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Caracterización de la respuesta fisiológica de cinco cultivares de fríjol arbustivo

(Phaseolus vulgaris L.) bajo condiciones de estrés por déficit hídrico.

ALEFSI DAVID SANCHEZ REINOSO

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agronomía

Bogotá D.C., Colombia

2016



ALEFSI DAVID SANCHEZ REINOSO

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de: Magister en Ciencias Agrarias – Línea Fisiología de Cultivos

Director:

Profesor Hermann Restrepo Díaz

Codirector:

Profesor. Gustavo Adolfo Ligarreto Moreno

Línea de Investigación:

Fisiología de Cultivos

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agronomía

Bogotá D.C., Colombia

2016

Dedicatoria

A Dios por darme la salud, perseverancia e

inteligencia para lograr todas mis metas. A mis padres

Fanny Reinoso Mosquera y José Crispín Sánchez

Rincón, por todo su apoyo incondicional en cada

decisión que he tomado. A mis hermanos y amigos

que me acompañaron en cada una de las etapas de

mi vida.

Agradecimientos

Quiero agradecer sinceramente a todas aquellas personas que compartieron

conmigo diferentes experiencias y conocimientos en el desarrollo de esta tesis. A

la Universidad Nacional de Colombia, mi alma máter. A los profesores Hermann

Restrepo, Gustavo Ligarreto y Augusto Ramírez por su apoyo y consejos durante

mi trabajo en la maestría. A mis compañeros Nixon Flórez Velasco y Cristian

Camilo Chávez Arias por su apoyo en los diferentes muestreos realizados en las

etapas del desarrollo de la tesis. A los laboratoristas Rafael Cruz y Wadith de León

Camelo por su generoso apoyo y asesorías prestadas en múltiples protocolos. Al

programa de Jóvenes Investigadores de Colciencias y al programa Estímulos

Thomas Van der Hammen del Jardín Botánico José Celestino Mutis, por la

financiación de gran parte del proyecto. A la beca exención de derechos

académicos de la Facultad de Ciencias Agrarias.

Resumen y Abstract IX

Resumen

La disponibilidad del recurso hídrico es uno de los principales factores ambientales

que determina el potencial desarrollo y rendimiento de una especie cultivada. En

los últimos años las precipitaciones han variado su frecuencia y volumen, donde

Colombia no ha sido la excepción incrementando las áreas expuestas a sequías.

Este aumento de la temperatura perjudica el crecimiento, desarrollo y producción

de los cultivos, dentro de ellos el fríjol. Esta especie es una de las principales

fuentes de proteína y minerales en la dieta humana, por lo que cualquier reducción

en el rendimiento afecta la seguridad alimentaria del mundo. En el presente estudio

se caracterizó la respuesta de cinco cultivares de fríjol arbustivo a estrés por déficit

hídrico de 15 días en estado de formación de la tercera hoja verdadera y durante

la apertura de las flores (30% – 40%). Para esto se evaluaron variables como

fotosíntesis, parámetros relacionados con estrés oxidativo, y algunos parámetros

de rendimiento. Los resultados indicaron que: i) el déficit hídrico afecta los procesos

fisiológicos (en estado vegetativo) desde los 10 días después de tratamiento e

exposición y que estos varían con el tiempo ii) el déficit hídrico disminuye la

acumulación de materia seca en los diferentes órganos debido a una menor

asimilación de CO2; iii) el déficit hídrico reduce los diferentes parámetros de

rendimiento en todos los cultivares evaluados, pero el más afectado fue Bacatá en

la etapa vegetativa y reproductiva; iv) Los índices de tolerancia y/o susceptibilidad

al estrés permitieron categorizar los diferentes cultivares; v) Se sugieren las

siguientes variables como posibles marcadores de estrés déficit hídrico en fríjol

arbustivo: asimilación de CO2, conductancia estomática, uso eficiente del agua

acumulación de masa en la raíz, MDA y contenido de prolina, índices de tolerancia

y/o susceptibilidad al estrés por déficit hídrico.

Palabras clave: limitación estomática, estrés oxidativo, peroxidación lipídica, déficit

hídrico, tolerancia al estrés.

X Caracterización de la respuesta fisiológica de cinco cultivares de fríjol arbustivo


Abstract

Water deficit is one of the main environmental factors that determines the potential

development and performance in crops. In recent years the rains have changed their

frequency and volume, where Colombia has been no exception increasing drought prone

areas. This temperature increase impairs growth, development and production of crops,

beans within them. This specie is one of the main source of proteins and minerals in the

human diet, so some reduction in yield affects food security in the world. In the present

study the response five cultivars of bush beans stress was characterized by water deficit

of 15 days in the third true leaf formation and during the opening of flowers (30% - 40%).

For this reason, variables like photosynthesis, parameters related to oxidative stress, and

some performance parameters were evaluated. The results indicated that: i) water deficit

affects physiological processes (vegetative state) from the 10 days of exposure and these

change over time ii) water deficit decreases dry matter accumulation due to a lower

assimilation CO2; iii) water deficit reduces different performance parameters in all cultivars

evaluated, but Bacatá was the most affected in the vegetative and reproductive stage; iv)

tolerance and / or susceptibility index to stress allowed categorize the different cultivars; v)

the following variables as potential markers of water deficit stress in bush beans are

suggested: CO2 assimilation, stomatal conductance, water use efficiency, mass

accumulation in the root, MDA and proline content, indexes of tolerance and / or

susceptibility to stress water deficit.

Keywords: stomatal limitation, oxidative stress, lipid peroxidation, water deficit,

stress tolerance.

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen IX

Lista de figuras ............................................................................................................. XV

Lista de tablas ........................................................................................................... XVIII

Lista de Símbolos y abreviaturas ................................................................................ XX

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Capítulo 1. Marco Teórico .......................................................................................... 5

1.1 El estrés por déficit hídrico y condiciones que lo generan. ............................... 5

1.2 La importancia del agua en las plantas. ........................................................... 5

1.3 Efectos a nivel fisiológico del déficit hídrico en plantas .................................... 6

1.4 Las respuestas de las plantas a condiciones de déficit hídrico ........................ 8

1.5 Fenología y el efecto del déficit hídrico sobre la fenología del fríjol (P. vulgaris

L.) 9

1.6 Antecedentes en el cultivo de fríjol en condiciones de déficit hídrico. ............ 12

1.7 La utilidad de los Índices de Tolerancia en la caracterización de genotipos de

plantas cultivadas. .................................................................................................... 14

2. Capítulo. Identificación del periodo crítico para estrés hídrico sobre variables

fisiológicas de un cultivar de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.). ..................... 16

2.1 Resumen ....................................................................................................... 16

2.2 Introducción ................................................................................................... 17

2.3 Materiales y métodos ..................................................................................... 19

2.3.1 Material vegetal y condiciones de crecimiento .................................... 19

2.3.2 Tratamientos de déficit hídrico y toma de datos en los muestreos....... 20

2.3.3 Diseño experimental y análisis de los datos ........................................ 21

XII Caracterización de la respuesta fisiológica de cinco cultivares de fríjol arbustivo

(Phaseolus vulgaris L.) bajo condiciones de estrés por déficit hídrico

2.3.4 Variables fisiológicas .......................................................................... 21

2.3.5 Variables bioquímicas ......................................................................... 23

2.4 Resultados .................................................................................................... 24

2.4.1 Intercambio gaseoso y relaciones hídricas. ........................................ 24

2.4.2 Parámetros de fluorescencia del fotosistema II, contenido de clorofilas

y carotenoides totales ....................................................................................... 29

2.4.3 Daño de la membrana por estrés oxidativo y la producción de

osmolitos. ......................................................................................................... 31

2.5 Discusión ....................................................................................................... 34

2.6 Conclusiones ................................................................................................. 36

3. Capítulo 3. Evaluación fisiológica y bioquímica de cinco cultivares de fríjol

arbustivo (Phaseolus vulgaris L.) bajo condición de estrés por déficit hídrico. ...... 37

3.1 Resumen ....................................................................................................... 37

3.2 Introducción ................................................................................................... 38

3.3 Materiales y métodos .................................................................................... 41


3.3.2 Tratamiento de déficit hídrico y determinación de las variables .......... 42


3.3.4 Variables fisiológicas .......................................................................... 43


3.4 Resultados .................................................................................................... 46

3.4.1 Relaciones hídricas e intercambio gaseoso de la hoja ........................ 46

3.4.2 Acumulación de materia seca y relación parte aérea/raíz ................... 53

3.4.3 Daño de la membrana por estrés oxidativo y la producción de

osmolitos. ......................................................................................................... 56

3.4.4 Índice Relativo de Tolerancia (RTI) ..................................................... 59

3.5 Discusión ....................................................................................................... 60

3.6 Conclusiones ................................................................................................. 62

4. Caracterización de la respuesta fisiológica de cinco cultivares de fríjol arbustivo

(Phaseolus vulgaris L.) a condiciones de estrés por déficit hídrico en dos etapas

fenológicas. ................................................................................................................... 63

4.1 Resumen ....................................................................................................... 63

Contenido XIII

4.2 Introducción ................................................................................................... 64



4.3.2 Tratamiento de déficit hídrico y determinación de las variables ........... 67


4.3.4 Variables fisiológicas ........................................................................... 68


4.4 Resultados ..................................................................................................... 71

4.4.1 Humedad del suelo, Relaciones hídricas e intercambio gaseoso de la

hoja ............................................................................................................ 71

4.4.2 Contenido de clorofilas, carotenoides y parámetros de fluorescencia, 78

4.4.3 Concentración de Malondialdehido y Prolina ....................................... 81

4.5 Conclusiones ................................................................................................. 82

5. Capítulo 5. Evaluación de índices de tolerancia a la sequía para la selección de

cultivares de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.) por inducción de estrés por

déficit hídrico. ................................................................................................................ 83

5.1 Resumen ....................................................................................................... 83

5.2 Introducción ................................................................................................... 84



5.3.2 Tratamiento de déficit hídrico .............................................................. 86


5.3.4 Contenido Relativo de Agua ................................................................ 88

5.3.5 Parámetros de rendimiento ................................................................. 88

5.3.6 Índice de tolerancia y susceptibilidad al estrés por sequía .................. 88

5.4 Resultados y discusión .................................................................................. 92

5.4.1 Humedad del suelo y Contenido Relativo de Agua .............................. 92

5.4.2 Parámetros de rendimiento ................................................................. 94

5.4.3 Comparación de cultivares con base a los índices de

resistencia/tolerancia ......................................................................................... 97

5.4.4 Análisis de correlación ...................................................................... 100

5.5 Conclusiones ............................................................................................... 102

6. Discusión final ........................................................................................................ 103

XIV Caracterización de la respuesta fisiológica de cinco cultivares de fríjol arbustivo


7. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 105

7.1 Conclusiones ............................................................................................... 105

7.2 Recomendaciones ....................................................................................... 106

8. Modelo conceptual ................................................................................................. 108

Bibliografía .................................................................................................................. 111

Contenido XV

Lista de figuras

.................................................................................................................... Pág.

Figura 1-1. Escala fenológica del fríjol (Phaseolus vulgaris L.) descrita por IICA et al.,

(2009). .............................................................................................................................. 9

Figura 1-2. Escala fenológica BBCH del fríjol (Phaseolus vulgaris L.) descrita por Feller et

al., (1995b). .................................................................................................................... 11

Figura 2-1. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre el contenido hídrico

relativo de la hoja (CRA) en plántulas de fríjol arbustivo cultivar ICA-CERINZA. Los puntos

son el promedio de cuatro datos. Las barras representan ± error estándar. Promedios

seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey

(P ≤ 0.05). ...................................................................................................................... 25

Figura 2-2. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre parámetros de

intercambio gaseoso de la hoja en plántulas de fríjol arbustivo cultivar ICA-CERINZA: A).

Fotosíntesis neta (Pn); B). Conductancia estomática (gs) y C). Transpiración (E). Las barras

son el promedio de cuatro datos ± error estándar. Promedios seguidos por la misma letra

no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). .................... 27

Figura 2-3. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre parámetros de

fluorescencia del fotosistema II plántulas de fríjol arbustivo cultivar ICA-CERINZA: A).

Eficiencia máxima del quantum en el fotosistema II (Fv/Fm); B). Quenching fotoquímico

(qP); C). La eficiencia real del fotosistema II (Y(II)) y D). Quenching no fotoquímico (QNP)

en plántulas de fríjol arbustivo. Las barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar.

Promedios seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes según la

prueba de Tukey (P ≤ 0.05). ........................................................................................... 30

Figura 2-4. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre contenido de clorofilas y

carotenoides totales en plántulas de fríjol arbustivo cultivar ICA-CERINZA: A). Contenido

de clorofila total; B). Contenido de clorofila a; C). Contenido de clorofila b y D). Contenido

de carotenoides totales en plántulas de fríjol arbustivo. Las barras son el promedio de

cuatro datos ± error estándar. Promedios seguidos por la misma letra no son

significativamente diferentes según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). ............................... 31

XVI Caracterización de la respuesta fisiológica de cinco cultivares de fríjol arbustivo


Figura 2-5. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre el daño de la membrana

por estrés oxidativo y la producción de osmolitos: A). Fuga de electrolitos; B). Producción

de malondialdehido (MDA) y C). Producción de prolina en plántulas de fríjol arbustivo. Las

barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar. Promedios seguidos por la misma

letra no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). ............ 33

Figura 3-1. Efecto del estrés hídrico sobre el contenido hídrico relativo de la hoja (CRA)

en plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo. Las barras son el promedio de cuatro

datos ± error estándar. .................................................................................................... 50

Figura 3-2. Efecto del estrés hídrico sobre contenido de clorofilas y carotenoides totales

en plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo: A). Fotosíntesis neta (Pn); B).

Conductancia estomática (gs); C). Transpiración (E) es en plántulas de fríjol arbustivo. .

Las barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar. ........................................ 52

Figura 3-3. Efecto del estrés hídrico sobre contenido de clorofilas y carotenoides totales

en plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo: A). Contenido de clorofila total; B).

Contenido de clorofila a; C). Contenido de clorofila b y D). Contenido de carotenoides

totales en plántulas de fríjol arbustivo. . Las barras son el promedio de cuatro datos ± error

estándar. ......................................................................................................................... 56

Figura 3-4. Efecto del estrés hídrico sobre la eficiencia máxima del quantum en el

fotosistema II (Fv/Fm) en plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo: Las barras son el

promedio de cuatro datos ± error estándar. .................................................................... 56

Figura 3-5. Efecto del estrés hídrico sobre el daño de la membrana por estrés oxidativo y

la producción de osmolitos: A). Fuga de electrolitos; B). Producción de malondialdehido

(MDA) y C). Producción de prolina en plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo. Las

barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar. ............................................... 58

Figura 3-6. Efecto del estrés hídrico sobre el índice relativo de tolerancia (RTI) en plántulas

de cinco cultivares de fríjol arbustivo: Las barras son el promedio de cuatro datos ± error

estándar. ......................................................................................................................... 59

Figura 4-1. Efecto del estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes sobre

la humedad del suelo (A) en porcentaje de la capacidad de campo entre los factores de

las diferentes etapas fenológicas y el contenido relativo de agua de la hoja de cinco

cultivares de fríjol arbustivo (B corresponden al muestreo después de finalizar el periodo

de estrés en etapa vegetativa; C corresponden al muestreo después de finalizar el periodo

de estrés en etapa reproductiva. Las barras representan ± error estándar. .................... 72

Contenido XVII


la fotosíntesis (A y B), conductancia estomática (C y D) y limitación estomática (E y F) de

cinco cultivares de fríjol arbustivo (A, C y E corresponden al muestreo después de finalizar

el periodo de estrés en etapa vegetativa; B, D y F corresponden al muestreo después de

finalizar el periodo de estrés en etapa reproductiva. Las barras representan ± error

estándar. ........................................................................................................................ 75


la clorofila total (A y B) y carotenoides totales (C y D) de cinco cultivares de fríjol arbustivo

(A y C corresponden al muestreo después de finalizar el periodo de estrés en etapa

vegetativa; B y D corresponden al muestreo después de finalizar el periodo de estrés en

etapa reproductiva. Las barras representan ± error estándar. ........................................ 79


la producción de malondialdehido (A y B) y producción de prolina (C y D) de cinco cultivares

de fríjol arbustivo (A y C corresponden al muestreo después de finalizar el periodo de estrés

en etapa vegetativa; B y D corresponden al muestreo después de finalizar el periodo de

estrés en etapa reproductiva. Las barras representan ± error estándar. ......................... 82


la humedad del suelo (A) en porcentaje de la capacidad de campo entre los factores de

las diferentes etapas fenológicas y el contenido relativo de agua de la hoja de cinco

cultivares de fríjol arbustivo (B corresponden al muestreo después de finalizar el periodo

de estrés en etapa vegetativa; C corresponden al muestreo después de finalizar el periodo

de estrés en etapa reproductiva. Las barras representan ± error estándar. .................... 93

Figura 5-2. Biplot de Análisis de Componente Principal (PCA) de diferentes variables de

rendimiento en plantas de cinco genotipos de fríjol arbustivo bajo condiciones de estrés en

dos etapas fenológicas diferentes. Gpod: Número de granos por vaina; Pod: Número de

vainas por planta; Pcg: Peso de 100 granos; RtoP: Rendimiento por planta; RtoHa:

Rendimiento por hectárea; GRP: Número de granos por planta. C: Control; E1: Estrés en

etapa Vegetativa; E2: Estrés en etapa Reproductiva; Cz: plantas del cultivar Cerinza; Bch:

plantas del cultivar Bachue; NUA: plantas del cultivar NUA35; Ba: plantas del cultivar

Bacatá y Bl: plantas del cultivar Bianca. ......................................................................... 97

Figura 8-1. Modelo conceptual de las respuestas de las plantas de fríjol arbustivo

(Phaseolus vulgaris L.) a condiciones de estrés por déficit hídrico. ...............................109

Contenido XVIII

Lista de tablas

Pág. Tabla 1-1. Resumen de los estudios en caracterización de las respuestas fisiológicas de

fríjol bajo condiciones de sequía. Adaptado de Beebe et al. (2013). ............................... 12

Tabla 2-1. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre el Uso Eficiente del Agua

(UEA), Carbono intercelular (Ci) y Relación Carbono intercelular sobre el Carbono

atmosférico de la hoja (Ci/Ca) en plántulas de fríjol arbustivo cultivar ICA-CERINZA. ..... 28

Tabla 3-1. Resumen del análisis de varianza de los efectos del estrés hídrico sobre el

comportamiento fisiológico de las plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo. ......... 49

Tabla 3-2. Efecto del estrés hídrico sobre el Uso Eficiente del Agua (UEA) y la relación

Carbono intercelular sobre el Carbono atmosférico (Ci/Ca) en plántulas de cinco cultivares

de fríjol arbustivoa. .......................................................................................................... 51

Tabla 3-3. Efecto del estrés hídrico sobre el Peso Seco de la Parte Aérea (PSA), Peso

Seco de la Raíz (PSR), Peso Seco Total (PST) y Relación Parte Aérea : Raíz (PA/R) en

plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivoa. ............................................................. 54


comportamiento fisiológico y parámetros de rendimiento de cinco genotipos de fríjol

arbustivo. *, **, y *** significativamente diferente en los niveles de probabilidad a 0.05, 0.01

y 0.001, respectivamente. NS, no significativo con a = 0.05. ........................................... 73

Tabla 4-2. Efecto del estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes sobre

parámetros de intercambio gaseoso de cinco genotipos de fríjol arbustivo (55 DDE y 65

DDE). .............................................................................................................................. 77


parámetros de fluorescencia de cinco genotipos de fríjol arbustivo (55 DDE y 65 DDE). 80


comportamiento fisiológico y parámetros de rendimiento de cinco genotipos de fríjol

arbustivo. ........................................................................................................................ 91


los parámetros de rendimiento de cinco genotipos de fríjol arbustivo. ............................. 96

Contenido XIX

Tabla 5-3. Índice de tolerancia y susceptibilidad de cinco genotipos de fríjol arbustivo bajo

condiciones de estrés por sequía. .................................................................................. 99

Tabla 5-4. Coeficiente de correlación entre los diferentes índices de tolerancia y

susceptibilidad al estrés por déficit hídrico en cinco genotipos de fríjol arbustivo. .........101

Contenido XX

Lista de Símbolos y abreviaturas

Símbolos con letras latinas Símbolo Término Unidad SI Definición

A Área m2 ∬ 𝑑𝑥 𝑑𝑦

D Diámetro m L Longitud m DF T Temperatura C DF T Tiempo s DF

V Volumen L ∫ 𝑑𝑟3

Superíndices Superíndice Término

N Exponente, potencia

Abreviaturas Abreviatura Término

CRA Contenido Relativo de Agua DDE Días después de Emergencia Pn Fotosíntesis neta gs Conductancia estomática E Transpiración UEA Uso Eficiente del Agua UEAi Uso Eficiente del Agua intrínseco Ci/Ca Relación Carbono intercelular sobre Carbono atmosférico Ls Limitación estomática Pn/Ci Eficiencia de la carboxilación Chl total Clorofila total Chl a Clorofila a Chl b Clorofila b Cx + c Carotenoides totales Fv/Fm Eficiencia máxima potencial del fotosistema II Y(II) Eficiencia real del fotosistema II qP Quenching fotoquímico

Contenido XXI

Abreviatura Término NPQ Quenching no fotoquímico MDA Malondialdehido PS Peso Seco PF Peso Fresco PT Peso Turgente RTI Índice Relativo de Tolerancia CHS Contenido de Humedad del Suelo Ys Promedio del rendimiento bajo condición de estrés Yp Promedio del rendimiento sin estrés

�̅�𝑆 Rendimiento promedio de todos los genotipos sin estrés

�̅�𝑃 Rendimiento promedio de todos los genotipos con estrés SSI Índice de Susceptibilidad al Estrés TOL Tolerancia MP Productividad Media GMP Productividad Media Geométrica STI Índice de Tolerancia al Estrés YSI Índice de Estabilidad del Rendimiento YI Índice de Rendimiento HM Media Armónica SDI Índice de Sensibilidad a la Sequía

Introducción

Una de las leguminosas de grano más importante en el mundo es el frijol común

(Phaseolus vulgaris L.), debido a que sus semillas constituyen una de las principales

fuentes de proteína y minerales de origen vegetal en la dieta de las comunidades de bajos

recursos (Broughton et al., 2003; Beebe, 2012). Es una especie nativa de Meso y

Suramérica, perteneciente a la familia Fabaceae (Kalavacharla et al., 2011). En los países

de América Latina, el consumo nacional per de los granos es típicamente entre 12 y 18 kg

por año, pero estas cifras no discriminan las zonas urbanas de las rurales (Broughton et

al., 2003).

Aunque la producción mundial es difícil de calcular con precisión debido al desconcierto

con otras leguminosas, se estima que sea entre 11 y 12 millones de toneladas (FAO, 2007).

América Latina es la región de mayor producción de frijol, abarcando alrededor del 50%

de la cosecha mundial y en segundo lugar se encuentra África con un 25%. Los sistemas

productivos de frijol son tradicionalmente pequeñas parcelas campesinas, que

tradicionalmente se siembran en sistemas agrícolas complejos en asociación o rotación

con las especies como el sorgo, plátano, café en etapas tempranas, maíz, entre otros

(Broughton et al., 2003). Existen diferentes fríjoles con hábitos de crecimiento de tipos

arbustivos determinados a escaladores vigorosos de crecimiento indeterminado, como

también la gama de los ciclos de crecimiento de 2 a 10 meses de duración, los cuales

producen granos en cultivos que se adaptan muchos nichos de producción (Beebe et al.,

2013).

Por otro lado, la estructura genética del frijol ha sido estudiada ampliamente (Gepts y

Debouck, 1991; Singh et al., 1991; Broughton et al, 2003; Beebe et al., 2013). Los frijoles

cultivados presentan una estructura genética bien definida que se origina en el ancestro

de frijol silvestre (Beebe et al., 2013). Según Toro et al. (1990), éste ancestro crece como

2 Introducción

una planta herbácea anual en regiones de bosque pre-montano sub-húmedo que van

desde el norte de México hasta el norte de Argentina. Los principales bancos de

germoplasma han clasificado los fríjoles en razas basados en la morfología de la planta,

rango de adaptación y las características agronómicas (Beebe et al., 2013). Finalmente,

las colecciones genéticas de origen mesoamericano se han dividido en tres razas: i)

Jalisco: frijol con crecimiento voluble de las tierras altas húmedas del centro de México; ii)

Mesoamérica: fríjoles con crecimiento determinado de semilla pequeña, encontrado en

tierras bajas de América central y México; y iii) Durango: fríjoles de tipo postrado con

crecimiento determinado con semillas de tamaño medio, encontrado en las tierras altas y

secas de México (Singh et al., 1991).

La variabilidad climática es uno de los fenómenos ambientales de mayor impacto en los

últimos años, incidiendo en las superficies afectadas por sequías que ocasionan

condiciones de estrés hídrico. Asimismo, el Niño/ Oscilación del Sur (ENOS) es uno de los

fenómenos que genera mayores anomalías en precipitación pluvial y temperaturas

(Monasterio et al., 2011). Por otro lado, Pabón y Torres (2007) evaluaron la variabilidad

climática asociada al ciclo ENOS para la Sabana de Bogotá, encontrando una relación

inversa entre las anomalías de la temperatura de la superficie del mar y la precipitación,

de tal forma que condiciones cálidas (anomalías asociadas al Niño) reducen la

precipitación regional. Igualmente, la producción agrícola es afectada fuertemente por las

condiciones ambientales desfavorables (exceso o déficit de precipitaciones),

especialmente, bajo condiciones de ciclo ENOS (Fenómeno del Niño o la Niña) que causa

climas extremos como inundaciones, altas temperaturas o sequías en varias regiones del

mundo (Holmgren et al., 2001; Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2011).

Adicionalmente, el cambio climático ha tenido un gran impacto en las zonas agrícolas,

incrementando las áreas afectadas por condiciones de baja disponibilidad de agua,

propiciando más episodios de estrés hídrico (Monasterio et al., 2011), y para el caso de

Colombia, gran parte de esta área se encuentra en la región andina donde el fríjol es un

cultivo predominante (Comunidad Andina, 2009).

Asimismo, se ha reportado que diferentes genotipos de frijol presentan distintas respuestas

a las condiciones de estrés (Beebe et al., 2013). Además, identificar y priorizar parámetros

fisiológicos y bioquímicos son de gran utilidad para los programas de fitomejoramiento

(Yousfi et al., 2012), ya que nos permite determinar posibles respuestas de aclimatación y

Introducción 3

sobrevivencia a la condición ambiental adversa estudiada. Finalmente, la implementación

de índices de tolerancia a sequía en los métodos de selección de genotipos de fríjol

tolerantes y/o susceptibilidad a la sequía no son muy usados.

Bajo dicho contexto, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar las respuestas

fisiológicas y bioquímicas de cinco cultivares de fríjol arbustivo bajo condiciones de estrés

por déficit hídrico. Para ello, se plantearon tres objetivos específicos los cuales fueron: i)

Identificar la duración de un periodo de estrés moderado por déficit hídrico para diseñar

ensayo al que se someterán los cinco genotipos de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.);

ii) Medir y comparar las respuestas fisiológicas, relaciones hídricas, respuesta oxidativa y

anatomía de los cinco cultivares de fríjol arbustivo bajo condiciones de estrés hídrico en

variables bioquímicas como producción de prolina y malondialdehido de cinco genotipos

de fríjol arbustivo; iii) Evaluar los efectos del estrés por déficit hídrico en una etapa

vegetativa y en una etapa reproductiva sobre parámetros de rendimiento e índices de

tolerancia de cinco cultivares de fríjol arbustivo.

Adicionalmente, es importante reconocer y aprovechar el potencial de los genotipos

colombianos como fuente de genes de tolerancia a estrés por déficit hídrico, considerando

que para los cultivares de fríjol arbustivo de Colombia se desconoce dicha información.

Igualmente, este trabajo aporta información fundamental acerca de la caracterización de

la respuesta de plantas de cinco cultivares de fríjol arbustivo ante la condición de déficit

hídrico.

En este documento está presentado diferentes capítulos, en el que el primero reúne el

marco teórico como estado del arte del déficit hídrico y unos antecedentes para el caso del

fríjol. Posteriormente se presentan cuatro capítulos adicionales los cuales reúnen los

resultados de las diferentes etapas de investigación para el alcance de los objetivos de la

tesis. La primera etapa corresponde al primer objetivo específico, en el que se buscó

identificar el periodo de estrés moderado por déficit hídrico para un cultivar comercial de

fríjol arbustivo. Seguidamente, al identificar el período de estrés, se realizó la

caracterización de los cinco cultivares de fríjol arbustivo en una etapa fenológica de la fase

vegetativa. Finalmente, se dividen los resultados de la última etapa de investigación en dos

capítulos; uno muestra los parámetros fisiológicos y bioquímicos evaluados; y el otro los

diferentes parámetros de rendimiento e índices de tolerancia de los cinco cultivares de fríjol

4 Introducción

arbustivo en dos etapas fenológicas: una en la fase vegetativa y una en la fase

reproductiva.

1. Capítulo 1. Marco Teórico

1.1 El estrés por déficit hídrico y condiciones que lo generan.

El estrés por déficit hídrico está definido como aquella condición en el que la tasa

transpiratoria de la planta supera la tasa de absorción de agua por parte de las raíces

(Lacape et al., 1998). Asimismo, se considera que un estrés moderado por déficit hídrico

es aquel que genera limitaciones en la fotosíntesis de tipo estomático, mientras que un

estrés severo por déficit hídrico cuenta con limitaciones de tipo estomática y no estomática

de la fotosíntesis, generalmente por daños en el fotosistema II (Hsiao., 1973). Son múltiples

los agentes del entorno que actúan como fuentes de estrés.

1.2 La importancia del agua en las plantas.

El agua es uno de los recursos renovables del planeta, aunque su disponibilidad es limitada

y variable (Pimentel et al., 1997). Según proyecciones de la FAO (2016), para el año 2025,

cerca de 3200 millones de personas vivirán en regiones del mundo en las que se tendrán

influencias de déficit hídrico severo. Según Oki y Kanae (2006), la agricultura con

suministro de riego comprende el 20% de las tierras con vocación agrícola e incluye la

mitad de la producción mundial.

Igualmente, la importancia del agua para los cultivos hortícolas es particularmente amplia

ya que la mayoría de la producción hortícola se vende por peso fresco, siendo un alto

porcentaje de agua el componente principal, por lo que a menudo se prioriza en asegurar

el suministro de agua a través de un control preciso de riego (Jones and Tardieu., 1998).

6 Caracterización de la respuesta fisiológica de cinco cultivares de fríjol arbustivo


Asimismo, la sequía es una limitación importante para el rendimiento del cultivo en aquellos

sistemas agrícolas que son de secano predominante, pero asociadas con bajas pérdidas

de rendimiento (muy por debajo del 10% de todos reportó pérdidas) para los cultivos en

los sistemas agrícolas con buen sistema de irrigación (Li et al., 2011). Adicionalmente, la

duración del cultivo de frijol para cosechar grano seco oscila entre 90 a 100 días, con una

demanda hídrica de aproximadamente 350 a 500 mm de agua por ciclo la cual varía con

respecto al cultivar, la profundidad del suelo y el clima (Beebe et al. 2010).

1.3 Efectos a nivel fisiológico del déficit hídrico en plantas

Las condiciones de estrés por déficit hídrico afectan drásticamente el rendimiento del

cultivo de fríjol (Rainey y Griffiths, 2005, Beebe et al., 2013). Igualmente, White e Izquierdo

(1991), reportaron que en periodos prolongados de ausencia de lluvias o reducción en la

humedad del suelo afectan más del 60% de la producción de frijol en todo el mundo.

Asimismo, las plantas presentan diferentes respuestas a nivel anatómico, fisiológico,

bioquímico y genético a las condiciones de estrés. Yousfi et al. (2012) encontraron que

materiales de alfalfa tolerantes a estrés hídrico presentan un menor número de estomas

en la hoja, mayor presencia de tricomas en la lámina foliar, mayor eficiencia en el uso del

agua, menor tasa de transpiración, los parámetros de rendimiento no se reducen

significativamente, siendo estas características de gran importancia para identificar

materiales tolerantes a estrés hídrico. Según Farooq et al. (2009), las plantas responden

al estrés hídrico con la reducción en la transpiración debido al cierre estomático inducido

por el incremento de las concentraciones de ácido abscísico (ABA), el crecimiento de la

células se ve restringido por la reducción en el turgor celular debido al descenso en el

potencial hídrico. Dado lo anterior, es importante enfocar investigaciones en conocer el

comportamiento de diferentes genotipos de fríjol bajo estas condiciones que puedan

contribuir en programas de fitomejoramiento.

La fotosíntesis es el proceso fisiológico más susceptible a cualquier condición de estrés

abiótico (Restrepo-Díaz y Garcés-Varón, 2013). Asimismo, ambientes contrastantes

Marco Teórico 7

también pueden afectar el contenido de clorofila en las hojas, la eficiencia máxima del PSII

fotoquímica (Fv/Fm), quenching no fotoquímico y el estado de activación de la enzima

Rubisco (Cao et al., 2008). En cuanto a las relaciones hídricas, Miyashita et al. (2005)

reportan que cuando plantas de fríjol se encuentran sometidas a condiciones de estrés

hídrico alteran las relaciones hídricas, con la finalidad de disminuir la pérdida de agua por

procesos de transpiración.

Se han estudiado ampliamente factores involucrados en la tolerancia a estrés ambiental,

que podrían ser usados como criterios de selección (Blumm y Jordan, 1989; Morgan y

Condon, 1986). La prolina, un aminoácido que aumenta en plantas bajo estrés, se ha

sugerido como un parámetro para la selección de materiales resistentes al estrés hídrico

(Bates et al., 1973). Sun et al., (2013), encontraron que condiciones de estrés hídrico

estimulan la producción de prolina, involucrada en funciones de las plantas tales como la

regulación osmótica, el mantenimiento de la estabilidad de la membrana, ser fuente de

carbono, entre otras. Adicionalmente, Ahmed y Hassan (2011) encontraron que valores

altos de prolina están asociados a genotipos con mejor adaptación a estrés ambiental.

Asimismo, mantener el balance osmótico es una importante adaptación fisiológica para

minimizar el efecto del estrés; algunas moléculas orgánicas específicas se acumulan en el

citoplasma celular, entre ellas se pueden mencionar azúcares solubles, betainas, polioles

y prolina (Sánchez et al., 1998). En efecto, variables como la producción de

malondialdehido y prolina se consideran como indicador de la integridad estructural de las

membranas sometidas a condiciones de estrés por déficit hídrico (Cao et al., 2008).

Sun et al. (2013) reportan que plantas susceptibles y tolerantes sometidas a condiciones

de estrés hídrico presentan actividad enzimática antioxidante con el fin de mitigar los

efectos provocados por los radicales libres de oxígeno. Los incrementos en las

concentraciones de enzimas como el superóxido dismutasa (SOD), Peroxidasa (POD) y

Catalasas (CAT) indican que las plantas han activado mecanismos de respuestas a

condiciones estresantes (Rosales et al., 2012).



1.4 Las respuestas de las plantas a condiciones de déficit

hídrico

Según Levitt. (1972) y Farooq et al. (2009) se reconocen tres tipos de mecanismos de a la

sequía: escape; evitación y tolerancia, las cuales se explican a continuación:

1. El escape a la sequía es definido como la capacidad de un genotipo vegetal para

completar su ciclo de vida antes de un grave déficit de agua del suelo y los cultivos

se desarrollan. Este mecanismo se caracteriza por un rápido desarrollo fenológico

reduciendo el tiempo para alcanzar la primera floración como una madurez

temprana, la plasticidad del desarrollo (variación en la duración del período de

crecimiento en función del grado de déficit de agua), y la removilización de

fotoasimilados al grano.

2. La evitación a la sequía es entendida como la capacidad del cultivo para mantener

alto el potencial de agua de los diferentes tejidos relativamente, a pesar de la baja

disponibilidad de humedad del suelo. Para ello, las plantas producen raíces más

largas para alcanzar una mayor profundidad en el suelo, un sistema de raíces

eficiente y el aumento de la conductancia hidráulica, y una menor pérdida de agua

a través del cierre de estomas en la hoja, la reducción de la absorción de la

radiación por el movimiento de las hojas, al igual que una reducción de la superficie

foliar para disminuir la evaporación.

3. La tolerancia a la sequía se define como la capacidad de una especie vegetal para

soportar el déficit hídrico a un bajo potencial de agua de los tejidos. Esto se logra a

través del mantenimiento de la turgencia mediante un ajuste osmótico, aumento de

la elasticidad de células y tolerancia a la desecación por la resistencia

protoplasmática.

El estudio de los diferentes mecanismos respuestas al déficit hídrico ha sido ampliamente

abordado en diferentes especies de importancia agronómica como el arroz (Boonjung y

Marco Teórico 9

Fukai., 1996-1 y 2), maíz (Cakir., 2004), trigo (Keyvan., 2010; Perveen et al., 2010), arveja

(Okçu et al., 2005), e incluso el fríjol (Rosales et al., 2012;) entre otras.

1.5 Fenología y el efecto del déficit hídrico sobre la

fenología del fríjol (P. vulgaris L.)

En cuanto a la fenología del fríjol, actualmente se cuentan con dos escalas fenológicas.

La primera, fue descrita por el IICA (2009), en la que la fenología del cultivo de frijol se

definió en 10 etapas, siendo cinco en estado vegetativos V y cinco en estado reproductivo

R (Figura 1-1): las etapas descritas son: V0: Germinación; V1: Emergencia; V2: Hojas

primarias; V3: Primera hoja trifoliada; V4: Tercera hoja trifoliada: R5: Prefloración; R6:

Floración; R7: Formación de vainas; R8: Llenado de vainas y R9: Maduración.

Por otro lado, la escala BBCH descrita por Fellet et al. (1995b), la cual está compuesta por

10 estados principales (Figura 1-2). El estado principal 0: Germinación; Estado 1:

Desarrollo de hojas; Estado 2: Formación de brotes laterales; Estado 5: Aparición del

órgano floral; Estado 6: Floración; Estado 7: Formación del fruto; Estado 8: Maduración de

frutos y semillas y Estado 9: Senescencia.

Finalmente, Muñoz et al. (2007), reportaron que el déficit hídrico en las etapas de pre

floración, formación y llenado de vainas afecta seriamente (aproximadamente un 40%) el

rendimiento, por lo cual es importante suministrar los requerimientos de agua, o fijar fechas

de siembra que coincidan con las etapas críticas de demanda hídrica.

Figura 1-1. Escala fenológica del fríjol (Phaseolus vulgaris L.) descrita por IICA et al., (2009).

1

0



Figura 1-2. Escala fenológica BBCH del fríjol (Phaseolus vulgaris L.) descrita por Feller et al., (1995b).

1.6 Antecedentes en el cultivo de fríjol en condiciones de

déficit hídrico.

A través de la historia se han realizado diferentes investigaciones para caracterizar las

respuestas fisiológicas de genotipos de las plantas de fríjol a condiciones de sequía. Beebe

et al. (2013), resumió las principales publicaciones realizadas en fríjol en condiciones de

estrés por sequía, en las cuales se evalúan las diferentes estrategias de las plantas a la

condición adversa las cuales incluyen el escape, la evitación y la tolerancia, las cuales se

relacionan en la Tabla 1-1.

Tabla 1-1. Resumen de los estudios en caracterización de las respuestas fisiológicas de fríjol bajo condiciones de sequía. Adaptado de Beebe et al. (2013).

Artículo Título Autores

1

Physiological analysis of common bean (Phaseolus

vulgaris L.) cultivars uncovers characteristics related to

terminal drought resistance.

Rosales et al. (2012)

2

Water use efficiency among dry bean landraces and

cultivars in drought-stressed and non-stressed

environments

Muñoz-Perea et al. (2007)

3 Differential adaptation of two varieties of common bean to

abiotic stress - II. Acclimation of photosynthesis Wentworth et al. (2006)

4

Differential adaptation of two varieties of common bean to

abiotic stress: I. Effects of drought on yield and

photosynthesis

Lizana et al. (2006)

5

Physiological Response to Drought Stress of Common

Bean (Phaseolus vulgaris L) Genotypes Differing in

Drought Resistance

Gebeyehu (2006)

6

Comparative effects of partial root drying (PRD) and

regulated deficit irrigation (RDI) on water relations and

water use efficiency in common bean (Phaseolus vulgaris

L).

Wakrim et al. (2005)

7 Comparative drought postponing and tolerance potentials

of two tepary bean lines in relation to seed yield Mohamed et al. (2005)

8 Leaf movements and photoinhibition in relation to water

stress in field-grown beans. Pastenes et al. (2005)

9 Paraheliotropism can protect water-stressed bean

(Phaseolus vulgaris L) plants against photoinhibition. Pastenes et al. (2004)

10 Breeding beans for resistance to terminal drought in the

lowland tropics Frahm et al. (2004)

11 Traits associated with dry edible bean (Phaseolus vulgaris

L) productivity under diverse soil moisture environments Shenkut y Brick (2003)

12 Mechanisms of drought resistance in grain legumes I:

osmotic adjustment Amede et al. (2003)

Marco Teórico 13


13 Mechanisms of drought resistance in grain legumes II:

stomatal regulation and root growth Amede y Schubert (2003)

14 Dehydration-avoidance responses of tepary bean lines

differing in drought resistance Mohamed et al. (2002)

15 Stomatal responses to leaf water status in common bean

(Phaseolus vulgaris L) is a function of time of day Mencuccini et al. (2000)

16 Indirect selection for drought resistance: a pilot study Dowkiw et al. (2000)

17

Acumulação de biomassa, características fisiológicas e

rendimento de grãos em cultivares de feijoeiro irrigado e

sob sequeiro

Gomes et al. (2000)

18

Differences in growth and water relations among

Phaseolus vulgaris cultivars in response to induced drought

stress

Costa et al. (2000)

19 Intrinsic water use efficiency at the pollination stage as a

parameter for drought tolerance in Phaseolus vulgaris Pimentel et al. (1999)

20 N2 fixation response to drought in common bean

(Phaseolus vulgaris L) Serraj y Sinclair (1998)

21 Traits related to drought resistance in common bean Ramirez-Vallejo y Kelly

(1998)

22 Adaptação do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L) a seca. I.

Densidade e efficiência radicular Guimarães et al. (1996)

23 Moisture stress impact on N partitioning, N remobilization

and N-use efficiency in beans (Phaseolus vulgaris L) Foster et al. (1995)

24 Phenological plasticity as an adaptation by common bean

to rainfed environments

Acosta-Gallegos y White

(1995)

25

Relations of carbon isotope discrimination and other

physiological traits to yield in common bean (Phaseolus

vulgaris) under rainfed conditions

White et al. (1994)

26 Variation in leaf movements among common bean

cultivars Kao et al. (1994)

27

Stomatal response to humidity in common bean (Phaseolus

vulgaris): implications for maximum transpiration rate,

water-use efficiency and productivity

Comstock y Ehleringer

(1993)

28 Evaluation of diverse shoot genotypes on selected root

genotypes of common bean under soil water deficits

Jeffrey White y Castillo

(1992)

29 Saturated rates of photosynthesis in water-stressed leaves

of common bean and tepary bean

Castonguay y Markhart

(1991)

30 Carbon isotope discrimination and transpiration efficiency

in common bean Ehleringer et al. (1991)

31

Associations between productivity, root growth and carbon

isotope discrimination in Phaseolus vulgaris under water

deficit

White et al. (1990)

32 Relative effect of root and shoot genotypes and yield on

common bean under drought stress White y Castillo (1989)

33

Root growth of four common bean cultivars in relation to

drought tolerance in environments with contrasting soil

types

Sponchiado et al. (1989)

1

4




34 Comparative water relations of Phaseolus vulgaris L and

Phaseolus acutifolius Gray Markhart (1985)

35 Effects of water stress on the water relations of Phaseolus

vulgaris and the drought resistant Phaseolus acutifolius Parsons y Howe (1984)

36 Photosynthetic response to water stress in Phaseolus

vulgaris O'Toole et al. (1977)

La mayoría de los estudios están enfocados en las diferentes variables fisiológicas

determinadas a nivel foliar, y pocos en las respuestas a nivel de raíz. Adicionalmente, los

estudios que se reportan anteriormente desarrollados en Colombia fueron realizados por

investigadores de CIAT, donde se han evaluado parámetros a nivel morfológico a nivel de

raíz (longitud, formación de raíces secundarias, acumulación de materia seca, etc.) y

fisiológico teniendo en cuenta variables como la eficiencia en el uso del agua el uso

eficiente del agua, transpiración, fotosíntesis, entre otros. Sin embargo, el uso de variables

bioquímicas como la producción de prolina y la acumulación de malondialdehido no ha sido

fuertemente estudiado en el país, e incluso el uso de tecnologías como el polietilenglicol

en sistemas de hidroponía, para estudiar detalladamente las raíces es escaso.

1.7 La utilidad de los Índices de Tolerancia en la caracterización de genotipos de plantas cultivadas.

La selección de genotipos con tolerancia a la sequía no es sencilla, debido principalmente

a las fuertes interacciones entre genotipos y el medio ambiente, además del escaso

conocimiento de la función y el papel de los diferentes mecanismos de tolerancia (Naghavi

et al., 2013). En este sentido, la implementación de índices de tolerancia a sequía en los

métodos de selección de genotipos de fríjol tolerantes y/o susceptibilidad al déficit hídrico

no son muy estudiados.

Actualmente, investigadores como Khakwani et al. (2011); Farshadfar et al. (2013) y

Naghavi et al. (2013), han trabajado en los diferentes métodos de selección de genotipos

con tolerancia a la sequía en cultivos de maíz y trigo mediante el uso de índices de

tolerancia y/o susceptibilidad. Igualmente, Fernández (1992), sugiere que el Índice de

Marco Teórico 15

tolerancia al estrés (STI) está definido como un marcador útil para determinar el potencial

de alta tolerancia y rendimiento el estrés de los genotipos evaluados. No obstante, se han

propuesto novedades de índices alternos útiles para la identificación de genotipos tales

como el Índice de Susceptibilidad al Estrés (SSI) por Fischer y Maurer (1978); la Tolerancia

al Estrés (TOL) y la Productividad Media (MP) por Rosielle y Hamblin (1981); la

Productividad Media Geométrica (GMP) por Fernández (1992), entre otros.

2. Capítulo. Identificación del periodo crítico para estrés hídrico sobre variables fisiológicas de un cultivar de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.).

2.1 Resumen

El cambio climático es uno de los fenómenos ambientales de mayor impacto en los últimos

años, incidiendo en las superficies afectadas por sequías, e incrementando el área de las

mismas en zonas que eran influenciadas por la baja disponibilidad de agua, propiciando

condiciones de estrés hídrico. Por tal motivo, el objetivo de esta investigación fue

determinar la duración de un periodo crítico de estrés hídrico en fríjol arbustivo evaluando

las respuestas fisiológicas y bioquímicas bajo condiciones controladas. Sembrando

semillas de fríjol ICA-Cerinza, se realizó un diseño completamente al azar con cuatro

tratamientos (0, 5, 10 y 20 días de duración de estrés hídrico). Para cuantificar los

desórdenes fisiológicos, se realizaron medidas de intercambio gaseoso, fluorescencia del

PSII, pigmentos y pruebas bioquímicas (prolina y malondialdehido). La tasa de fotosíntesis,

conductancia estomática, clorofilas, y relaciones de fluorescencia se reducen en todos los

tratamientos, pero el efecto es prolongado en plantas sometidas a 10 y 20 días de estrés.

Asimismo, se evidencia una mayor fuga de electrolitos, acumulación de carotenoides

totales, MDA y prolina en las plantas que fueron afectadas por un periodo prolongado de

estrés hídrico. En conclusión, un estrés hídrico de 20 días genera daños fisiológicos

irreversibles en las plantas de fríjol arbustivo. Periodos de 5 y 10 días de estrés hídrico no

genera efectos severos sobre las variables fisiológicas de la especie estudiada. Un periodo

de estrés de 15 días permite generar un efecto moderado de estrés hídrico en las plantas

de fríjol sin ocasionar su muerte.

Palabras clave: Fotosíntesis, uso eficiente del agua, peroxidación lipídica,

regulación osmótica.

Capítulo 2 17

2.2 Introducción

El fríjol (Phaseolus vulgaris L.) es una especie de leguminosa nativa de Meso y

Suramérica, perteneciente a la familia Fabaceae (Kalavacharla et al., 2011). Esta

leguminosa es consumida ampliamente en Colombia como grano seco por su contenido

de proteínas, carbohidratos, vitaminas y minerales (FAO, 2007). Asimismo, esta especie

ocupó una producción de 62,974 toneladas durante el primer semestre del año 2015

(Fenalce, 2016), causando un impacto positivo sobre la generación de empleo e ingresos

para la economía campesina (FAO, 2007).

Los cultivos hortícolas se han visto sometidos a condiciones climáticas adversas

acentuadas por condiciones de cambio climático durante los últimos años en Colombia

(Miranda, 2009). Este sentido, Monasterio et al. (2011) afirman que el cambio climático ha

incidido en el incremento de áreas afectadas por condiciones de baja disponibilidad de

agua, propiciando más episodios de estrés hídrico. Asimismo, fenómenos de variabilidad

climática como el Niño/ Oscilación del Sur (ENOS) también causan mayores reducciones

de las precipitaciones e incremento de las temperaturas (Li et al., 2011; Ruiz y Pabón,

2013). En este aspecto, se ha reportado que Fenómenos ENOS pueden causar una

disminución en la oferta hídrica del 50% en más de 180 municipios del país (UNGRD,

2014). Igualmente, en el país existe un área alrededor de los 59.000 km2 expuestas a

sequía, encontrando gran parte de esta área en la región andina donde el fríjol es

comúnmente cultivado (Comunidad Andina, 2009).

Las plantas presentan diferentes tipos de respuestas a déficit hídrico como cambios

anatómicos, fisiológicos y bioquímicos a periodos transitorios o prolongados de baja

disponibilidad de agua, ocasionando afectaciones negativas sobre el crecimiento,

desarrollo y rendimiento (Segura-Monroy et al., 2015). Türkan et al. (2005) reportan en

plantas de Phaseolus vulgaris L. y Phaseolus acutifolius L. expuestas a diferentes días de

estrés hídrico se ven afectadas negativamente en parámetros como la acumulación de

materia fresca y seca, longitud de raíz y parte aérea de la planta entre otros, pero dicha

afectación es más significativa cuando el periodo de estrés es más prolongado (14 días de

1

8



duración). Con respecto a las variables fisiológicas, las propiedades de intercambio

gaseoso de la hoja (fotosíntesis, transpiración y conductancia estomática), se ha reportado

ampliamente que bajo condiciones de estrés por déficit hídrico la tasa fotosintética y la

transpiración tienden a disminuir como consecuencia del cierre estomático (Yousfi et al.,

2012; Rosales et al., 2012). En cuanto a las relaciones hídricas, Miyashita et al. (2005)

reportan que cuando plantas de fríjol se encuentran sometidas a condiciones de estrés

hídrico afectan las relaciones hídricas, con la finalidad de disminuir la pérdida de agua por

procesos de transpiración. Adicionalmente, varios estudios han reportado que periodos de

déficit hídrico provocan alteraciones de los componentes de la fase lumínica tales como

una disminución sobre el contenido de clorofila en las hojas, la eficiencia máxima del PSII

fotoquímica (Fv/Fm) y el quenching fotoquímico disminuyen; mientras un incremento en el

quenching no fotoquímico como una estrategia de disipación de energía en forma de calor

(Aranjuelo et al., 2011).

Por otro lado, el estrés por sequía también induce una serie de respuestas bioquímicas

que son indicadores de tolerancia o susceptibilidad de plantas (Ahmed y Hassan, 2001;

Aranjuelo et al, 2011; Mohamed y Ibrahim, 2011). Las respuestas fisiológicas al igual que

las bioquímicas de las plantas a estrés por sequía están condicionadas por la duración del

periodo de estrés (Ashraf y Harris 2013). En este contexto, periodos cortos o prolongados

de estrés hídrico pueden afectar la estabilidad de la membrana debido a la peroxidación

lipídica, causando una producción de iones de peróxido y malondialdehido (MDA)

(Sánchez-Rodríguez et al., 2009; Sánchez-Reinoso et al., 2013). Del mismo modo,

cambios en la concentración de MDA han sido considerado como otro indicador de la

integridad estructural de las membranas sometidas a condiciones de estrés por estrés

hídrico (Cao et al., 2008). Adicionalmente, Sun et al. (2013) encontraron que condiciones

de estrés hídrico estimulan la producción de metabolitos secundarios tales como prolina,

que cumplen diversas funciones en las plantas en procesos como la regulación osmótica,

el mantenimiento de la estabilidad de la membrana, ser fuente de carbono y entre otras.

Igualmente, Ahmed y Hassan (2011) reportaron que una alta producción de prolina está

asociada a genotipos con mejor aclimatación a estreses ambientales. Por otro lado, el

estudio de la duración de diferentes periodos de estrés hídrico ha permitido conocer las

posibles estrategias de las plantas que les ayudan a sobrellevar esta condición abiótica

adversa y asimismo, tener una comprensión de los mecanismos fisiológicos involucrados

Capítulo 2 19

en las respuestas de aclimatación que repercuten en el funcionamiento de la planta y

posteriormente en el rendimiento del cultivo (Chaves et al., 2002; Farooq, et al., 2009, Xu

et al., 2010). Asimismo, la literatura disponible sobre el comportamiento de materiales

arbustivos comerciales de frijol a la duración de periodos de estrés hídrico en Colombia es

aún escasa, ya que la información disponible se ha centrado principalmente en la

caracterización de genotipos en un periodo puntual de sequía (Polanía et al, 2009;

Cardona-Ayala et al., 2014). En este sentido, evaluar las respuestas fisiológicas y

bioquímicas en plántulas de fríjol a diferentes periodos de duración del estrés por sequía

es de gran importancia, ya que nos permite determinar posibles respuestas de aclimatación

y sobrevivencia a la condición ambiental adversa estudiada. Por tal motivo, el objetivo de

esta investigación fue estudiar el efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre las

respuestas fisiológicas y bioquímicas de plántulas de un cultivar de fríjol arbustivo

(Phaseolus vulgaris L.) determinando variables tales como la fotosíntesis, conductancia

estomática, transpiración, carbono interno, contenido relativo hídrico de la hoja, pérdida de

electrolitos, producción de malondialdehido y prolina

2.3 Materiales y métodos

2.3.1 Material vegetal y condiciones de crecimiento

El ensayo fue llevado a cabo en los invernaderos y laboratorios de la Facultad de Ciencias

Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia ubicada en la ciudad de Bogotá a una

altura de 2556 msnm, (4° 35’56’’LN y 74°04’51’’LO) en el periodo comprendido entre los

meses de septiembre a noviembre del 2014. En el invernadero durante el periodo de la

evaluación, la temperatura promedio osciló entre los 15 y 22°C, la humedad relativa estuvo

entre el 60 a 90% y se tuvo un fotoperiodo natural de 12 h, con radiación fotosintéticamente

activa al medio día en promedio de 1000 µmol m−2 s−1). Para el establecimiento del

experimento, semillas del cultivar de fríjol arbustivo ICA-CERINZA fueron sembradas en

macetas de 1,5 litros de capacidad conteniendo arena cuarzítica, con el fin de mantener

un sustrato de baja retención de humedad y garantizar una condición de estrés por déficit

hídrico. Después de la germinación de semillas, las plantas fueron fertirrigidas con una

2

0



solución nutritiva conteniendo la siguiente composición: 2.08 mM Ca(NO3)2 4H2O, 1.99 mM

Mg SO4 7 H2O, 2.00 mM NH4H2PO4, 10.09 mM KNO3, 46.26 nM H3BO3, 0.45 nM Na2MoO4

2H2O, 0.32 nM CuSO4 5H2O, 9.19 nM MnCl2 4H2O, 0.76 nM ZnSO4 7H2O, 19.75 nM FeSO4

H2O (Flórez-Velasco et al., 2015). El volumen de fertirriego fue calculado de acuerdo a la

capacidad de matera y los requerimientos hídricos de las plantas, realizando aplicaciones

cada dos días de 100 mL en las etapas iniciales (1-32 días después de emergencia (DDE))

y de 200 mL en etapas finales del experimento (33-65 DDE).

2.3.2 Tratamientos de déficit hídrico y toma de datos en los muestreos

El inicio de aplicación de todos los tratamientos fue cuando las plantas alcanzaron el

estado fenológico según escala BBCH 13-14 (formación de 3 a 4 hojas trifoliadas

completamente expandidas) aproximadamente a los 45 DDE según la metodología

reportada por Ghanbari et al. (2013). Los tratamientos consistieron en establecer cuatro

diferentes periodos de exposición a un déficit hídrico. Adicionalmente, plantas de los

tratamientos de 5 y 10 días contaron con un periodo de rehidratación hasta el muestreo a

los 20 días de inicio del estrés. El déficit hídrico fue establecido mediante el procedimiento

descrito por Moftha y Al Humaid (2005) y Segura-Monroy et al. (2015) donde se cubrían el

50% de las necesidades de evapotranspiración, las cuales eran determinadas mediante la

pérdida de peso de las materas. Asimismo, el criterio de tomar un 50% de humedad en el

suelo se fundamentó porque las plantas presentan reducción alteraciones en sus

relaciones hídricas en humedades del sustrato entre el 40 y 60 % (Costa-França et al.,

2000; Segura-Monroy et al., 2015).

Se desarrollaron cuatro muestreos de variables fisiológicas y bioquímicas a los 0, 5, 10 y

20 días de iniciado los diferentes tratamientos de estrés (DDT), donde las plantas con

periodo de estrés de 5 y 10 días contaron con 15 y 10 días de recuperación al final del

experimento, respectivamente. En general, las medidas fisiológicas fueron realizadas en

la segunda hoja trifoliada completamente expandida según la metodología utilizada por

Ghambari et al. (2013). Con respecto a las variables bioquímicas, se colectó material

vegetal, el cual fue homogenizado con nitrógeno líquido y posteriormente almacenado a -

Capítulo 2 21

80°C. Finalmente, el experimento duró aproximadamente 65 días a partir de la emergencia

de la totalidad de las plántulas

2.3.3 Diseño experimental y análisis de los datos

Se aplicó un diseño completamente al azar en el que se evaluaron cuatro tratamientos de

duración del estrés por déficit hídrico (cero, cinco, diez y veinte días). Cada tratamiento

consistió de cuatro repeticiones por tratamiento-muestreo (16 plántulas por tratamiento; 64

plántulas por todo el experimento). Posteriormente, cuando se presentaron diferencias

significativas en el ANAVA, se empleó la prueba comparativa de medias de Tukey a p ≤

0.05. Los datos se analizaron usando el programa Statistix v 9.0 (software analítico,

Tallahassee, FL, US).

2.3.4 Variables fisiológicas

Relaciones hídricas e intercambio gaseoso de la hoja

El contenido relativo de agua (CRA) fue determinado en hojas totalmente expandidas de

la parte media del follaje. Las hojas fueron recolectadas a los cinco, diez y veinte días

después del inicio del periodo de estrés hídrico para las plantas de cada uno de los

tratamientos. El CRA fue calculado mediante la siguiente ecuación

𝐶𝑅𝐴 = [𝑃𝐹 − 𝑃𝑆

𝑃𝑇 − 𝑃𝑆] 𝑋100 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1)

Siendo PF el peso fresco, PT el peso en turgencia medido después de 24 horas de

saturación en agua destilada a 4 °C en la oscuridad y PS es el peso seco determinado

después de 48 horas en un horno a 70°C.

2

2



La fotosíntesis fue estimada usando un medidor de fotosíntesis portable (LI-COR 6200,

Lincoln, NE, USA), a los 45, 50, 55 y 65 DDE (0, 5, 10 y 20 DDT) entre los periodos

comprendidos de las 930 a 1100 h y 1330 a 1500 h durante tres días seguidos a partir del

penúltimo día antes de finalizar el periodo de estrés de cada tratamiento. Asimismo, este

equipo estimó la concentración interna de dióxido de carbono. Adicionalmente, se calculó

la relación Carbono intercelular entre el Carbono atmosférico (Ci/Ca). La conductancia

estomática y la traspiración se midió en la segunda hoja trifoliada completamente

expandida con la ayuda de un porómetro portable (LI-COR 1600, Lincoln, NE, USA). Del

mismo modo, se calculó la eficiencia en el uso del agua como producto de la relación entre

la fotosíntesis y la transpiración. Las mediciones se realizaron entre los periodos

comprendidos de las 930 a 1100 h y 1330 a 1500 h. Durante las mediciones las condiciones

fueron las siguientes: Radiación fotosintéticamente activa 800 μmol m-2 s-1, temperatura de

la hoja 27 ± 5 °C, diferencia de presión de vapor del aire de la hoja 1.8 ± 0.5 kPa.

Parámetros de fluorescencia, contenido de clorofilas y carotenoides

Para la determinación de los parámetros de fluorescencia de PSII, se empleó un

fluorómetro modulado (MINI-PAM, Walz, Effeltrich, GE). Las medidas fueron tomadas

entre las 700 y 1000 h en la segunda hoja trifoliada completamente expandida desde la

parte superior del dosel a los 45, 50, 55 y 65 DDE (0, 5, 10 y 20 DDT). Las relaciones de

fluorescencia fueron determinadas con un pulso máximo de intensidad de luz de hasta

2.600 µmol m-2 s-1 en la superficie de la muestra de la hoja, adaptando previamente a la

oscuridad durante 10 minutos. Para las mediciones de clorofilas y carotenoides, las

muestras de tejidos foliar (0.03 g aprox. de la segunda hoja trifoliada completamente

expandida) fueron homogenizadas en 2 mL de acetona (80%), centrifugada para eliminar

partículas y el sobrenadante diluido a un volumen final de 6 mL adicionando acetona (Sims

y Gamon, 2002). El contenido de clorofila fue determinado a 663 y 646 nm y carotenoides

a 470 nm utilizando un espectrofotómetro (Spectronic BioMate 3 UV–vis Thermo, Madi-

son, WI, USA). Para obtener el contenido de pigmentos fotosintéticos en hoja, se

emplearon las ecuaciones para acetona descritas por Wellburn (1994).

Capítulo 2 23

2.3.5 Variables bioquímicas

MDA y daño en la permeabilidad de la membrana en fuga de electrolitos

Para la determinación de la oxidación lipídica (Malondialdehido-MDA), se empleó el

método del ácido tiobarbitúrico (TBA) descrito por Hodges et al. (1999) tomando aprox. 0.3

g de material vegetal homogenizado y almacenado con nitrógeno líquido. Las muestras

luego de ser centrifugadas se les estimó las absorbancias a 440, 532 y 600 nm con un

espectrofotómetro (Spectronic BioMate 3 UV - Vis, Thermo, Madison, WI, USA). Por último,

se utilizó un coeficiente de extinción (157 M mL-1) para la obtención de la concentración de

MDA.

El daño de la membrana plasmática estimada en el porcentaje de fuga de electrolitos se

determinó por el método descrito por Jiang and Zhang (2001) modificado. Extrayendo 5

discos de 0.5 dm de diámetro de la segunda hoja trifoliada completamente expandida. Se

utilizó 25 mL de agua desionizada como medio en tubos falcon de 50 mL de capacidad, a

las cuales se les registró la conductividad eléctrica inicial (CE1) luego de dos horas en baño

de agua a 30°C y la conductividad eléctrica final (CE2) del medio después de 20 min en

baño de agua a 90°C. El porcentaje de electrolitos se calculó aplicando la siguiente

ecuación:

𝐹𝑢𝑔𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑙𝑖𝑡𝑜𝑠 (%) = (𝐶𝐸1

𝐶𝐸2) 𝑥 100 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 2)

Concentración de Prolina

Para la determinación del contenido de prolina, utilizamos el método descrito por Bates et

al. (1973), extrayendo de la segunda hoja trifoliada completamente expandida

aproximadamente 0.3 g de material vegetal homogenizado y almacenado con nitrógeno

líquido. La absorbancia se medió a 520 nm usando un espectrofotómetro (Spectronic

2

4



BioMate 3 UV - Vis, Thermo, Madison, WI, USA). El contenido de prolina se determinó

mediante una curva estándar y calculada en peso fresco basado en la ecuación 3:

𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑃𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎

𝑔 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑓𝑟𝑒𝑠𝑐𝑜=

[(

𝜇𝑔 𝑃𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎𝑚𝐿

𝑥 𝑚𝐿 𝑇𝑜𝑙𝑢𝑒𝑛𝑜)

115.5 𝜇𝑔𝜇𝑚𝑜𝑙

]

[𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

5 ] (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 3)

2.4 Resultados

2.4.1 Intercambio gaseoso y relaciones hídricas.

Resultados del Contenido Relativo de Agua (CRA) en la hoja se muestran en la Figura

2-1. En general, plantas de los tratamientos control y cinco días de déficit hídrico mostraron

un CRA aproximadamente del 90% a lo largo de los diferentes periodos de exposición al

estrés. Asimismo, diferencias significativas se observaron a los 10 días de iniciado los

tratamientos de estrés hídrico (DIT). En este punto, plántulas de frijol de los tratamientos

de 10 y 20 días de duración de estrés empezaron a registrar un menor CRA (73.3 y 75.7%

respectivamente). Adicionalmente, un CRA del 30% fue obtenido cuando las plántulas

estuvieron bajo una condición estresante de 20 días, situando a este grupo de plantas

cerca del punto de marchitez permanente, en el que se han reportado que valores

inferiores al 40% en el CRA están relacionados con condiciones de punto de marchitez

permanente (Lacape et al., 1998; Korir et al., 2006). Finalmente, estos resultados permiten

indicar que se poseían diferentes estatus hídricos durante los diferentes periodos de

exposición.

Capítulo 2 25

Figura 2-1. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre el contenido hídrico relativo de la hoja (CRA)

en plántulas de fríjol arbustivo cultivar ICA-CERINZA. Los puntos son el promedio de cuatro datos. Las barras representan ± error estándar. Promedios seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

2

6



Los resultados de las variables de intercambio gaseoso de la hoja (fotosíntesis (Pn),

conductancia estomática (gs) y transpiración (E)), los resultados son resumidos en la

Figura 2-2 (A, B y C, respectivamente). La Figura 2-2A muestra las diferencias

significativas a partir de los primeros 5 días de iniciado el estrés hídrico, donde la tasa de

fotosíntesis se redujo en más del 50% en las plantas de los tratamientos de cinco, diez y

veinte días de estrés. Asimismo, esta tendencia se mantuvo entre tratamientos a los 10

DDT. Al final del experimento (20 DDT), la Pn siguió en los mismos bajos valores en las

plantas que fueron sometidas durante 10 y 20 días a estrés. Mientras los valores de Pn en

el tratamiento de 5 días de estrés mostraron una recuperación y alcanzaron niveles

cercanos a las plantas control. Por otro lado, la gs también se vio afectada negativamente

en los diferentes tratamientos a partir de los 10 DDT con un descenso en los valores de

aproximadamente el 45% en todos los tratamientos de estrés hídrico con respecto al

control. Asimismo, esta variable de intercambio gaseoso mostro una mayor reducción

(alrededor del 95%) en el tratamiento de veinte días de estrés al final del ensayo. Mientras,

las plantas expuestas cinco y diez días 5 y 10 días de duración del periodo de estrés

mostraron una recuperación en la gs con respecto a las plantas control (Figura 2-2B). En

este sentido, la reducción de la conductancia estomática está relacionada con los bajos

valores de fotosíntesis y las mismas tendencias para todos los Figura 1-1tratamientos

fueron observadas en los resultados de la tasa de transpiración, donde los valores más

bajos se pudieron apreciar en el tratamiento de 20 días de estrés, con una disminución

mayor al 70% al final del ensayo (Figura 2-2C). Sin embargo, el uso eficiente del agua

(UEA) mostró diferencias significativas entre los tratamientos a partir de los 5 días de

iniciado el periodo de estrés, aunque los cambios más marcados se evidenciaron en el

último muestreo (20 DDT). En este punto el UEA en plantas que estuvieron bajo 20 días

de periodo de estrés fue diez veces mayor en comparación con los demás tratamientos

(Tabla 2-1).

Capítulo 2 27

Figura 2-2. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre parámetros de intercambio gaseoso de la hoja en plántulas de fríjol arbustivo cultivar ICA-CERINZA: A). Fotosíntesis neta (Pn); B). Conductancia estomática (gs) y C). Transpiración (E). Las barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar. Promedios seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

2

8



Tabla 2-1. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre el Uso Eficiente del Agua (UEA), Carbono

intercelular (Ci) y Relación Carbono intercelular sobre el Carbono atmosférico de la hoja (C i/Ca) en plántulas de fríjol arbustivo cultivar ICA-CERINZA.

UEA (µmol mol-1 H2O)

Tratamiento Días después de iniciado el estrés

0 5 10 20

0 días 1,87 ± 0,33 5,52 ± 2,00 bz 3,08 ± 0,12 b 4,66 ± 1,22 b

5 días 1,44 ± 0,20 14,94 ± 2,30 a 2,99 ± 0,05 b 2,98 ± 0,51 b

10 días 1,41 ± 0,19 17,74 ± 0,62 a 4,00 ± 0,06 a 3,37 ± 0,40 b

20 días 1,73 ± 0,29 16,55 ± 1,85 a 4,30 ± 0,06 a 43,78 ± 5,67 a

Significancia NSy ** *** ***

C,V, (%)x 29,96 28,02 4,71 37,88

Ci (ppm)


0 5 10 20

0 días 325,70 ± 7,98 332,36 ± 6,61 336,33 ± 5,30 b 332,36 ± 6,61 b

5 días 311,31 ± 2,78 318,05 ± 3,61 355,70 ± 7,54 b 318,05 ± 3,61 b

10 días 313,76 ± 9,06 328,21 ± 2,09 399,53 ± 8,41 a 328,21 ± 2,09 b

20 días 308,63 ± 2,66 317,65 ± 2,35 396,69 ± 6,40 a 385,15 ± 9,87 a

Significancia NS NS *** ***

C,V, (%) 4,08 2,52 3,66 3,69

Ci/Ca


0 5 10 20

0 días 0,81 ± 0,04 0,81 ± 0,02 0,82 ± 0,01 b 0,81 ± 0,02 b

5 días 0,78 ± 0,01 0,77 ± 0,01 0,80 ± 0,03 b 0,77 ± 0,01 b

10 días 0,79 ± 0,02 0,80 ± 0,01 0,94 ± 0,00 a 0,80 ± 0,01 b

20 días 0,78 ± 0,01 0,79 ± 0,00 0,93 ± 0,00 a 0,95 ± 0,02 a

Significancia NS NS *** ***

C,V, (%) 4,43 2,27 2,97 3,45 z Valores dentro una columna seguidos por diferentes letras son significativamente diferentes a P≤ 0.05 según el test de Tukey. y N.S.= No significativo (P≤ 0.05). **, *** Significativo a P≤ 0.01 o P≤ 0.001 x C.V.: Coeficiente de variación

Capítulo 2 29

Adicionalmente, en el contenido de carbono intercelular (Ci) se encontraron diferencias

significativas a partir de los 10 días de estrés, evidenciándose un incremento

aproximadamente del 15% en las plantas sometidas a tres diferentes periodos de duración

de déficit de agua en el suelo comparadas con plantas control. Al final del experimento,

las plantas de frijol que estuvieron durante 20 días de estrés continuaron mostrando una

mayor Ci Mientras, las plantas con cinco y diez días de estrés sus niveles internos CO2

estuvieron cercanos a los observados en las plantas control. Finalmente, la relación

Carbono intercelular sobre el Carbono atmosférico presentó diferencias significativas a los

10 y 20 DDT. Se pudo observar que las mayores valores fueron obtenido para los

tratamientos de mayor duración de sequía (10 y 20 días de sequía respectivamente) con

respecto al tratamiento control y cinco días de duración de estrés con respecto al tercer

muestreo (10 DDE). A los 20 DDE, el único tratamiento que mostro diferencias con

respecto a los otros tres tratamiento fueron aquellas plántulas que tuvieron el periodo de

estrés más prolongado (20 días). En este punto de muestro, la relación Ci/Ca fue 18%

mayor comparado al control.

2.4.2 Parámetros de fluorescencia del fotosistema II, contenido de clorofilas y carotenoides totales

En cuanto a los parámetros de fluorescencia, resultados de la eficiencia máxima del

quantum en el fotosistema II (Fv/Fm), Eficiencia real del fotosistema II (YII), quenching no

fotoquímico (QNP) y quenching fotoquímico (qP) se muestran en la Figura 2-3(A, B, C y D

respectivamente). Diferencias significativas fueron encontradas en las plantas de todos los

tratamientos a los 20 días después de haber iniciado el estrés; donde las mayores

reducciones en la Fv/Fm, Y(II) y qP se evidencian en las plantas que fueron sometidas a un

periodo de 20 días de estrés. Sin embargo, una tendencia opuesta fue observada sobre el

QPN donde este índice presentó un incremento, indicando que una estrategia de

aclimatación es la disipación de energía en el fotosistema II a través de la producción de

calor.

3

0



Por otro lado, la Figura 2-4 se muestra los resultados obtenidos en la cuantificación del

contenido de clorofila a, b, total y contenido de carotenoides totales. Se puede observar

que para los tres primeros muestreos (a los cero, cinco y diez DDE) no se obtuvieron

diferencias significativas en la concentración de los pigmentos fotosintéticos evaluados. En

el último muestro (20 DDT) se observó una reducción en el contenido de clorofila a, b y

total del ~25%, ~7% y ~17% respectivamente en las plantas de frijol que estuvieron

sometidas al periodo de estrés de mayor duración. Sin embargo, la producción de

carotenoides totales presento un incremento en general para los tratamientos que

contaron con algún periodo de estrés. Asimismo, las plántulas que estuvieron bajo 20 días

de sequía mostraron un incremento aproximadamente del doble de la concentración de los

carotenoides totales obtenida en el tratamiento control.

Figura 2-3. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre parámetros de fluorescencia del fotosistema II plántulas de fríjol arbustivo cultivar ICA-CERINZA: A). Eficiencia máxima del quantum en el fotosistema II (Fv/Fm); B). Quenching fotoquímico (qP); C). La eficiencia real del fotosistema II (Y(II)) y D). Quenching no

fotoquímico (QNP) en plántulas de fríjol arbustivo. Las barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar. Promedios seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

Capítulo 2 31

Figura 2-4. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre contenido de clorofilas y carotenoides totales en plántulas de fríjol arbustivo cultivar ICA-CERINZA: A). Contenido de clorofila total; B). Contenido de clorofila a; C). Contenido de clorofila b y D). Contenido de carotenoides totales en plántulas de fríjol arbustivo. Las

barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar. Promedios seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

2.4.3 Daño de la membrana por estrés oxidativo y la producción de osmolitos.

En cuanto al daño de la membrana por estrés oxidativo y producción de osmolitos,

resultados del porcentaje de fuga de electrolitos, producción de malondialdehido (MDA) y

prolina se muestran en la Figura 2-5A, B y C respectivamente. Diferencias significativas

3

2



fueron observadas entre los diferentes tratamiento en las variables anteriormente

mencionada a partir de los 10 DDT, sin embargo, estas diferencias fueron más notorias al

final del experimento (20 DDT). En este punto de muestreo, la mayor pérdida de electrolitos

se evidencia en el tratamiento de 20 días de duración del periodo de estrés, alcanzando

valores cercanos al 50%; mientras que los tratamientos de 5 y 10 días no superaron niveles

del 20% y 18%, respectivamente; siendo los niveles del tratamiento control no mayores al

16% (Figura 2-5A). Lo anterior se puede relacionar con el incremento en la producción de

MDA donde los mayores valores también se obtuvieron en el tratamiento de 20 días de

estrés, En este grupo de plantas fue encontrada una producción de MDA cercana al doble

a los valores presentados en el tratamiento control (Figura 2-4B). Asimismo, la producción

de prolina fue favorecida en todos los tratamientos que tuvieron estrés hídrico a los cinco

y diez DDT. Sin embargo, las plantas expuestas a 20 días de déficit de agua se presentaron

los mayores valores de 350 µmol g-1 PF comparado con los 25 µmol g-1 FW encontrados

en hojas de plantas frijol control y sometidas a cinco y diez días de sequía.

Capítulo 2 33

Figura 2-5. Efecto de diferentes periodos de estrés hídrico sobre el daño de la membrana por estrés oxidativo y la producción de osmolitos: A). Fuga de electrolitos; B). Producción de malondialdehido (MDA) y C).

Producción de prolina en plántulas de fríjol arbustivo. Las barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar. Promedios seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes según la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

3

4



2.5 Discusión

El contenido relativo de agua de la hoja (CRA) es una de las variables de gran importancia

fisiológica que ayuda a cuantificar el estado hídrico de una planta tanto en condiciones

normales como de sequía (Keyvan., 2010). Cuando el CRA presenta una reducción en los

valores ayuda a inferir que las relaciones hídricas pueden estar siendo afectadas por una

condición abiótica adversa, lo cual puede repercutir en algunos procesos fisiológicos como

una reducción de la tasa fotosintética (Costa-França et al., 2000). Los resultados

encontrados en el presente estudio muestran que a medida que el estrés por déficit hídrico

era más prolongado, se podía evidenciar una reducción de los valores del CRA en las

plantas de los diferentes tratamientos, especialmente en las plantas que estuvieron

sometidas durante 20 días de estrés. Costa-França et al., 2000 y De Laat, 2014

argumentan que un menor CRA está relacionado con una baja tasa de fotosíntesis

principalmente debido a una limitación por cierre de estomas, la cual se refleja en los

valores bajos de la conductancia estomática y transpiración. Adicionalmente, Huang et al.,

(2011) señalan que un ajuste estomático es una estrategia común para evitar una

condición de sequía en plantas y que una menor Pn puede ser ocasionada por: i) una

limitación estomática que reduce simultáneamente la gs y Ci o ii) una limitación no

estomática como el aumento de la Ci. En este estudio, la Pn mostro una reducción

alrededor de un 50% y la Cí aumento alrededor de un 398 ppm y 385 ppm cuando las

plantas estuvieron entre 10 y 20 días de exposición a un déficit hídrico, respectivamente.

Lo anterior indica que las plantas de frijol presentaron una limitación no estomática, lo cual

se reflejó en una menor Pn y a su vez en un incremento de la Ci (Farquhar y Sharkey,

1982). Por otro lado, el UEA fue mayor cuando el periodo de estrés hídrico aumentaba en

este trabajo. En este aspecto, Huang et al. (2011) señalan que un alto UEA provee una

evidencia del papel de los estomas en mantener un alto contenido de agua en los tejidos

de la hoja bajo condiciones de déficit hídrico. Asimismo, un alto UEA puede conducir a una

alta actividad fotosintética, sin embargo, ellos señalan que estos morfogenéticos y

metabólicos son requeridos con el propósito de un mejor entendimiento de la relación entre

cierre estomático y UEA. Por otro lado, el efecto negativo que puede generar una

condición de déficit hídrico sobre la eficiencia máxima del PSII fotoquímica (Fv/Fm), la

eficiencia real del fotosistema II (Y(II)), quenching fotoquímico y no fotoquímico (qP y QNP)

Capítulo 2 35

depende de la duración y la severidad del estrés (Aranjuelo et al, 2011). En este contexto,

los resultados obtenidos indican que un periodo de 20 días de duración de estrés hídrico

redujo significativamente los parámetros del fotosistema II (Fv/Fm, Y(II) y qP).

Adicionalmente, un déficit hídrico generó un estrés moderado ya que solo presentó

limitaciones de la fotosíntesis de tipo estomático, mientras que un periodo de 20 días de

déficit hídrico generó un estrés severo, ya que se evidenciaron limitaciones de la

fotosíntesis te tipo estomático y no estomático. Similares observaciones fueron obtenidas

por Dias y Brüggemann. (2010) en Phaseolus vulgaris donde encontraron que plantas bajo

condición de estrés hídrico reducen el qP considerablemente comparadas con las plantas

control. De igual manera, se evidencia un incremento en el NPQ como medida principal de

disipación de energía en el PSII bajo condiciones de estrés abiótico (Perveen et al., 2010;

Aranjuelo et al, 2011; Gorbe y Catalayud., 2012).En el presente trabajo, se observó

también un incremento del NPQ, especialmente, en las plantas con 20 días de déficit

hídrico. Cousins et al. 2002 señalan que un mayor NPQ puede ser un mecanismo de

protección en contra de la fotoinhibición y fotodaño bajo estrés hídrico. Con respecto a la

producción de pigmentos fotosintéticos, se observó que el contenido de clorofilas totales

mantuvo valores cercanos a los obtenidos en las plantas control a los 0, 5 y 10 DDT (~1400

µg mg-1 PF). Similares observaciones fueron obtenidas por Aranjuelo et al., (2011) donde

la clorofila total no varió significativamente entre las plantas con estrés hídrico vs las

plantas control, debido a que el estrés hídrico de 5 y 10 días de duración en fríjol no

degrada los pigmentos fotosintéticos. Sin embargo, las plántulas de frijol con un periodo

de estrés de 20 días si mostraron un descenso en el contenido de clorofila total con

respecto al control. La disminución del contenido clorofila bajo condiciones de déficit

hídrico ha sido también reportada en otras especies, dependiendo la severidad y la

duración del estrés (Mafakheri et al., 2010). En este aspecto, una reducción del contenido

total de clorofila bajo estrés hídrico señala una baja capacidad de los centros de reacción

de la luz con el propósito evitar daños de especies reactivas de oxígeno, ya que la

producción de estas es impulsado principalmente por el exceso de absorción de energía

en el aparato fotosintético (Herbinger et al., 2002). Por otro lado, la concentración de

carotenoides totales se incrementó en las plantas a medida que el periodo de estrés era

mayor (Fig. 4). Los resultados sugieren que la producción de carotenoides obedecen a una

estrategia de aclimatación a la condición estresante, la cual está involucrada en las

funciones antioxidantes de dichos pigmentos (Efeoğlu et al., 2009).

3

6



El uso de marcadores bioquímicos como MDA y prolina también han sido ampliamente

evaluados para evaluar el grado de aclimatación de las plantas a condiciones de estrés

por déficit hídrico (Keyvan., 2010; Türkan et al., 2005). En el presente estudio, la

concentración de prolina era mayor comparada en las plantas control, especialmente

cuando las plantas del cultivar Cerinza tenían un estrés de 20 días de déficit hídrico (353.6

µmol g-1 PF en plantas estresadas vs 20.04 µmol g-1 PF en plantas control). En general, la

literatura menciona que la relación entre la acumulación de prolina y estrés ambiental

sugiere que este aminoácido puede tener una función de tipo de protección que ayuda a

la planta en su proceso de aclimatación a esa condición de déficit hídrico (Farooq et al.,

2009). Adicionalmente, Cao et al. (2008) reporta que la producción y acumulación de MDA

en plantas expuestas a condiciones de estrés es considerado como un indicador de

peroxidación lipídica, es decir que a mayor valor mayor daño a la membrana de la

integridad estructural de las membranas sometidas a condiciones de estrés hídrico.

Similares observaciones han sido reportadas por Türkan et al. (2005) donde encontraron

una mayor acumulación de MDA (50% mayor en plantas estresadas), lo cual les indico que

las plantas sufrieron un daño severo causado por la condición estresante (Türkan et al.,

2005; Farooq et al., 2009; Keyvan., 2010).

2.6 Conclusiones

• En el presente estudio se identificó que un periodo de déficit hídrico (50% humedad

del suelo) superior a quince días causó una afectación negativa sobre la fisiología

de plantas de frijol arbustivo (ICA-CERINZA) debido a un mayor estrés oxidativo y

una menor fotosíntesis.

3. Capítulo 3. Evaluación fisiológica y bioquímica de cinco cultivares de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.) bajo condición de estrés por déficit hídrico.

3.1 Resumen

La agricultura mundial se ha visto afectada negativamente por la baja disponibilidad de

agua en épocas de sequía, como consecuencia de la variabilidad climática y el cambio

climático, generando condiciones de estrés en las plantas por déficit hídrico, afectando

cultivos de importancia en la dieta humana como el fríjol. Por tal motivo, el objetivo de esta

investigación fue evaluar las respuesta fisiológicas y bioquímicas de cinco cultivares de

fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.) bajo una condición de estrés por déficit hídrico de

15 días en una etapa vegetativa. Sembrando semillas de los cultivares de fríjol ICA-

Cerinza, ICA-Bachue, NUA35, Bacatá y Bianca se realizó un diseño completamente al azar

en arreglo factorial (factor principal el estatus hídrico y factor secundario los cultivares)

para un total de 10 tratamientos con cuatro repeticiones. Para cuantificar las respuestas

fisiológicas, se realizaron medidas de fotosíntesis, fluorescencia del PSII, acumulación de

materia seca, pigmentos, prolina y malondialdehido. La tasa de fotosíntesis, conductancia

estomática, clorofilas, y relaciones de fluorescencia se reducen en todos cultivares que

tuvieron condición de estrés. Asimismo, se evidencia una mayor fuga de electrolitos,

acumulación de carotenoides totales, MDA y prolina en las plantas que fueron afectadas

por un periodo de 15 días de déficit hídrico. En conclusión, los cinco cultivares de fríjol

arbustivo evaluados en la etapa vegetativa se vieron afectados negativamente en variables

fisiológicas evaluadas a causa de un déficit hídrico de 15 días, aunque los cultivares más

afectados fueron Bacatá y Bianca.

Palabras clave: Polietilenglicol, estrés oxidativo, partición de asimilados.



3.2 Introducción

La producción agrícola está siendo afectada negativamente por condiciones climáticas

adversas acentuadas en los escenarios de cambio climático durante los últimos años en

Colombia (Miranda, 2009). Este sentido, el cambio climático ha incidido en el incremento

de áreas afectadas por condiciones de baja disponibilidad de agua, propiciando

condiciones de estrés hídrico (Monasterio et al., 2011). Asimismo, fenómenos de

variabilidad climática tales como El Niño/ Oscilación del Sur (ENOS) han generado un

incremento de las temperaturas y menor volumen y frecuencia de las precipitaciones

durante ciertas épocas del año (Li et al., 2011; Ruiz y Pabón, 2013). En este aspecto, se

ha reportado que Fenómenos del Niño pueden causar una disminución en la oferta hídrica

alrededor del 50% en más de 180 municipios del país (UNGRD, 2014). Igualmente, según

reportes de la Comunidad Andina (2009), Colombia posee un área cercana de los 59.000

km2 expuesta a sequía, encontrando gran parte de esta área en la región andina donde el

fríjol es comúnmente cultivado y esta puede incrementar por el escenario de cambio

climático tienden a incrementar.

Asimismo, el fríjol (Phaseolus vulgaris L.) es una especie de leguminosa perteneciente a

la familia Fabaceae cuyo centro de domesticación es meso y Suramérica (Kalavacharla et

al., 2011; Kumar et al., 2015), de gran importancia en la dieta familiar en América Latina

por su contenido de proteínas, carbohidratos, vitaminas y minerales (FAO, 2007). En

Colombia, esta especie alcanzó una producción de 62,974 toneladas durante el primer

semestre del año 2015 con un rendimiento promedio de 1.3 ton ha-1 (Fenalce, 2016).

Por otro lado, las plantas presentan diferentes tipos de respuestas como cambios

anatómicos, fisiológicos y bioquímicos a condiciones de baja disponibilidad de agua,

ocasionando afectaciones negativas sobre el crecimiento, desarrollo y rendimiento (Farooq

et al., 2009; Sánchez-Reinoso et al., 2014; Segura-Monroy et al., 2015). Con respecto a

las variables fisiológicas, las propiedades de intercambio gaseoso de la hoja (fotosíntesis,

conductancia estomática y transpiración), se ha reportado que bajo condiciones de estrés

por déficit hídrico la tasa fotosintética y la transpiración tienden a disminuir como

consecuencia a un cierre de estomático (Rosales et al., 2012; Yousfi et al., 2012). En

Capítulo 39

cuanto al estatus hídrico de la hoja, las plantas de fríjol sometidas a condiciones de estrés

por déficit hídrico presentan cambios en el estatus hídrico de la hoja tales como incremento

del potencial hídrico, reducción del Contenido Relativo de Agua y un incremento en el Uso

Eficiente del Agua tanto extrínseco como intrínseco, con la finalidad de disminuir la pérdida

de agua por procesos de transpiración (Miyashita et al., 2005; Farooq et al., 2009; Keyvan.,

2010; De Laat, 2014). Adicionalmente, varios estudios han reportado que periodos de

déficit hídrico provocan cambios en los componentes de la fase lumínica de la fotosíntesis

tales como una disminución sobre el contenido de clorofila en las hojas, la eficiencia

máxima del PSII fotoquímica (Fv/Fm) y el quenching fotoquímico (qP); de lo contrario, se

ha observado un incremento en el quenching no fotoquímico (NPQ) como una estrategia

de disipación de energía en forma de calor (Perveen et al., 2010; Aranjuelo et al, 2011;

Gorbe y Catalayud., 2012).

El estrés por déficit hídrico también genera una serie de respuestas bioquímicas que son

indicadores de tolerancia o susceptibilidad de plantas (Ahmed y Hassan, 2001; Aranjuelo

et al, 2011; Mohamed y Ibrahim, 2011;). En este contexto, las plantas de tomate expuestas

a un periodo de 22 días de estrés por déficit hídrico presentaron afectaciones a nivel de la

estabilidad de la membrana debido a la peroxidación lipídica, causando una producción de

iones de peróxido y malondialdehido (MDA) (Sánchez-Rodríguez et al., 2010). Del mismo

modo, cambios en la concentración de MDA pueden ser considerado otro indicador de

estrés oxidativo de las membranas sometidas a condiciones de estrés hídrico (Cao et al.,

2008). Adicionalmente, Sun et al. (2013) encontraron que condiciones de estrés hídrico

estimulan la producción de metabolitos secundarios tales como prolina, que cumplen

diversas funciones en las plantas en procesos como la regulación osmótica, el

mantenimiento de la estabilidad de la membrana, ser fuente de carbono y entre otras.

Igualmente, Ahmed y Hassan (2011) reportaron que valores altos de prolina están

asociados a genotipos con mejor aclimatación a estreses ambientales. Por otro lado, el

estudio de las respuestas fisiológicas de diferentes cultivares bajo estrés por déficit hídrico

ha permitido conocer las posibles estrategias de las plantas que les ayudan a sobrellevar

esta condición abiótica adversa y asimismo, tener una comprensión de los mecanismos

fisiológicos involucrados en sus respuestas de aclimatación que repercuten en el

funcionamiento de la planta y posteriormente en el rendimiento del cultivo (Chaves et al.,

2002; Farooq, et al., 2009, Xu et al., 2010).



Asimismo, se han desarrollado estudios en diferentes genotipos de frijol a condiciones de

déficit hídrico y han observado diferencias en sus comportamiento fisiológico y bioquímico

bajo esta condición adversa (Beebe et al., 2013). Muchos estudios reportan los efectos en

el rendimiento de genotipos con rasgos de tolerancia a condiciones están más

influenciados por una mayor longitud de raíz (White y Castillo., 1992). Lo anterior, también

relaciona el tamaño de las raíces con el estatus hídrico de la hoja (Sanders y Markhart.,

1992). También, Rao et al. (2006a) concluyeron que una de las características de dos

genotipos de fríjol con rasgos de tolerancia a estrés por sequía es la capacidad de movilizar

fotosintatos al grano en desarrollo con el fin de utilizar el nitrógeno adquirido de forma más

eficiente para la producción de granos. Por lo tanto, identificar y priorizar parámetros

fisiológicos y bioquímicos tales como menor reducción de la tasa fotosintética, menor tasa

de transpiración, mayor eficiencia en el uso del agua, producción de metabolitos

secundarios como prolina, menor daño a nivel de membrana han sido características de

gran importancia para clasificar genotipos susceptibles y/o tolerantes a estrés hídrico

(Farooq, et al., 2009; Mohamed y Ibrahim, 2011; Yousfi et al., 2012).

Dado lo anterior, es importante desarrollar investigaciones con el propósito conocer el

comportamiento de diferentes genotipos de fríjol bajo estas condiciones que puedan

contribuir en programas de fitomejoramiento y/o zonificación agrícola (Polanía et al, 2009;

Restrepo-Díaz et al., 2010; Yousfi et al., 2012; Cardona-Ayala et al., 2014). Hong-Bo et al.

(2006) encontraron que en 10 diferentes genotipos de trigo sometidos a condición de estrés

por sequía producían prolina en diferentes concentraciones, y aquellos con mayor nivel de

prolina tenían un mayor ajuste osmótico. Del mismo modo, Sánchez-Rodríguez et al.

(2010) reportaron que en plantas de cinco diferentes genotipos de tomate tenían diferente

grado de respuestas en parámetros como el contenido relativo de agua de la hoja (con

genotipos susceptibles perdían mayor cantidad de agua en la hoja), acumulaban menor

cantidad de materia seca, la producción de MDA y peróxido de hidrógeno incrementa

(cuyos niveles eran más altos en genotipos susceptibles), al igual que una alta producción

de sustancias antioxidantes tales como peroxidasas, catalasas, glutatión reductasa, entre

otros en los genotipos tolerantes. Igualmente, otro beneficio de evaluar las respuestas

fisiológicas y bioquímicas en plántulas de diferentes cultivares de fríjol expuestas a estrés

por déficit hídrico es caracterizar posible respuestas de aclimatación y sobrevivencia a la

condición ambiental adversa estudiada. En consecuencia, el objetivo de esta investigación

Capítulo 41

fue evaluar las respuesta fisiológicas como la fotosíntesis, conductancia estomática,

transpiración, carbono interno, contenido relativo hídrico de la hoja y pérdida de electrolitos;

y bioquímicas como la producción de malondialdehido y prolina de cinco cultivares de fríjol

arbustivo (Phaseolus vulgaris L.) bajo una condición de estrés por déficit hídrico.



Semillas de cinco cultivares de fríjol arbustivo fueron usadas en el presente estudios. Los

cultivares estudiados fueron los siguientes: i) ICA-Cerinza e ICA-Bachue son dos

materiales con 20 años de siembra en la agricultura tradicional colombiana, ii) NUA35 es

un genotipo con siete años de comercialización desde su liberación y iii) Bianca y Bacatá

son dos cultivares de reciente liberación (menos de dos años). Las semillas fueron

pregerminadas en una cámara de crecimiento durante siete días bajo condiciones de

oscuridad con 75% HR y 25 °C de temperatura ambiental antes de ser trasplantadas.

Posteriormente, las plántulas de cada genotipo fueron trasplantadas a un sistema de

hidroponía flotante con recipientes de vidrio de 80 L de capacidad. El ensayo fue llevado a

cabo en el laboratorio de Fisiología de Cultivos de la Facultad de Ciencias Agrarias de la

Universidad Nacional de Colombia ubicado en la ciudad de Bogotá a una altura de 2556

msnm, (4°35’56’’ y 74°04’51’’) durante 55 días (septiembre a noviembre del 2014). Las

condiciones de crecimiento del laboratorio durante la evaluación fueron temperatura

promedio de 22°C, humedad relativa de 60 a 80% y un fotoperiodo artificial con lámparas

de luz incandescente de 12 h con una PAR de 800 µmol m-2 s-1.

Las plantas fueron establecidas en una solución de hidroponía (Nutri-Ponic, Walco S.A.,

Bogotá D.C., Colombia) a una dosis de 2.5 mL L-1. La composición de la solución nutritiva

fue: N nítrico, 40.3 g L-1, N amoniacal, 4 g L-1; P asimilable (P2O5), 20.4 g L-1; K soluble

(K2O), 50.6 g L-1; 28.8 g L-1 Ca; 11.4 g L-1 Mg; 1.0 g L-1 S; 1120 mg L-1 Fe; 112 mg L-1 Mn;

12.0 mg L-1 Cu; 26.4 mg L-1 Zn; 106 mg L-1 B; 1.2 mg L-1 Mo y 0.36 mg L-1 Co.



Adicionalmente, la solución tenía una conductividad eléctrica (C.E) de 2.0 mmhos cm-3 -

pH en una solución 1:200 (v/v) 5.8. El sustrato líquido se cambiaba cada 15 días

suministrando la concentración inicial, manteniendo un volumen aproximado de solución

nutritiva en todos los recipientes de 42 L.

3.3.2 Tratamiento de déficit hídrico y determinación de las variables

El inicio del periodo de estrés hídrico fue establecido cuando las plantas alcanzaron el

estado fenológico BBCH (Feller et al., 1995b) 13-14 de (formación de 3 a 4 hojas trifoliadas

completamente expandidas) aproximadamente a los 40 días después del trasplante (DDT)

según la metodología reportada por Ghanbari et al. (2013). El tratamiento de déficit hídrico

en las plantas de frijol fue inducido mediante la adición de polietilenglicol (PEG 6000,

PanReac, Barcelona, España) a la solución nutritiva, a una dosis modificada de 20 g L-1

(DeLaat et al. 2014); la cual permite generar un estrés hídrico a partir de las 24 horas

después de aplicación del PEG 6000. El periodo exposición de las plantas a la solución

con polietilenglicol fue de quince días. Posteriormente, las diferentes las variables

fisiológicas y bioquímicas se estimaron al final del periodo de estrés (entre los 52 y 55

DDE). En general, las medidas fisiológicas fueron desarrollas en la segunda hoja trifoliada

completamente expandida entre los 52 y 55 días después de la emergencia (DDE). Con

respecto a las variables bioquímicas, se colectó 1.5 g de material vegetal, el cual fue

homogenizado con nitrógeno líquido y posteriormente almacenado a -80°C. Finalmente, el

experimento duró aproximadamente 55 DDE.


Se realizó un diseño completamente al azar en arreglo factorial donde el primer factor fue

el estado hídrico y el segundo factor fueron los cinco cultivares evaluados para un total de

10 tratamientos con cuatro repeticiones para un total de 40 plántulas. Antes del análisis,

los valores de porcentaje fueron transformados con la fórmula del arcoseno.

Capítulo 43

Posteriormente, cuando se presentaron diferencias significativas en el ANAVA, se empleó

la prueba comparativa de medias de Tukey a P ≤ 0.05. Los datos se analizaron usando el

programa Statistix v 9.0 (software analítico, Tallahassee, FL, US). Los resultados del

análisis de varianza son resumidos en la Tabla 3-1.




la parte media. Las hojas fueron recolectadas al final del periodo de estrés hídrico para

cada uno de los cultivares de fríjol evaluados. El CRA fue calculado mediante la siguiente

ecuación:


𝑃𝑇 − 𝑃𝑆] 𝑋100 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛. 1)




La fotosíntesis fue estimada en la segunda hoja trifoliada completamente expandida del

porción media superior de la planta usando un medidor de fotosíntesis portable (LI-COR

6200, Lincoln, NE, USA), entre los periodos comprendidos de las 930 a 1100 h y 1330 a

1500 h durante tres días seguidos a partir del penúltimo día antes de finalizar el periodo

de estrés. Asimismo, este equipo estimó la concentración interna de CO2. Adicionalmente,

se calculó la relación Carbono intercelular entre el Carbono atmosférico (Ci/Ca). La

conductancia estomática y la traspiración se midió en la segunda hoja trifoliada

completamente expandida con la ayuda de un porómetro portable (LI-COR 1600, Lincoln,

NE, USA). Del mismo modo, se calculó el uso eficiente del agua como producto de la

relación entre la fotosíntesis y la transpiración. La toma de los datos se realizó entre las



1000 y las 1500 horas entre los 52 y 55 DDE. Durante las mediciones las condiciones

fueron las siguientes: Radiación fotosintéticamente activa 800 μmol m-2 s-1, temperatura

de la hoja 27 ± 5 °C, diferencia de presión de vapor del aire de la hoja 1.8 ± 0.5 kPa.

Pesos secos y relación parte aérea/raíz

Las plantas fueron recolectadas los 55 DDT. Luego, las plantas se secaron en una estufa

de aire seco comprimido (ThelcoMod 27, Chicago, USA) a 70 °C durante 48 horas con el

propósito de obtener los pesos secos de hojas, tallos, raíces y total de la planta.

Igualmente, la relación parte aérea / raíz (PA/R) se calculó mediante la relación entre el

peso seco de la parte aérea sobre el peso seco de la raíz.


Para la determinación de los parámetros de fluorescencia de PSII, se utilizó un fluorómetro

modulado (MINI-PAM, Walz, Effeltrich, GE). Las medidas fueron tomadas entre las 700 y

1000 h en la segunda hoja trifoliada completamente expandida desde la parte superior del

dosel. Las relaciones de fluorescencia fueron determinadas con un pulso máximo de

intensidad de luz de hasta 2.600 µmol m-2 s-1 en la superficie de la muestra de la hoja,

adaptándola previamente a la oscuridad durante 10 minutos. Para las mediciones de

clorofilas y carotenoides, las muestras de tejidos (30 mg aprox. de la segunda hoja trifoliada

completamente expandida) fueron homogenizadas en 4 mL de acetona (80%),

posteriormente se llevaron las muestras a una centrífuga (Model 420101, Becton Dickinson

Primary Care Diagnostics, Maryland, USA) a 5000 rpm durante 10 min para eliminar

partículas y el sobrenadante diluido a un volumen final de 6 ml adicionando acetona (Sims

y Gamon, 2002). El contenido de clorofila fue determinado a 663 y 646 nm y carotenoides

a 470 nm utilizando un espectrofotómetro (Spectronic BioMate 3 UV–vis Thermo, Madison,

WI, USA). Para obtener el contenido de pigmentos fotosintéticos en hoja, se emplearon las

ecuaciones para acetona descritas por Wellburn (1994).

Capítulo 45

Índice Relativo de Tolerancia (RTI)

El cálculo del Índice Relativo de Tolerancia (RTI) fue obtenido mediante la metodología

empleada por Dutta Gupta et al. (1995), basada en el uso de la acumulación de material

seca total de la planta en los diferentes tratamientos y se utilizó la siguiente fórmula:

𝑅𝑇𝐼 = (𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑏𝑎𝑗𝑜 𝑠𝑒𝑞𝑢í𝑎

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑖𝑟𝑟𝑖𝑔𝑎𝑑𝑜) 𝑥 100 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 2


MDA e incremento de la permeabilidad de la membrana en fuga de electrolitos


método del ácido tiobarbitúrico (TBA) descrito por Hodges et al. (1999), donde se tomaron

0.3 g aprox. de material vegetal homogenizado y almacenado con nitrógeno líquido. Las

muestras luego de ser centrifugadas se les estimó las absorbancias a 440, 532 y 600 nm

con un espectrofotómetro (Spectronic BioMate 3 UV - Vis, Thermo, Madison, WI, USA).

Por último, se utilizó un coeficiente de extinción (157 M mL-1) para la obtención de la

concentración de MDA.

Por otro lado, el daño de la membrana plasmática estimada en el porcentaje de fuga de

electrolitos se determinó por el método descrito por Jiang and Zhang (2001) modificado.

Extrayendo 5 discos de 0.5 dm de diámetro de la segunda hoja trifoliada completamente

expandida. Se utilizó 25 mL de agua desionizada como medio en tubos falcon de 50 mL

de capacidad, a las cuales se les registró la conductividad eléctrica inicial (CE1) luego de

dos horas en baño de agua a 30°C y la conductividad eléctrica final (CE2) del medio

después de 20 min en baño de agua a 90°C. El porcentaje de electrolitos se calculó por el

uso de la siguiente ecuación:



𝐹𝑢𝑔𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑙𝑖𝑡𝑜𝑠 (%) = (𝐶𝐸1

𝐶𝐸2) 𝑥 100 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 3)


Para la determinación del contenido de prolina, se utilizó el método descrito por Bates et

al. (1973) donde se recolectaron de la segunda hoja trifoliada completamente expandida


líquido. La absorbancia se medió a 520 nm empleando el espectrofotómetro que se utilizó

en la cuantificación de pigmentos fotosintéticos (Spectronic BioMate 3 UV - Vis, Thermo,

Madison, WI, USA). El contenido de prolina se determinó mediante una curva estándar y

calculada en peso fresco basado en la ecuación 3:



[(

𝜇𝑔 𝑃𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎𝑚𝐿

𝑥 𝑚𝐿 𝑇𝑜𝑙𝑢𝑒𝑛𝑜)


]



3.4 Resultados

3.4.1 Relaciones hídricas e intercambio gaseoso de la hoja

Diferencias significativas fueron solamente observadas el factor de estatus hídrico sobre

el Contenido Relativo de Agua (CRA) con P≤0.001 (Tabla 3-1).En general, las plantas bajo

condiciones de déficit hídrico de todos los cultivares evaluados presentaron valores

Capítulo 47

cercanos al 60% del CRA, mientras que las plantas control presentaron valores del 85%

(Figura 3-1). Esta variación en el CRA indica la existencia de un grupo de plantas se

encontraba con dos estados hídricos diferentes debido a los dos tratamientos de riego. En

cuanto a las propiedades de intercambio gaseoso de la hoja (fotosíntesis (Pn),

conductancia estomática (gs) y transpiración (E)) se encuentran resumidas en la Figura

3-2 (A, B y C, respectivamente). Se encontraron diferencias significativas solamente a nivel

de los tres factores: estatus hídrico, cultivar e interacción (Tabla 3-1); estatus hídrico en la

Pn, mientras que en la conductancia estomática y transpiración se evidenciaron diferencias

significativas a nivel de interacción estatus hídrico × cultivar con P≤0.05 (Tabla 1). Con

respecto a la Pn, plántulas no estresadas en todos los cultivares, en general, presentaron

valores alrededor 10 µmol m-2 s-1. Sin embargo, bajo condiciones de estrés por déficit

hídrico una reducción de aproximadamente el 60% (3 µmol m-2 s-1) se observó en esta

variable (Figura 3-2A).

Por otro lado, la conductancia estomática mostró que los cultivares no sometidos a

condiciones de déficit hídrico tuvieron una gs alrededor de 0.5 µmol m-2 s-1. Bajo estrés, la

gs mostró una reducción, siendo esta reducción mayor especialmente en los genotipos

NUA35 (0.21 µmol m-2 s-1) y Bianca (0.18 µmol m-2 s-1) en comparación a las plantas de

Bacatá (0.31 µmol m-2 s-1) y Bachue (0.29 µmol m-2 s-1) que tuvieron unas reducciones

aproximadamente de 30% y 40%, respectivamente Figura 3-2B). Finalmente, se

obtuvieron diferencias también entre cultivares y déficit hídrico sobre la tasa de

transpiración (E) donde Bacatá, Bianca y NUA35 fueron los cultivares con una mayor tasa

de transpiración en condiciones normales (6.65 mol m-2 s-1). Asimismo, un periodo de déficit

hídrico de 15 días también causo una reducción en la transpiración donde los cultivares

Bachue, Bianca y NUA35 tuvieron una mayor caída (1.04, 1.13 y 1.12 mol m-2 s-1,

respectivamente) en comparación a Cerinza y Bacatá (1.15 y 1.37 mol m-2 s-1,

respectivamente) (Figura 3-2C). Lo anterior concuerda con o reportado por Miyashita et

al. (2005); Keyvan. (2010); De Laat. (2014), donde el estrés por déficit hídrico reduce la

tasa fotosintética y la transpiración como consecuencia a un cierre de estomático.

Por otro lado, el uso eficiente del agua (UEA) y la relación carbono intercelular sobre el

carbono atmosférico (Ci/Ca) mostraron diferencias significativas a nivel de interacción

estatus hídrico × cultivar (P≤0.001) (Tabla 3-1). En general, los valores más altos de UEA

fueron obtenidos en las plantas que estuvieron sometidas a condiciones de estrés por



déficit hídrico. En este contexto, las plantas del cultivar Bianca tuvieron los mayores valores

(28.08 µmol CO2 mol-1 H2O), seguidos por los cultivares NUA35, Bachue y Cerinza (20.46,

20.11 y 18.21 µmol CO2 mol-1 H2O, respectivamente). Con respecto a la relación Ci/Ca,

ésta también mostró un incremento en las plantas que estuvieron expuestas a condiciones

de estrés donde plantas cultivares Cerinza y Bachue en condiciones normales tuvieron los

siguientes valores 0.82 y 0.85 y por la condiciones esta relación sufrió un aumento (0.93 y

0.93 respectivamente). Mientras, los genotipos NUA35, Bacatá y Bianca no presentaron

variaciones con respecto a las plantas en condiciones normales, ya que presentaron

valores de Ci/Ca cercanos a 0.90 en ambas condiciones (Tabla 3-2). Mismas tendencias

fueron encontradas por Rosales et al. (2012) y Yousfi et al. (2012).

Capítulo 49

Tabla 3-1. Resumen del análisis de varianza de los efectos del estrés hídrico sobre el comportamiento

fisiológico de las plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo.

Abreviatura Fuente de variación

Estatus hídrico Cultivar Estatus hídrico × Cultivar

Contenido relativo del agua CRA *** NS NS

Fotosíntesis Pn *** ** *

Conductancia estomática gs *** NS ***

Transpiración E *** *** *

Uso eficiente del Agua WUE *** *** ***

Relación Ci/Ca Ci/Ca *** ** ***

Peso Seco Parte Aérea PSA ** *** NS

Peso Seco Raíz PSR *** *** *

Peso Seco Total PST *** *** **

Relación Parte Aérea : Raíz PA/R NS *** ***

Clorofila a Chl a ** *** ***

Clorofila b Chl b * *** ***

Clorofila total Chl total * *** ***

Carotenoides Cx + c * *** ***

Eficiencia máxima del PSII Fv/Fm *** * *

Electrolitos *** * **

Malondialdehido MDA *** ** *

Prolina *** *** ***

*, **, y *** significativamente diferente en los niveles de probabilidad a 0.05, 0.01 y 0.001, respectivamente. NS, no significativo con P ≤0.05.



Figura 3-1. Efecto del estrés hídrico sobre el contenido hídrico relativo de la hoja (CRA) en plántulas de cinco

cultivares de fríjol arbustivo. Las barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar.

Capítulo 51

Tabla 3-2. Efecto del estrés hídrico sobre el Uso Eficiente del Agua (UEA) y la relación Carbono intercelular sobre el Carbono atmosférico (Ci/Ca) en plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivoa.

Tratamiento UEA

Ci/Ca (µmol mol-1 H2O)

Interacción

Cerinza × Control 1,60 d 0,82 b

Cerinza × Estrés 18,21 b 0,93 a

Bachue × Control 1,56 d 0,85 b

Bachue × Estrés 20,11 b 0,93 a

NUA35 × Control 1,33 d 0,90 a

NUA35 × Estrés 20,46 b 0,90 a

Bacatá × Control 1,07 d 0,90 a

Bacatá × Estrés 10,19 c 0,90 a

Bianca × Control 1,11 d 0,91 a

Bianca × Estrés 28,30 a 0,90 a

Significancia *** ***

Cultivares

Cerinza 9,90 b 0,88 b

Bachue 10,83 b 0,89 ab

NUA35 10,89 b 0,90 ab

Bacatá 5,63 c 0,90 a

Bianca 14,71 a 0,91 a

Significancia *** **

Estatus hídrico

Sin PEG 1,33 b 0,88 b

Con PEG 19,45 a 0,91 a

Significancia *** ***

CV (%) 16,27 1,90 a Los datos representan el promedio de 4 plantas por tratamiento (n = 4). Promedios seguidos por la misma letra no muestran diferencias significativas con P≤0.05. ** y ***: Difieren significativamente en los niveles de probabilidad a 0.05, 0.01 y 0.001 con P≤0.05.



Figura 3-2. Efecto del estrés hídrico sobre contenido de clorofilas y carotenoides totales en plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo: A). Fotosíntesis neta (Pn); B). Conductancia estomática (gs); C). Transpiración (E)

es en plántulas de fríjol arbustivo. . Las barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar.

Capítulo 53

3.4.2 Acumulación de materia seca y relación parte aérea/raíz

Resultados de la acumulación de materia seca en la parte aérea, raíz, total y relación parte

aérea sobre la raíz son resumidos en la Tabla 3-3. Diferencias fueron encontradas en la

interacción déficit hídrico vs cultivares sobre la materia seca de la parte aérea (PSA

P≤0.05), raíz (P≤0.01), total y la relación Aérea/Raíz (PA/R P≤0.001). En general, las

plantas del cultivar Cerinza bajo condiciones de estrés hídrico presentaron la mayor

reducción en la acumulación de materia seca en la parte aérea en comparación a las

plantas de los demás cultivares, alcanzando valores cercanos a 0.82 g. Por otro lado, la

acumulación de materia seca en la raíz se vio más afectada en las plántulas de los

cultivares Bianca y Bacatá bajo condiciones de estrés hídrico (0.68 y 0.83 g

respectivamente). Asimismo, la materia seca total tuvo una menor acumulación cuando las

plantas de todos los cultivares estuvieron sometidas a un déficit hídrico de 15 días, ya que

este grupo de plantas mostraron valores alrededor de 3.42 g mientras las plantas sin

periodo de déficit presentaron valores de 4.86 g. Igualmente, es importante señalar que las

plantas del cultivar Bachue bajo condiciones de estrés hídrico presentaron la mayor

acumulación de materia seca total con respecto a los demás cultivares evaluados (5.36 g).

En contraste, las plantas de los cultivares Cerinza y Bianca con estrés hídrico fueron las

más afectadas y tuvieron los menores valores (2.50 y 1.71 g respectivamente). Finalmente,

la relación (PA/R) también fue condicionada por las condiciones de baja disponibilidad de

agua. Plantas con estrés por déficit hídrico de los cultivares Cerinza, Bianca y Bachue

presentaron los menores valores en la PA/R (aproximadamente entre 1.45 y 1.65) en

comparación a los cultivares Bacatá y NUA35 que mostraron una mayor relación (alrededor

3.65). Similares resultados fueron reportados por Huang et al. (2011), donde la mayor

acumulación de materia seca se presenta en las plantas con características de tolerancia

al estrés por déficit hídrico.



Tabla 3-3. Efecto del estrés hídrico sobre el Peso Seco de la Parte Aérea (PSA), Peso Seco de la Raíz (PSR), Peso Seco Total (PST) y Relación Parte Aérea : Raíz (PA/R) en plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivoa.

Tratamiento PSA PSR PST

PA/R (g) (g) (g)

Interacción

Cerinza × Control 4,38 1,34 ab 5,70 ab 3,44 ab

Cerinza × Estrés 1,49 1,01 abcd 2,50 cd 1,65 cd

Bachue × Control 5,45 1,24 abc 6,68 a 4,41 a

Bachue × Estrés 4,02 1,44 a 5,36 ab 3,02 abc

NUA35 × Control 3,13 1,30 ab 4,44 bc 2,54 bcd

NUA35 × Estrés 3,50 0,92 bcd 4,42 bc 3,71 ab

Bacatá × Control 2,83 1,29 abc 4,11 bc 2,21 bcd

Bacatá × Estrés 2,28 0,83 cd 3,11 cd 3,62 ab

Bianca × Control 2,37 0,99 abcd 3,35 cd 2,41 bcd

Bianca × Estrés 1,03 0,68 d 1,71 c 1,45 d

Significancia NS *** ** ***

Cultivares

Cerinza 2,94 ab 1,17 a 4,08 b 2,54 bc

Bachue 4,73 a 1,34 a 6,02 a 3,71 a

NUA35 3,31 ab 1,11 ab 4,43 b 3,13 ab

Bacatá 2,56 b 1,06 ab 3,62 bc 2,91 ab

Bianca 1,70 b 0,83 b 2,53 c 1,93 c

Significancia *** *** *** ***

Estatus hídrico

Sin PEG 3,63 a 1,23 a 4,86 a 3,00

Con PEG 2,46 b 0,98 b 3,42 b 2,69

Significancia *** *** *** NS

CV (%) 41,48 17,45 19,67 22,30 a Los datos representan el promedio de 4 plantas por tratamiento (n = 4). Promedios seguidos por la misma letra no muestran diferencias significativas con P≤0.05. ** y ***: Difieren significativamente en los niveles de probabilidad a 0.01 y 0.001. NS no significativo con P≤0.05.

Capítulo 55

- Parámetros de fluorescencia, contenido de clorofilas y carotenoides

Diferencias significativas fueron encontradas en la concentración de los pigmentos

fotosintéticos evaluados a nivel de estatus hídrico vs cultivar (Figura 3-3). En general, el

contenido de clorofila a, b y total de la mayoría de los cultivares bajo condiciones de estrés

por déficit hídrico estresados no sufrieron mayores variaciones con respecto al control a

excepción del cultivar Bianca. En este material, se observó el doble de la concentración de

dichos pigmentos comparados con los niveles encontrados en las plantas control (Chl a de

3384.39 µg mg-1 PF; Chl b de 1358.29 µg mg-1 PF, Chl total de 4566.73 µg mg-1 PF. ). Una

similar tendencia también fue observada para la concentración carotenoides totales, cuyo

incremento alcanzó valores cercanos de ~617.64 µg mg-1 PF. Por otro lado, la Figura 3-4

resume los resultados obtenidos en la eficiencia máxima del quantum en el fotosistema II

(Fv/Fm) donde las plántulas del cultivar Bianca mostraron la mayor reducción de la Fv/Fm

con valores cercanos a 0.50, mientras que la Fv/Fm de los cultivares Cerinza, Bachue,

NUA35 y Bacatá bajo estrés por déficit hídrico estuvo cerca del 0.71. Esto concuerda con

lo reportado por Perveen et al, (2010); Aranjuelo et al. (2011); Gorbe y Catalayud. (2012).



Figura 3-3. Efecto del estrés hídrico sobre contenido de clorofilas y carotenoides totales en plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo: A). Contenido de clorofila total; B). Contenido de clorofila a; C). Contenido de clorofila b y D). Contenido de carotenoides totales en plántulas de fríjol arbustivo. . Las barras son el promedio

de cuatro datos ± error estándar.

Figura 3-4. Efecto del estrés hídrico sobre la eficiencia máxima del quantum en el fotosistema II (Fv/Fm) en

plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo: Las barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar.

3.4.3 Daño de la membrana por estrés oxidativo y la producción de osmolitos.

En cuanto al daño de la membrana por estrés oxidativo y producción de osmolitos

representado como porcentaje de fuga de electrolitos, producción de malondialdehido

(MDA) y prolina son mostrados en la Figura 3-5 (A, B y C respectivamente). Diferencias

fueron observadas en las plantas de los diferentes tratamientos en las variables

anteriormente mencionadas en la interacción estatus hídrico × cultivar. Con respecto a la

Capítulo 57

fuga de electrolitos, los cultivares Cerinza, NUA35, Bacatá y Bianca pasaron de un

17.75% a un 27.70% de perdida cuando las plántulas se encontraron en condiciones de

estrés a excepción del cultivar Bachue que mantuvo los niveles cercanos a los encontrados

en las plantas control (17.28%) (Figura 3-5A). Por otro lado, la producción de

malondialdehido (MDA) fue mayor en todos los cultivares evaluados cuando estuvieron

sometidas a un estrés por déficit hídrico, siendo los genotipos Bianca y Bacatá los de mayor

producción (20 y 16 µmol g-1 PF, respectivamente). Asimismo, la producción de prolina fue

favorecida bajo estrés donde Cerinza y Bianca fueron los cultivares con mayor producción

de este osmolito (92 y 86 µmol g-1 PF respectivamente) y seguidos por Bacatá, NUA35 y

Bachue ( ̴50 µmol g-1 PF) (Figura 3-5B). Ahmed y Hassan (2011), reportan que plantas

con alta producción de prolina son relacionadas como genotipos con tolerancia al déficit

hídrico.



Figura 3-5. Efecto del estrés hídrico sobre el daño de la membrana por estrés oxidativo y la producción de osmolitos: A). Fuga de electrolitos; B). Producción de malondialdehido (MDA) y C). Producción de prolina en

plántulas de cinco cultivares de fríjol arbustivo. Las barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar.

Capítulo 59

3.4.4 Índice Relativo de Tolerancia (RTI)

En cuanto al Índice Relativo de Tolerancia, la Figura 3-6 muestra los resultados obtenidos

para cada uno de los cultivares evaluados. Encontramos que las plántulas del cultivar

NUA35 fueron las que mostraron los valores más altos para la RTI, seguidamente por el

cultivar Bachue y Bacatá con un ~98, ~79 y ~74% respectivamente. Mientras que las

plántulas de los cultivares Cerinza y Bianca tuvieron los valores más bajos (~42 y ~50%

respectivamente). Dutta Gupta et al. (1995), reportaron que valores bajos en el RTI son

características de genotipos con baja tolerancia al estrés por déficit hídrico aunque en este

índice no se considera el rendimiento.

Figura 3-6. Efecto del estrés hídrico sobre el índice relativo de tolerancia (RTI) en plántulas de cinco cultivares

de fríjol arbustivo: Las barras son el promedio de cuatro datos ± error estándar.



3.5 Discusión

El déficit hídrico es uno de los estreses abióticos que más limitan la productividad de los

cultivos. Asimismo, las diferentes respuestas de la planta a condiciones de baja humedad

en el suelo pueden ser usadas para identificar características que ayuden a identificar

diferentes niveles de tolerancia (Celular, bioquímico, fisiológico y molecular) que ayudan a

proveer información de las diferentes estrategias de aclimatación que posteriormente

puedan ser usadas en programas de mejoramiento (Larbi, 2004; Farooq et al., 2009). En

este contexto, el contenido relativo de agua de la hoja (CRA) es una de las variables de

gran importancia fisiológica que ayuda a cuantificar el estado hídrico de una planta tanto

en condiciones normales como de sequía (Keyvan., 2010). Cuando el CRA presenta una

reducción en los valores ayuda a inferir que las relaciones hídricas pueden estar siendo

afectadas por una condición abiótica adversa, lo cual puede repercutir en algunos procesos

fisiológicos como una reducción de la tasa fotosintética (Costa-França et al., 2000). En

este sentido, el RWC ha sido usado como una variable fisiológica para caracterizar

genotipos tolerantes al déficit hídrico (Larbi, 2004). Sin embargo, los resultados

encontrados en el presente estudio mostraron una reducción de los valores del CRA

solamente en el factor sequía y esta variable no arrojo diferencias entre genotipos debido

a las condiciones estresantes (Tabla 1). Por otro lado, la habilidad de mantener el

contenido de clorofilas bajo condiciones de estrés abiótico ha sido usada como herramienta

en la selección de genotipos tolerantes en programas de mejoramiento (Kiani-Pouya y

Rasouli., 2014). Asimismo, el contenido de otro pigmento fotosintético como los

carotenoides también juega un papel importante en la tolerancia a condiciones de sequía

(Farooq et al., 2009). En este contexto, los contenidos de Clorofila y carotenoides fueron

favorecidos bajos condiciones de estrés hídrico, especialmente, en Bianca. Por lo tanto,

un incremento del contenido de estos pigmentos puede ser considerado como un

mecanismo de respuesta para reducir los efectos negativos del estrés hídrico tales como

la fotoinhibición (Silva et al., 2007). Sin embargo, el genotipo Bianca fue el que también

presentó una mayor reducción sobre la relación Fv/Fm, obteniéndose el menor valor. En

este sentido, se ha reportado ampliamente que el estrés por déficit hídrico causa

alteraciones a la eficiencia del PSII debido un daño a las membranas tilacoidales en parte

por un proceso de fotoinhibición (Farooq et al., 2009). En este aspecto, estudios

Capítulo 61

desarrollados por Rahbarian et al., (2011) encontraron que los genotipos tolerantes de

garbanzo presentaban una menor variación en la relación Fv/Fm y contenido de clorofila,

tal como ocurrió en nuestro ensayo. Continuando con variables del tipo bioquímico, la

prolina y MDA también han sido usados como indicadores para estimar la susceptibilidad

o tolerancia de genotipos a condiciones de estreses abióticos (Sánchez-Reinoso et al.,

2014). En este estudio, todos los genotipos estudiados mostraron un incremento de la

concentración de prolina bajo condiciones de déficit hídrico, siendo el incremento más

notorio en los genotipos ICA-Cerinza y Bianca. Un incremento del contenido de prolina

bajo condiciones de estrés hídrico tiene el propósito de mantener la hidratación en la célula

y prevenir daño por las condiciones estresantes. Igualmente, este aminoácido actúa como

osmolito y fuente de almacenamiento de carbono y nitrógeno que son posteriormente

utilizados para estabilizar macromoléculas, proteínas y membranas celulares en los tejidos

de las plantas (George et al., 2015). Por lo anterior, la determinación de la concentración

de prolina en los tejidos de la hoja se ha recomendado como un marcador bioquímico para

mirar la tolerancia de genotipos al estrés hídrico (Naser et al., 2010). Con respecto al MDA,

el cultivar Bianca presentó una mayor acumulación de este producto bajo condiciones de

estrés. En consecuencia, una mayor acumulación de MDA está indicando un mayor daño

a nivel celular debido a un incremento de la peroxidación lipídica de las membranas

(Sánchez-Reinoso et al., 2014). En general, se ha reportado que plantas que muestren

características fisiológicas tales como un alto CRA, contenido de prolina y una baja

producción de MDA bajo déficit hídrico son indicadores de tolerancia y que estas

características pueden ser usadas para la selección de genotipos tolerantes (Liu et al.,

2013).

El índice de tolerancia relativo del genotipo NUA35 fue el mayor (Fig. 6), dando a entender

que fue el material que presentó una mayor producción de biomasa (Tabla 3) y permitiendo

considerar como un genotipo con tolerancia a estrés hídrico. Dichas observaciones están

en concordancia por lo reportado por Kausar et al. (2012) donde genotipos de sorgo

considerados tolerantes a salinidad presentaron la mayor acumulación de biomasa que a

su vez se reflejaban en un mayor índice. Es ampliamente citado que una mayor

acumulación de biomasa bajo condiciones de estrés hídrico es una característica

importante a la ahora de caracterizar genotipos y este incremento en la biomasa puede

deberse a un mejor uso eficiente del agua, ya que se está optimizando la producción de



biomasa por unidad de agua transpirada (Farooq et al., 2009). En este aspecto, todos los

genotipos seleccionados para este estudio mostraron un mayor UEA cuando fueron

sometidas a un periodo de estrés de déficit hídrico por 15 días (Tabla 2). Finalmente, el

déficit hídrico afecta la fotosíntesis de las plantas por limitaciones estomáticas y no

estomáticas. En este sentido, la fotosíntesis fue seriamente afectada por el estrés hídrico.

La reducción de la tasa fotosintética en todos los genotipos de frijol puede deberse al hecho

que la plantas de frijol

3.6 Conclusiones

En condiciones ambientales asociadas a las condiciones de estrés en estudio,

debería tenerse en cuenta que cultivares como las anteriormente mencionadas

exhibirían una mayor afectación por estrés, resultados soportados en las

respuestas evaluadas en el trabajo.

El uso de PEG6000 en el estudio del estrés por déficit hídrico en cultivares de fríjol

arbustivo permite evaluar las características de la raíz sin perder material vegetal,

por lo cual es más preciso la toma de datos.

En el estado vegetativo de tercera hoja verdadera, se observó que el cultivar Bianca

fue el de mayor susceptibilidad evidenciando un mayor daño oxidativo y un menor

producción de biomasa e índice de tolerancia relativo.

4. Caracterización de la respuesta fisiológica de cinco cultivares de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.) a condiciones de estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas.

Efecto sobre las propiedades de Intercambio Gaseoso de

la hoja, eficiencia de la fluorescencia de la clorofila a,

malondialdehido y prolina.

4.1 Resumen

El objetivo de esta investigación fue evaluar las respuestas fisiológicas y bioquímicas de cinco cultivares de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.) bajo condición de estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes (una vegetativa y una reproductiva) en variables como la fotosíntesis, conductancia estomática, transpiración, carbono interno, contenido relativo hídrico de la hoja y pérdida de electrolitos producción de malondialdehido y prolina. Se sembraron semillas de los cultivares de fríjol ICA-Cerinza, ICA-Bachue, NUA35, Bacatá y Bianca. Se realizó un diseño en bloques completamente al azar en arreglo factorial (factor principal la etapa fenológica y factor secundario los cultivares) para un total de 15 tratamientos con cuatro repeticiones. Se cuantificaron variables como el Contenido Relativo de Agua (CRA), la fotosíntesis, parámetros de fluorescencia del PSII, pigmentos, prolina y malondialdehido. La tasa de fotosíntesis, conductancia estomática y relaciones de fluorescencia disminuyen en todos cultivares que tuvieron condición de estrés en las dos etapas evaluadas, aunque en la etapa vegetativa fue mayor, especialmente en el cultivar Bacatá. Asimismo, se evidenció una mayor producción MDA, carotenoides totales y prolina en las plantas que fueron afectadas por un periodo de 15 días de déficit hídrico, principalmente en la etapa vegetativa. En conclusión, los cinco cultivares de fríjol arbustivo evaluados en las etapa vegetativa se vieron afectados negativamente en variables fisiológicas evaluadas a causa de un déficit hídrico de 15 días, aunque los cultivares más afectados fueron Bacatá y Bianca en las dos etapas fenológicas evaluadas.

Palabras clave: Uso eficiente del agua, fenología, peroxidación lipídica, antioxidante.



4.2 Introducción

Las plantas presentan una gran variedad de respuestas a condiciones de déficit hídrico

que pueden influir negativamente sobre el rendimiento de los cultivos (Segura-Monroy et

al., 2015). Asimismo, los efectos nocivos de la sequía sobre el rendimiento también

dependen de la etapa de crecimiento del cultivo y de la intensidad del estrés (Farooq et al.,

2012).En este contexto, un estrés hídrico en etapas vegetativas (33 a 67 días después de

siembra) reduce significativamente variables tales como el contenido relativo de agua de

la hoja, uso eficiente del agua, acumulación de materia seca, y afecta drásticamente los

diferentes componentes de rendimiento en arroz (Boonjung and Fukai., 1996-1 y 2).

Igualmente, Okçu et al. (2005) ha reportado también que un estrés hídrico en etapas

vegetativas tempranas puede reducir significativamente la acumulación de materia seca

en genotipos de Pisum sativum L. susceptibles a sequía. La caída en los rendimiento

puede deberse en parte que déficit hídrico causa una reducción de la tasa de asimilación

de carbono y transpiración como consecuencia del cierre de estomas en plantas (Rosales

et al., 2012; Yousfi et al., 2012). Adicionalmente, se ha mencionado que el tipo de

respuesta de un cultivo puede variar según la etapa fenológica en la que inicia el estrés

por déficit hídrico (Cakir, 2004). Por otro lado, los procesos involucrados en la fase lumínica

de la fotosíntesis (concentración de pigmentos fotosintéticos, eficiencias del fotosistema II

y mecanismos de disipación de energía fotoquímica y no fotoquímica) han sido utilizados

para entender los mecanismos de respuesta y aclimatación de los cultivos a estrés por

déficit hídrico (Keyvan., 2010; Perveen et al., 2010; Aranjuelo et al, 2011). Sin embargo,

estudios donde se relacionen los parámetros de la fase lumínica de la fotosíntesis bajo

condiciones de estrés por déficit hídrico en etapas fenológicas diferentes siguen siendo

escasos (Chaves et al., 2002; Moradi and Ismail., 2007;).

Dentro del proceso de caracterización de respuestas fisiológicas de cultivares a

condiciones de déficit hídrico, el estudio de variables bioquímicas ha sido de gran utilidad

para ser marcadores de susceptibilidad y/o tolerancia de genotipos a la condición de estrés

(Sánchez-Rodríguez et al., 2010; Aranjuelo et al, 2011; Mohamed y Ibrahim, 2011). En

este sentido, se ha reportado que los genotipos susceptibles acumulaban menor cantidad

de materia seca y producían prolina en diferentes concentraciones, es decir, aquellos

Capítulo 4 65

materiales con mayor contenido de prolina tenían un mejor ajuste osmótico (Sánchez-

Rodríguez et al., 2010). También, un déficit hídrico favorece la producción de MDA y

peróxido de hidrógeno incrementa, cuyos niveles eran más altos en genotipos

susceptibles. Por otro lado, el estudio de las respuestas fisiológicas de diversos genotipos

bajo estrés por déficit hídrico en etapas fenológicas diferentes ha permitido conocer las

posibles estrategias de las plantas para sobrellevar esta condición abiótica adversa, como

también tener una comprensión de los mecanismos fisiológicos involucrados en la

aclimatación que repercuten en el funcionamiento de la planta y posteriormente en el

rendimiento del cultivo (Winterhalter et al., 2011; Beebe et al., 2013; Osman., 2015). Por

lo tanto, identificar y priorizar la etapa fenológica más sensible al estrés por déficit hídrico,

al igual que los parámetros fisiológicos y bioquímicos tales como menor reducción de la

tasa fotosintética, menor tasa de transpiración, mayor eficiencia en el uso del agua,

producción de prolina, menor producción de malondialdehido son características de gran

importancia para identificar materiales tolerantes a estrés hídrico (Farooq, et al., 2009;

Mohamed y Ibrahim, 2011; Yousfi et al., 2012). Dado lo anterior, es importante enfocar

investigaciones en conocer el comportamiento de diferentes genotipos de fríjol bajo estas

condiciones en diferentes etapas fenológicas que puedan contribuir en programas de

fitomejoramiento y procesos de evaluación de tierras (Polanía et al, 2009; Yousfi et al.,

2012; Cardona-Ayala et al., 2014). En este aspecto, evaluar las respuestas fisiológicas y

bioquímicas en plántulas de diversos cultivares fríjol en etapas fenológicas diferentes bajo

un periodo de 15 días de estrés por déficit hídrico es de gran importancia, ya que nos

permite caracterizar posible respuestas de aclimatación y sobrevivencia a la condición

ambiental adversa estudiada, ya que la producción agrícola ha venido enfrentando

escenarios de cambio climático durante los últimos años en Colombia donde se han

afectado negativamente en el rendimiento e ingresos de los productores (Miranda, 2009).

Igualmente, el cultivo del frijol es sembrado principalmente en la región andina en Colombia

como una fuente ingresos para pequeños y mediados campesinos (Fenalce, 2016).

Asimismo, esta zona del país ha venido siendo afectada por el efecto de cambio climático

y/o variabilidad climática (Fenómenos ENOS), ya que causan incrementos en la

temperatura y alteraciones de los patrones normales de precipitación (Pabón y Torres.,

2007; Li et al., 2011; Monasterio et al., 2011). Por tal motivo, el objetivo de esta

investigación fue evaluar las respuesta fisiológicas y bioquímicas de cinco cultivares de

fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.) bajo un periodo moderado de déficit hídrico en dos

diferentes etapas fenológicas (vegetativa vs reproductiva), determinando el



comportamiento de variables como la fotosíntesis, conductancia estomática, transpiración,

carbono interno, contenido relativo hídrico de la hoja, pérdida de electrolitos, producción

de malondialdehido y prolina.



Semillas de cinco cultivares de fríjol arbustivo fueron usadas en el presente estudio. Los

cultivares estudiados fueron los siguientes: i) ICA-Cerinza e ICA-Bachue son dos

materiales con 20 años de siembra en la agricultura tradicional colombiana, ii) NUA35 es

un genotipo con siete años de comercialización desde su liberación y iii) Bianca y Bacatá

son dos cultivares de reciente liberación (menos de dos años). Las semillas fueron

sembradas en el invernadero de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad

Nacional de Colombia ubicado en la ciudad de Bogotá a una altura de 2556 msnm,

(4°35’56’’ y 74°04’51’’) durante los meses de septiembre del 2015 a enero del 2016 en

parcelas de 2.1 m2 (3 surcos de 1 m lineal de largo). La parcela experimental contó con un

marco de plantación era 16 × 70 cm entre planta y entre surcos, respectivamente (20

semillas por parcela = 85.000 plantas ha-1). Las características físico-químicas del suelo

en el invernadero eran las siguientes: i) una textura Franco Arcilloso (26% arena, 42% de

limo y 32% de Arcilla), ii) características químicas: Nitrógeno total: 0.36%, Ca: 10.6, K:

0.98, Mg: 1.75, Na: 0.24 meq 100 g-1, Cu: 1.67, Fe: 310, Mn: 3.21, Zn: 15.5, B: 0.48 y P:

>116 mg kg-1, iii) pH 5.4 y iv) Capacidad de Intercambio Catiónico Efectiva (CICE) 13.8

meq/100g. Las condiciones de crecimiento del invernadero durante la evaluación fueron

temperatura promedio de 27°C, humedad relativa de 60 a 80% y un fotoperiodo natural de

12 h con una PAR de 1000 µmol m-2 s-1. Después de la emergencia, las plantas fueron

fertilizadas con dos fertilizantes edáficos: i) 4 g planta-1 (350 Kg ha-1) de un fertilizante

compuesto de grado 15-15-15 (TRIAN 15® Yara, Colombia) como fuente de nitrógeno,

fósforo y potasio; ii) y 2 g planta-1 (170 Kg Ha-1) de microelementos (Agrimins granulado,

Colinagro®, Colombia) respectivamente, repartidas en dos aplicaciones (los fertilizantes

Capítulo 4 67

edáficos fueron suministrados en dos aplicaciones de la mitad de la dosis

anteriormente mencionada a los 15 y 40 DDE)). Finalmente, la composición del

fertilizante Agrimins era: Nitrogeno total 8% (Úrea N 7% y Amonio N 1%), Fósforo

asimilable (P2O5) 5.0%, Calcio (CaO) 18%, Magnesio (MgO) 6%, Azufre Total 1.6%,

Cobre 0.75%, Boro 1%, Molibdeno 0.005% y Zinc 2.5%.

4.3.2 Tratamiento de déficit hídrico y determinación de las variables

Plantas de frijol por cada cultivar fueron separadas en dos grupos para ser sometidas a

dos diferentes periodos de déficit hídrico. Un primer grupo, las plantas sufrieron un periodo

de estrés de 15 días en etapa vegetativa cuando las plantas alcanzaron el estado

fenológico 13-14 según escala BBCH (Feller et al., 1995b) (formación de 3 a 4 hojas

trifoliadas completamente expandidas), el cual se alcanzó aproximadamente a los 40 días

después de la emergencia de la totalidad de las plantas (DDE). En el segundo grupo, el

estrés fue desarrollado durante la etapa reproductiva en el estado 63-64 (30 a 40% de las

flores abiertas) aproximadamente a los 50 días después de la emergencia de la totalidad

de las plantas según la metodología reportada por Ghanbari et al. (2013). El déficit de agua

fue establecido mediante la suspensión del agua de riego durante 15 días según estudios

realizados previamente. Posteriormente, se monitoreo el contenido de humedad del suelo

mediante una sonda de humedad (Kelway HB-2 Soil Acidity and Moisture Tester, Kel

Instruments Co., Inc. NJ, USA), buscando tener una humedad entre el 45% y 55% de la

capacidad de campo durante el periodo de estrés, teniendo en cuenta que el 100% de la

capacidad de campo corresponde a un 29.87% de humedad del suelo en peso.

Adicionalmente, el criterio de tomar un 50% de humedad en el suelo se fundamentó porque

las plantas presentan reducción alteraciones en sus relaciones hídricas en humedades del

sustrato entre el 40 y 60 % (Costa-França et al., 2000; Segura-Monroy et al., 2015).

Se realizaron muestreos de todas las variables fisiológicas y bioquímicas al final del

periodo de estrés (15 días después del inicio del déficit hídrico, es decir a los 55 DDT para

la etapa vegetativa y 65 DDT para la etapa reproductiva). En general, las variables

fisiológicas fueron registradas en la segunda hoja trifoliada completamente expandida de



la parte superior del dosel. Con respecto a las variables bioquímicas, se colectó

aproximadamente 2 g material vegetal, fue homogenizado con nitrógeno líquido y

posteriormente almacenado a -80°C hasta sus respectivos análisis. El experimento duró

aproximadamente 115 días a partir de la emergencia de la totalidad de las plántulas.


Se realizó un diseño en bloques al azar con arreglo factorial donde el primer factor fue la

etapa fenológica en la que se inició el estrés por sequía y el segundo factor fueron los cinco

genotipos evaluados para un total de 15 tratamientos con cuatro repeticiones para un total

de 60 parcelas de 2.1 m2 (3 surcos de 1 m lineal de largo). Posteriormente, cuando se

presentaron diferencias significativas en el ANAVA, se empleó la prueba comparativa de

medias de Tukey a P ≤ 0.05. Los datos se analizaron usando el programa Statistix v 9.0

(software analítico, Tallahassee, FL, US). Los resultados del análisis de varianza son

resumidos en la Tabla 4-1.




la parte media. Las hojas fueron recolectadas al final del periodo de estrés hídrico para

cada uno de los genotipos de fríjol evaluados. El CRA fue calculado mediante la siguiente

ecuación:


𝑃𝑇 − 𝑃𝑆] × 100 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1)

Capítulo 4 69




La fotosíntesis fue estimada en la segunda hoja trifoliada completamente expandida del

porción media superior de la planta usando un medidor de fotosíntesis portable (LI-COR

6200, Lincoln, NE, USA), entre los periodos comprendidos de las 930 a 1100 h y 1330 a

1500 h durante tres días seguidos a partir del penúltimo día antes de finalizar el periodo

de estrés. Asimismo, este equipo estimó la concentración interna de CO2. Adicionalmente,

se calculó la relación Carbono intercelular entre el Carbono atmosférico (Ci/Ca) y las

limitaciones estomáticas se obtuvo usando la ecuación Ls = 1 - (Ci/Ca) (Huang et al. 2011).

La conductancia se midió en la segunda hoja trifoliada completamente expandida con la

ayuda de un porómetro portable (LI-COR 1600, Lincoln, NE, USA). Del mismo modo, se

calculó el uso eficiente del agua como producto de la relación entre la fotosíntesis y la

transpiración. Las medidas de intercambio gaseoso se desarrollaron entre las 1000 y 1500

horas los 55 y 65 DDT. Durante las mediciones las condiciones fueron las siguientes:

Radiación fotosintéticamente activa 1000 μmol m-2 s-1, temperatura de la hoja 27 ± 5 °C,

diferencia de presión de vapor del aire de la hoja 1.8 ± 0.5 kPa.


Para la determinación de los parámetros de fluorescencia de PSII, se utilizó un fluorómetro

modulado (MINI-PAM, Walz, Effeltrich, GE). Las medidas fueron tomadas entre las 700 y

1000 h en la segunda hoja trifoliada completamente expandida desde la parte superior del

dosel. Las relaciones de fluorescencia fueron determinadas con un pulso máximo de

intensidad de luz de hasta 2.600 µmol m-2 s-1 en la superficie de la muestra de la hoja,

adaptándola previamente a la oscuridad durante 10 minutos. Para las mediciones de

clorofilas y carotenoides, las muestras de tejidos (30 mg aprox. de la segunda hoja trifoliada

completamente expandida) fueron homogenizadas en 4 ml de acetona (80%),

posteriormente se llevaron las muestras a una centrífuga (Model 420101, Becton Dickinson

Primary Care Diagnostics, Maryland, USA) a 5000 rpm durante 10 min para eliminar

partículas y el sobrenadante diluido a un volumen final de 6 ml adicionando acetona (Sims



y Gamon., 2002). El contenido de clorofila fue determinado a 663 y 646 nm y carotenoides

a 470 nm utilizando un espectrofotómetro (Spectronic BioMate 3 UV–vis Thermo, Madi-

son, WI, USA). Para obtener el contenido de pigmentos fotosintéticos en hoja, se

emplearon las ecuaciones para acetona descritas por Wellburn (1994).


Malondialdehido


método del ácido tiobarbitúrico (TBA) descrito por Hodges et al. (1999), tomando 0.3 g

aprox. de material vegetal homogenizado y almacenado con nitrógeno líquido. Las

muestras luego de ser centrifugadas se les estimó las absorbancias a 440, 532 y 600 nm

con un espectrofotómetro (Spectronic BioMate 3 UV - Vis, Thermo, Madison, WI, USA).

Por último, se utilizó un coeficiente de extinción (157 M mL-1) para la obtención de la

concentración de MDA.


Para la determinación del contenido de prolina, se usó el método descrito por Bates et al.

(1973), extrayendo de la segunda hoja trifoliada completamente expandida


líquido. La absorbancia se medió a 520 nm usando un espectrofotómetro (Spectronic

BioMate 3 UV - Vis, Thermo, Madison, WI, USA). El contenido de prolina se determinó

mediante una curva estándar y calculada en peso fresco basado en la ecuación 2:



[(

𝜇𝑔 𝑃𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎𝑚𝐿 𝑥 𝑚𝐿 𝑇𝑜𝑙𝑢𝑒𝑛𝑜)


]



Capítulo 4 71

4.4 Resultados

4.4.1 Humedad del suelo, Relaciones hídricas e intercambio gaseoso de la hoja

En general, la humedad de suelo (CHS) en el tratamiento control estuvo alrededor 90% de

capacidad de campo durante el ensayo. Con respecto al CHS de los otros tratamientos, se

observó que este estuvo cercano al 55% al final de los 15 días de déficit hídrico iniciado

en la etapa vegetativa (55DDE). Asimismo, el CHS del tratamiento de estrés durante la

etapa reproductiva presentaba una humedad alrededor del 53.5% a los 65 DDE (Figura

4-1A). Los resultados obtenidos en la cuantificación de la humedad del suelo señalan que

un grupo de plantas estuvo con una menor disponibilidad de agua en algún momento de

su desarrollo. Igualmente, los resultados del Contenido Relativo de Agua (CRA) en la hoja

son resumidos en la Figura 4-1(B y C). Diferencias significativas solamente fueron

observadas para el factor de estatus hídrico (Tabla 1). En el muestreo de los 55 DDE,

plantas que iniciaron su periodo de estrés en la etapa vegetativa presentaron un

CRA ̴70% en comparación a las plantas control que presentaron valores cercanos al 85%

a los 55 DDE. Asimismo, las plantas que iniciaron a sufrir un déficit hídrico en la etapa

reproductiva mostraron un valor ̴ 77.43% en ese punto (Figura 4-1B). Cuando finalizó el

periodo de estrés de la fase reproductiva (65 DDE), las plantas control continuaron con un

CRA del 82.57% mientras las plantas con condiciones de estrés en la etapa vegetativa

fue aproximadamente del 75.22% y un 73.34% en fase reproductiva (Figura 4-1C).

Nuestros resultados concuerdan con lo reportado por DeLat et al. (2014) y Huang et al.

(2011), donde un estrés por déficit hídrico redujo significativamente el CRA en las plantas,

y ésta reducción está dada principalmente por la baja disponibilidad de agua en el suelo.



Figura 4-1. Efecto del estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes sobre la humedad del suelo (A) en porcentaje de la capacidad de campo entre los factores de las diferentes etapas fenológicas y el contenido relativo de agua de la hoja de cinco cultivares de fríjol arbustivo (B corresponden al muestreo después de finalizar el periodo de estrés en etapa vegetativa; C corresponden al muestreo después de finalizar

el periodo de estrés en etapa reproductiva. Las barras representan ± error estándar.

Tabla 4-1. Resumen del análisis de varianza de los efectos del estrés hídrico sobre el comportamiento fisiológico y parámetros de rendimiento de cinco genotipos de fríjol arbustivo. *, **, y *** significativamente diferente en los niveles de probabilidad a 0.05, 0.01 y 0.001, respectivamente. NS, no significativo con a = 0.05.


Final estrés etapa vegetativa (55

DDE)

Final estrés etapa reproductiva (55

DDE)

Etapa Cultivar Etapa × Cultivar Etapa Cultivar Etapa × Cultivar

Contenido relativo del agua CRA *** NS NS *** NS NS

Fotosíntesis Pn *** *** *** *** * *

Conductancia estomática gs *** * * *** NS ***

Uso eficiente del Agua intrínseco WUEi NS * NS NS NS ***

Relación Ci/Ca Ci/Ca * * NS * NS NS

Limitación estomática Ls *** *** * *** NS *

Eficiencia de la carboxilación Pn/Ci *** ** * *** * NS

Clorofila total Chl total *** *** *** NS *** *

Carotenoides Cx + c *** *** * ** *** ***

Eficiencia máxima del PSII Fv/Fm * NS * * NS NS

Quenching fotoquímico qP NS NS NS NS * NS

Quenching no fotoquímico NPQ NS * * *** *** NS

Malondialdehido MDA * * *** NS *** *

Prolina *** *** *** ** ** *

En cuanto a las propiedades de intercambio gaseoso de la hoja (fotosíntesis (Pn),

conductancia estomática (gs) y limitaciones estomáticas (Ls)), los resultados son

presentados en la Figura 4-2. Se encontraron diferencias significativas la interacción etapa

de desarrollo × cultivar en la Pn, gs y Ls al finalizar cada periodo de estrés (55 y 65 DDE).

A los 55 DDE, la Pn, en general, era mayor (18.20 µmol m-2 s-1) en todos los cultivares

estudiados sin déficit hídrico. Asimismo, la tasa de intercambio de CO2 fue un ~45 % (9.07

µmol m-2 s-1) menor en las plantas de los cultivares Bacatá y Bianca bajo condiciones de

estrés por estrés hídrico tanto en la fase vegetativa como en la reproductiva a excepción

de las plantas del cultivar Cerinza que presentaron una reducción solamente del ~37%

(12.10 µmol m-2 s-1) en la etapa vegetativa y ~17% (15.80 µmol m-2 s-1) en la reproductiva.

Finalmente, las plantas del cultivar NUA35 tuvieron reducciones en la Pn mayor en las

plantas con estrés en la etapa reproductiva cercanos al 42% (19.13 µmol m-2 s-1) (Figura

4-2A). Con respecto a las mediciones desarrolladas a los 65 DDE, se obtuvieron

tendencias similares a las observadas en el muestreo anterior. En este aspecto, las plantas

control de todos los cultivares presentaron valores iguales de fotosíntesis entre ellas (20.81

µmol m-2 s-1). Mientras, un periodo de déficit hídrico, en general, redujo la Pn cerca del 55%

(12.01 µmol m-2 s-1) tanto en etapa vegetativa o reproductiva en todos los casos (Figura

4-2B). Con respecto a la gs, ésta también fue mayor en el tratamiento control donde se

registraron lecturas promedios alrededor de 0.33 µmol m-2 s-1 y 0.51 µmol m-2 s-1 a los 55

y 65 DDE, respectivamente. Asimismo, un periodo de 15 días déficit hídrico tanto en la

fase vegetativa o reproductiva también causó una reducción significativa en los valores de

esta variable de intercambio gaseoso. En general, todos los cultivares mostraron una gs un

50% menor (~0.28 µmol m-2 s-1) en ambas etapas muestreos (Figura 4-2C y D).

Finalmente, la limitación estomática (Figura 4-2E y F) se mantuvo generalmente constante

en la mayoría de cultivares (Ls ~0.34) en ambos tratamientos a los 55 DDE, excepto las

plantas del genotipo NUA35 que mostraron una mayor valor en los dos periodos de déficit

hídrico (0.33) (Figura 4-2E). Asimismo, Ls fue mayor específicamente en las plantas de

frijol Cerinza sometidas a un periodo de 15 días de déficit hídrico durante la etapa

reproductiva a los 65 DDE (Ls bajo estrés: 0.27 y Ls Control: 0.21). No obstante, los

cultivares Bachue, NUA35, Bacatá y Bianca (0.24) mantuvieron los valores cercanos a los

encontrados en las plantas control (0.25) (Figura 4-2F).

Figura 4-2. Efecto del estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes sobre la fotosíntesis (A y B), conductancia estomática (C y D) y limitación estomática (E y F) de cinco cultivares de fríjol arbustivo (A, C y E corresponden al muestreo después de finalizar el periodo de estrés en etapa vegetativa; B, D y F corresponden al muestreo después de finalizar el periodo de estrés en etapa reproductiva. Las barras representan ± error estándar.



Por otro lado, la Tabla 4-2 resume los resultados del uso eficiente del agua intrínseco

(UEAi), relación carbono intercelular sobre carbono atmosférico (Ci/Ca), y la Eficiencia de la

Carboxilación (Pn/Ci), respectivamente. Para el UEAi, se resaltan solamente las diferencias

significativas obtenidas en la interacción etapa × cultivar al finalizar el periodo de estrés por

déficit hídrico en la etapa reproductiva (65DDE). En este sentido, las plantas de los

cultivares Bachue, Bacatá y Bianca (45.21; 44.16 y 41.24 μmol CO2 mmol -1 H2O,

respectivamente) sometidas al periodo de estrés por déficit hídrico durante la etapa

reproductiva mostraron un mayor UEAi. Mientras, los cultivares NUA35 y Cerinza

expuestas a estrés durante un periodo de la fase reproductiva mostraron las menores

relaciones (21.37 y 39.79 μmol CO2 mmol-1 H2O, respectivamente). En cuanto a la relación

Ci/Ca, diferencias fueron obtenidas en el factor déficit hídrico tanto a los 55 y 66 DDE. En

este sentido, las plantas bajo estrés en etapa vegetativa presentaron los valores más bajos

en la Ci/Ca (aproximadamente de 0.69), mientras que las plantas de los cultivares bajo

condiciones control y estrés en la etapa reproductiva tuvieron valores de aproximadamente

0.72 a los 55 DDE (Tabla 4-2). Además, las plantas que estuvieron en estrés por déficit

hídrico en la etapa reproductiva tuvieron valores similares a las plantas en condiciones

control (Ci/Ca de 0.76) a los 65 DDE (Tabla 4-2).

Por otra parte, diferencias en la interacción etapa × cultivar (P≤0.05) fueron encontradas

sobre la eficiencia de carboxilación (Pn/Ci) a los 55 DDE. En este punto de muestreo,

plantas de todos los cultivares bajo alguna condiciones de estrés tuvieron una Pn/Ci en

promedio de 0.04 mol m-2 s-1 comparado con las plantas control (0.06 mol m-2 s-1). Del mismo

modo, para la Pn/Ci se encontraron diferencias significativas en el factor Etapa a los, DDE

donde las plantas de los cultivares bajo condición de estrés en la etapa vegetativa tuvieron

las relaciones más bajos en la Pn/Ci (aproximadamente de 0.03 mol m-2 s-1), mientras que

las plantas con estrés en la etapa reproductiva los valores de alrededor de 0.04 mol m-2 s-

1y las plantas en condiciones sin estrés por déficit hídrico mantuvieron valores cercanos a

0.07 mol m-2 s-1 (Tabla 4-2). Similares tendencias fueron reportadas por Boonjung y Fukai

(1996-1 y 2); Huang et al. (2011) Rosales et al. (2012); Yousfi et al. (2012), donde las

principales reducciones en los parámetros como la fotosíntesis neta, conductancia

estomática, e incrementos en las limitaciones estomáticas se evidencias cuando las plantas

se encuentran en déficit hídrico, especialmente en las etapas vegetativas tempranas.

Capítulo 4 77

Tabla 4-2. Efecto del estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes sobre parámetros de

intercambio gaseoso de cinco genotipos de fríjol arbustivo (55 DDE y 65 DDE).

Tratamiento

Final de Estrés en etapa vegetativa (55

DDE) Final de Estrés en etapa reproductiva (65

DDE)

UEAi Ci/Ca Pn/Ci UEAi Ci/Ca Pn/Ci

μmol mmol -1

H2O mol m–2 s–1

μmol mmol -1 H2O

mol m–2 s–1

Etapa de estrés

Control 57,45 0,73 a 0,06 a 42,65 0,76 b 0,07 a

Vegetativo 60,53 0,69 b 0,04 b 39,46 0,82 a 0,03 c

Reproductivo 54,77 0,71ab 0,04 b 38,35 0,76 b 0,04 b

Significancia NS * *** NS *** ***

Cultivar

Cerinza 55,40ab 0,72 a 0,06ab 40,73 0,78 0,05 a

Bachue 55,90ab 0,71ab 0,05ab 44,73 0,77 0,05 a

NUA35 64,83 a 0,68 b 0,06 a 36,6 3 0,78 0,05ab

Bacatá 51,84 b 0,73 a 0,05 b 38,84 0,77 0,04 b

Bianca 59,94ab 0,72 a 0,04 b 39,83 0,77 0,05ab

Significancia * * ** NS NS *

Interacción

Control × Cerinza 58,15 0,76 0,06 ab 48,05 a 0,79 0,07

Control × Bachue 48,21 0,74 0,06 abc 37,42ab 0,75 0,06

Control × NUA35 61,71 0,69 0,07 a 50,32 a 0,74 0,07

Control × Bacatá 55,70 0,71 0,07 ab 36,51ab 0,74 0,07

Control × Bianca 63,50 0,77 0,06 abc 40,95 a 0,76 0,07

Vegetativa × Cerinza 52,08 0,71 0,04 bcde 34,36ab 0,82 0,03

Vegetativa × Bachue 69,40 0,66 0,05abcde 51,55 a 0,84 0,04

Vegetativa × NUA35 69,39 0,66 0,06 abcd 38,19ab 0,81 0,03

Vegetativa × Bacatá 52,59 0,73 0,03 de 35,86ab 0,80 0,03

Vegetativa × Bianca 59,18 0,70 0,03 e 37,31ab 0,80 0,03

Floración × Cerinza 55,97 0,71 0,06 abc 39,79 a 0,73 0,05

Floración × Bachue 50,09 0,73 0,04 bcde 45,21 a 0,73 0,05

Floración × NUA35 63,40 0,67 0,04 bcde 21,37 b 0,79 0,04

Floración × Bacatá 47,24 0,73 0,04 cde 44,16 a 0,77 0,03

Floración × Bianca 57,14 0,70 0,04 bcde 41,24 a 0,76 0,05

Significancia NS NS * *** NS NS

CV (%) 16,89 6,43 18,84 16,89 6,94 16,14 z Valores dentro una columna seguidos por diferentes letras son significativamente diferentes a P≤ 0.05 según el test de Tukey. y N.S.= No significativo (P≤ 0.05). **, *** Significativo a P≤ 0.01 o P≤ 0.001 x C.V.: Coeficiente de variación.



4.4.2 Contenido de clorofilas, carotenoides y parámetros de fluorescencia,

Por otro lado, la Figura 4-3 se muestran los resultados obtenidos en la cuantificación del

contenido de clorofila total y el contenido de carotenoides totales. En general, se puede

observar que para los dos puntos de muestreo se obtuvieron diferencias significativas en

la interacción Etapa × Cultivar sobre la concentración de los pigmentos fotosintéticos

evaluados. En el primer muestro (55 DDT), se observó que la mayoría de plantas control

mostro un contenido de clorofila en hoja alrededor de 2166.26 µg mg-1 PF. Asimismo, es

importante señalar que se presentó una mayor reducción en el contenido de clorofila total

en las plantas del cultivar Bacatá que estuvieron sometidas condiciones de estrés por déficit

hídrico tanto en etapa vegetativa (1517.65 µg mg-1 PF) y reproductiva (1538.90 µg mg-1 PF).

Sin embargo, a los 65 DDE (final del estrés en la etapa reproductiva), las plantas del cultivar

Bachue con estrés en la etapa reproductiva presentaron los mayores contenidos de clorofila

total (~1709.29 µg mg-1 PF). Con respecto al contenido de carotenoides, se observó que el

éste pigmento disminuyo por el estrés hídrico tanto en fase vegetativo como reproductiva,

especialmente, en Bianca, Bacatá y NUA35 a los 55 DDE (Figura 4-3C). Por otro lado, la

concentración de estos carotenoides fue favorecida por una condición de estrés hídrico en

la etapa vegetativa en los cultivares Bacatá y Bianca tuvieron una concentración de estos

pigmento con un incremento cercano al 44% y 32% (279.46 y 356.13 µg mg-1 PF,

respectivamente) a los 65 DDE. Igualmente, las plantas del cultivar Bachue con estrés por

déficit hídrico en la etapa reproductiva tuvieron una mayor concentración (320.50 µg mg-1

PF) de carotenoides totales con relación a su control (230.39 µg mg-1 PF) en este punto de

muestreo (Figura 4-3D). Aranjuelo et al. (2011), reportaron similares resultados, donde la

clorofilas no se vieron significativamente afectadas por condiciones de estrés hídrico,

aunque una mayor producción de carotenoides totales puede ser considerada un

mecanismo de regulación del estrés como actividad antioxidante.

En cuanto a los parámetros de fluorescencia, la Tabla 4-3 presenta los resultados

encontrados en la eficiencia máxima del fotosistema II (Fv/Fm), quenching fotoquímico (qP)

y quenching no fotoquímico (NPQ). Diferencias significativas fueron encontradas en la

interacción Etapa × Cultivar para la relación Fv/Fm y el NPQ a los 55 DDE. Donde las

mayores reducciones en la Fv/Fm (0.67), y NPQ (0.71) se evidenciaron en las plantas del

Capítulo 4 79

cultivar NUA35 con un periodo de quince días de estrés en la etapa vegetativa en

comparación a las plantas control en el mismo cultivar (Fv/Fm de 0.78 y NPQ de 1.07).

Asimismo, no se encontraron diferencias significativas sobre qP en dicho punto de

muestreo. Por otro lado, al final del periodo de estrés por déficit hídrico en la etapa

reproductiva (65 DDE), se encontraron diferencias significativas a nivel de estrés entre

etapas sobre la relación Fv/Fm, donde los menores valores se encontraron en las plantas de

los cultivares que estuvieron bajo condiciones de estrés en la etapa vegetativa (Fv/Fm de

aproximadamente 0.72). Con respecto a los otros parámetros de la fluorescencia de la

clorofila a (qP y el NPQ), se obtuvieron diferencias principalmente en el factor cultivar. En

este aspecto, los valores más bajos en el qP fueron observados en las plantas del cultivar

Cerinza (0.56) y los más altos en las plantas del cultivar NUA35 (0.66); mientras que para

el NPQ los valores más bajos fueron encontrados en las plantas del cultivar NUA35 (0.97)

y los más altos en las plantas del cultivar Bacatá (1.60). Esto concuerda con lo reportado

con Keyvan. (2010) y Perveen et al. (2010).

Figura 4-3. Efecto del estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes sobre la clorofila total (A y B) y carotenoides totales (C y D) de cinco cultivares de fríjol arbustivo (A y C corresponden al muestreo después de finalizar el periodo de estrés en etapa vegetativa; B y D corresponden al muestreo después de finalizar el

periodo de estrés en etapa reproductiva. Las barras representan ± error estándar.



Tabla 4-3. Efecto del estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes sobre parámetros de

fluorescencia de cinco genotipos de fríjol arbustivo (55 DDE y 65 DDE).

Tratamiento

Final de Estrés en etapa vegetativa (55 DDE)

Final de Estrés en etapa reproductiva (65 DDE)

Fv/Fm qP NPQ Fv/Fm qP NPQ

Etapa de estrés

Control 0,78 a 0,61 1,1 0,79 a 0,6 1,07 b

Vegetativo 0,74 b 0,6 1,23 0,72 b 0,62 1,54 a

Reproductivo 0,76ab 0,61 1,28 0,75ab 0,63 1,21 b

Significancia * NS NS ** NS ***

Cultivar

Cerinza 0,77 0,63 1,12ab 0,77 0,56 b 1,27abc

Bachue 0,76 0,63 0,89 b 0,75 0,65ab 1,10 bc

NUA35 0,74 0,62 1,16 a 0,76 0,66 a 0,97 c

Bacatá

0,77 0,57 1,58 a 0,75 0,58ab 1,60

a

Bianca

0,77 0,58 1,29ab 0,75 0,63ab 1,41 ab

Significancia NS NS * NS * ***

Interacción

Control × Cerinza 0,79 a 0,64 1,22ab 0,79 0,55 1,47

Control × Bachue 0,79 a 0,66 0,60 b 0,80 0,65 0,78

Control × NUA35 0,78 a 0,62 1,07ab 0,79 0,71 0,50

Control × Bacatá 0,79 a 0,62 0,92ab 0,78 0,54 1,25

Control × Bianca 0,76ab 0,51 1,69ab 0,79 0,57 1,35

Vegetativa × Cerinza 0,79 a 0,58 1,26ab 0,75 0,56 1,38

Vegetativa × Bachue 0,74ab 0,64 1,23ab 0,72 0,66 1,39

Vegetativa × NUA35 0,67 b 0,65 0,71 b 0,72 0,64 1,32

Vegetativa × Bacatá 0,75ab 0,54 1,86 a 0,74 0,56 1,99

Vegetativa × Bianca 0,77ab 0,61 1,11ab 0,70 0,70 1,61

Floración × Cerinza 0,74ab 0,66 0,86ab 0,77 0,57 0,98

Floración × Bachue 0,74ab 0,6 0,83ab 0,73 0,65 1,14

Floración × NUA35 0,78 a 0,59 1,70ab 0,76 0,64 1,08

Floración × Bacatá 0,77ab 0,56 1,95 a 0,73 0,66 1,56

Floración × Bianca 0,77ab 0,62 1,07ab 0,77 0,62 1,27

Significancia * NS ** NS NS NS

CV (%) 5,25 5,25 36,94 6,93 6,93 27,92

z Valores dentro una columna seguidos por diferentes letras son significativamente diferentes a P≤ 0.05 según el test de Tukey. y N.S.= No significativo (P≤ 0.05). **, *** Significativo a P≤ 0.01 o P≤ 0.001 x C.V.: Coeficiente de variación.

4.4.3 Concentración de Malondialdehido y Prolina

En cuanto al daño de la membrana por estrés oxidativo y producción de osmolitos,

resultados de la producción de malondialdehido (MDA) y prolina se muestran en la Figura

4-4A, B, C y D respectivamente). Diferencias significativas fueron también observadas

entre los diferentes tratamientos en las variables anteriormente mencionadas sobre la

interacción etapa de Estrés × Cultivar (P≤0.001 a los 55 DDE y P≤0.05 a los 65 DDE). Las

plantas del cultivar Cerinza con estrés hídrico durante la fase fenológica vegetativa

presentaron la mayor producción de MDA a los 55 DDE (con valores cercanos a 14 µmol

g-1 PF). Luego, los cultivares Bacatá (8.90 µmol g-1 PF) y Bianca (6.54 µmol g-1 PF) también

tuvieron un aumento en la producción de MDA cercano al 30% comparado a sus controles

(Figura 4-4A). A los 65 DDE, la producción de MDA fue especialmente mayor en el

genotipo Bacatá bajo condiciones de estrés en la etapa reproductiva (6.37 µmol g-1 PF),

seguido por el cultivar Cerinza que fue sometido a déficit en etapa vegetativa (5.96 µmol

g-1 PF) (Figura 4-4B).

Asimismo, la producción de prolina fue favorecida bajo las condiciones de estrés en las

etapas vegetativa y reproductiva en los dos puntos de muestreo (55 y 65 DDE,

respectivamente), donde Bachue fue el cultivar con mayor producción de este osmolito

(aproximadamente 76 y 58 µmol g-1 PF para la etapa vegetativa y reproductiva

respectivamente a los 55 DDE). Finalmente, los contenidos de prolina en general fueron

menores a los 65 DDE en relación a los observados a los 55 DDE. En este sentido, un

menor contenido de prolina fue registrado en los cultivares durante déficit hídrico en el

segundo punto de muestreo (65DDE). Es decir, los cultivares Cerinza, NUA35, Bacatá y

Bianca pasaron de un contenido promedio de prolina en plantas control de 40 µmol g-1 PF

a valores de 51 µmol g-1 PF bajo condiciones de sequía durante la eta reproductiva. (Figura

4-4 C y D). Similares resultados fueron reportados por Hong-Bo et al. (2006); Sánchez-

Rodríguez et al. (2010); Sun et al. (2013) y Osman. (2015), siendo los genotipos tolerantes

aquellos cuya producción de sustancias antioxidantes tales como la prolina y carotenoides

es mayor bajo condiciones de estrés.



Figura 4-4. Efecto del estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes sobre la producción de malondialdehido (A y B) y producción de prolina (C y D) de cinco cultivares de fríjol arbustivo (A y C corresponden al muestreo después de finalizar el periodo de estrés en etapa vegetativa; B y D corresponden

al muestreo después de finalizar el periodo de estrés en etapa reproductiva. Las barras representan ± error estándar.

4.5 Conclusiones

Un periodo de estrés hídrico de 15 días en la etapa vegetativa y reproductiva causó

afectaciones negativas en las plantas de los diferentes cultivares de fríjol arbustivo,

especialmente en los cultivares Bacatá y Bianca cuando el déficit hídrico se aplicó

en la etapa vegetativa, generando daños a nivel de fotosistema II, incremento de la

producción de malondialdehido y niveles de prolina.

5. Capítulo 5. Evaluación de índices de tolerancia a la sequía para la selección de cultivares de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.) por inducción de estrés por déficit hídrico.

5.1 Resumen

El rendimiento es uno de los factores más afectados por condiciones de déficit hídrico.

Asimismo, se ha encontrado que existen etapas fenológicas más sensibles a condiciones

estresantes. Por tal motivo, el objetivo de esta investigación fue evaluar las respuestas en

parámetros de rendimiento de cinco cultivares de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.)

bajo condición de estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes (una

vegetativa y una reproductiva). Para ello se implementó un diseño en bloques

completamente al azar en arreglo factorial (factor principal la etapa fenológica y factor

secundario los cultivares) para un total de 15 tratamientos con cuatro repeticiones. Se

sembraron semillas de los cultivares de fríjol ICA-Cerinza, ICA-Bachue, NUA35, Bacatá y

Bianca se realizó un diseño. Adicionalmente se cuantificaron parámetros de rendimiento e

índices de susceptibilidad y/o tolerancia al estrés por déficit hídrico. Se encontró que el

cultivar Bacatá es el más sensible al déficit hídrico, especialmente en la etapa vegetativa,

lo cual se evidencia en la reducción de los diferentes parámetros de rendimiento.

Asimismo, el cultivar NUA35 fue considerado un cultivar tolerante al déficit hídrico en las

dos etapas evaluadas. Se recomienda el uso de índices para caracterizar genotipos a

condiciones de estrés por déficit hídrico.

Palabras clave: Susceptibilidad, tolerancia, sequía, rendimiento, fenología.



5.2 Introducción

El fríjol común (Phaseolus vulgaris L.) es el grano de legumbre más importante para la

alimentación humana (Beebe., 2012; Beebe et al., 2013). El consumo per cápita de fríjoles

en los países latinoamericanos oscila entre 12 Kg y 18 Kg por año, aunque éstas cifras no

discriminan el consumo urbano del rural (Broughton et al., 2003; Beebe et al., 2013). Es

consumido principalmente por su alto contenido de proteínas y minerales (FAO, 2007), y

América Latina es la región mundial con mayor producción de fríjol, cubriendo el 50% de

la producción mundial (Beebe et al., 2013), y Colombia en el primer semestre del 2015

alcanzó una producción de 62,974 toneladas (Fenalce., 2016).

Todos los estreses bióticos y abióticos causan en algún grado disminución sobre el

rendimiento de los cultivos; sin embargo, el estrés por déficit hídrico es el factor más

limitante de la producción agrícola del mundo (Mollasadeghi et al., 2011; Naghavi et al.,

2013). En este aspecto, la Unidad Nacional para la Gestión del Riesgo de Desastres en

Colombia (2014), ha reportado que Fenómenos del Niño pueden afectar a más de 180

municipios del país, causando una reducción de la oferta hídrica cercana al 50%.

Igualmente, según estudios de la Comunidad Andina (2009), en Colombia existe un área

de ~59.000 km2 expuestas a condiciones de sequía, en la que gran parte de esta área se

pertenece a la región andina, donde el fríjol es comúnmente cultivado.

Por otro lado, entender las respuestas de las plantas al estrés por sequía es de gran

importancia para la selección de genotipos tolerantes a condiciones ambientales adversas

(Zhao et al., 2008; Farshadfar et al., 2013). Asimismo, el comportamiento del rendimiento

relativo de los genotipos en condiciones tanto favorables como aquellos afectados por el

déficit hídrico parece ser un punto de partida importante en la identificación de genotipos

deseables para las regiones afectadas por la baja disponibilidad de agua (Nouri et al.,

2011; Farshadfar et al., 2013). La selección de genotipos con tolerancia a la sequía no es

fácil, debido a la ocurrencia de fuertes interacciones entre genotipos y el medio ambiente,

Capítulo 5 85

además del escaso conocimiento de la función y el papel de los diferentes mecanismos

de tolerancia (Naghavi et al., 2013).

Actualmente, numerosos investigadores han trabajado en los diferentes métodos de

selección de genotipos con tolerancia a la sequía mediante el uso de índices de tolerancia

y/o susceptibilidad (Yang et al., 2002; Khakwani et al., 2011; Farshadfar et al., 2013;

Naghavi et al., 2013). Fernández (1992), sugieren que el Índice de tolerancia al estrés (STI)

está definido como un marcador útil para determinar el potencial de alta tolerancia y

rendimiento el estrés de los genotipos evaluados. No obstante, se han propuesto

novedades de índices alternos útiles para la identificación de genotipos tales como el Índice

de Susceptibilidad al Estrés (SSI) por Fischer y Maurer (1978); la Tolerancia al Estrés

(TOL) y la Productividad Media (MP) por Rosielle y Hamblin (1981); la Productividad Media

Geométrica (GMP) por Fernández (1992), entre otros.

Sin embargo, la implementación de índices de tolerancia a sequía en los métodos de

selección de genotipos de fríjol tolerantes y/o susceptibilidad a la sequía no son muy

usados. Por tal motivo, el objetivo de esta investigación fue evaluar las respuestas en

parámetros de rendimiento de cinco cultivares de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.)

bajo condición de estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes (una

vegetativa y una reproductiva). Además, se realizó este estudio con el fin de evaluar los

criterios de selección para la identificación de tolerancia al déficit hídrico en cultivares de

fríjol, de modo que los cultivares adecuados puedan ser recomendados para el cultivo en

zonas propensas a la sequía en Colombia y áreas similares.





Semillas de cinco cultivares de fríjol arbustivo fueron usadas en el presente estudio. Los

genotipos estudiados eran los siguientes: i) ICA-Cerinza e ICA-Bachue son dos materiales

con 20 años de siembra en la agricultura tradicional colombiana, ii) NUA35 es un genotipo

con siete años de comercialización desde su liberación y iii) Bianca y Bacatá son dos

cultivares de reciente liberación (menos de dos años). Las semillas fueron sembradas en

el invernadero de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia

ubicado en la ciudad de Bogotá a una altura de 2556 msnm, (4°35’56’’ y 74°04’51’’) durante

los meses de septiembre del 2015 a enero del 2016 en parcelas de 2.1 m2 (3 surcos de 1

m lineal de largo). El marco de plantación era 16 × 70 cm entre planta y entre surcos,

respectivamente (20 semillas por parcela = 85.000 plantas ha-1). Las características físico-

químicas del suelo en el invernadero eran las siguientes: i) una textura Franco Arcilloso

(26% arena, 42% de limo y 32% de Arcilla), ii) características químicas: Nitrógeno total:

0.36%, Ca: 10.6, K: 0.98, Mg: 1.75, Na: 0.24 meq 100 g-1, Cu: 1.67, Fe: 310, Mn: 3.21, Zn:

15.5, B: 0.48 y P: >116 mg kg-1, iii) pH 5.4 y iv) Capacidad de Intercambio Catiónico

Efectiva (CICE) 13.8 meq/100g. Las condiciones de crecimiento del invernadero durante

la evaluación fueron temperatura promedio de 27°C, humedad relativa de 60 a 80% y un

fotoperiodo natural de 12 h con una PAR de 1000 µmol m-2 s-1. Después de la emergencia,

las plantas fueron fertilizadas con dos fertilizantes edáficos: i) 4 g planta-1 (350 Kg ha-1) de

un fertilizante compuesto de grado 15-15-15 (TRIAN 15® Yara, Colombia) como fuente de

nitrógeno, fósforo y potasio; ii) y 2 g planta-1 (170 Kg Ha-1) de microelementos (Agrimins

granulado, Colinagro®, Colombia) respectivamente, repartidas en dos aplicaciones (Los

fertilizantes edáficos fueron aplicados a los 15 y 40 DDE)). Finalmente, la composición

de Agrimins era: Nitrogeno total 8% (Úrea N 7% y Amonio N 1%), Fósforo asimilable

(P2O5) 5.0%, Calcio (CaO) 18%, Magnesio (MgO) 6%, Azufre Total 1.6%, Cobre

0.75%, Boro 1%, Molibdeno 0.005% y Zinc 2.5%.

5.3.2 Tratamiento de déficit hídrico

Plantas de frijol por cada cultivar fueron separadas en dos grupos para ser sometidas a

dos diferentes periodos de déficit hídrico. Un primer grupo, las plantas fueron sometidas a

un periodo de estrés en etapa vegetativa cuando las plantas alcanzaron el estado

Capítulo 5 87

fenológico 13-14 según escala BBCH (Feller et al., 1995b) (formación de 3 a 4 hojas

trifoliadas completamente expandidas), el cual se alcanzó aproximadamente a los 40 días

después de la emergencia de la totalidad de las plantas (DDE). En el segundo grupo, el

estrés fue aplicado desarrollado durante la etapa reproductiva en el estado 63-64 (30 a

40% de las flores abiertas) aproximadamente a los 50 días después de la emergencia de

la totalidad de las plantas según la metodología reportada por Ghanbari et al. (2013). El

déficit de agua fue establecido mediante la suspensión del agua de riego durante 15 días.

Este periodo de tiempo fue tomado según estudios desarrollados previamente donde

variables tales como fotosíntesis, perdida de electrolitos y producción de prolina tuvieron

afectaciones negativas. Posteriormente, se estuvo monitoreando el contenido de humedad

del suelo mediante una sonda de humedad (Kelway HB-2 Soil Acidity and Moisture Tester,

Kel Instruments Co., Inc. NJ, USA), buscando tener una humedad entre el 45% y 55% de

la capacidad de campo durante el periodo de estrés, teniendo en cuenta que el 100% de

la capacidad de campo corresponde a un 29.87% de humedad del suelo en peso.

Adicionalmente, el criterio de tomar un 50% de humedad en el suelo se fundamentó porque

las plantas presentan reducción y alteraciones en sus relaciones hídricas con humedades

del suelo entre el 40 y 60 % (Costa-França et al., 2000; Segura-Monroy et al., 2015).


Se aplicó un diseño en bloques al azar con arreglo factorial donde el primer factor fue la

etapa fenológica en la que se inició el estrés por sequía y el segundo factor fueron los cinco

cultivares evaluados para un total de 15 tratamientos con cuatro repeticiones para un total

de 60 parcelas. Posteriormente, cuando se presentaron diferencias significativas en el

ANAVA, se empleó la prueba comparativa de medias de Tukey a P ≤ 0.05. Los datos se

analizaron usando el programa Statistix v 9.0 (software analítico, Tallahassee, FL, US).

Adicionalmente, se realizó un análisis de componentes principales utilizando el programa

InfoStat 2016 (Di Rienzo et al., 2016). Los resultados del análisis de varianza son

resumidos en la Tabla 5-1.



5.3.4 Contenido Relativo de Agua

Se realizaron dos muestreos del contenido relativo del agua (CRA) de la hoja al final de

cada periodo de estrés (15 días después del inicio del déficit hídrico, es decir a los 55 DDT

para la etapa vegetativa y 65 DDT para la etapa reproductiva). El contenido relativo de

agua fue determinado en hojas totalmente expandidas de la parte media del dosel. Las

hojas solamente fueron recolectadas al final del periodo de estrés hídrico para cada uno

de los genotipos de fríjol evaluados. El CRA fue calculado mediante la siguiente ecuación:


𝑃𝑇 − 𝑃𝑆] × 100 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1)




5.3.5 Parámetros de rendimiento

La cosecha de los granos se realizó al final del ciclo del cultivo (155 DDE) de los genotipos

(granos con aproximadamente el 14% de humedad). Al momento de la cosecha, se

seleccionaron al azar cinco plantas individuales para la evaluación de los parámetros de

rendimiento, teniendo en cuenta el número de granos por vaina, el número de semillas por

vaina, número de vainas por planta, número de semillas por planta, rendimiento por planta

y rendimiento por hectárea.

5.3.6 Índice de tolerancia y susceptibilidad al estrés por sequía

Para la estimación de la susceptibilidad y tolerancia de los genotipos al estrés por sequía

se aplicaron las ecuaciones propuestas por Fischer y Maurer (1978) para la determinación

del Índice de Susceptibilidad al Estrés (SSI); Rosielle y Hamblin (1981) para la Tolerancia

(TOL), Productividad Media (MP) y Productividad Media Geométrica (GMP); Fernández

Capítulo 5 89

(1992) para el Índice de Tolerancia al Estrés (STI); Bouslama y Schapaugh, (1984) para el

Índice de estabilidad del rendimiento (YSI); Gavuzzi et al. (1997) para el Índice de

rendimiento (YI), Farshadfar et al. (2013) para la Media armónica (HM), Farshadfar y

Javadinia, (2011) para el Índice de Sensibilidad a la Sequía (SDI).

𝑆𝑆𝐼 = 1 − (

𝑌𝑆𝑌𝑃

)

1 − (�̅�𝑆

�̅�𝑃)

(𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 3)

𝑇𝑂𝐿 = 𝑌𝑃 − 𝑌𝑆 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 4)

𝑀𝑃 = (𝑌𝑃 + 𝑌𝑆)

2 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 5)

𝐺𝑀𝑃 = √(𝑌𝑆 × 𝑌𝑃) (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 6)

𝑆𝑇𝐼 = (𝑌𝑃 × 𝑌𝑆)

(�̅�𝑃)2 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 7)

𝑌𝑆𝐼 = 𝑌𝑆

𝑌𝑃 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 8)

𝑌𝐼 = 𝑌𝑆

�̅�𝑃

(𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 9)

𝐻𝑀 = 2 ( 𝑌𝑆)( 𝑌𝑃)

( 𝑌𝑆 + 𝑌𝑃) (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 10)

𝑆𝐷𝐼 = 𝑌𝑆 − 𝑌𝑃

𝑌𝑃 (𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 11)

Donde YP es el promedio del rendimiento del genotipo sin condición de estrés, YS es el

promedio del rendimiento del genotipo bajo condición de estrés �̅�𝑃 es el rendimiento

promedio de todos los genotipos sin condición de estrés y �̅�𝑠 es el promedio de rendimiento

de todos los genotipos bajo condiciones de estrés.

Tabla 5-1. Resumen del análisis de varianza de los efectos del estrés hídrico sobre el comportamiento fisiológico y parámetros de rendimiento de cinco genotipos

de fríjol arbustivo.


Final estrés etapa vegetativa (55 DDE)

Final estrés etapa reproductiva (65 DDE)

Etapa Cultivar Etapa × Cultivar Etapa Cultivar Etapa × Cultivar

Contenido relativo del agua CRA *** NS NS *** NS NS


Etapa Cultivar Etapa × Cultivar

No. Vainas por planta ** NS NS No. Granos por vaina *** *** NS

No granos por planta *** *** *** Rendimiento por planta *** *** ***

Rendimiento por hectárea *** *** ***

Peso de 100 granos ** * * *, **, y *** significativamente diferente en los niveles de probabilidad a 0.05, 0.01 y 0.001, respectivamente. NS, no significativo con a = 0.05.



5.4 Resultados y discusión

5.4.1 Humedad del suelo y Contenido Relativo de Agua

Resultados del contenido de humedad del suelo (CHS) y contenido relativo del agua CRA

se muestran en la Figura 5-1. En las plantas del tratamiento control estuvo alrededor 90%

de capacidad de campo durante el ensayo. Con respecto al CHS de los otros tratamientos,

se observó que este estuvo cercano al 55% al final de los 15 días de déficit hídrico iniciado

en la etapa vegetativa (55DDE). Asimismo, el CHS del tratamiento de estrés durante la

etapa reproductiva presentaba una humedad alrededor del 53.5% a los 65 DDE (Figura

5-1A). Los resultados obtenidos en la cuantificación de la humedad del suelo señalan que

un grupo de plantas estuvo con una menor disponibilidad de agua en algún momento de su

desarrollo. Igualmente, los resultados del Contenido Relativo de Agua (CRA) en la hoja son

resumidos en la Figura 5-1(B y C). Diferencias significativas solamente fueron observadas

para el factor de estatus hídrico (Tabla 5-1). En el muestreo de los 55 DDE, plantas que

iniciaron su periodo de estrés en la etapa vegetativa presentaron un CRA ̴70% en

comparación a las plantas control que presentaron valores cercanos al 85% a los 55 DDE.

Asimismo, las plantas que iniciaron a sufrir un déficit hídrico en la etapa reproductiva

mostraron un valor ̴ 77.43% en ese punto (Figura 5-1B). Cuando finalizó el periodo de

estrés de la fase reproductiva (65 DDE), las plantas control continuaron con un CRA del

82.57% mientras las plantas con condiciones de estrés en la etapa vegetativa fue

aproximadamente del 75.22% y un 73.34% en fase reproductiva (Figura 5-1C).

Capítulo 5 93

Figura 5-1. Efecto del estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes sobre la humedad del suelo (A) en porcentaje de la capacidad de campo entre los factores de las diferentes etapas fenológicas y el contenido relativo de agua de la hoja de cinco cultivares de fríjol arbustivo (B corresponden al muestreo después de finalizar el periodo de estrés en etapa vegetativa; C corresponden al muestreo después de finalizar el periodo

de estrés en etapa reproductiva. Las barras representan ± error estándar.



5.4.2 Parámetros de rendimiento

La Tabla 5-2 resume las diferencias significativas en los parámetros de rendimiento para

cada uno de los cultivares bajo las condiciones de estrés evaluados. Una significancia de

P≤0.001 fue encontrada en la interacción Etapa × Cultivar para el número de granos por

planta, rendimiento por planta y rendimiento por hectárea, y una significancia de P≤0.05

para el peso de 100 granos. Sin embargo, para el número de granos por vaina se encontró

una significancia de P≤0.001 para el factor Cultivar, mientras que para el número de vainas

por planta solo se encontró diferencias significativas en el factor Etapa con P≤0.01 (Tabla

5-1). En general, un estrés hídrico de 15 días en la etapa vegetativa y reproductiva

disminuyen significativamente el número de granos por vaina (~3.80 en plantas control vs

~3.40 en plantas estresadas) y el número de vainas por planta (~7.30 en plantas control vs

~4.68 en plantas estresadas). Por otro lado, el número de granos por planta se vio afectado

negativamente en las dos etapas fenológicas evaluadas (~26.5 granos en plantas control

vs ~15.85 en plantas estresadas), aunque el cultivar Bacatá bajo condición de estrés por

déficit hídrico en la etapa vegetativa tuyo la mayor reducción en el número de granos,

pasando de ~25.50 a ~7.00 granos. Igualmente, fue el cultivar con la más baja producción

de granos cuando las plantas de los diferentes cultivares estuvieron bajo condición de

estrés por déficit hídrico en la etapa reproductiva (~12.33 granos por planta).

Adicionalmente, los que se afectaron en menor medida cuando el estrés inició en la etapa

vegetativa fueron Bachue, NUA35 y Cerinza, con una reducción del 30% (aproximadamente

18.42 granos por planta). Esta tendencia se mantuvo en el cultivar NUA35 cuando el déficit

hídrico inició en la etapa reproductiva, siendo el cultivar con mayor producción de granos

(cerca de 19.67 granos por planta), seguidamente del cultivar Cerinza, Bachue y Bianca

con 19.25, 17.50 y 13.75 granos por planta respectivamente (Tabla 5-2). En cuanto al peso

de 100 granos, del cultivar Bianca presentó el mayor rendimiento entre los cultivares que

se encontraron en condiciones control (72.03 g); y el cultivar Cerinza mostró el menor peso

(59.87g). No obstante, el cultivar Cerinza bajo condiciones de estrés por déficit hídrico en

la etapa vegetativa presentó un incremento del 20% en dicha variable comparado con las

plantas control (69.69 g), y mantuvo los valores cercanos a los encontrados en plantas

Capítulo 5 95

control cuando el estrés inició en la etapa reproductiva (59.48 g). Adicionalmente, los

cultivares Bacatá y Bianca presentaron las mayores reducciones en el peso de 100 granos

en las dos etapas evaluadas (46.54 g y 50.77 g respectivamente). Por otro parte, el cultivar

NUA35 no vario significativamente en el peso de 100 granos cuando las plantas tuvieron

influencia por déficit hídrico en la etapa vegetativa y reproductiva (Tabla 5-2).

En cuanto al rendimiento por hectárea, se observa que en general los cultivares bajo

condiciones control tienen un rendimiento cercano a 1427.75 Kg. Adicionalmente, el

rendimiento de los cultivares Cerinza, Bachue y NUA35 cuando estuvieron en condición de

déficit hídrico en la etapa vegetativa tuvieron la menor reducción, alcanzando una

producción de 1139.83 Kg, 901.04 Kg y 877.67 Kg, respectivamente y el rendimiento del

cultivar Bacatá en condición de déficit hídrico en la etapa vegetativa fue el más afectado,

con una reducción cercana al 80% (281.27 Kg). Esta tendencia se mantuvo cuando los

cultivares se encontraron en condiciones de estrés por déficit hídrico en la etapa

reproductiva, donde las plantas de NUA35, Cerinza y Bachue tuvieron el mayor rendimiento

(1074.88 Kg, 943.13 Kg y 780.62 Kg, respectivamente) y los rendimientos más bajos se

encontraron en los cultivares Bacatá y Bianca (472.78 Kg y 626.50 Kg, respectivamente).

El rendimiento por planta para todos los cultivares tuvo un comportamiento similar al

rendimiento por hectárea (Tabla 5-2).

En la Figura 5-2 se presenta el biplot para los primeros dos componentes principales, los

cuales representan el 94,1 % del total de la varianza. Las variables de rendimiento

evaluadas se representan mediante vectores, mientras que las variedades sometidas a

estrés en diferentes estados fisiológicos se identifican mediante puntos. Se puede apreciar

una clara separación de las muestras en dos grupos. El primer grupo correspondiente a las

muestras control, ubicadas hacia la parte positiva del componente 1; el segundo grupo,

ubicado en la parte negativa del primer componente principal, formado por las muestras

sometidas a estrés en las dos etapas vegetativas, con la excepción de Cz-E1 y NUA-E2.

Las variables de RtoP, RtoHa y GRP presentan gran similitud y tiene mayores valores en

las variedades Bl-C, NUA y Cerinza. Por su parte, las variedades de Ba-C y Bch-C

presentan menor RtoP, RtoHa y GRP que las otras tres variedades, pero tienen un Pcg

mayor.



Tabla 5-2. Efecto del estrés por déficit hídrico en dos etapas fenológicas diferentes sobre los parámetros de

rendimiento de cinco genotipos de fríjol arbustivo.

Tratamiento

No, granos ×

planta

No, vainas × planta

No, granos ×

vaina

Rendimiento × planta

Rendimiento × ha

Peso 100 granos

g planta-1 Kg ha-1 g

Etapa de estrés

Control 26,50 a 7,30 a 3,80 a 16,80 a 1427,75 a 64,25 a

Vegetativo 15,20 b 4,55 b 3,35 b 9,04 b 768,80 b 55,80 b

Reproductivo 16,50 b 4,80 b 3,45ab 9,17 b 779,58 b 54,81 b

Significancia *** *** * *** *** ***

Variedades

Cerinza 22,83 a 6,33 a 3,67 13,97 a 1187,66 a 62,34 a

Bachue 20,67 a 5,75 a 3,58 12,18bc 1035,16bc 57,23 ab

NUA35 21,14 a 6,08 a 3,58 13,12 a 1115,53ab 61,67 a

Bacatá 14,94 c 4,25 b 3,50 8,40 d 713,86 d 52,34 b

Bianca 17,42 b 5,33ab 3,33 10,68 c 908,00 c 57,85 ab

Significancia *** *** NS *** *** *

Interacción

Control × Cerinza 30,00 aZ 8,00 3,75 17,41 a 1480,04 a 65,87 abc

Control × Bachue 26,25 ab 7,00 4,00 16,75 ab 1423,81 ab 63,80abcd

Control × NUA35 26,00 ab 7,50 3,75 16,40 ab 1394,05 ab 63,64abcd

Control × Bacatá 25,50 ab 6,75 4,00 16,32 ab 1387,53 ab 63,94abcd

Control × Bianca 24,75 bc 7,25 3,50 17,10 a 1453,31 a 72,03 a

Vegetativa × Cerinza 19,25 d 5,50 3,75 13,41 bc 1139,82 bc 69,69 ab

Vegetativa × Bachue 18,25 de 5,25 3,25 10,60cde 901,04 cde 55,97abcd

Vegetativa × NUA35 17,75 de 5,00 3,50 10,33cde 877,67 cde 56,67abcd

Vegetativa × Bacatá 7,00 g 2,25 3,25 3,31 g 281,27 g 47,17 cd

Vegetativa × Bianca 13,75 ef

4,75 3,00 7,58 ef 644,20 ef 49,49 cd

Floración × Cerinza 19,25 d 5,50 3,50 11,10 cd 943,13 cd 59,48abcd

Floración × Bachue 17,50 de 5,00 3,50 9,18 de 780,62 de 51,92 bcd

Floración × NUA35 19,67 cd 5,75 3,50 12,65 c 1074,88cde 64,72 abc

Floración × Bacatá 12,33 f 3,75 3,25 5,56 fg 472,78 fg 45,90 d

Floración × Bianca 13,75 ef 4,00 3,50 7,37 ef 626,50 ef 52,05 bcd

Significancia *** NSy NS *** *** *

CV (%)x 10,27 18,90 13,88 11,57 11,64 12,65 z Valores dentro una columna seguidos por diferentes letras son significativamente diferentes a P≤ 0.05 según el test de Tukey. y NS = No significativo (P≤ 0.05). **, *** Significativo a P≤ 0.01 o P≤ 0.001 x C.V.: Coeficiente de variación.

Figura 5-2. Biplot de Análisis de Componente Principal (PCA) de diferentes variables de rendimiento en plantas

de cinco genotipos de fríjol arbustivo bajo condiciones de estrés en dos etapas fenológicas diferentes. Gpod: Número de granos por vaina; Pod: Número de vainas por planta; Pcg: Peso de 100 granos; RtoP: Rendimiento por planta; RtoHa: Rendimiento por hectárea; GRP: Número de granos por planta. C: Control; E1: Estrés en etapa Vegetativa; E2: Estrés en etapa Reproductiva; Cz: plantas del cultivar Cerinza; Bch: plantas del cultivar Bachue; NUA: plantas del cultivar NUA35; Ba: plantas del cultivar Bacatá y Bl: plantas del cultivar Bianca.

5.4.3 Comparación de cultivares con base a los índices de resistencia/tolerancia

Con el fin de investigar la identificación adecuada de cinco cultivares de fríjol arbustivo

susceptibles y/o tolerantes a condiciones de estrés por déficit hídrico en dos diferentes

etapas fenológicas (vegetativa y reproductiva), se calcularon diferentes índices de

susceptibilidad y tolerancia (Tabla 5-3). Basados en el Índice de Tolerancia al estrés (STI),

MP, GMP, YI, HM, YSI y alto rendimiento de grano. Cerinza, Bachue y NUA35 fueron

encontrados tolerantes a estrés por déficit hídrico para las plantas con estrés en la etapa

vegetativa, mientras que Bacatá mostró los valores más bajos en los índices anteriormente

mencionados. El cultivar Bianca fue considerado semi-tolerante al estrés por déficit hídrico

en la etapa vegetativa, ya que mostró valores intermedios en los diferentes índices que se

muestran en la Tabla 5-3. Por otro lado, NUA35 y Cerinza fueron identificados como



materiales tolerantes al estrés por déficit hídrico inició en la etapa reproductiva según el

STI, MP, GMP, YI, HM, YSI y el rendimiento de grano obtenido, mientras que los cultivares

Bachue y Bianca se categorizaron como materiales semi-tolerantes y el cultivar Bacatá

como susceptible (Tabla 5-3). Mismas tendencias fueron encontradas en genotipos de

trigo y maíz, identificando los genotipos más tolerantes por índices como el STI, MP, GMP

(Yang et al., 2002; Farshadfar et al., 2013; Naghavi et al., 2013).

Tabla 5-3. Índice de tolerancia y susceptibilidad de cinco genotipos de fríjol arbustivo bajo condiciones de estrés por sequía.

Genotipos YS YP SSI TOL MP GMP STI YSI YI HM SDI

Índice de tolerancia y susceptibilidad a estrés hídrico en etapa vegetativa

Cerinza 1,14 1,48 0,50 0,34 1,31 1,30 0,83 0,77 1,48 1,29 0,23

Bachue 0,90 1,42 0,80 0,52 1,16 1,13 0,63 0,63 1,17 1,10 0,37

NUA35 0,88 1,39 0,80 0,52 1,14 1,11 0,60 0,63 1,14 1,08 0,37

Bacatá 0,28 1,39 1,73 1,11 0,83 0,62 0,19 0,20 0,37 0,47 0,80

Bianca 0,64 1,45 1,21 0,81 1,05 0,97 0,46 0,44 0,84 0,89 0,56

Índice de tolerancia y susceptibilidad a estrés hídrico en etapa reproductiva

Cerinza 0,94 1,48 0,80 0,54 1,21 1,18 0,68 0,64 1,21 1,15 0,36

Bachue 0,78 1,42 1,00 0,64 1,10 1,05 0,55 0,55 1,00 1,01 0,45

NUA35 1,07 1,39 0,50 0,32 1,23 1,22 0,74 0,77 1,38 1,21 0,23

Bacatá 0,47 1,39 1,45 0,91 0,93 0,81 0,32 0,34 0,61 0,71 0,66

Bianca 0,63 1,45 1,25 0,83 1,04 0,95 0,45 0,43 0,80 0,88 0,57

Para SSI, TOL y SDI, los valores más bajos son deseables mientras que para YS, YP, MP, HM, GMP, YSI, YI y STI, los valores más altos son deseables.

5.4.4 Análisis de correlación

Con el fin de determinar los criterios de tolerancia al estrés por déficit hídrico más

convenientes, se calcularon los coeficientes de correlación entre YS, YP y otros índices

cuantitativos de la tolerancia a la sequía. En otras palabras, el análisis de correlación entre

los índices de tolerancia a la sequía y el rendimiento de grano pueden ser un buen criterio

para la selección de los mejores cultivares e índices utilizados (Tabla 5-4). La más alta

correlación positiva para las plantas con estrés en la etapa vegetativa fue observada entre

YS y YI al igual que entre el GMP y SDI (r = 1.00 con P≤0.001), mientras que la correlación

altamente negativa fue registrada entre SSI y YSI (r = -1.00 con P≤0.001). Sin embargo, la

más alta correlación positiva para las plantas con estrés en la etapa reproductiva se

registró entre YS y MP, MP y YI, GMP y YI, STI y YSI (r = 0.99 con P≤0.01), YS y GMP, YS

y STI, YS y YSI, YS y YI, YS y HM, TOL y SSI, MP y GMP, MP y STI, MP y YI, MP y HP,

GMP y STI, GMP y YI, GMP y HM, STI y YSI, STI y YI, STI y HM, YSI y YI, YI y HM (r =

0.99 con P≤0.001); entretanto que la correlación altamente negativa fue registrada entre

YS y SSI, TOL y YSI, TOL y YI, SSI y YSI, SSI y YI (r = -0.99 con P≤0.001). Esto concuerda

con lo reportado por Naghavi et al. (2013) y Farshadfar et al. (2013).

Capítulo 5 101

Tabla 5-4. Coeficiente de correlación entre los diferentes índices de tolerancia y susceptibilidad al estrés por déficit hídrico en cinco genotipos de fríjol arbustivo.

Índice de tolerancia y susceptibilidad al estrés por sequía en etapa vegetativa

YS TOL MP GMP SSI STI YSI YI HM SDI

YP 0,59 NS -0,51 NS 0,65 NS 0,61 NS -0,53 NS 0,64 NS 0,53NS 0,59 NS 0,58 NS 0,61 NS

YS -0,99*** 0,99*** 0,99 *** -0,99 *** 0,99*** 0,99*** 1,00*** 0,99*** 0,99 ***

TOL -0,98* -0,99 ** 0,99*** -0,99** -0,99*** -0,99*** -0,99** -0,99**

MP 0,99 *** -0,99 ** 0,99*** 0,99** 0,99*** 0,99*** 0,99***

GMP -0,99*** 0,99*** 0,99*** 0,99*** 0,99*** 1,00***

SSI -0,99*** -1,00*** -0,99*** -0,99*** -0,99***

STI 0,99*** 0,99*** 0,99*** 0,99***

YSI 0,99*** 0,99*** 0,99***

YI 0,99*** 0,99***

HM 0,99***

Índice de tolerancia y susceptibilidad al estrés por sequía en etapa reproductiva

YS TOL MP GMP SSI STI YSI YI HM SDI

YP 0,15 NS 0,26 NS 0,31 NS 0,27 NS -0,52 NS 0,23 NS 0,06NS 0,14NS 0,25NS 0,61NS

YS -0,98 * 0,99 ** 0,99 *** -0,99*** 0,99*** 0,99*** 0,99*** 0,99*** 0,83NS

TOL -0,94 * -0,95 * 0,99*** -0,97 ** -0,99*** -0,99*** -0,96* -0,73NS

MP 0,99*** -0,97 * 0,99*** 0,97** 0,99** 0,99*** 0,90*

GMP -0,97*** 0,99*** 0,98** 0,99** 0,99*** 0,89*

SSI -0,98 * -0,99*** -0,99*** -0,98** -0,77NS

STI 0,99** 0,99*** 0,99*** 0,87NS

YSI 0,99*** 0,98** 0,78NS

YI 0,99*** 0,82NS

HM 0,89*

NS = No significativo (P≤ 0.05). *, **, *** Significativo a P≤ 0.05, P≤ 0.01 o P≤ 0.001.

5.5 Conclusiones

• Los cultivares Bacatá y Bianca fueron los más susceptibles a condiciones de estrés

por déficit hídrico tantos en estado vegetativo como reproductivo, ya que

presentaron una mayor disminución de los componentes de rendimiento (granos

por planta, peso de 100 granos, rendimiento por planta y por hectárea), lo cual se

asoció con los menores índices de tolerancia (SSI, TOL, STI, YSI y SDI)

6. Discusión final

El fríjol (Phaseolus vulgaris L.) es una especie ampliamente cultivada en regiones

principalmente del África y América Latina, con gran importancia en la seguridad

alimentaria debido a sus altos contenidos de proteína y minerales (Beebe et al., 2010); y

presenta alta sensibilidad a la sequía debido a que posee un sistema radical poco profundo

(Beebe et al., 2013). Por consiguiente, la producción de los cultivos de fríjol en épocas

secas está limitada por la condición de déficit hídrico (White e Izquierdo., 1991). Esta

investigación tuvo como objetivo evaluar las respuestas fisiológicas y bioquímicas de cinco

cultivares de fríjol arbustivo bajo condiciones de estrés por déficit hídrico con el motivo de

conocer posibles mecanismos potenciales de respuesta de estos cultivares frente al estrés.

Los resultados presentados en los capítulos 2, 3, 4 y 5 del estudio permiten afirmar que de

los cinco cultivares evaluados. Los resultados son consistentes con el concepto de

tolerancia que plantea que un genotipo es tolerante cuando tiene la capacidad para crecer,

reproducirse y producir óptimo rendimiento bajo condiciones de restricción hídrica (Farooq

et al., 2009; Farooq et al., 2013).

Por otro lado, los resultados expuestos en este trabajo aportan información valiosa que

permite explicar los mecanismos utilizados por los cultivares de fríjol para aumentar su

tolerancia al déficit hídrico, mitigar el daño ocasionado por el estrés y proteger los

diferentes procesos fisiológicos sin disminuir el rendimiento. Adicionalmente, brinda

elementos importantes para la comprensión de cómo las variedades regulan y mitigan el

efecto negativo del déficit hídrico por 15 días; mostrando las diferencias fisiológicas,

bioquímicas y de rendimiento entre los cultivares evaluados y permiten indicar la existencia

diferencias genotípicas en la capacidad para generar diferentes respuestas para

sobrellevar un estrés.

10

4

Título de la tesis o trabajo de investigación

Para tolerar el período de déficit hídrico los cultivares de P. vulgaris L. respondieron

mediante la inducción de respuestas comunes relacionadas con los mecanismos

morfológicos de evitación, respuestas relacionadas con los mecanismos fisiológicos de

estabilidad de la membrana celular, ajuste osmótico y respuesta oxidativa. Además, el

mecanismo de evitación se evidenció a partir de respuestas como la reducción de la

conductancia estomática como estrategia de mitigación de la pérdida de agua

disminuyendo la transpiración (Xu et al., 2010; Farooq et al., 2009); permitiendo conservar

el contenido de agua a nivel celular sin interrumpir la actividad fisiológica durante el déficit

hídrico. Lo anterior fue acompañado de un incremento en el uso eficiente del agua

intrínseco, siendo más alta en aquellos cultivares con rasgos de tolerancia como Cerinza

en la etapa vegetativa y NUA35 en la etapa reproductiva, y ésta se relaciona con los altos

valores de rendimiento bajo condiciones de estrés (Boonjung and Fukai., 1996-1; Boutra

et al., 2010)

En resumen, la mayor capacidad de respuesta de los cultivares Cerinza y NUA35 para

tolerar un déficit hídrico de 15 días con respecto a los cultivares Bacatá, Bianca y Bachue

se relacionan con aquellas respuestas fisiológicas tales como: menor reducción en la

fotosíntesis neta, incremento en la concentración de clorofila total, mayor incremento del

Uso Eficiente del Agua intrínseco, menor transpiración, altos niveles de Carotenoides,

menor fuga de electrolitos, menor producción de malondialdehido y mayor acumulación de

prolina. La menor capacidad de respuesta del genotipo Bacatá y Bianca para tolerar un

déficit hídrico de 15 días está influenciada por una mayor reducción de la tasa fotosintética,

disminución en el WUEi, bajos niveles en el contenido de carotenoides y prolina, mayor

incremento MDA.

La mayor capacidad de respuesta a déficit hídrico presentada por Cerinza en la etapa

vegetativa y NUA35 en la etapa reproductiva se puede asociar con los índices de tolerancia

más altos encontrados en un mayor número de parámetros tanto fisiológicos como

bioquímicos y de componentes de rendimiento como la producción de granos por planta,

rendimiento por planta y por hectárea y el peso de cien granos con respecto a Bacatá y

Bianca (Tabla 5-3).

Anexo B. Nombrar el anexo B de acuerdo con su contenido 105

La información presentada en este trabajo aumenta el conocimiento acerca de los

mecanismos implicados en la tolerancia a la sequía de las variedades colombianas de

fríjol, considerando que para producir genotipos resistentes a sequía es necesario

comprender las respuestas de las plantas a estrés. También puede aportar para desarrollar

nuevas estrategias metodológicas que contribuyen para diferenciar los cultivares

tolerantes y/o susceptibles a estrés, utilizando parámetros fisiológicos y de rendimiento.

Finalmente, en la Figura 8-1se muestra un esquema que explica a manera general las

respuestas de las plantas de fríjol arbustivo evaluadas a condiciones de déficit hídrico, las

cuales incluyen la evitación, escape y tolerancia.

7. Conclusiones y recomendaciones

7.1 Conclusiones

1. El uso de variables relacionadas a la fase lumínica de la Pn como el contenido de

pigmentos fotosintéticos y parámetros de la fluorescencia de clorofila a mostraron

una utilidad en la selección y/o caracterización de genotipos de frijol arbustivo déficit

hídrico.

2. Un periodo de estrés hídrico de 20 días causo afectaciones negativas en las plantas

de fríjol arbustivo cultivar Cerinza. Lo anterior se evidencia en la caída de la tasa

de fotosíntesis, reducción del Fv/Fm, Y(II) y qP en el fotosistema II, incremento del

NPQ, fuga de electrolitos, MDA y niveles de prolina. Asimismo, periodos de 5 y 10

días de duración del estrés hídrico no genera efectos severos sobre las variables

fisiológicas de la especie estudiada.

3. Un periodo de estrés hídrico de 15 días con PEG 6000 en la etapa vegetativa causo


especialmente en los cultivares Bacatá y Bianca. Lo anterior se evidencia en la

caída de la tasa de fotosíntesis, reducción de la masa seca, del Fv/Fm en el

fotosistema II, incremento de la fuga de electrolitos, MDA y niveles de prolina.

10

6


4. Un periodo de estrés hídrico de 15 días en la etapa vegetativa y reproductiva causo


especialmente en los cultivares Bacatá y Bianca en la etapa vegetativa. Lo anterior

se evidencia en la caída de la tasa de fotosíntesis y conductancia estomática, del

Fv/Fm y qP en el fotosistema II, incremento del NPQ, MDA y niveles de prolina.

5. Los cultivares NUA35, Bachue y Cerinza durante el periodo de déficit hídrico

presentaron un aumento en el contenido de carotenoides, la eficiencia en el uso del

agua intrínseca y prolina temprana, indicando su alto potencial de respuesta a

estrés.

6. En los cinco cultivares el rendimiento potencial fue modificado por el déficit hídrico,

posiblemente porque hubo daño al aparato fotosintético; lo cual podría ser un

indicador de la baja capacidad de las plantas de fríjol para mantener el fotosistema

II funcional bajo estrés hídrico, siendo considerado un importante rasgo fisiológico

en la tolerancia a la sequía.

7. Asimismo, se identificó que el cultivar Bacatá es uno de los cultivares más

susceptibles a condiciones de estrés por déficit hídrico, lo cual se evidencia en los

diferentes índices de tolerancia y/o susceptibilidad.

8. Los índices de tolerancia (SSI, TOL, STI, YSI y SDI) fueron una herramienta

interesante en la caracterización del rendimiento de diferentes cultivares bajo

condiciones de déficit hídrico.

9. Este trabajo permitió caracterizar en general un grupo respuestas fisiológicas de

cultivares de frijol arbustivo a déficit hídrico a lo largo de su desarrollo.

7.2 Recomendaciones

1. A pesar de que varios de los mecanismos fisiológicos de tolerancia a un período de

15 días de déficit hídrico fueron explicados en este documento para los cultivares

Cerinza, Bachue, NUA35, Bacatá y Bianca, se recomienda hacer nuevos estudios

en los que se evalúe el efecto de diferentes períodos de déficit hídrico en etapas

fenológicas distintas tanto en invernadero como en campo para complementar los

resultados obtenidos en este estudio.

2. Es importante realizar estudios de las respuestas fisiológicas y bioquímicas en

plantas de diversos cultivares de fríjol arbustivo en diferentes etapas fenológicas.

Anexo B. Nombrar el anexo B de acuerdo con su contenido 107

3. Es necesario incluir nuevas variables bioquímicas como la producción de prolina y

MDA en tejidos de la raíz, como posibles marcadores del estrés, ya que estudios

en este nivel no se han realizado en fríjol.

4. El uso de los índices de tolerancia y/o susceptibilidad al estrés por déficit hídrico en

plantas de diversos cultivares de fríjol arbustivo en diferentes etapas fenológicas

pueden ser considerados marcadores de clasificación de susceptibilidad a la

sequía.

5. Realizar curvas de respuesta a la luz y CO2 con el fin de determinar puntos de

compensación de la fotosíntesis.

6. Caracterizar la actividad antioxidante enzimática y no enzimática como respuesta

al déficit hídrico.

7. Estudiar el comportamiento del uso eficiente de la radiación bajo condiciones de

déficit hídrico.

10

8


8. Modelo conceptual

Este trabajo permitió caracterizar en general un grupo respuestas fisiológicas de cultivares

de frijol arbustivo a déficit hídrico a lo largo de su desarrollo. Estas respuestas son

resumidas en el modelo conceptual que se muestra en la Figura 8-1

En éste modelo se puede apreciar que dentro de las primeras respuestas de las plantas

de fríjol ante una condición de déficit hídrico se da a nivel de raíz, donde se han reportado

la recepción de señales a la sequía y se generan la producción de la hormona ácido

abscísico (ABA), la cual está involucrada en el mecanismo de apertura y cierre de estomas.

Seguidamente se da una reducción de la conductancia estomática, y por ende una

reducción de la transpiración y de la fotosíntesis neta, con el fin de incrementar la eficiencia

en el uso del agua. Dichas respuestas están relacionadas con la estrategia de la evitación

a la sequía, la cual ha sido reportada ampliamente en especies como el arroz, trigo, maíz

entre otras. Adicionalmente, se evidencia pérdida del turgor de la planta reflejada en una

reducción del contenido relativo de agua en la hoja, y estrés oxidativo por la producción de

especies reactivas de oxígeno (ROS), que generan daños a nivel de permeabilidad de

membranas. Ante ésta situación, dos de las respuestas de las plantas de fríjol arbustivo

que se encontraron en nuestro estudio relacionadas con el mecanismo de tolerancia fue la

producción de prolina como una estrategia de ajuste osmótico y la producción de

carotenoides, la cual ha sido reportada como una respuesta antioxidante de tipo no

enzimática. Por otro lado, debido a la reducción de la tasa de fotosíntesis, lo cual se

evidencia en una reducción de la acumulación de materia seca total, especialmente en los

órganos de la parte aérea. Igualmente, se evidencia una removilización de asimilados, en

donde cultivares con características de tolerancia al déficit hídrico mantienen los

parámetros de rendimiento en niveles cercanos a los encontrados en plastas bajo

condiciones control, lo cual se evidencia en los diferentes índices de tolerancia y/o

susceptibilidad al estrés por sequía.

Figura 8-1. Modelo conceptual de las respuestas de las plantas de fríjol arbustivo (Phaseolus vulgaris L.) a condiciones de estrés por déficit hídrico.

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