... 43
Figura 20. Tratamiento de efluente al 15% (v/v) a las 192 h de incubación, (a) Porcentaje de
decoloración y (b) Remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA
de medias, p<0.05; (c) Cinética de actividad lacasa; (d) Muestras sin tratar y muestras
tratadas. .......................................................................................................................... 44
Figura 21. Tratamiento de efluente al 20% (v/v) a las 192 h de incubación, (a) Porcentaje de
decoloración y (b) Remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA
de medias, p<0.05; (c) Cinética de actividad lacasa; (d) Muestras sin tratar y muestras
tratadas. .......................................................................................................................... 45
Figura 22. Tratamiento de efluente al 25% (v/v) a las 192 h de incubación, (a) Porcentaje de
decoloración y (b) Remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA
de medias, p<0.05; (c) Cinética de actividad lacasa; (d) Muestras sin tratar y muestras
tratadas. .......................................................................................................................... 46
vi
RESUMEN
Las vinazas son aguas residuales, altamente coloreadas, que se generan de las destilerías
de etanol. Las vinazas que se generan de melazas contienen altas cantidades de
contaminantes, incluyendo compuestos fenólicos y melanoidina. Por cada litro de bioetanol
obtenido, se producen diez litros de vinazas. La eliminación de estos residuos es peligrosa
y presenta un riesgo considerable de contaminación, que se incrementa cuando se usan
estas aguas residuales en la agricultura. En la búsqueda de tratamientos biológicos para
este problema, se han propuesto los hongos ligninolíticos, por la acción de sus sistemas
enzimáticos, que eliminan o reducen estos compuestos, que persisten incluso después de
haber sido tratados por la digestión anaeróbica. El objetivo de este trabajo fue evaluar la
eficacia, en la eliminación de colorantes de las vinazas, de siete cepas de hongos
Basidiomicetes, nativos de Yucatán. Todas las cepas probadas tienen la capacidad de
eliminar el color del efluente, destacando la cepa Bm-2. La decoloración de las vinazas fue
concomitante con el incremento de la actividad de las lacasas. En el tratamiento de 10%
(v/v) de vinazas fue donde se encontró la más alta actividad enzimática (2543.7 U/mlml) y
se obtuvo un 69.2% de decoloración con una remoción del 78.2% de fenoles. También, en
la decoloración de efluentes de digestión anaeróbica, se alcanzó una decoloración del
68.8% con el tratamiento de concentración de 25% (v/v), con una actividad lacasa de
3415.97 U/ml y una remoción de fenoles totales del 65.5%. Este estudio muestra el gran
potencial en la degradación de las vinazas que tiene la cepa Bm-2 de T. hirsuta.
vii
ABSTRACT
Vinasses are the dark-colored wastewaters that are generated by ethanol distilleries. The
vinasses that are generated from molasses contain high amounts of pollutants, including
phenolic compounds and melanoindin. For each liter of bioethanol obtained, ten liters of
vinasses are produced. The disposal of these residues is hazardous and presents a
considerable risk of pollution that is increased when this wastewater is used in agriculture.
In the search for biological treatments for this problem, the ligninolytic fungi have been
proposed, for their enzymatic systems, which eliminate or reduce these compounds, which
persist even after being treated by anaerobic digestion. The goal of this work was to evaluate
the effectiveness in removing colorants from vinasse of seven strains of basidiomycetous
fungi, natives from Yucatán. All strains tested have the ability to eliminate color from the
effluent, highlighting the Bm-2 strain. The discoloration of vinasse was concomitant with the
increase in laccase activity. The highest value of enzyme activity (2543.7 U/ml) was obtained
with Bm-2, in 10% (v/v) vinasse, which corresponded to a 69.2% increase in discoloration
and 78.2% of phenolic compounds remotion. Also with T. hirsuta Bm-2, in 25% (v/v) effluent
from the anaerobic digestion of vinasse were obtained 68.8% of discoloration, 65.5% in
phenolic compounds remotion and 3415.97 U/ml of laccase activity. This study
demonstrates the potential of the Bm-2 strain of T. hirsuta for the biodegradation of vinasse.
1
INTRODUCCIÓN
Las vinazas, son aguas residuales que derivan de la producción de etanol (de la industria
de bebidas o de biocombustibles). Se ha estimado que en promedio se generan 10 litros de
vinazas por cada litro de etanol. Estas aguas residuales ocasionan un gran problema
ambiental, debido a que generalmente son vertidas, inadecuadamente en los cuerpos de
agua y/o usadas en fertirriego, afectando a los ecosistemas. Las vinazas se caracterizan
por su alto contenido de materia orgánica, pH ácido y coloración café oscuro [1, 2] . La
coloración es un contaminante, ya que está asociado a componentes tóxicos, como
melanoidinas y fenoles. Por lo tanto, la disposición de este residuo es peligrosa y presenta
un riesgo considerable de contaminación, que se incrementa cuando es usado en la
agricultura. En el estado de Veracruz, México, el gran volumen de producción de alcohol,
generado por las industrias azucareras, incrementa estos riesgos, de ahí la importancia de
la búsqueda de alternativas biotecnológicas para la degradación efectiva de compuestos
fenólicos y la decoloración de las vinazas [3, 4]. Entre los diferentes tratamientos
implementados en aguas residuales, destacan los fisicoquímicos y los biológicos, siendo
éstos últimos los más prometedores, por la eficiencia en la degradación de compuestos
orgánicos y ser amigables con el ambiente. Entre los tratamientos biológicos sobresalen los
realizados con hongos, que utilizan hongos basidiomycetos causantes de la podredumbre
blanca, por su capacidad para degradar una amplia gama de xenobióticos y compuestos
recalcitrantes persistentes en el medio ambiente [5], gracias a su sistema de enzimas
ligninolíticas no específicas, que participan en la degradación de una amplia variedad de
materiales naturales y sintéticos, tales como lignina, melanoidinas, taninos, hidrocarburos
aromáticos policíclicos, y clorofenoles. Los sistemas enzimáticos de mayor importancia
incluyen manganeso peroxidasas, lignino peroxidasas y lacasas [3, 4] Las lacasas se
producen en presencia de varios inductores, y sus efectos sobre la actividad metabólica y
el crecimiento celular dependen de las condiciones ambientales y los mecanismos de
regulación específicos [6, 7]. Las lacasas catalizan la reducción de O2 en H2O utilizando
una gama de compuestos fenólicos como donantes de hidrógeno [8], pueden degradar
fenoles mediante acoplamiento oxidativo y polimerización y reducir el contenido de fenol de
diferentes aguas residuales [9]. Las vinazas contienen compuestos tales como los fenoles
y melanoidinas, los cuales pueden ser degradados por acción de las laccasas, por lo
anterior en el presente trabajo se evalúan hongos nativos de Yucatán para su uso en
tratamiento de vinazas y efluentes de su digestión anaeróbica.
3
ANTECEDENTES
1.1. Vinazas
La demanda de etanol se ha incrementado con el paso de los años. En el año 2013 la
producción de etanol anhidro a nivel mundial fue de 23,429 mil millones de galones (Figura
1), aproximadamente 88,562 mil millones de litros según datos del Departamento de
Energía de Estados Unidos [10].
Figura 1. Producción global de etanol en billones de galones [10] .
El etanol puede ser producido a partir de diversas materias primas con un alto contenido de
carbohidratos, sin embargo cerca del 40% de todo el etanol producido en el mundo proviene
de la caña de azúcar [1]. En el 2013 en México, la Unión Nacional de Cañeros A. C. reporta
que al menos en las industrias azucareras con destilería se generaron 17´607,854 L de
alcohol anhidro a nivel nacional, teniendo en cuenta que en promedio se generan 10L de
agua residual (vinaza) por cada litro de etanol producido para ese año se generaron
aproximadamente 176´078,540 L [11]. Otra industria de bebidas alcohólicas con gran
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013
Mil
mill
on
es
de
Gal
on
es
Resto del mundo
Canada
China
Europa
Brasil
E.U.A
4
producción es la del tequila que para el mismo año produjeron 229.2 millones de litros de
etanol hidratado, es decir que se generaron solo en ese año cerca de 2,292 millones de
litros de vinaza [12], con base a lo anterior se aproxima que anualmente se generan más
de 2,500 millones de litros de vinaza anualmente en México, lo que implica con gran impacto
ambiental.
1.1.1. Caracterización
Durante el proceso de obtención de azúcar, el jugo de la caña se cristaliza para su
recuperación, obteniéndose al final del proceso melaza, que a continuación es diluida y
fermentada con microorganismos (generalmente levaduras) para obtener etanol. Al término
de la fermentación, las levaduras son retiradas por medio de filtración y se realiza una
concentración del alcohol por medio de destilación, Figura 2 [1]. En México una destilería
produce en promedio 24,200.3 L de etanol hidratado al día, es decir que se generan al día
242,003 L de vinaza [11].
Figura 2. Proceso de producción de Etanol [1].
Las vinazas se definen como efluentes o aguas residuales de la fermentación y destilación
de la producción de alcohol para bebidas o biocombustibles. Las vinazas se caracterizan
por su color café oscuro, pH ácido y alto contenido de materia orgánica e inorgánica [13].
El color café oscuro se debe a la presencia de compuestos tales como melanoidinas,
caramelos, fenoles, furfurales, entre otros [14, 15].
En general las vinazas están compuestas de un 93% de agua y un 7% de sólidos. Tienen
gran cantidad de materia orgánica, aproximadamente 90-150 g/L, y son bajas en nitrógeno
5
y potasio; sin embargo las características de estos efluentes varían dependiendo de la
materia prima y del proceso de destilación utilizado en la producción de etanol; por tanto,
los efluentes de la destilación de mostos de melaza o de jugo de caña de azúcar puro son
diferentes, así como los efluentes provenientes de la industria mezcalera y tequilera, y los
generados como subproductos a partir de la fermentación de otras materias primas (Tabla
1) [16, 17].
6
Tabla 1. Diferentes resultados de caracterización de Vinazas provenientes de diferentes materias primas.
Parámetro Jugo de Caña de azúcar Melaza de caña
de azúcar
Melaza de
remolacha
Vinaza de
Vino
pH 4.7 3.9 4 4.5 3.4-4.5 3.1 4.9 3.8
DQO (g/L) 85.6 42.0 121.0 117.8 60.0-100.0 279.5 104.6 18.5
DBO (g/L) 32.3 11.3 - - 35.0-60.0 - 364.0 -
Fosfatos (g/L) - 0.2 0.1 0.7 - - - -
TS (g/L) - 6.0 - 116.2 25.0-50.0 25.80% - 13.0
TSS (g/L) - - - 106.8 2.0-8.0 - 46.4 -
TSD (g/L) - - 45.5 105.5 23.0-42.0 - - -
Fenoles (g/L) - - - - - - - 13.0
Referencias [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25]
ST: Total de solidos; TSS: Total de solidos suspendidos; TSD: Total de sólidos disueltos.
7
Una de las principales problemáticas de las vinazas es su contenido de materia orgánica,
que excede los límites máximos permisibles por la Norma Oficial Mexicana NOM-064-
ECOL-1994 sobre descargas de efluentes provenientes de la industria de la destilería [26].
La cantidad de materia orgánica contenida, se expresa en relación a la Demanda Química
de Oxígeno (DQO), que indica la cantidad total de oxígeno que se requiere para oxidar
todos los materiales orgánicos a dióxido de carbono y agua [14]. Evaluar diversos
parámetros además de la DQO, como pH, conductividad, sólidos disueltos, turbidez,
azúcares reductores, fósforo, fenoles, potasio y nitrógeno total, permite una mejor selección
para los tratamientos de aguas residuales [18].
Aunque su composición varía, la vinaza es un residuo altamente coloreado, que
difícilmente puede ser tratado en un proceso biológico como lodos activados o lagunas
anaeróbicas, debido a su recalcitrancia por la presencia de compuestos cromóforos [2].
Una de las características peculiares de las vinazas es su color café oscuro, atribuido a la
presencia de colorantes naturales, desde los pigmentos contenidos en las células de la
materia prima (por ejemplo: carotenoides y clorofilas) hasta los formados durante el
proceso de la fermentación (melanoidinas, caramelos, melaninas, fenoles, etc.). La
formación de los caramelos, resulta de la serie de reacciones que ocurren en la
deshidratación de los carbohidratos y su consecutiva polimerización a altas temperaturas,
catalizada por compuestos ácidos o básicos. Los caramelos no han demostrado actividad
antimicrobiana, en contraste con las melanoidinas, que sí tienen un efecto antimicrobiano
a partir de una concentración de 100 mg/L, semejante a 16 mg/L de oxitetraciclina, por lo
que se considera a las vinazas como un recurso para controlar fitopatógenos, aunque
precisamente este efecto ha provocado graves problemas de contaminación al ser
dispuestas en cuerpos de agua [1].
Las melanoidinas constituyen aproximadamente el 2% de las vinazas, son producto de la
reacción de Maillard, reacción no enzimática entre un aminoácido y un monómero de
azúcar, a altas temperaturas, durante la concentración de carbohidratos [27]. Su estructura
varía, pues van desde pequeñas moléculas hasta largos polímeros, así mismo pueden
contener moléculas antioxidantes tóxicas para los microorganismos, Figura 3 [1, 14, 15].
8
Figura 3. Estructura de una melanoidina producto de la reacción glucosa-glicina, [28].
Además de las melanoidinas y los caramelos, se encuentran otros compuestos que le
confieren el color a la vinaza, como son los polifenoles. Los compuestos polifenólicos y
fenólicos se encuentran en gran proporción, lo que representa una de las principales
limitantes de los tratamientos a las vinazas, ya que son persistentes y recalcitrantes en el
suelo. Los compuestos fenólicos, como el ácido benzoico, inhiben el crecimiento de los
microorganismos encargados de la oxidación y degradación en los tratamientos aeróbicos
y anaeróbicos [18, 29]. Los compuestos con grupos fenólicos, se liberan en el
procesamiento de la materia prima, previo a la fermentación alcohólica, quedan libres
durante el rompimiento de las células y componentes de la lignocelulosa. Durante este
proceso, se produce un color amarillo a marrón debido a su oxidación, por exposición al
aire, además algunos pueden ser generados durante la fermentación. En vinazas se han
detectado ácidos fenólicos, como ácido benzoico (principalmente su derivado; ácido
gálico), y ácido cinámico (y sus derivados: ácido cumárico, cafeico, clorogénico y ferúlico)
[1].
Al igual que las melanoidinas, los compuestos fenólicos originados desde la formación de
la melaza hasta la vinaza, tienen efecto antimicrobiano por lo que inhiben el crecimiento y
la reproducción de algunas levaduras y bacterias, como las metanogénicas, comúnmente
usadas en tratamientos de residuos por medio de digestión anaeróbica [1].
9
También se ha reportado que desde una concentración 5%, en un medio convencional, las
vinazas pueden ser usadas como control de fitopatógenos como Fusarium oxysporum,
Sclerotinia sclerotiorum, Pythium aphanidermatum y Phytophthora parasitica [30].
Para la industria alimentaria, la producción de melaza (de caña de azúcar, remolacha
azucarera u otra materia prima), así como la producción de bebidas alcohólicas a partir de
éstas, genera una excesiva cantidad de vinazas. Las vinazas y su manejo apropiado, son
la principal limitante ambiental para el crecimiento de la industria del bioetanol. Países
productores de bioetanol como Brasil, de Asia y de Europa han propuesto algunas
aplicaciones, para darle un valor agroindustrial como el fertirriego y biotecnológico como
nutriente de microorganismos que promueven una mayor eficiencia en la producción de
metabolitos [1, 31]. No obstante, existen estudios que demuestran que la aplicación de las
vinazas crudas sobre el suelo, no tienen los resultados esperados, por el contrario los
suelos de buena calidad se ven perjudicados y sólo podrían ser benéficas para suelos
erosionados, marginados, degradados, etc. [21]. Con el objetivo de darle un valor agregado
a éste residuo la búsqueda de tratamientos para vinazas se ha vuelto extensa,
considerando a los procesos biológicos como métodos más efectivos para tratamientos de
aguas residuales provenientes de destilerías [18].
El color, pocas veces es considerado como una forma de contaminación, a pesar de los
daños que provoca, debido a que el color en aguas residuales está asociado a la presencia
de compuestos tóxicos, grupos cromóforos y polímeros de alto peso molecular como la
lignina. En el tratamiento de aguas residuales coloreadas, el principal objetivo es la
reducción o eliminación del color, para contribuir en la disminución del impacto sobre los
ecosistemas donde son vertidas [30].
La coloración de la vinaza afecta directamente a los cuerpos de agua cuando son arrojados
en ella, perjudica la penetración de la luz para los organismos fotosintéticos y por
consecuencia a la cadena trófica [32]. Las vinazas pueden incrementar la temperatura de
las aguas receptoras y provocan la disminución del oxígeno disuelto, los sólidos
suspendidos restringen la penetración de la luz [13]. El derrame de las vinazas en los
cuerpos de agua naturales, puede causar eutrofización (un aumento gradual en la
concentración de fosforo, nitrógeno y otros nutrientes de los ecosistemas acuáticos), los
cuales inducen un gran incremento en las concentraciones de algas y microorganismos en
10
la superficie, evitando que la luz solar y el oxígeno necesario lleguen a los organismos sub
acuáticos [2].
1.1.2. Tratamientos
La reducción del impacto ambiental de aguas residuales, involucra la degradación de
compuestos orgánicos y la conversión de sustancias orgánicas tóxicas, a sustancias más
susceptibles a la degradación, para esto se han desarrollado diversos tipos de
tratamientos, clasificados principalmente en físico-químicos y en biológicos.
Tratamientos fisicoquímicos
Los tratamientos físico-químicos requieren de equipos costosos y sustancias químicas no
recuperables (generalmente metales o sales), que en ocasiones generan nuevos residuos
contaminantes. Frecuentemente son complementados con los tratamientos biológicos,
debido a que no se realiza una degradación como tal, sino una separación física.
Los estanques de sedimentación. Pueden ser útiles a escala industrial, se basan en el
almacenamiento de las vinazas en estanques, para la eliminación de sólidos sedimentables
presentes. Puede eliminarse más del 80% de los sólidos sedimentables, pero al ser una
eliminación física, la concentración de la materia disuelta sigue siendo elevada, cerca del
90%. Este método no siempre es recomendable, puesto que existe el riesgo de
contaminación del suelo y el subsuelo por filtración [22].
Coagulación –floculación. Este proceso es uno de los más utilizados a escala piloto e
industrial, ha sido usado en el tratamiento de vinazas de tequila. Se basa en la utilización
de metales como coagulantes y un polímero como floculante, para separar sólidos
suspendidos y sólidos coloidales. En otro estudio sobre tratamiento de vinazas, se utilizó
Al2(SO4)3 a pH 6, con lo que se pudo eliminar el 70% del color y 37% de DQO. La desventaja
que presentó es la de generar grandes cantidades de lodo, puesto que es una separación
física con intermediarios, además del aumento en los costos para las dosis del coagulante
[22] .
El ácido poliglutámico (PGA) ha sido utilizado también como coagulante en el tratamiento
de vinazas de tequila. El procedimiento se lleva a cabo con una concentración de 300 ppm
de PGA, seguido de una filtración en una columna de arena, posteriormente se añadió
hipoclorito de sodio a 60 °C, en agitación de 200 rpm y nuevamente se filtró en la columna
11
de arena (Figura 4). Los resultados en este estudio reportaron un 70% de remoción de
turbidez y 79.5% de reducción de DQO, sin embargo aunque este proceso ha demostrado
una alta eficiencia, aún no es viable económicamente [33].
Figura 4. Remoción del color en vinaza por tratamiento químico. a) control, b) tratamiento con
hipoclorito de sodio y c) sedimentación de los sólidos después de 24 h [33] .
Oxidacion de Fenton. La oxidación de Fenton es un proceso catalítico basado en una
transferencia de electrones entre peróxido de hidrógeno y un metal como catalizador La
presencia de iones ferrosos, facilitan la eliminación de compuestos fenólicos u orgánicos,
en el caso de un proceso de tratamiento de aguas residuales [32].
Biosorción, Es la absorción de compuestos presentes en aguas residuales, por materiales
biológicos inertes o derivados de fuentes biológicas. Este mecanismo se basa en la
utilización de residuos de biomasa vegetal como absorbente de ciertos compuestos
mediante un intercambio iónico, adsorción, interacción electrostática, quelación y/o
microprecipitación. Sin embargo, como desventaja tiene la formación de lodos [34].
Por lo general, los métodos físico-químicos son más eficientes cuando van en conjunto con
un tratamiento biológico. Beltran et al. , realizaron una oxidación de Fenton posterior a una
degradación aeróbica de lodos activados. La degradación aeróbica la hicieron en un reactor
batch con agitación a temperatura de 28 ± 0.5 °C y pH 7.0. Efectuaron un filtrado para la
eliminación de la biomasa. La oxidación de Fenton se realizó a 25 ± 0.5 °C, pH de 3.5 y
FeSO4 7 H2O. En este tratamiento aeróbico redujo del 75 a 94%, de materia orgánica y del
12
54 a 79% de componentes fenólicos. En la oxidación de Fenton se removieron del 50 al
80% de DQO y hasta un 90% de fenoles [25].
Tratamientos biológicos
En las últimas décadas, el interés hacia la biorremediación, se ha ido incrementando con
la tecnología. Por ello, se ha intensificado la utilización de microorganismos, tales como
bacterias y hongos, que han demostrado una buena capacidad para decolorar los efluentes
de diferentes industrias textilera, incluyendo la industria de la destilería. Una mejor
comprensión de las actividades microbianas responsables de la degradación de los
materiales colorantes contribuiría al posible escalamiento a nivel industrial al optimizar las
condiciones adecuadas para ello [35]. Además, es una opción viable en términos
económicos, puesto que es un sistema de bajo costo, a diferencia de los sistemas físico-
químicos [14].
Tratamientos anaeróbicos
La digestión anaeróbica, es uno de los tratamientos más empleados en residuos con alta
carga orgánica como la vinaza por su bajo costo operacional, la baja producción de
residuos y generación de subproductos, como el gas metano. Tiene alta eficiencia para el
tratamiento de la fracción orgánica de las vinazas, pero no de los componentes que llegan
a ser recalcitrantes, como la melanoidina, y los fenoles, que resultan inhibidores para las
bacterias metanogénicas. Sin embargo, estos pueden ser tratados combinando de varias
técnicas [14, 17] . El tratamiento anaerobio causa la elevación del pH de las vinazas crudas,
debido a la actividad microbiana, que al descomponer la materia orgánica, produce dióxido
de carbono con el que se presenta un aumento de pH, lo mismo ocurre con la reacción de
oxidación-reducción cuando el agua es el aceptor de electrones [21].
Budiyono et al, produjeron metano a partir de la degradación de vinaza de melaza,
evaluaron los efectos del pH y determinaron que a pH 7, las bacterias tienen la actividad
óptima para degradar la materia orgánica, con un rendimiento de metano de 11.07 ml/gr
de DQO removido en un experimento de 30 días, en comparación con los pH 6 y 8 en los
cuales la producción de metano fue lenta [23].
Algunos autores recomiendan un pretratamiento para llevar a cabo una digestión
anaeróbica más eficiente. Kotcharoen et al., propusieron como pre-tratamiento la
electrocoagulación, debido al contenido elevado de sulfatos (SO4) 2-, cloro (Cl-) y potasio
13
(K+). La electrocoagulación se efectuó en un tanque de acrílico, como reactor batch con
placas de hierro en el interior, a manera de electrodos, al que se le aplicaron de 0 a 5
Amperes de corriente directa y un voltaje ajustado en un rango de 0 - 50 Volts, durante 20
min. Se alcanzó hasta un 50% de reducción de presencia de iones, a excepción de los
iones de potasio. De esta manera el sobrenadante pudo ser colectado para su utilización
en la digestión anaeróbica, en un reactor UASB (Upflow anaerobic sludge blanket o reactor
anaeróbico de manto de lodos de flujo ascendente) de DQO de 25,000 mg/L. [36].
España-Gamboa et al., utilizaron un reactor UASB modificado con un sedimentador de alta
tasa de platos inclinados, que favoreció la retención de los sólidos volátiles suspendidos y
su recirculación dentro del reactor. La vinaza proveniente de la producción de alcohol
hidratado, con DQO de 121 g/L, a una carga orgánica de 17.05 kg de DQO/m3- día,
obteniendo una eficiencia de 69% en la remoción de DQO y una producción de 0.263 m3
CH4/kg DQOinicial [20].
Existen métodos para la explotación y purificación de las vinazas, particularmente entre los
biológicos (aeróbico y anaeróbico), hasta ahora el más aplicable y con mayores ventajas
es la digestión anaeróbica, sin embargo los rendimientos suelen verse limitados debido a
la presencia de compuestos fenólicos .[13].
Robles-Gonzales et al, propusieron dos post-tratamientos: ozonización y tratamiento
fúngico (con Trametes versicolor), para vinazas pre-tratadas anaeróbicamente
incrementando la remoción de fenoles. Utilizaron una vinaza con una DQO de 26.7 g/L para
la ozonización y la diluyeron a 4.14 g/L para el tratamiento con T. versicolor. Con sus
resultados demostraron que los tratamientos fungosos, después de la digestión
anaeróbica, fueron más eficientes, con un 88.9% de remoción, que la ozonización después
de la digestión anaeróbica con 76.2% de remoción. Esto podría representar una ventaja
económica para el tratamiento de efluentes de la digestión anaeróbica, con un alto
contenido de compuestos recalcitrantes, como en el caso de la vinaza de mezcal [37].
Tratamientos aeróbicos
Generalmente no son recomendados en tratamientos de aguas residuales con alta carga
orgánica, ya que implica un incremento de costos por energía y se ven limitados por la
transferencia de oxígeno para la aireación. Pero éstos son más eficientes en la eliminación
de color y sustancias tóxicas (como los fenoles) que los tratamientos anaeróbicos y los
fisicoquímicos. Existen varios estudios sobre el tratamiento aeróbico de vinazas utilizado
14
consorcios microbianos con predominio de bacterias, así como cultivos puros de bacterias
y los hongos ligninolíticos [38].
El uso de bacterias y levaduras ha sido destacado debido a su rápida tasa de crecimiento
en sistemas líquidos y a que pueden adaptarse en comunidades mixtas, combinando su
modo metabólico individual. Pediococcus acidilactici y Candida tropicalis fueron utilizados
para la decoloración de las melanoidinas en un reactor de columna, inmovilizados con
diferentes materiales como alginato de sodio, agar, agarosa y poliacrilamida (2%), sin
embargo, la decoloración decrece si la carga celular es alta, lo cual se atribuye a la
limitación de los nutrientes y es necesario que estén en presencia de medio de cultivo basal
y a pH 6 para alcanzar la degradación de las melanoidinas [39]. No obstante la utilización
de microorganismos inmovilizados hace más seguros y efectivos económicamente los
tratamientos para las industrias.
Entre las bacterias más estudiadas para la decoloración de vinazas se encuentran
Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei, que durante el
tratamiento de decoloración generan un valor agregado, ya que producen ácido láctico, sin
embargo, este proceso aún no se considera económicamente viable [40]. Géneros como
Pseudomonas y Bacillus también han sido estudiados en tratamientos de vinazas, y
alcanzaron porcentajes de remoción de DQO de un 80 y de hasta un 90% de remoción de
color en un tiempo de 4 a 5 días [34]. La importancia de la degradación de los compuestos
fenólicos radica en la disminución de su fitotoxicidad y actividad antimicrobiana, por lo cual
podría acelerar la digestión anaeróbica y disminuir los costos por el tiempo de retención
hidráulica [13]. Puesto que existen diversas propuestas para los tratamientos de aguas
residuales que hasta el momento pueden ser inefectivos y económicamente no viables, se
ha vuelto atractivo el uso de microorganismos capaces de degradar compuestos con
diversas estructuras químicas [41].
Bacillus sp., Raoultella planticola y Cronobacter sakazakii (Enterobacter sakazakii)
producen enzimas ligninolíticas capaces de decolorar las melanoidinas. Yaday y Chandra
evaluaron estas cepas para decolorar las melanoidinas en medio de cultivo YMPG (por sus
siglas en inglés, extracto de levadura, extracto de malta, peptona y glucosa) y en presencia
de metales como Fe3+, Mn2+ y Zn2+, estos metales son inductores de las enzimas
ligninolíticas y provocan una mayor coloración, ellos concluyeron que la unión de metales
a los fenoles contenidos en los efluentes del destilado, provocaron toxicidad e influyeron
15
en el crecimiento de las bacterias de estudio. La degradación de la vinaza por parte de
estas bacterias pudo verse afectada bajo las condiciones antes mencionadas [27].
Además de las bacterias se han utilizado hongos ligninolíticos, debido a su capacidad de
tolerar y degradar compuestos recalcitrantes, gracias a que contienen enzimas óxido
reductasas extracelulares, como: manganeso peroxidasa (MnP), lignino peroxidasa (LiP)
y fenol oxidasa (Lacasa) [1]. En tratamientos de vinaza derivadas de la producción de vino,
se observó que Coriolus versicolor (T. versicolor) demostró tener la capacidad de decolorar
hasta un 80% de la vinaza en condiciones óptimas de oscuridad, Geotrichum candidum
eliminó parcialmente a los fenoles contenidos en éste efluente. Rhizoctonia sp decoloró
hasta un 87%, mientras que Aspergillus oryzae se inhibió por presencia de los fenoles [34].
Otros organismos: Pleurotus sajor-caju, Pleurotus ostreatus y Trichoderma reesei, fueron
propagados en vinazas con bagazo de caña, con el objetivo de producir enzimas
exoglucanasas y endoglucanasas. En dicho estudio se reveló la actividad oxidativa de la
enzima manganeso peroxidasa, producida por T. reesei, que provocó una decoloración de
las mismas [19]. La vinaza es considerada como fuente de nutrientes para producir lacasas,
por los fenoles que la componen y se ha observado que la enzima puede ser inducida
añadiendo salvado de trigo [42].
1.2. Hongos ligninolíticos
Son pocos los organismos capaces de degradar polímeros aromáticos de lignina; entre los
más eficientes. Existen tres grupos de hongos capaces de la degradación de la lignina: los
de la pudrición blanca, los de la pudrición café y los de la pudrición suave [43] (Tabla 2).
16
Tabla 2. Hongos lignolíticos, ejemplos y procedencia [43] .
Organismo Subdivisión
Phylum
Ejemplos Acción Ubicación
Hongos de la pudrición blanca
Basidiiomycota Phanerochaete sp.
Pleurotus sp.
Bjerkandera sp.
Trametessp.
Phlebia sp.
Mineraliza la lignina a CO2 y H2O; algunas especies preferencialmente remueven la lignina (delignificación selectiva) y otros degradan la lignina y celulosa simultáneamente
Se encuentran en residuos forestales (angiospermas), incluyendo la madera seca y dura.
Hongos de pudrición café
Basidiiomycota Serpula. lacrymans
Pleurotus betulinus
Ganoderma trabeum
Phanerochaete placenta
Modifican la lignina por demetilación, hidroxilación aromática limitada y rompimiento de los anillos aromáticos
Tienen preferencia por sustratos de coníferas (gimnospermas), es decir, residuos blandos de madera.
Hongos de pudrición suave
Ascomycota y Deuteromycota
Chaetomium sp.
Ceratocystis sp.
Phialophora sp.
Algunas modificaciones en la lignina. Se mantienen en ambientes húmedos sobre residuos vegetales; atacan residuos duros y suaves.
Los hongos de la podredumbre blanca, son aquellos que crecen en la madera y en los
residuos vegetales en descomposición. Se caracterizan por la producción de enzimas
como la lacasa, manganeso peróxidasa, celobiohidrolasa y glucosidasa, que degradan
materiales fuertemente enlazados como la lignina, que se encuentra en la pared celular
vegetal. Por esta razón, han sido considerados de gran aplicación biotecnológica y en
biorremediación. [43] . El amplio rango de componentes que los hongos son capaces de
degradar incluye insecticidas, hidrocarburos aromáticos policíclicos, colorantes,
nitroexplosivos, y otros químicos tóxicos como cianuro, tetracloruro de carbono y
pentaclorofenol. La reacción más importante de la acción de estos hongos, es la
despolimerización que corresponde a la ruptura oxidativa que cataliza una reacción no
específica en las ligninas y modelos dímeros de lignina, consumiendo H2O2 y O2 [2].
Diversos hongos de la podredumbre blanca del género Trametes, tales como T. versicolor
y T. villosa han sido estudiados, por su capacidad de producir lacasas. La enzima lacasa
es una enzima capaz de actuar sobre una amplia gama de sustratos fenólicos (mono fenol,
difenol, metoxifenol, polifenol y otros) y otros compuestos aromáticos. Es característico en
basidiomicetos de la podredumbre blanca, los que les permite actuar sobre un amplio rango
de sustratos como las vinazas [44, 45]. Recientemente estas enzimas han demostrado
tener diferentes aplicaciones biotecnológicas, como por ejemplo en tratamientos de
biorremediación industrial de efluentes y tintes. Trametes hirsuta (Figura 5a), un hongo de
podredumbre blanca, ha probado ser de gran utilidad en biorremediación de efluentes
textiles por efecto de la lacasa, siendo ésta una enzima termoestable que degrada
compuestos recalcitrantes, y que se encuentra implicada indirectamente en la degradación
de lignina, ya que provoca la oxidación de los fenoles produciendo aceptores de hidrógeno,
como quinonas o radicales libres [46, 47].
Este hongo ha sido evaluado ampliamente en la biorremediación de efluentes textiles, con
una capacidad de decolorar en casi su totalidad los efluentes [48, 49]. En algunos estudios
se ha alcanzado una decoloración del 88% con T. hirsuta optimizando un pH a 6.45 y
temperatura de 30.7 °C [50].
Se ha demostrado que T. hirsuta, basidiomiceto de podredumbre blanca, es capaz de
decolorar el tinte índigo carmín completamente a las 24h, en un biorreactor aireado. Al
inmovilizar las células de ésta cepa por la técnica de atrapamiento, se promovió un
aumento en su actividad de lacasa lo que provocó la decoloración de dicho tinte [51].
Figura 5. a) Trametes hirsuta y b) Sclerotium rolfsii.
Rodriguez Couto et al., realizaron pruebas de decoloración de efluentes de las fábricas de
cueros, con tintes verde luganil y rojo sella sólido, en un reactor cilíndrico con agitación,
donde determinaron que T. hirsuta tuvo una actividad de lacasa de 5000 U/L durante 9
días, decolorando en 2 horas hasta un 16.2% del verde luganil a pH 4 y hasta un 40% del
rojo a pH 5 [52]. T. hirsuta también fue probado en la decoloración de cuatro diferentes
colorantes que contenían las antraquinonas: Índigo carmín, rojo de fenol, Naranja de metilo
y azul de bromofenol, respectivamente. La decoloración se determinó a través de la
disminución de la absorbancia, a diferentes longitudes de onda (610, 431, 466 y 591 nm)
con respecto al tinte, y se expresaron en términos de porcentajes. La decoloración con T.
hirsuta para índigo carmín y azul de bromofenol fue del 100%, el naranja de metilo se
degradó en un 65% y el rojo de fenol presentó cierta resistencia a la degradación, con un
porcentaje de 36% de decoloración en 24 h. Estos resultados indican la especificidad de la
lacasa para diferentes estructuras [53].
Sathiya et al, evaluaron la decoloración de los tintes negro B133 con las cepas Pleurotus
florida y T. hirsuta, usando medio de cultivo líquido básico de Kirk, que contenía una
concentración de 200 mg/L de cada colorante, sin ajuste de pH. Los resultados se
evaluaron al quinto día, en porcentajes de absorbancia a una longitud de onda de 560nm,
demostrando una decoloración de hasta el 62 y 46% para P. florida y T. hirsuta
respectivamente; los resultados fueron mejorados al añadir 2% de glucosa al medio de
cultivo [54].
Tapia-Tussell et al., evaluaron la decoloración de los reactivos azul ácido 74, verde 19 y
rojo 195, a una concentración de 0.01% en medio de cultivo EM (extracto de malta líquido)
con diferentes cepas de hongos ligninolíticos. Entre las cepas evaluadas, la más destacada
fue T. hirsuta Bm-2, que a las 48 h decoloró 90% del azul ácido 74, mientras que el verde
19 fue decolorado en un 95% y el rojo 195 a un 83% a las 72 h, [55].
Phanerochaete chrysosporium (nombre actual, Phanerodontia chrysosporium) es otro
hongo ligninolítico que ha sido reportado como capaz de decolorar las vinazas a
temperaturas cercanas a los 40 °C, así como la disminución de la DQO y degradación de
los compuestos fenólicos en un lapso de 24 h [2]. Este hongo ha sido estudiado en años
recientes, debido su producción de enzimas ligninolíticas, y a que tiene la capacidad de
decolorar diferentes tintes textiles (cristal violeta, rojo de cresol, verde brillante e índigo) y
degradar lignina. La enzima, producida en P. chrysosporium que juega un mejor papel en
la decoloración es la lignina peroxidasa [56].
Se han realizado estudios para producir la enzima lignino peroxidasa inmovilizando al
hongo P. chrysosporium en un material de poliuretano, y se ha visto que el exceso de
oxígeno puede disminuir la producción de estas enzimas y bajo condiciones limitadas de
nitrógeno, la actividad enzimática se incrementa [57]. Por otra parte, el incremento de la
lignino peroxidasa está relacionada con la producción de biomasa, es decir, que cuando
inicia la actividad enzimática, la actividad de producción celular por lo general cesa [58].
Sclerotium rolfsii (Teleomorfo: Athelia rolfsii) es un hongo fitopatógeno que vive en el suelo,
y afecta directamente a las raíces, los tallos y en algunos casos a los frutos. Tiene un
amplio rango de hospederos, entre ellos están calabaza, frijol, sandia, tomate, cacahuate
y soya, aunque también se hospeda sobre residuos de madera [55, 59]. Este hongo carece
de esporas asexuales y su característica principal son las estructuras de preservación que
presenta, denominados esclerocios, los cuales producen en gran cantidad y le confieren la
capacidad de mantenerse viables mucho tiempo, (Figura 5b) [55, 59, 60] . Se ha visto que
tiene la capacidad de producir enzimas como endoglucanasas, exoglucanasas, β-
glucosidasa y celobio dehidrogenasa, lo que aporta gran valor a sus aplicaciones
biotecnológicas [44].
S. rolfsii sólo ha sido utilizado en tratamiento de residuos sólidos municipales debido a que
este tipo de residuos tienen grandes cantidades de celulosa; Gautam et al, probaron
diferentes cepas de hongos y bacterias, entre los cuales evaluaron a Sclerotium rolfsii.
Después de 30 días de tratamiento, los residuos sólidos presentaron cambios de olor y
pérdidas de peso por descomposición. S. rolfsii demostró actividad exoglucanasa,
endoglucanasa y β-glucosidasa, provocando un 30% de reducción del peso por
descomposición de los sólidos [61]. Por otro lado Campos et al. evaluaron lacasas
purificadas de S. rolfsii, para degradar el colorante Índigo oxidándolo primeramente a
isatina (indol -2,3-diona), que posteriormente fue descompuesta aún más a ácido
antranílico (ácido 2-aminobenzoico), sin embargo la mayor degradación (30%) se obtuvo
al utilizar un mediador [62].
Campos Rui et al., también evaluaron lacasas de A. rolfsii y Polyporus sp. para la
decoloración de Índigo en telas teñidas. Pequeños trozos de tela, fueron dispuestos en
buffer de ácido acético/NaOH y agitación a 30 °C y se aplicaron concentraciones de hasta
0.3 mg/L. Aunque la lacasa de Polyporus sp. presentó una mayor afinidad al índigo, A.
rolfsii presentó una degradación de índigo de 76%, [63].
1.2.1. Enzimas ligninolíticas
Los hongos causantes de podredumbre blanca, han demostrado ser muy eficientes en la
degradación de colorantes sintéticos. Este grupo está constituido principalmente por
basidiomicetos, y son capaces de despolimerizar y mineralizar aeróbicamente la lignina.
Esta propiedad se basa en la capacidad que tienen de producir una o más enzimas
extracelulares modificadoras de lignina, capaces de degradar un amplio rango de
compuestos xenobióticos [64].
Las enzimas ligninolíticas participan en la degradación de la lignina, que es un polímero
complejo y recalcitrante. Este grupo de enzimas es altamente versátil por ello es posible
encontrar para ellas una amplia variedad de aplicaciones en la industria. El impacto
biotecnológico de estas enzimas, ha llevado a un incremento drástico en la demanda de
las mismas. Las enzimas ligninolíticas son promisorias para reemplazar los procesos
químicos convencionales en la industria, esto da pie a seguir con las investigaciones para
establecer propuestas razonables y nuevas aplicaciones para un futuro no tan lejano [41].
La degradación del material lignocelulósico puede levarse a cabo con hongos de la
podredumbre blanca por medio de una combustión enzimática, provocada por el sistema
de enzimas lignocelulósicas. El sistema enzimático lignocelulósico consiste de una batería
de enzimas extracelulares que incluyen: peroxidasa, lacasas y oxidasas que producen
peróxido de hidrógeno extracelular, principalmente manganeso peróxidasa (MnP,
E.C.1.11.1.13), Lignino peroxidasa (LiP, E.C. 1.11.1.14) y una fenol oxidasa que contiene
cobre denominada Lacasa (Lac; E.C. 1.10.3.2) [41] .
1.2.2. Lacasas
Las lacasas (bencenodiol oxidorreductasas (EC 1.10.3.2) catalizan la oxidación de un
amplio número de compuestos fenólicos y aminas aromáticas, y también pueden oxidar
sustratos no fenólicos en presencia de mediadores redox apropiados. Las lacasas
pertenece a las oxidasas que contienen cobre, este cobre contenido en las enzimas
catalizan el oxígeno molecular de los sustratos a agua.
Figura 6. Esquema de los sitios de cobre T1 (Cu1) y T2/T3 (Cu4/Cu2-Cu3) de la lacasa de Bacillus subtilis, [41] .
Las lacasas son multinucleares, el sitio activo de las lacasas comprende 4 tomos de cobre
en tres grupos, T1, T2 y T3, Figura 6. El cobre T1, es el responsable de la coloración azul
de las enzimas y se caracteriza por absorber a cerca de 610 nm. El cobre T2, carece de
coloración y no puede ser detectado espectrofotométricamente, el cobre binuclear T3 tiene
su espectro de absorbancia en la región de 330 nm y tiene características de espectro
fluorescencia. Se ha sugerido que las lacasas amarillas, resultan de la modificación de las
lacasas azules por los subproductos de la degradación de la lignina, los cuales juegan un
papel importante, como mediadores naturales de transferencia de electrones para la
oxidación de sustancias no fenólicas. Casi todos los hongos producen más de una isoforma
de Lacasa. Generalmente, las lacasas son las primeras enzimas en ser secretadas en el
ambiente circundante del hongo, y provocan la oxidación de compuestos semejantes a la
lignina con un grupo fenólico libre [41].
Actividad catalítica de las lacasas
Las lacasas catalizan la oxidación de una gran variedad de sustratos mediante la
transferencia de un electrón, lo que produce un radical libre que, espontáneamente,
reacciona consigo mismo o con otro compuesto, reduciéndose y recuperando así el
electrón para su estabilidad [48]. Las lacasas pueden actuar sobre fenoles o con otro tipo
de sustrato, con contenido de cobre, que influye como inductor. Las lacasas son
notablemente inespecíficas en cuanto a su sustrato reductor y el rango de sustratos
oxidados varía de acuerdo al origen de la enzima. Algunos de los sustratos más empleados
son guayacol, catecol y algunos difenoles, como la hidroquinona. Algunos sustratos
específicos para otras enzimas ligninoliticas pueden ser empleados por las lacasas cuando
el sustrato reductor varía, por ejemplo, sustratos utilizados por la manganeso peroxidasa,
pueden ser oxidados por la lacasa en ausencia de peróxido de hidrógeno. La lacasa es
una oxidasa caracterizada por oxidar fenoles, metoxi-polifenoles, diaminas y una gama
considerable de otros compuestos recalcitrantes. La eficiencia de la actividad enzimática
puede ser delimitada por el tipo de sustrato, así como a la utilización de un mediador, el
cual permite y facilita la oxidación de compuestos no fenólicos con modelos estructurales
semejantes a la lignina [41].
Aplicaciones de las lacasas
Las funciones biológicas de las lacasas en los hongos son: aportarle resistencia a las
esporas, formación de rizomorfos, formación de cuerpos fructíferos, síntesis de pigmentos
y degradación de lignina [41].
En la Tabla 3 se enumeran las aplicaciones de las lacasas en diferentes sectores de la
industria.
Tabla 3. Aplicaciones de las Lacasas en diferentes sectores de la industria [41]
Sector Aplicaciones
Alimentario Remoción de contenido fenólico en alimentos y
bebidas
Determinación del ácido ascórbico
Gelación de la pectina de remolacha azucarera
Industria del papel y pulpa Despolimerización de lignina
Deslignificación de la pulpa de madera
Blanqueador de pulpa
Textil Degradación de tintes textiles
Blanqueador
Biorremediación Biodegradación de xenobióticos
Degradación de Hidrocarburos aromáticos
policíclicos (PAHs)
Aplicaciones en Síntesis
orgánica, Médica,
farmacéutica, cosmética y
nanotecnología
Producción de polímeros
Enlaces de fenoles y esteroides
Construcción de enlaces Carbono-Nitrógeno
Síntesis de compuestos naturales complejos
Productos de higiene personal
1.3. Justificación
La principal problemática que presenta la producción de etanol hidratado, a partir de
melaza de caña de azúcar, es la generación de grandes cantidades de vinazas, aguas
residuales, que se caracterizan por su alto contenido de materia orgánica, pH ácido y una
coloración café oscuro, que está asociada a altas concentraciones de melanoidinas y
polifenoles. Estas aguas residuales son principalmente utilizadas en la agricultura lo que
ha conllevado a problemas serios de contaminación de suelos y afectación de los cultivos.
Para resolver esta problemática se ha trabajado en la búsqueda de alternativas y/o
procesos amigables con el ambiente que permitan degradar esta gama de compuestos
tóxicos presentes en las vinazas. Dentro de estas alternativas destaca el uso de
microorganismos (hongos ligninolíticos) que tienen una batería enzimática capaz de
metabolizar dichos compuestos. De ahí la necesidad de evaluar cepas de diferentes
hongos ligninolíticos nativos de Yucatán para seleccionar las de mayor potencial a fin de
que puedan ser empleadas en los tratamientos de vinazas y efluentes.
1.4. Hipótesis
Al menos una de las cepas de hongos ligninolíticos nativas de Yucatán tendrá la capacidad
de decolorar y remover compuestos fenólicos presentes en las vinazas de alcohol hidratado
obtenidas de la destilación de melaza de caña de azúcar y los efluentes de la digestión
anaeróbica.
1.5. Objetivo general
Evaluar siete diferentes cepas de hongos ligninolíticos, con potencial biotecnológico en la
decoloración y remoción de fenoles de vinazas provenientes de melaza de caña de azúcar
y efluentes de su digestión anaeróbica en un UASB.
1.6. Objetivos particulares
1. Evaluar la capacidad de las cepas de Trametes hirsuta (Bm-2 y AHB-6)
Phanerochaete crhysosporium (Bm-4), Cochliobollus lunnatus (AHB-1) y Athelia
rolfsii (AT5, AT13 y AT17) para decolorar y degradar diluciones con diferentes
concentraciones de vinazas y de efluentes de digestión anaeróbica.
2. Determinar la remoción de fenoles en los tratamientos a diferentes diluciones de
vinazas y efluentes de su digestión anaeróbica.
3. Evaluar la actividad lacasa de diferentes cepas autóctonas de Yucatán, Trametes
hirsuta (Bm-2 y AHB-6) Phanerochaete crhysosporium (Bm-4), Cochliobollus
lunnatus (AHB-1) y Athelia rolfsii (AT5, AT13 y AT17) en vinazas y efluentes de su
digestión anaeróbica.
MATERIALES Y METODOS
2.1. Estrategia experimental
2.2. Aguas residuales a tratar
Las muestras bajo estudio fueron proporcionadas por la Unidad de Energía Renovable del
Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY) y procedían de las siguientes fuentes:
La vinaza de melaza de caña de azúcar provino del ingenio azucarero “La Gloria”
ubicado en el municipio Úrsulo de Galván, Veracruz, México. Las muestras fueron
tomadas de un contenedor receptor de vinaza caliente (70 °C), luego fueron
depositadas en botes y almacenadas en refrigeración (4 °C).
El “efluente” fue el subproducto de la vinaza tratada en digestión anaeróbica con un
reactor UASB modificado.
2.3. Microorganismos a evaluar
En el presente trabajo fueron evaluadas las cepas Trametes hirsuta Bm-2, Trametes hirsuta
AHB-6, Phanerochaete crhysosporium Bm-4, Cochliobollus lunnatus y AHB-1 (registradas
en el NCBI bajo las claves GQ280373.1, GQ280372.1, GQ280374.1 y GQ280375,
respectivamente) y cepas de Athelia rolfsii, AT5, AT13 y AT17 proporcionadas por el
laboratorio GeMBio del Centro de Investigación Científica de Yucatán.
2.4. Propagación de las cepas
Las cepas fueron propagadas por medio de subcultivos en medio sólido. De cada cepa se
tomó un disco, de 1 cm de diámetro, del crecimiento micelial de una placa madre con medio
sólido EMA (Extracto de malta 2% DIBICO y agar 2% MCD LAB) y se depositó en el centro
de una nueva placa de EMA, y se incubó a 35 °C en obscuridad durante 5 días.
2.5. Determinación de actividad enzimática en placa
La producción de la enzima lacasa, se analizó con un método de detección basado en la
oxidación del sustrato ABTS (2,2’-ácido azino bis-3-etilbenzotiazolina 6-sulfónico, SIGMA-
ALDRICH).
En una placa de EMA, que contenía 5 mM de ABTS, se inoculó un disco de crecimiento
micelial de 0.8 cm de diámetro, proveniente de un cultivo madre en medio EMA, y se incubó
en oscuridad a 35 °C durante cuatro días. La producción de la lacasa se observó al
formarse un halo verde-azul oscuro, alrededor del crecimiento micelial, correspondiente a
la oxidación del sustrato ABTS por la enzima. La medición del diámetro del halo, con
respecto a los días, se usó como indicador de la producción de la enzima [55].
2.6. Crecimiento en placa con vinaza y efluente
La evaluación del crecimiento en vinaza se realizó a dos concentraciones 5 y 25% (v/v) en
medio de cultivo sólido YMPGA (por sus siglas en inglés, Dextrosa 1% FERMONT, Extracto
de Malta 1% DIBICO, Peptona 0.2% BD-DIOXON, Extracto de Levadura 0.2%, KH2PO4
0.2%, MgSO4 7H2O 0.1%, Tiamina 0.01% SIGMA-ALDRICH y agar 2% MCD LAB). El
medio YMPGA fue preparado, esterilizado en autoclave a 121 °C, 0.15 MPa durante 20
min y ya tibio se le añadió la vinaza, una vez homogenizado se dosificó en cajas Petri de
100 x 15 mm (20 ml c/u).
La evaluación del crecimiento en dos concentraciones 5 y 25% (v/v) de Efluentes con
YMPGA, a diferencia de las vinazas, el efluente se añadió previo al esterilizado. En el
centro de cada placa, se inoculó un disco de 1 cm de diámetro, de un cultivo en medio EMA
de 5 días de crecimiento a 35 °C y oscuridad, de cada uno de los hongos bajo estudio, esto
se realizó por triplicado para cada cepa y se incubó a 35 °C durante 7 días en oscuridad.
2.7. Preparación del inóculo
Se crecieron cada uno de los hongos, durante 7 días en medio de EMA (Extracto de Malta
2% y Agar 2%) y adicionado con 2% (p/v) de salvado de trigo, incubados a 35 °C en
oscuridad, a partir de estos cultivos puros, se obtuvieron 10 discos de 1 cm de diámetro
que se transfirieron, bajo condiciones asépticas, a matraces Erlenmeyer de 250 ml que
contenían 100 ml de medio estéril de YMPG con 2% (p/v) de salvado de trigo. El inóculo
se incubó durante 3 días a 35 °C y 150 rpm. Finalmente los pellets de la biomasa se
rompieron y homogenizaron, con un homogenizador marca HSIANGTAI MACHINERY
(Modelo HG-300D), dejando una suspensión celular, para su posterior utilización en los
tratamientos.
2.8. Tratamientos de Vinaza
Los tratamientos se llevaron a cabo en matraces de Erlenmeyer de 250 ml, con un volumen
de 100 ml de una dilución acuosa de vinaza al 5, 10, 15, 20 y 25% (v/v). Para ello, el pH se
ajustó a 4.5 y se esterilizó por autoclave a 121 °C durante 20 min. Bajo condiciones
estériles, se añadió el volumen requerido de vinaza (pH 4.5) para ajustar los porcentajes
requeridos. A cada matraz se añadieron 2 ml del inóculo del hongo, y se incubó a 28 ± 2
°C a 130 rpm, en un agitador orbital New Brunswick (EUA) durante 196 h. Las evaluaciones
se relaizaron cada 48 h; el bioensayo se realizó por triplicado.
2.9. Tratamientos de Efluentes
Los tratamientos de los efluentes se realizaron siguiendo la misma metodología descrita
anteriormente (inciso 2.7) para las vinazas, con la diferencia de que las diluciones acuosas
con efluentes fueron ajustadas a un pH de 5.5 previo a la esterilización. La inoculación de
los matraces así como su incubación y evaluación se realizó de la forma ya descrita.
2.10. Determinación de remoción de color
El porcentaje de decoloración se determinó centrifugando 1 ml de muestra a 12 000 rpm
durante 10 minutos, y se leyó la absorbancia del sobrenadante (en dilución 10-1 con agua
destilada) en espectrofotómetro (Barnstead International, Modelo Classic C10, EUA) a una
longitud de onda de 475 nm. Los resultados de la decoloración se expresaron en porcentaje
con respecto a los controles de acuerdo a la siguiente ecuación:
% 𝐷𝑒𝑐𝑜𝑙𝑜𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝑖 − 𝐴𝑓
𝐴𝑖𝑥100
Donde, Ai: Absorbancia inicial y Af es absorbancia final [2].
Se utilizó agua destilada como blanco y como control positivo se usaron muestras
de las diluciones de vinaza sin tratar.
2.11. Determinación de fenoles
La cuantificación de compuestos fenólicos se realizó de acuerdo al método colorimétrico
de Folin Ciocalteu. La reacción se realizó en 50 µl de muestra, a la que se añadieron 750
µl de agua destilada y 50 µl de reactivo Folin Ciolcateau (10% v/v) [13]. Se mezcló
suavemente y se dejó reposar durante 5min a temperatura ambiente (28 ± 2°C). En seguida
se adicionaron 150 µl de Na2CO3 al 7.5% y se incubó a 40 °C y oscuridad por 30 min.
Finalmente se hicieron las lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 765 nm. Los
resultados obtenidos se analizaron por medio de una curva estándar de calibración, con
ácido gálico, y se expresaron en mg de ácido gálico/ml de muestra.
2.12. Actividad Lacasa
La actividad lacasa se midió por oxidación de ABTS (2,2’-ácido azino bis-3-
etilbenzotiazolina 6-sulfónico, SIGMA-ALDRICH). La reacción se llevó a cabo mezclando
100 μl de buffer de acetato (pH 5, 1M), 100 μl de ABTS (5 mM), 100 μl agua desionizada y
100 μl de muestra, El medio de reacción se incubó a 40º C durante 20 min. Después del
tiempo de incubación, la muestra adquiere una coloración con tonalidades verde-azul
correspondiente a la oxidación de ABTS, la cual se determinó leyendo en un
espectrofotómetro Barnstead International a 420nm (E=36,000 M-1 cm-1). Una unidad de
actividad se definió como 1 μmol de producto formado por min [55].
2.13. Determinación de DQO (Demanda Química de Oxígeno)
Las muestras de los tratamientos con mejor desempeño en decoloración y remoción de
fenoles fueron analizadas para determinar la DQO. Se determinó en un colorímetro con el
Kit Hig Range Plus (Hach DR-890/8000), en el que se hicieron reaccionar 200 µl de muestra
(1:9 con agua destilada) en un tiempo de incubación de 120 min a 150 °C.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Actividad enzimática en placa
Todas las cepas evaluadas presentaron actividad lacasa, como se puede ver en la Figura
7, a las 96 h las cepas de T. hirsuta (Bm-2 y AHB-6) presentaron un halo verde oscuro
alrededor del crecimiento micelial con diámetros de 6.5 y 4.6 cm, respectivamente y C.
lunnatus AHB-1 con un diámetro de 3.8 cm, lo que indica que la actividad enzimática de
estas cepas es extracelular. Esto coincide con lo reportado por Tapia-Tussell et al, [49].
Mientras que las cepas de A. rolfsii AT5, AT13 y AT17, presentaron un menor halo de
actividad lacasa extracelular. Se ha reportado que los hongos fitopatógenos producen
lacasas con el propósito de degradar la pared celular, así como los componentes tóxicos
generados por las plantas como respuesta a la infección del patógeno. Debido a esto se
explicaría que las cepas de S. rolfsii presentaron un pequeño halo de oxidación, debido a
que la actividad enzimática está asociada a la pared celular [65, 66]. Por su parte, la cepa
de P. chrysosporium Bm-4 no mostró ningún halo que indicara la excreción de la lacasa al
medio, pero si se pudo notar que después de 48 h de crecimiento mostró un cambio de
color debido a la oxidación del ABTS, esto nos confirma que este hongo tiene actividad de
lacasa asociada a la pared celular [67].
Figura 7. Actividad lacasa en placa de los hongos de T. hirsuta (Bm-2 y AHB-6), P. chrysosporium
(Bm-4), A. rolfsii (AT5, AT13 y AT17) y Cochliobollus lunnatus (AHB-1).
3.2. Crecimiento en placa con vinaza a concentraciones de 5 y 25% (v/v)
Como se puede ver en la Figura 8, todas las cepas evaluadas crecieron a concentraciones
de 5 y 25% (v/v) de vinazas, a diferencia de lo reportado por Santos et al., que plantean
que a concentraciones superiores al 1%, las vinazas provenientes de la producción de vino
inhiben el crecimiento de hongos fitopatógenos [30].
Figura 8. Crecimiento de los hongos de T. hirsuta (Bm-2 y AHB-6), P. chrysosporium (Bm-4), A.
rolfsii (AT5, AT13 y AT17) y C. lunnatus (AHB-1) en placa con 5 y 25% (v/v) de vinaza
Algunos autores señalan que la actividad antimicrobiana de las vinazas incrementa con el
aumento de la concentración de este residuo [1, 30], sin embargo, en este trabajo se
observó que las cepas no fueron inhibidas a la concentración del 25% (v/v) de Vinaza, por
lo que se seleccionó ésta concentración como la máxima para los tratamientos.
3.3. Tratamiento de Vinazas.
Como se aprecia en la Figura 9 todas las cepas tuvieron la capacidad de decolorar a las
vinazas, destacando S. rolfsii AT17, AT13 y Bm-2 con valores de decoloración de 61.81,
61.69 y 53% respectivamente (Figura 9a).
Figura 9. Tratamiento 5% (v/v) de Vinaza a las 192h de incubación (a) Porcentaje de decoloración
(ANOVA de medias, p<0.05); (b) decoloración de vinazas.
Aunque el mayor valor de decoloración para este tratamiento se obtuvo con la especie S.
rolfsii, la mayor degradación de fenoles totales (84.83%) se alcanzó con la cepa Bm-2 de
T. hirsuta (Figura 10a). De igual manera, en la Figura 10b se observa que a las 96 h, Bm-
2 produjo una mayor actividad lacasa (1056.5 U/ml), que a las 144 h disminuyó y se
mantuvo cerca de 200 U/ml.
Figura 10. Tratamiento 5% (v/v) de Vinaza a las 192h de incubación (a) Remoción de fenoles a
las 192h (ANOVA de medias, p<0.05); (b) Cinética de actividad lacasa.
En la dilución del 10% (v/v) de vinaza, Bm-2 presentó el mayor porcentaje de decoloración
(69.4%), mientras que AT13, AT17 y Bm-4 decoloraron el 53.5, 46.7 y 45.9% de las vinazas
respectivamente (Figura 11a). Igualmente la cepa Bm-2 removió el 79.2% de fenoles,
seguida de AHB-6, Bm-4 y AHB-1 que provocaron una remoción de fenoles de 59.1, 57.5
y 54.9 respectivamente. De igual manera que en la concentración de 5% (v/v) las cepas de
A. rolfsii AT13 y AT17, tuvieron un buen desempeño en la decoloración, no así en la
remoción de fenoles. Como se puede apreciar en la Figura 11, los basidiomicetos de la
podredumbre blanca tuvieron un mejor comportamiento en la remoción de fenoles que los
hongos fitopatógenos evaluados, esto puede estar dado porque los primeros liberan las
enzimas extracelularmente [54].
Figura 11. Tratamiento de vinaza al 10% (v/v) (a) Porcentaje de decoloración y (b) remoción de
fenoles con hongos en). ANOVA de medias, p<0.05.
Los valores de DQO del tratamiento con Bm-2 fueron de 30.3 g/L (carga inicial) y 10.3 g/L
(carga final), obteniendo un porcentaje de remoción de DQO del 69.7%. Estos valores
están en el rango de los reportados por Sun et al, quienes alcanzaron una remoción de
62.85% en vinaza de melaza de caña usando Coriolus hirsuta (T. hirsuta) [68].
En la Figura 12a, se muestran los niveles de la actividad lacasa para este tratamiento, Bm-
2 fue la única cepa en incrementar su actividad lacasa con respecto al tiempo, alcanzando
hasta 2534.7 U/ml a las 144 h, valores que se encuentran por encima de los reportados
por Sun et al., [68], de 2198 U/L con C. hirsuta. Estos resultados se confirman que la alta
decoloración mostrada por esta cepa en la Figura 12b, difirió significativamente de los
valores obtenidos con el resto de los hongos estudiados.
Figura 12. Tratamiento de vinaza a 10% (v/v) a las 192 h de incubación (a) Cinética de actividad
lacasa; (b) Decoloración de vinaza.
Este comportamiento puede ser explicado por lo planteado por Gonzales et al, que
indicaron que las melanoidinas, contenidas en las vinazas funcionan como inductoras en
la expresión de genes de lacasas en Trametes sp. y demostraron que existe una
correlación entre la actividad enzimática y la decoloración de este efluente [69].
La coloración de las vinazas está asociada directamente a las melanoidinas, por ser los
compuestos cromóforos más abundantes en ellas [1], de manera que la decoloración está
vinculada directamente a la degradación de estos compuestos, que se determinan con la
absorbancia a la longitud de onda de los mismos (475 nm). Aunque A. rolfsii no ha sido
usado, hasta el momento, en tratamientos de vinazas, sí se ha probado en residuos sólidos
urbanos, debido a su capacidad de producir enzimas como: endoglucanasa, exoglucanasa,
β-glusidasa, celobiosa deshidrogenasa [61] y lacasas. Campos y Cavaco-Paulo, al evaluar
la capacidad de las lacasas provenientes de cepas de S. rolfsii (Teleomorfo: A. rolfsii) en
la decoloración del colorante índigo, obtuvieron cerca del 80% de decoloración, en un lapso
de 24 h [63], lo que sugiere que el uso de las lacasas provenientes de A. rolfsii, sería una
buena alternativa para el tratamiento de efluentes coloreados [62].
La importancia de la remoción de los compuestos fenólicos se debe a que ocupan el
segundo lugar de los principales componentes cromóforos de la vinaza [1]. La cepa Bm-2
removió un mayor porcentaje de estos compuestos, en comparación con las demás cepas
evaluadas y se puede relacionar con su alta actividad lacasa, que es evidencia de su
participación en la decoloración de la vinaza (remoción de melanoidinas y fenoles) [70].
Los hongos ligninolíticos degradan un amplio rango de sustratos, entre los que se
encuentran los fenoles y polifenoles, similares a los presentes en vinaza, gracias al
complejo enzimático extracelular que producen [68].
En el tratamiento de vinazas a 15% (v/v) todas las cepas decoloraron menos del 50%, no
obstante, las cepas P. chrysosporium Bm-4 y T. hirsuta Bm-2 tuvieron los mejores
resultados en decoloración, con una remoción del color del 46.1 y 45% respectivamente,
como se observa en la Figura 13a y con respecto a la remoción de fenoles AHB-6 y Bm-2
presentaron los mejores resultados con 55.4% y 53.3% respectivamente (Figura 13b).
Figura 13. Tratamiento con vinaza al 15% (v/v) (a) Porcentaje de decoloración y (b) remoción de
fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA de medias, p<0.05.
Es importante señalar que el comportamiento de las cepas de A. rolfsii, mostró la misma
tendencia observada previamente en relación al porcentaje de decoloración y la remoción
de fenoles.
La cepa Bm-2 mantuvo una correlación directa entre la decoloración, remoción de fenoles
y la actividad lacasa, como se puede observar en las Figuras 14, alcanzando los máximos
valores de actividad lacasa (1777.7 U/ml) a las 192 h. No obstante los porcentajes de
decoloración y actividad enzimática fueron inferiores al tratamiento de 10 % (v/v) esto
puede asociarse a que mayores concentraciones de vinazas, aumenta el efecto tóxico de
sus componentes sobre los microorganismos [68].
Figura 14. Tratamiento de vinaza a 15% (v/v) a las 192 h de incubación (a) Cinética de actividad lacasa; (b) Decoloración.
Para este caso, la determinación de DQO arrojó los valores de 36,600 mg/L antes del
tratamiento y 16,600 mg/L después tratada, con un porcentaje de remoción de DQO del
54.6%; los cuales se encuentran en el rango de lo reportado por Potentini y Rodriguez-
Malaver, usando P. chrysosporium, que alcanzaron una remoción de DQO del 54.1% en
vinaza de melaza de caña, con una carga orgánica ajustada a 40,000 mg/L, además estos
autores reportaron una remoción de fenoles entre 54-59% que la asocian a la capacidad
oxidativa e inespecífica que tienen los hongos modificadores de lignina [2]. Estos
resultados son similares a los encontrados en este estudio con los tratamientos de las
diluciones del 10 y 15% (v/v) de vinaza con Bm-2.
Jiménez et al [71], reportaron que Penicillium decumbens decoloró el 41% de vinaza de
melaza, con una carga orgánica (DQO) ajustada a 42 g/L. Sin embargo, estos autores
observaron un incremento de biomasa, el cual asociaron con la decoloración y eliminación
de compuestos fenólicos, mediante la adsorción de estos compuestos por las células del
hongo, lo que no ocurre en el caso de Bm-2 ya que no se observó un incremento
significativo de biomasa con respecto a las demás cepas evaluadas.
En los tratamientos de vinaza a 20% (v/v) la decoloración máxima alcanzada fue de 34.5%
y el mayor porcentaje de remoción de fenoles fue de 58.4%, Figura 15. Estos resultados
fueron obtenidos en el tratamiento con Bm-2, mientras que las cepas fitopatógenas
evaluadas (AT5, AT13, AT17 y AHB-1) se mantuvieron con el mismo comportamiento
previamente observado en cuanto a la relación porcentaje de decoloración/remoción de
fenoles. Aunque aumentó la concentración de vinazas hasta un 20% los valores de
decoloración para este grupo de hongos se mantuvieron alrededor del 30%. Sin embargo,
su capacidad de remoción de fenoles no supera el 20%, esto sugiere un efecto inhibitorio
a ciertas concentraciones de fenoles sobre estas cepas en cuestión.
Figura 15. Tratamiento de vinaza al 20% (v/v) a las 192 h de incubación (a) Porcentaje de
decoloración y (b) remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA de medias,
p<0.05.
La cepa que Bm-2 mantuvo la actividad lacasa a niveles elevados (1350 U/ml) (Figura 16a),
a pesar del aumento en la concentración de vinazas, de igual manera fue la única cepa
que logró decolorar de una manera conspicua el agua residual (Figura 16b).
Figura 16. Tratamiento de vinaza al 20% (v/v) a las 192 h de incubación (a) Cinética de actividad
lacasa; (b) Decoloración.
De manera general la cepa Bm-2 mostró un patrón en cuanto a la dinámica de producción
de la enzima, ya que para todos los tratamientos su actividad lacasa se disparó a partir de
las 96 horas, alcanzando los máximos valores de actividad entre las 144 y 192 horas
Todos estos resultados apuntan a que la cepa de T. hirsuta Bm-2 tiene un alto potencial
para su escalamiento en el tratamiento de vinazas procedentes de melazas de caña de
azúcar. Arimi et al [1], señalaron como los principales compuestos polifenólicos presentes
en vinazas de melazas, al ácido ferúlico, ácido cumárico, ácido p-cumárico, vanillina y ácido
cafeíco, que son compuestos tóxicos y recalcitrantes a la hora de su degradación. En un
trabajo reciente se demostró que el ácido ferúlico, el guaiacol y la vanillina son inductores
de los genes de la lacasas en T. hirsuta Bm-2, [72].
3.4. Crecimiento en placa con efluentes a concentraciones de 5 y 25% (v/v).
En la Figura 17, se muestra el crecimiento de las cepas en presencia del efluente a
concentraciones de 5 y 25% en medio EMA. Se puede observar que los hongos de la
podredumbre blanca T. hirsuta Bm-2 y P. chrysosporium Bm-4 fueron los únicos que
crecieron en ambas concentraciones. Por lo anterior, fueron seleccionadas las cepas Bm-
2 y AHB-6 pertenecientes a la especie T. hirsuta, y Bm-4 (Phanerochaete crhysosporium)
para el tratamiento de las diluciones acuosas de los efluentes.
La inhibición del crecimiento del resto de las cepas, se debe a las altas concentraciones de
fenoles presentes en los efluentes.
Figura 17. Crecimiento de los hongos T. hirsuta (Bm-2 y AHB-6), P. chrysosporium (Bm-4), A.
rolfsii (AT5, AT13 y AT17) y C. lunnatus (AHB-1) en medios con efluentes al 5 y 20% (v/v) al
séptimo día de incubación.
3.5. Tratamiento de efluentes
En la Figura 18 se observa el comportamiento de los tres hongos seleccionados, siendo
Bm-2 (87.69%) y Bm-4 (83.07%) los que alcanzaron un mayor porcentaje de decoloración
(Fig. 18a). De igual manera, el porcentaje de remoción de fenoles fu significativamente
diferente entre las tres cepas, destacando Bm-2 con un 76.17% (Figura 18b).
Figura 18. Tratamiento de efluente al 5% (v/v) a las 192 h de incubación, (a) Porcentaje de
decoloración y (b) Remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA de
medias, p<0.05; (c) Cinética de actividad lacasa; (d) Muestras sin tratar y muestras tratadas.
En la Figura 18c, a partir de las 48 horas comenzó a incrementarse la actividad de la
lacasa, alcanzando su máximo valor a las 96 horas (1391.6 U/ml), luego decreció y
nuevamente se volvió a incrementar.
A la concentración de 10% (v/v) de efluentes se alcanzó una decoloración del 84.4, 66.4 y
41.53% con las cepas Bm-2, Bm-4 y AHB-6 respectivamente (Figura 19a). En la remoción
de fenoles, Bm-2 alcanzó un 75.3%, mientras Bm-4 y AHB-6 estuvieron muy por debajo
(Figura 19b).
Figura 19. Tratamiento de efluente al 10% (v/v) a las 192 h de incubación, (a) Porcentaje de
decoloración y (b) Remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA de
medias, p<0.05; (c) Cinética de actividad lacasa; (d) Muestras sin tratar y muestras tratadas.
En la Figura 19c se observa que la actividad lacasa en Bm-2 comienza a incrementarse a
partri de las 48 alcanzando su máximo a las 96 h (3475.0 U/ml), cantidad mayor a la
obtenida en la dilución del 5% (v/v) de efluentes. La enzima utilizó los sustratos que se
encontraban más accesibles, posiblemente fenoles, ya que éstos quedan libres durante el
proceso de digestión anaeróbica [73], y funcionan como inductores y/o mediadores de la
enzima, para poder desdoblar los sustratos más complejos. La disminución de la actividad
decreció debido a la limitación de los sustratos [74]. Las cepas AHB-6 y Bm-4 mostraron
actividad lacasa inferior a 300 U/ml. En la Figura 19d se observa un cambio evidente en el
color de la dilución, a 10% (v/v) del efluente, pasando de color marrón a amarillo claro en
el tratamiento con Bm-2.
En el tratamiento de efluentes al 15% (v/v), la cepa T. hirsuta Bm-2 presentó el mejor
rendimiento, con una decoloración del 75.76%, mientras que las otras cepas decoloraron
poco más del 40% como se observa en la Figura 20a. Bm-2 provocó una remoción de
fenoles del 69.34%, AHB-6 de 27% y Bm-4 apenas del 12.95% (Figura 20b).
Figura 20. Tratamiento de efluente al 15% (v/v) a las 192 h de incubación, (a) Porcentaje de
decoloración y (b) Remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA de
medias, p<0.05; (c) Cinética de actividad lacasa; (d) Muestras sin tratar y muestras tratadas.
En la Figura 20c, se observa que nuevamente la cepa Bm-2 alcanzó su máxima producción
de lacasas a las 96 h (3663.8 U/ml), como sucedió en los tratamientos anteriores. En la
Figura 20d, se hace evidente que Bm-2 fue la única cepa que logró cambiar el color del
agua residual tratada.
Figura 21. Tratamiento de efluente al 20% (v/v) a las 192 h de incubación, (a) Porcentaje de
decoloración y (b) Remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA de
medias, p<0.05; (c) Cinética de actividad lacasa; (d) Muestras sin tratar y muestras tratadas.
A la concentración de 20% de efluente, se obtuvo una decoloración del 66.7%, con la cepa
Bm-2, mientras que Bm-4 y AHB-6 decoloraron el 42.9 y 41.7% respectivamente (Figura
21a). Así mismo, se observa en la Figura 21b que Bm-2 removió el 66.84% de los fenoles
totales, mientras que AHB-6 y Bm-4 alcanzaron un 30.1 y 18.7% respectivamente. Se pudo
constatar que la eficiencia de los hongos disminuye gradualmente con respecto al
incremento de la concentración del efluente, debido al aumento de la concentración de
compuestos recalcitrantes [75]
En la actividad lacasa el comportamiento de Bm-2 se mantuvo similar a los anteriores
tratamientos, alcanzándose el máximo nivel de esta enzima a las 96 horas con 3411.1 U/ml
(Figura 21c). La determinación de DQO en la dilución de 20% (v/v) de efluente en la carga
inicial tuvo un valor de 25,600 mg/L y con el tratamiento con Bm-2 alcanzó una remoción
del 76.9%, obteniendo una carga orgánica final de 5,900 mg/L.
En la concentración máxima probada de efluente (25% v/v), únicamente Bm-2 tuvo un
comportamiento relevante tanto en decoloración (68.8%), como de remoción de fenoles
(65.58%) (Figura 22).
Figura 22. Tratamiento de efluente al 25% (v/v) a las 192 h de incubación, (a) Porcentaje de
decoloración y (b) Remoción de fenoles. Los resultados fueron analizados con ANOVA de
medias, p<0.05; (c) Cinética de actividad lacasa; (d) Muestras sin tratar y muestras tratadas.
En la Figura 22c se observa que la cepa Bm-2 mantuvo la consistencia en cuanto a la
producción de lacasa (3415.97 U/ml a las 144 h) lo que provocó que la degradación de los
compuestos de color fuera eficiente (Figura 22d). Los valores iniciales de la DQO fueron
de 27,400 mg/L y con el tratamiento con Bm-2 se alcanzó una remoción del 84.7%,
obteniendo una carga orgánica final de 4,200 mg/L, que se encuentra en el rango
establecido por la Norma Oficial Mexicana NOM-001-ECOL-1996 [26].
Es importante destacar que a pesar de que Bm-2 y AHB-6 son cepas de la misma especie
tuvieron un comportamiento muy diferente en la decoloración de estos efluentes lo cual
puede estar dado por que fueron aisladas de diferentes fuentes y como las lacasas son
inducidas por familias de multigenes, pueden estar produciéndose diferentes tipos de
lacasas en cada cepa [8, 76].
Los resultados de decoloración y remoción de fenoles obtenidos con Bm-2 para todos los
tratamientos, son producto de la actividad lacasa; ya que en los efluentes del tratamiento
de las vinazas por digestión anaeróbica aún se encuentran persistentes los componentes
que aportan color a la vinaza (fenoles y melanoidinas) [77, 78], los cuales son sustratos
para las lacasas [46, 69].
Debido a la poca información y escasos estudios relacionados con el tratamiento de los
efluentes provenientes de la digestión anaeróbica de vinazas de melaza de caña, los
resultados obtenidos en este trabajo son relevantes, ya que demuestran la capacidad de
la cepa de T. hirsuta (Bm-2) para decolorar y degradar los compuestos tóxicos presentes
en las vinazas, alcanzando valores promedios de 75% de decoloración y 65% de remoción
de fenoles, a las diferentes concentraciones utilizadas. Esta capacidad de Bm.2 está
estrechamente relacionada con la actividad enzimática de las lacasas, ya que siempre se
mantuvo un promedio de 3000 U/ml de dicha enzima. Esto confirma resultados previos de
González et al. [5] para el género Trametes.
CONCLUSIONES
1. Todas las cepas evaluadas: T. hirsuta (Bm-2 y AHB-6), P. chrysosporium (Bm-4),
A. rolfsii (AT5, AT13 y AT17) y C. lunnatus (AHB-1) tienen la capacidad de degradar
y remover compuestos fenólicos presentes en las vinazas de melaza de caña de
azúcar.
2. En el tratamiento de 10% (v/v) de vinazas con Bm-2 fue donde se encontró la más
alta actividad enzimática (2543.7 U/ml) y se obtuvo un 69.2% de decoloración con
una remoción del 78.2% de fenoles.
3. La decoloración de las vinazas fue concomitante con el incremento de la actividad
de las lacasas.
4. La cepa Bm-2 fue la más eficiente en el tratamiento de los efluentes de la digestión
anaerobia de las vinazas en cuanto a la decoloración y remoción de fenoles,
alanzando promedios superiores a 75% y 65% respectivamente.
5. Los valores obtenidos de la DQO (4200 mg/L) en el tratamiento de efluentes de la
digestión anaerobia de las vinazas, se aproxima a lo permitido por la Norma Oficial
Mexicana NOM-001-ECOL-1994
6. Este estudio muestra el gran potencial en la degradación de las vinazas que tiene
la cepa Bm-2 de T. hirsuta
PERSPECTIVAS
1. Escalar a nivel de bioreactor la cepa T. hirsuta Bm-2 tanto para el tratamiento de
las vinazas de melaza de caña de azúcar como para los efluentes de la digestión
anaerobia de la misma
2. Probar mayores porcentajes de concentración de efluentes y tiempo de remoción
en los tratamientos con T. hirsuta Bm-2.
3. Evaluar la utilización de la vinaza de melaza de caña como sustrato para la
producción de la enzima lacasa.
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