UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOacuteGICAS

UNIDAD DE POST-GRADO

Caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de

una isoenzima baacutesica de Fosfolipasa A2 del veneno de

la serpiente peruana Lachesis muta (Linnaeus 1766)

TESIS

Para optar al grado acadeacutemico de Magister en Biologiacutea Molecular

AUTOR

Rosalina Rosio Inga Arellano

Lima-Peruacute

2010

Amo al Sentildeor porque escucha el clamor de mi plegaria

Inclino hacia miacute su oiacutedo el diacutea en que lo llame

Estaba yo sin fuerza y me salvoacute

Al Sentildeor en mi angustia recurriacute me respondioacute sacaacutendome de apuros

Si yo tengo al Sentildeor no tengo miedo

iquestQueacute podraacute hacerme el hombre

1

DEDICATORIA

A Dios por su bendicioacuten su fuerza y su amor

A mis amados padres David y Rosalina por su amor paciencia y apoyo

incondicional

A mis dos angelitos mis sobrinos Sebastiaacuten y Rodrigo

A mis queridisimos hermanos Daly Joel y Antonio

y a mis cuntildeadas Maribel JuliaElisa y Carla

AGRADECIMIENTOS

A la Memoria del Maestro Orestes Maacutelaga Maacutelaga por inculcar ciencia creer en los

suentildeos de un mejor laboratorio y ensentildearme a no rendirme

Al Dr Armando Yarlequeacute Jefe del laboratorio de Biologiacutea Molecular por su

asesoramiento durante la elaboracioacuten del presente trabajo

Al Dr Cesar Cabezas Jefe del Instituto Nacional de Salud por su apoyo brindado para el

perfeccionamiento con la pasantia en Italia

A los Drs Joseacute Maria Gutieacuterrez y Bruno Lomonte por compartir sus conocimientos por

sus ensentildeanzas ayuda y amistad brindada Asiacute mismo mi gran respeto y carintildeo a Mauren

Oscar Marvin Melvin Julian Carmen Rigo Laura Teresa Alvaro y todos los

compantildeeros y compantildeeras del Instituto Clodomiro Picado-Costa Rica

Al los Drs Alessandro Bartoloni Fillippo Bartalesi Dra Marianne Strohmeyer por la

oportunidad de ampliar mis conocimientos y su gentileza en Firenze-Italia

Al Dr Jean-Denis Docquier por su constante intereacutes en mi avance profesional a la Dra

Lucia Henrici DeAngelis porque en esas dos ultimas semanas aprendiacute maacutes que en 2 antildeos

a los dos les brindo mi eterno agradecimiento

Al Dr Gian Maria Rossolini asiacute como a todo el grupo Tiziana Lucia Eleonora

Samanta Gisela Tommaso Vincenzo Marco Luisa Filomena Claudia y a todos de la

Universidad de Siena-Italia

A la Mag Fanny Lazo por sus consejos y ayuda oportuna en todo el proceso de la

investigacioacuten A la Mag Edith Rodriacuteguez por inculcarme la disciplinada y el orden en la

investigacioacuten

Al Blgo Javier Caacuterdenas sin su apoyo no hubiera sido posible la culminacioacuten de esta

investigacioacuten gracias tambieacuten por tus consejos y amistad

A las Blgas Claudia Barleta y Katya Zumaeta por su ayuda en un punto muy importante

de la tesis gracias chicas tambieacuten por su amistad

A mis colegas y amigos Gustavo Sandoval Dan Vivas Pedro Palermo y Julio Mendoza

por los momentos compartidos en el laboratorio su ayuda en la realizacioacuten de la tesis y

por creer que se puede llegar maacutes lejos si uno quiere

A las amigas de siempre Fanny R Betty F Nora R Fiorella L Miriam L Luz H Guliana

G Marina V Melissa T Rocio D

A los chicos del LBM si no hubiese a quien ensentildear no se investigariacutea Y a todos

aquellos que la ingrata memoria no me permite hoy mencionar pero si mantildeana ayudar

mi sincero agradecimiento

A CONCYTEC por su apoyo financiero con la Beca de estudio

Y sobre todo gracias a ti Dios Padre por estar siempre a mi lado cuidaacutendome

1

ABREVIATURAS

PLA2 Fosfolipasa A2

PLA2baacutesicaLmuta Fosfolipasa A2baacutesica de Lachesis muta

CM-Sephadex C-50 Carboximetil Sephadex C-50

rpm revoluciones por minuto

Da Daltons

pI Punto isoelectrico

mg microg miligramos microgramos

ml microl mililitros microlitros

mlh mililitros por hora

nm nanometros

mM nM microM milimolar nanomolar micromolar

UTA Unidades totales de actividad

SDS sodio dodecil sulfato

Tris tris (hidroximetil amino metano)

HCl aacutecido clorhiacutedrico

PAGE-SDS Electroforesis en gel de poliacrilamida

com sodio dodecil sulfato

TEMED N N N N acute-tetrametil etilen diamino

EDTA Etilen diamino tetra aceacutetico

PMSF Fenil metil sulfonil fluoruro

DTT Ditiotreitol

TLCK Tosyl lisil clorometil cetona

DH50 Dosis hemoliacutetica media

DMM Dosis miotoacutexica miacutenima

CK Cretina kinasa

IUL Unidades internacionales por litro

DEM Dosis edemaacutetica miacutenima

Log Logaritmo

Long longitud

UV ultravioleta

IacuteNDICE GENERAL

Paacuteg

RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1

ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2

INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3

ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5

OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11

MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 70

REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 72

1

IacuteNDICE DE FIGURAS

Paacuteg

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5 Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6 Figura 3 Primer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 4 Segundo paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 5 Tercer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Figura 6 Determinacioacuten del peso molecular y pureza de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphellip 36 Figura 7 pH Oacuteptimo de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36 Figura 8 Determinacioacuten de la dosis hemoliacutetica media DH50helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 9 Actividad hemoliacutetica indirecta en placa de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 10 Actividad edemaacutetica de la fosfolipasa A2 baacutesica de Lachesis mutahelliphelliphelliphellip 44 Figura 11 Actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46 Figura 12 Antigenicidad de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48 Figura 13 Neutralizacioacuten de la actividad enzimaacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 49 Figura 14 Neutralizacioacuten de la actividad hemoliacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 50 Figura 15 Neutralizacioacuten de la actividad edemaacutetica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 51 Figura 16 Neutralizacioacuten de la actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphellip 52 Figura 17 Amplificado de cDNA de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54 Figura 18 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias nucleotiacutedicas de la PLA2helliphelliphelliphelliphellip 57 Figura 19 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 58 Figura 20 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59 Figura 21 Ubicacioacuten del peacuteptido sentildeal PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 61 Figura 22 Composicioacuten de la estructura secundaria de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 62 Figura 23 Modelo propuesto de estructura tridimensional de la PLA2baacutesicaLmutahelliphellip 64 Figura 24 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias aminoaciacutedicas de las PLA2helliphelliphelliphellip 66 Figura 25 Aacuterbol filogeneacutetico de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 68

IacuteNDICE DE TABLAS

Paacuteg Tabla 1 Cuadro de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Tabla 2 Efecto de algunos iones sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 3 Efecto de algunos inhibidores sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 4 Alineamiento de la secuencia nucleotiacutedica la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 56 Tabla 5 Determinacioacuten del peacuteptido sentildeal de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 60 Tabla 6 Composicioacuten de aminoaacutecidos de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 63 Tabla 7 Alineamiento de la secuencia proteica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 65

1

RESUMEN

En la presente investigacioacuten se estudian las propiedades bioquiacutemicas

bioloacutegicas inmunoloacutegicas y moleculares de una isoforma baacutesica de Fosfolipasa

A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta

(PLA2baacutesicaLmuta) La purificacioacuten se realizoacute mediante cromatografiacutea de

intercambio ioacutenico filtracioacuten y de alta performance la enzima fue purificada 412

veces con un rendimiento de 64 Se obtuvo una uacutenica banda proteica de 147

kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras demostrando ser

una proteiacutena monomeacuterica Su pH oacuteptimo es de 78 y es fuertemente inhibida por

el PMSF EDTA y glutatioacuten En cuanto a su accioacuten bioloacutegica se obtuvo la dosis

hemoliacutetica media (DH50) en 435microg la dosis miotoacutexica miacutenima (DMM) en

1896microgml y la dosis edemaacutetica miacutenima (DEM) 2356μg La enzima no mostroacute

actividad hemorraacutegica ni accioacuten anticoagulante Adicionalmente las pruebas de

inmunodifusioacuten e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2baacutesicaLmuta es

reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilacheacutesico (INS-

Peruacute)

Empleando la metodologiacutea de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa

del cDNA de PLA2baacutesicaLmuta con 445 pb anaacutelisis bioinformaacuteticos indican que

la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleoacutetidos que codifica

un peacuteptido sentildeal de 16 aminoaacutecidos y una proteiacutena madura de 122 residuos el

peso molecular fue de 1386 kDa y un pI de 8316 La secuencia aminoaciacutedica

contiene residuos conservados para el sitio cataliacutetico His48 Asp49 Tyr52 asiacute

como para unioacuten al Ca+2 Tyr18 Gly30 y Gly32 El modelaje tridimensional de la

PLA2 muestra que estaacute formada por tres heacutelices- una laacutemina- y un lazo de

unioacuten al Ca+2 PLA2baacutesicaLmuta mostroacute alta homologiacutea estructural con otras

sPLA2 de venenos de serpientes Finalmente los estudios revelan que la

PLA2baacutesicaLmuta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] baacutesicas de bajo peso

molecular Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y funcioacuten de

una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana

Palabras claves Fosfolipasa A2 Isoenzima Lachesis muta sitio farmacoloacutegico transcrito

2

ABSTRACT

In the present research the biochemical biological immunological as well

as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of

peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicLmuta) were studied This enzyme

was purified using ion exchange filtration and high performance

chromatographical steps respectively The enzyme was purified 412 times with

a yield of 64 SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 147 kDa

under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single

polypeptide chain Furthermore the enzyme had a optimal pH of 78 and was

inhibited by PMSF EDTA and glutation In relation to its biologic activity a

Medium Hemolytic Doses (DH50) of 435microgtube Minimum Miotoxic Doses

(MMD) of 1896microgml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 915μg were

obtained For another hand the PLA2 didnacutet show either hemorrhagic or

anticoagulant activities and was recognized and partially inhibited by monovalent

antilachesic serum (INS-Peruacute) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis

Using RT-PCR methodology and bioinformaacutetics analysis the complete

cDNA sequence of PLA2basicLmuta with 445 bp and an open reading frames of

414 nucleotides were obtained which encodes a peptide signal of 16 amino

acids and a matured protein of 122 residues with 13 86 kDa and a pI value of

83 calculated by in silico analysis The amino acidic sequence contains

conserved residues of His48 Asp49 Tyr52 in the catalytic site as well as Tyr18

Gly30 y Gly32 in the Ca+2-binding site Three-dimensional model of

PLA2basicLmuta showed that was conformed by three α-helix one β-sheet and

one Ca+2-binding ribbon PLA2basicLmuta shows a high structural homology with

other snake venom phospholipases Finally studies reveal that PLA2basicLmuta

belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49] This work is

the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom

enzyme

Key words Phospholipase A2 Isoenzyme Lachesis muta pharmacologic site

transcript

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

Amo al Sentildeor porque escucha el clamor de mi plegaria

Inclino hacia miacute su oiacutedo el diacutea en que lo llame

Estaba yo sin fuerza y me salvoacute

Al Sentildeor en mi angustia recurriacute me respondioacute sacaacutendome de apuros

Si yo tengo al Sentildeor no tengo miedo

iquestQueacute podraacute hacerme el hombre

1

DEDICATORIA

A Dios por su bendicioacuten su fuerza y su amor

A mis amados padres David y Rosalina por su amor paciencia y apoyo

incondicional

A mis dos angelitos mis sobrinos Sebastiaacuten y Rodrigo

A mis queridisimos hermanos Daly Joel y Antonio

y a mis cuntildeadas Maribel JuliaElisa y Carla

AGRADECIMIENTOS

A la Memoria del Maestro Orestes Maacutelaga Maacutelaga por inculcar ciencia creer en los

suentildeos de un mejor laboratorio y ensentildearme a no rendirme

Al Dr Armando Yarlequeacute Jefe del laboratorio de Biologiacutea Molecular por su

asesoramiento durante la elaboracioacuten del presente trabajo

Al Dr Cesar Cabezas Jefe del Instituto Nacional de Salud por su apoyo brindado para el

perfeccionamiento con la pasantia en Italia

A los Drs Joseacute Maria Gutieacuterrez y Bruno Lomonte por compartir sus conocimientos por

sus ensentildeanzas ayuda y amistad brindada Asiacute mismo mi gran respeto y carintildeo a Mauren

Oscar Marvin Melvin Julian Carmen Rigo Laura Teresa Alvaro y todos los

compantildeeros y compantildeeras del Instituto Clodomiro Picado-Costa Rica

Al los Drs Alessandro Bartoloni Fillippo Bartalesi Dra Marianne Strohmeyer por la

oportunidad de ampliar mis conocimientos y su gentileza en Firenze-Italia

Al Dr Jean-Denis Docquier por su constante intereacutes en mi avance profesional a la Dra

Lucia Henrici DeAngelis porque en esas dos ultimas semanas aprendiacute maacutes que en 2 antildeos

a los dos les brindo mi eterno agradecimiento

Al Dr Gian Maria Rossolini asiacute como a todo el grupo Tiziana Lucia Eleonora

Samanta Gisela Tommaso Vincenzo Marco Luisa Filomena Claudia y a todos de la

Universidad de Siena-Italia

A la Mag Fanny Lazo por sus consejos y ayuda oportuna en todo el proceso de la

investigacioacuten A la Mag Edith Rodriacuteguez por inculcarme la disciplinada y el orden en la

investigacioacuten

Al Blgo Javier Caacuterdenas sin su apoyo no hubiera sido posible la culminacioacuten de esta

investigacioacuten gracias tambieacuten por tus consejos y amistad

A las Blgas Claudia Barleta y Katya Zumaeta por su ayuda en un punto muy importante

de la tesis gracias chicas tambieacuten por su amistad

A mis colegas y amigos Gustavo Sandoval Dan Vivas Pedro Palermo y Julio Mendoza

por los momentos compartidos en el laboratorio su ayuda en la realizacioacuten de la tesis y

por creer que se puede llegar maacutes lejos si uno quiere

A las amigas de siempre Fanny R Betty F Nora R Fiorella L Miriam L Luz H Guliana

G Marina V Melissa T Rocio D

A los chicos del LBM si no hubiese a quien ensentildear no se investigariacutea Y a todos

aquellos que la ingrata memoria no me permite hoy mencionar pero si mantildeana ayudar

mi sincero agradecimiento

A CONCYTEC por su apoyo financiero con la Beca de estudio

Y sobre todo gracias a ti Dios Padre por estar siempre a mi lado cuidaacutendome

1

ABREVIATURAS

PLA2 Fosfolipasa A2

PLA2baacutesicaLmuta Fosfolipasa A2baacutesica de Lachesis muta

CM-Sephadex C-50 Carboximetil Sephadex C-50

rpm revoluciones por minuto

Da Daltons

pI Punto isoelectrico

mg microg miligramos microgramos

ml microl mililitros microlitros

mlh mililitros por hora

nm nanometros

mM nM microM milimolar nanomolar micromolar

UTA Unidades totales de actividad

SDS sodio dodecil sulfato

Tris tris (hidroximetil amino metano)

HCl aacutecido clorhiacutedrico

PAGE-SDS Electroforesis en gel de poliacrilamida

com sodio dodecil sulfato

TEMED N N N N acute-tetrametil etilen diamino

EDTA Etilen diamino tetra aceacutetico

PMSF Fenil metil sulfonil fluoruro

DTT Ditiotreitol

TLCK Tosyl lisil clorometil cetona

DH50 Dosis hemoliacutetica media

DMM Dosis miotoacutexica miacutenima

CK Cretina kinasa

IUL Unidades internacionales por litro

DEM Dosis edemaacutetica miacutenima

Log Logaritmo

Long longitud

UV ultravioleta

IacuteNDICE GENERAL

Paacuteg

RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1

ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2

INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3

ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5

OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11

MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 70

REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 72

1

IacuteNDICE DE FIGURAS

Paacuteg

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5 Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6 Figura 3 Primer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 4 Segundo paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 5 Tercer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Figura 6 Determinacioacuten del peso molecular y pureza de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphellip 36 Figura 7 pH Oacuteptimo de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36 Figura 8 Determinacioacuten de la dosis hemoliacutetica media DH50helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 9 Actividad hemoliacutetica indirecta en placa de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 10 Actividad edemaacutetica de la fosfolipasa A2 baacutesica de Lachesis mutahelliphelliphelliphellip 44 Figura 11 Actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46 Figura 12 Antigenicidad de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48 Figura 13 Neutralizacioacuten de la actividad enzimaacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 49 Figura 14 Neutralizacioacuten de la actividad hemoliacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 50 Figura 15 Neutralizacioacuten de la actividad edemaacutetica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 51 Figura 16 Neutralizacioacuten de la actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphellip 52 Figura 17 Amplificado de cDNA de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54 Figura 18 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias nucleotiacutedicas de la PLA2helliphelliphelliphelliphellip 57 Figura 19 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 58 Figura 20 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59 Figura 21 Ubicacioacuten del peacuteptido sentildeal PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 61 Figura 22 Composicioacuten de la estructura secundaria de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 62 Figura 23 Modelo propuesto de estructura tridimensional de la PLA2baacutesicaLmutahelliphellip 64 Figura 24 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias aminoaciacutedicas de las PLA2helliphelliphelliphellip 66 Figura 25 Aacuterbol filogeneacutetico de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 68

IacuteNDICE DE TABLAS

Paacuteg Tabla 1 Cuadro de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Tabla 2 Efecto de algunos iones sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 3 Efecto de algunos inhibidores sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 4 Alineamiento de la secuencia nucleotiacutedica la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 56 Tabla 5 Determinacioacuten del peacuteptido sentildeal de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 60 Tabla 6 Composicioacuten de aminoaacutecidos de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 63 Tabla 7 Alineamiento de la secuencia proteica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 65

1

RESUMEN

En la presente investigacioacuten se estudian las propiedades bioquiacutemicas

bioloacutegicas inmunoloacutegicas y moleculares de una isoforma baacutesica de Fosfolipasa

A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta

(PLA2baacutesicaLmuta) La purificacioacuten se realizoacute mediante cromatografiacutea de

intercambio ioacutenico filtracioacuten y de alta performance la enzima fue purificada 412

veces con un rendimiento de 64 Se obtuvo una uacutenica banda proteica de 147

kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras demostrando ser

una proteiacutena monomeacuterica Su pH oacuteptimo es de 78 y es fuertemente inhibida por

el PMSF EDTA y glutatioacuten En cuanto a su accioacuten bioloacutegica se obtuvo la dosis

hemoliacutetica media (DH50) en 435microg la dosis miotoacutexica miacutenima (DMM) en

1896microgml y la dosis edemaacutetica miacutenima (DEM) 2356μg La enzima no mostroacute

actividad hemorraacutegica ni accioacuten anticoagulante Adicionalmente las pruebas de

inmunodifusioacuten e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2baacutesicaLmuta es

reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilacheacutesico (INS-

Peruacute)

Empleando la metodologiacutea de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa

del cDNA de PLA2baacutesicaLmuta con 445 pb anaacutelisis bioinformaacuteticos indican que

la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleoacutetidos que codifica

un peacuteptido sentildeal de 16 aminoaacutecidos y una proteiacutena madura de 122 residuos el

peso molecular fue de 1386 kDa y un pI de 8316 La secuencia aminoaciacutedica

contiene residuos conservados para el sitio cataliacutetico His48 Asp49 Tyr52 asiacute

como para unioacuten al Ca+2 Tyr18 Gly30 y Gly32 El modelaje tridimensional de la

PLA2 muestra que estaacute formada por tres heacutelices- una laacutemina- y un lazo de

unioacuten al Ca+2 PLA2baacutesicaLmuta mostroacute alta homologiacutea estructural con otras

sPLA2 de venenos de serpientes Finalmente los estudios revelan que la

PLA2baacutesicaLmuta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] baacutesicas de bajo peso

molecular Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y funcioacuten de

una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana

Palabras claves Fosfolipasa A2 Isoenzima Lachesis muta sitio farmacoloacutegico transcrito

2

ABSTRACT

In the present research the biochemical biological immunological as well

as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of

peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicLmuta) were studied This enzyme

was purified using ion exchange filtration and high performance

chromatographical steps respectively The enzyme was purified 412 times with

a yield of 64 SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 147 kDa

under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single

polypeptide chain Furthermore the enzyme had a optimal pH of 78 and was

inhibited by PMSF EDTA and glutation In relation to its biologic activity a

Medium Hemolytic Doses (DH50) of 435microgtube Minimum Miotoxic Doses

(MMD) of 1896microgml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 915μg were

obtained For another hand the PLA2 didnacutet show either hemorrhagic or

anticoagulant activities and was recognized and partially inhibited by monovalent

antilachesic serum (INS-Peruacute) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis

Using RT-PCR methodology and bioinformaacutetics analysis the complete

cDNA sequence of PLA2basicLmuta with 445 bp and an open reading frames of

414 nucleotides were obtained which encodes a peptide signal of 16 amino

acids and a matured protein of 122 residues with 13 86 kDa and a pI value of

83 calculated by in silico analysis The amino acidic sequence contains

conserved residues of His48 Asp49 Tyr52 in the catalytic site as well as Tyr18

Gly30 y Gly32 in the Ca+2-binding site Three-dimensional model of

PLA2basicLmuta showed that was conformed by three α-helix one β-sheet and

one Ca+2-binding ribbon PLA2basicLmuta shows a high structural homology with

other snake venom phospholipases Finally studies reveal that PLA2basicLmuta

belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49] This work is

the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom

enzyme

Key words Phospholipase A2 Isoenzyme Lachesis muta pharmacologic site

transcript

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

1

DEDICATORIA

A Dios por su bendicioacuten su fuerza y su amor

A mis amados padres David y Rosalina por su amor paciencia y apoyo

incondicional

A mis dos angelitos mis sobrinos Sebastiaacuten y Rodrigo

A mis queridisimos hermanos Daly Joel y Antonio

y a mis cuntildeadas Maribel JuliaElisa y Carla

AGRADECIMIENTOS

A la Memoria del Maestro Orestes Maacutelaga Maacutelaga por inculcar ciencia creer en los

suentildeos de un mejor laboratorio y ensentildearme a no rendirme

Al Dr Armando Yarlequeacute Jefe del laboratorio de Biologiacutea Molecular por su

asesoramiento durante la elaboracioacuten del presente trabajo

Al Dr Cesar Cabezas Jefe del Instituto Nacional de Salud por su apoyo brindado para el

perfeccionamiento con la pasantia en Italia

A los Drs Joseacute Maria Gutieacuterrez y Bruno Lomonte por compartir sus conocimientos por

sus ensentildeanzas ayuda y amistad brindada Asiacute mismo mi gran respeto y carintildeo a Mauren

Oscar Marvin Melvin Julian Carmen Rigo Laura Teresa Alvaro y todos los

compantildeeros y compantildeeras del Instituto Clodomiro Picado-Costa Rica

Al los Drs Alessandro Bartoloni Fillippo Bartalesi Dra Marianne Strohmeyer por la

oportunidad de ampliar mis conocimientos y su gentileza en Firenze-Italia

Al Dr Jean-Denis Docquier por su constante intereacutes en mi avance profesional a la Dra

Lucia Henrici DeAngelis porque en esas dos ultimas semanas aprendiacute maacutes que en 2 antildeos

a los dos les brindo mi eterno agradecimiento

Al Dr Gian Maria Rossolini asiacute como a todo el grupo Tiziana Lucia Eleonora

Samanta Gisela Tommaso Vincenzo Marco Luisa Filomena Claudia y a todos de la

Universidad de Siena-Italia

A la Mag Fanny Lazo por sus consejos y ayuda oportuna en todo el proceso de la

investigacioacuten A la Mag Edith Rodriacuteguez por inculcarme la disciplinada y el orden en la

investigacioacuten

Al Blgo Javier Caacuterdenas sin su apoyo no hubiera sido posible la culminacioacuten de esta

investigacioacuten gracias tambieacuten por tus consejos y amistad

A las Blgas Claudia Barleta y Katya Zumaeta por su ayuda en un punto muy importante

de la tesis gracias chicas tambieacuten por su amistad

A mis colegas y amigos Gustavo Sandoval Dan Vivas Pedro Palermo y Julio Mendoza

por los momentos compartidos en el laboratorio su ayuda en la realizacioacuten de la tesis y

por creer que se puede llegar maacutes lejos si uno quiere

A las amigas de siempre Fanny R Betty F Nora R Fiorella L Miriam L Luz H Guliana

G Marina V Melissa T Rocio D

A los chicos del LBM si no hubiese a quien ensentildear no se investigariacutea Y a todos

aquellos que la ingrata memoria no me permite hoy mencionar pero si mantildeana ayudar

mi sincero agradecimiento

A CONCYTEC por su apoyo financiero con la Beca de estudio

Y sobre todo gracias a ti Dios Padre por estar siempre a mi lado cuidaacutendome

1

ABREVIATURAS

PLA2 Fosfolipasa A2

PLA2baacutesicaLmuta Fosfolipasa A2baacutesica de Lachesis muta

CM-Sephadex C-50 Carboximetil Sephadex C-50

rpm revoluciones por minuto

Da Daltons

pI Punto isoelectrico

mg microg miligramos microgramos

ml microl mililitros microlitros

mlh mililitros por hora

nm nanometros

mM nM microM milimolar nanomolar micromolar

UTA Unidades totales de actividad

SDS sodio dodecil sulfato

Tris tris (hidroximetil amino metano)

HCl aacutecido clorhiacutedrico

PAGE-SDS Electroforesis en gel de poliacrilamida

com sodio dodecil sulfato

TEMED N N N N acute-tetrametil etilen diamino

EDTA Etilen diamino tetra aceacutetico

PMSF Fenil metil sulfonil fluoruro

DTT Ditiotreitol

TLCK Tosyl lisil clorometil cetona

DH50 Dosis hemoliacutetica media

DMM Dosis miotoacutexica miacutenima

CK Cretina kinasa

IUL Unidades internacionales por litro

DEM Dosis edemaacutetica miacutenima

Log Logaritmo

Long longitud

UV ultravioleta

IacuteNDICE GENERAL

Paacuteg

RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1

ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2

INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3

ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5

OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11

MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 70

REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 72

1

IacuteNDICE DE FIGURAS

Paacuteg

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5 Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6 Figura 3 Primer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 4 Segundo paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 5 Tercer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Figura 6 Determinacioacuten del peso molecular y pureza de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphellip 36 Figura 7 pH Oacuteptimo de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36 Figura 8 Determinacioacuten de la dosis hemoliacutetica media DH50helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 9 Actividad hemoliacutetica indirecta en placa de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 10 Actividad edemaacutetica de la fosfolipasa A2 baacutesica de Lachesis mutahelliphelliphelliphellip 44 Figura 11 Actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46 Figura 12 Antigenicidad de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48 Figura 13 Neutralizacioacuten de la actividad enzimaacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 49 Figura 14 Neutralizacioacuten de la actividad hemoliacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 50 Figura 15 Neutralizacioacuten de la actividad edemaacutetica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 51 Figura 16 Neutralizacioacuten de la actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphellip 52 Figura 17 Amplificado de cDNA de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54 Figura 18 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias nucleotiacutedicas de la PLA2helliphelliphelliphelliphellip 57 Figura 19 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 58 Figura 20 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59 Figura 21 Ubicacioacuten del peacuteptido sentildeal PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 61 Figura 22 Composicioacuten de la estructura secundaria de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 62 Figura 23 Modelo propuesto de estructura tridimensional de la PLA2baacutesicaLmutahelliphellip 64 Figura 24 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias aminoaciacutedicas de las PLA2helliphelliphelliphellip 66 Figura 25 Aacuterbol filogeneacutetico de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 68

IacuteNDICE DE TABLAS

Paacuteg Tabla 1 Cuadro de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Tabla 2 Efecto de algunos iones sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 3 Efecto de algunos inhibidores sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 4 Alineamiento de la secuencia nucleotiacutedica la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 56 Tabla 5 Determinacioacuten del peacuteptido sentildeal de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 60 Tabla 6 Composicioacuten de aminoaacutecidos de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 63 Tabla 7 Alineamiento de la secuencia proteica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 65

1

RESUMEN

En la presente investigacioacuten se estudian las propiedades bioquiacutemicas

bioloacutegicas inmunoloacutegicas y moleculares de una isoforma baacutesica de Fosfolipasa

A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta

(PLA2baacutesicaLmuta) La purificacioacuten se realizoacute mediante cromatografiacutea de

intercambio ioacutenico filtracioacuten y de alta performance la enzima fue purificada 412

veces con un rendimiento de 64 Se obtuvo una uacutenica banda proteica de 147

kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras demostrando ser

una proteiacutena monomeacuterica Su pH oacuteptimo es de 78 y es fuertemente inhibida por

el PMSF EDTA y glutatioacuten En cuanto a su accioacuten bioloacutegica se obtuvo la dosis

hemoliacutetica media (DH50) en 435microg la dosis miotoacutexica miacutenima (DMM) en

1896microgml y la dosis edemaacutetica miacutenima (DEM) 2356μg La enzima no mostroacute

actividad hemorraacutegica ni accioacuten anticoagulante Adicionalmente las pruebas de

inmunodifusioacuten e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2baacutesicaLmuta es

reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilacheacutesico (INS-

Peruacute)

Empleando la metodologiacutea de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa

del cDNA de PLA2baacutesicaLmuta con 445 pb anaacutelisis bioinformaacuteticos indican que

la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleoacutetidos que codifica

un peacuteptido sentildeal de 16 aminoaacutecidos y una proteiacutena madura de 122 residuos el

peso molecular fue de 1386 kDa y un pI de 8316 La secuencia aminoaciacutedica

contiene residuos conservados para el sitio cataliacutetico His48 Asp49 Tyr52 asiacute

como para unioacuten al Ca+2 Tyr18 Gly30 y Gly32 El modelaje tridimensional de la

PLA2 muestra que estaacute formada por tres heacutelices- una laacutemina- y un lazo de

unioacuten al Ca+2 PLA2baacutesicaLmuta mostroacute alta homologiacutea estructural con otras

sPLA2 de venenos de serpientes Finalmente los estudios revelan que la

PLA2baacutesicaLmuta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] baacutesicas de bajo peso

molecular Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y funcioacuten de

una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana

Palabras claves Fosfolipasa A2 Isoenzima Lachesis muta sitio farmacoloacutegico transcrito

2

ABSTRACT

In the present research the biochemical biological immunological as well

as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of

peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicLmuta) were studied This enzyme

was purified using ion exchange filtration and high performance

chromatographical steps respectively The enzyme was purified 412 times with

a yield of 64 SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 147 kDa

under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single

polypeptide chain Furthermore the enzyme had a optimal pH of 78 and was

inhibited by PMSF EDTA and glutation In relation to its biologic activity a

Medium Hemolytic Doses (DH50) of 435microgtube Minimum Miotoxic Doses

(MMD) of 1896microgml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 915μg were

obtained For another hand the PLA2 didnacutet show either hemorrhagic or

anticoagulant activities and was recognized and partially inhibited by monovalent

antilachesic serum (INS-Peruacute) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis

Using RT-PCR methodology and bioinformaacutetics analysis the complete

cDNA sequence of PLA2basicLmuta with 445 bp and an open reading frames of

414 nucleotides were obtained which encodes a peptide signal of 16 amino

acids and a matured protein of 122 residues with 13 86 kDa and a pI value of

83 calculated by in silico analysis The amino acidic sequence contains

conserved residues of His48 Asp49 Tyr52 in the catalytic site as well as Tyr18

Gly30 y Gly32 in the Ca+2-binding site Three-dimensional model of

PLA2basicLmuta showed that was conformed by three α-helix one β-sheet and

one Ca+2-binding ribbon PLA2basicLmuta shows a high structural homology with

other snake venom phospholipases Finally studies reveal that PLA2basicLmuta

belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49] This work is

the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom

enzyme

Key words Phospholipase A2 Isoenzyme Lachesis muta pharmacologic site

transcript

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

AGRADECIMIENTOS

A la Memoria del Maestro Orestes Maacutelaga Maacutelaga por inculcar ciencia creer en los

suentildeos de un mejor laboratorio y ensentildearme a no rendirme

Al Dr Armando Yarlequeacute Jefe del laboratorio de Biologiacutea Molecular por su

asesoramiento durante la elaboracioacuten del presente trabajo

Al Dr Cesar Cabezas Jefe del Instituto Nacional de Salud por su apoyo brindado para el

perfeccionamiento con la pasantia en Italia

A los Drs Joseacute Maria Gutieacuterrez y Bruno Lomonte por compartir sus conocimientos por

sus ensentildeanzas ayuda y amistad brindada Asiacute mismo mi gran respeto y carintildeo a Mauren

Oscar Marvin Melvin Julian Carmen Rigo Laura Teresa Alvaro y todos los

compantildeeros y compantildeeras del Instituto Clodomiro Picado-Costa Rica

Al los Drs Alessandro Bartoloni Fillippo Bartalesi Dra Marianne Strohmeyer por la

oportunidad de ampliar mis conocimientos y su gentileza en Firenze-Italia

Al Dr Jean-Denis Docquier por su constante intereacutes en mi avance profesional a la Dra

Lucia Henrici DeAngelis porque en esas dos ultimas semanas aprendiacute maacutes que en 2 antildeos

a los dos les brindo mi eterno agradecimiento

Al Dr Gian Maria Rossolini asiacute como a todo el grupo Tiziana Lucia Eleonora

Samanta Gisela Tommaso Vincenzo Marco Luisa Filomena Claudia y a todos de la

Universidad de Siena-Italia

A la Mag Fanny Lazo por sus consejos y ayuda oportuna en todo el proceso de la

investigacioacuten A la Mag Edith Rodriacuteguez por inculcarme la disciplinada y el orden en la

investigacioacuten

Al Blgo Javier Caacuterdenas sin su apoyo no hubiera sido posible la culminacioacuten de esta

investigacioacuten gracias tambieacuten por tus consejos y amistad

A las Blgas Claudia Barleta y Katya Zumaeta por su ayuda en un punto muy importante

de la tesis gracias chicas tambieacuten por su amistad

A mis colegas y amigos Gustavo Sandoval Dan Vivas Pedro Palermo y Julio Mendoza

por los momentos compartidos en el laboratorio su ayuda en la realizacioacuten de la tesis y

por creer que se puede llegar maacutes lejos si uno quiere

A las amigas de siempre Fanny R Betty F Nora R Fiorella L Miriam L Luz H Guliana

G Marina V Melissa T Rocio D

A los chicos del LBM si no hubiese a quien ensentildear no se investigariacutea Y a todos

aquellos que la ingrata memoria no me permite hoy mencionar pero si mantildeana ayudar

mi sincero agradecimiento

A CONCYTEC por su apoyo financiero con la Beca de estudio

Y sobre todo gracias a ti Dios Padre por estar siempre a mi lado cuidaacutendome

1

ABREVIATURAS

PLA2 Fosfolipasa A2

PLA2baacutesicaLmuta Fosfolipasa A2baacutesica de Lachesis muta

CM-Sephadex C-50 Carboximetil Sephadex C-50

rpm revoluciones por minuto

Da Daltons

pI Punto isoelectrico

mg microg miligramos microgramos

ml microl mililitros microlitros

mlh mililitros por hora

nm nanometros

mM nM microM milimolar nanomolar micromolar

UTA Unidades totales de actividad

SDS sodio dodecil sulfato

Tris tris (hidroximetil amino metano)

HCl aacutecido clorhiacutedrico

PAGE-SDS Electroforesis en gel de poliacrilamida

com sodio dodecil sulfato

TEMED N N N N acute-tetrametil etilen diamino

EDTA Etilen diamino tetra aceacutetico

PMSF Fenil metil sulfonil fluoruro

DTT Ditiotreitol

TLCK Tosyl lisil clorometil cetona

DH50 Dosis hemoliacutetica media

DMM Dosis miotoacutexica miacutenima

CK Cretina kinasa

IUL Unidades internacionales por litro

DEM Dosis edemaacutetica miacutenima

Log Logaritmo

Long longitud

UV ultravioleta

IacuteNDICE GENERAL

Paacuteg

RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1

ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2

INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3

ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5

OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11

MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 70

REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 72

1

IacuteNDICE DE FIGURAS

Paacuteg

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5 Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6 Figura 3 Primer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 4 Segundo paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 5 Tercer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Figura 6 Determinacioacuten del peso molecular y pureza de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphellip 36 Figura 7 pH Oacuteptimo de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36 Figura 8 Determinacioacuten de la dosis hemoliacutetica media DH50helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 9 Actividad hemoliacutetica indirecta en placa de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 10 Actividad edemaacutetica de la fosfolipasa A2 baacutesica de Lachesis mutahelliphelliphelliphellip 44 Figura 11 Actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46 Figura 12 Antigenicidad de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48 Figura 13 Neutralizacioacuten de la actividad enzimaacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 49 Figura 14 Neutralizacioacuten de la actividad hemoliacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 50 Figura 15 Neutralizacioacuten de la actividad edemaacutetica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 51 Figura 16 Neutralizacioacuten de la actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphellip 52 Figura 17 Amplificado de cDNA de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54 Figura 18 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias nucleotiacutedicas de la PLA2helliphelliphelliphelliphellip 57 Figura 19 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 58 Figura 20 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59 Figura 21 Ubicacioacuten del peacuteptido sentildeal PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 61 Figura 22 Composicioacuten de la estructura secundaria de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 62 Figura 23 Modelo propuesto de estructura tridimensional de la PLA2baacutesicaLmutahelliphellip 64 Figura 24 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias aminoaciacutedicas de las PLA2helliphelliphelliphellip 66 Figura 25 Aacuterbol filogeneacutetico de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 68

IacuteNDICE DE TABLAS

Paacuteg Tabla 1 Cuadro de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Tabla 2 Efecto de algunos iones sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 3 Efecto de algunos inhibidores sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 4 Alineamiento de la secuencia nucleotiacutedica la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 56 Tabla 5 Determinacioacuten del peacuteptido sentildeal de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 60 Tabla 6 Composicioacuten de aminoaacutecidos de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 63 Tabla 7 Alineamiento de la secuencia proteica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 65

1

RESUMEN

En la presente investigacioacuten se estudian las propiedades bioquiacutemicas

bioloacutegicas inmunoloacutegicas y moleculares de una isoforma baacutesica de Fosfolipasa

A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta

(PLA2baacutesicaLmuta) La purificacioacuten se realizoacute mediante cromatografiacutea de

intercambio ioacutenico filtracioacuten y de alta performance la enzima fue purificada 412

veces con un rendimiento de 64 Se obtuvo una uacutenica banda proteica de 147

kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras demostrando ser

una proteiacutena monomeacuterica Su pH oacuteptimo es de 78 y es fuertemente inhibida por

el PMSF EDTA y glutatioacuten En cuanto a su accioacuten bioloacutegica se obtuvo la dosis

hemoliacutetica media (DH50) en 435microg la dosis miotoacutexica miacutenima (DMM) en

1896microgml y la dosis edemaacutetica miacutenima (DEM) 2356μg La enzima no mostroacute

actividad hemorraacutegica ni accioacuten anticoagulante Adicionalmente las pruebas de

inmunodifusioacuten e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2baacutesicaLmuta es

reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilacheacutesico (INS-

Peruacute)

Empleando la metodologiacutea de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa

del cDNA de PLA2baacutesicaLmuta con 445 pb anaacutelisis bioinformaacuteticos indican que

la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleoacutetidos que codifica

un peacuteptido sentildeal de 16 aminoaacutecidos y una proteiacutena madura de 122 residuos el

peso molecular fue de 1386 kDa y un pI de 8316 La secuencia aminoaciacutedica

contiene residuos conservados para el sitio cataliacutetico His48 Asp49 Tyr52 asiacute

como para unioacuten al Ca+2 Tyr18 Gly30 y Gly32 El modelaje tridimensional de la

PLA2 muestra que estaacute formada por tres heacutelices- una laacutemina- y un lazo de

unioacuten al Ca+2 PLA2baacutesicaLmuta mostroacute alta homologiacutea estructural con otras

sPLA2 de venenos de serpientes Finalmente los estudios revelan que la

PLA2baacutesicaLmuta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] baacutesicas de bajo peso

molecular Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y funcioacuten de

una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana

Palabras claves Fosfolipasa A2 Isoenzima Lachesis muta sitio farmacoloacutegico transcrito

2

ABSTRACT

In the present research the biochemical biological immunological as well

as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of

peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicLmuta) were studied This enzyme

was purified using ion exchange filtration and high performance

chromatographical steps respectively The enzyme was purified 412 times with

a yield of 64 SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 147 kDa

under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single

polypeptide chain Furthermore the enzyme had a optimal pH of 78 and was

inhibited by PMSF EDTA and glutation In relation to its biologic activity a

Medium Hemolytic Doses (DH50) of 435microgtube Minimum Miotoxic Doses

(MMD) of 1896microgml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 915μg were

obtained For another hand the PLA2 didnacutet show either hemorrhagic or

anticoagulant activities and was recognized and partially inhibited by monovalent

antilachesic serum (INS-Peruacute) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis

Using RT-PCR methodology and bioinformaacutetics analysis the complete

cDNA sequence of PLA2basicLmuta with 445 bp and an open reading frames of

414 nucleotides were obtained which encodes a peptide signal of 16 amino

acids and a matured protein of 122 residues with 13 86 kDa and a pI value of

83 calculated by in silico analysis The amino acidic sequence contains

conserved residues of His48 Asp49 Tyr52 in the catalytic site as well as Tyr18

Gly30 y Gly32 in the Ca+2-binding site Three-dimensional model of

PLA2basicLmuta showed that was conformed by three α-helix one β-sheet and

one Ca+2-binding ribbon PLA2basicLmuta shows a high structural homology with

other snake venom phospholipases Finally studies reveal that PLA2basicLmuta

belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49] This work is

the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom

enzyme

Key words Phospholipase A2 Isoenzyme Lachesis muta pharmacologic site

transcript

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

1

ABREVIATURAS

PLA2 Fosfolipasa A2

PLA2baacutesicaLmuta Fosfolipasa A2baacutesica de Lachesis muta

CM-Sephadex C-50 Carboximetil Sephadex C-50

rpm revoluciones por minuto

Da Daltons

pI Punto isoelectrico

mg microg miligramos microgramos

ml microl mililitros microlitros

mlh mililitros por hora

nm nanometros

mM nM microM milimolar nanomolar micromolar

UTA Unidades totales de actividad

SDS sodio dodecil sulfato

Tris tris (hidroximetil amino metano)

HCl aacutecido clorhiacutedrico

PAGE-SDS Electroforesis en gel de poliacrilamida

com sodio dodecil sulfato

TEMED N N N N acute-tetrametil etilen diamino

EDTA Etilen diamino tetra aceacutetico

PMSF Fenil metil sulfonil fluoruro

DTT Ditiotreitol

TLCK Tosyl lisil clorometil cetona

DH50 Dosis hemoliacutetica media

DMM Dosis miotoacutexica miacutenima

CK Cretina kinasa

IUL Unidades internacionales por litro

DEM Dosis edemaacutetica miacutenima

Log Logaritmo

Long longitud

UV ultravioleta

IacuteNDICE GENERAL

Paacuteg

RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1

ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2

INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3

ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5

OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11

MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 70

REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 72

1

IacuteNDICE DE FIGURAS

Paacuteg

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5 Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6 Figura 3 Primer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 4 Segundo paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 5 Tercer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Figura 6 Determinacioacuten del peso molecular y pureza de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphellip 36 Figura 7 pH Oacuteptimo de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36 Figura 8 Determinacioacuten de la dosis hemoliacutetica media DH50helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 9 Actividad hemoliacutetica indirecta en placa de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 10 Actividad edemaacutetica de la fosfolipasa A2 baacutesica de Lachesis mutahelliphelliphelliphellip 44 Figura 11 Actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46 Figura 12 Antigenicidad de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48 Figura 13 Neutralizacioacuten de la actividad enzimaacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 49 Figura 14 Neutralizacioacuten de la actividad hemoliacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 50 Figura 15 Neutralizacioacuten de la actividad edemaacutetica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 51 Figura 16 Neutralizacioacuten de la actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphellip 52 Figura 17 Amplificado de cDNA de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54 Figura 18 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias nucleotiacutedicas de la PLA2helliphelliphelliphelliphellip 57 Figura 19 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 58 Figura 20 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59 Figura 21 Ubicacioacuten del peacuteptido sentildeal PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 61 Figura 22 Composicioacuten de la estructura secundaria de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 62 Figura 23 Modelo propuesto de estructura tridimensional de la PLA2baacutesicaLmutahelliphellip 64 Figura 24 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias aminoaciacutedicas de las PLA2helliphelliphelliphellip 66 Figura 25 Aacuterbol filogeneacutetico de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 68

IacuteNDICE DE TABLAS

Paacuteg Tabla 1 Cuadro de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Tabla 2 Efecto de algunos iones sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 3 Efecto de algunos inhibidores sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 4 Alineamiento de la secuencia nucleotiacutedica la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 56 Tabla 5 Determinacioacuten del peacuteptido sentildeal de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 60 Tabla 6 Composicioacuten de aminoaacutecidos de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 63 Tabla 7 Alineamiento de la secuencia proteica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 65

1

RESUMEN

En la presente investigacioacuten se estudian las propiedades bioquiacutemicas

bioloacutegicas inmunoloacutegicas y moleculares de una isoforma baacutesica de Fosfolipasa

A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta

(PLA2baacutesicaLmuta) La purificacioacuten se realizoacute mediante cromatografiacutea de

intercambio ioacutenico filtracioacuten y de alta performance la enzima fue purificada 412

veces con un rendimiento de 64 Se obtuvo una uacutenica banda proteica de 147

kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras demostrando ser

una proteiacutena monomeacuterica Su pH oacuteptimo es de 78 y es fuertemente inhibida por

el PMSF EDTA y glutatioacuten En cuanto a su accioacuten bioloacutegica se obtuvo la dosis

hemoliacutetica media (DH50) en 435microg la dosis miotoacutexica miacutenima (DMM) en

1896microgml y la dosis edemaacutetica miacutenima (DEM) 2356μg La enzima no mostroacute

actividad hemorraacutegica ni accioacuten anticoagulante Adicionalmente las pruebas de

inmunodifusioacuten e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2baacutesicaLmuta es

reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilacheacutesico (INS-

Peruacute)

Empleando la metodologiacutea de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa

del cDNA de PLA2baacutesicaLmuta con 445 pb anaacutelisis bioinformaacuteticos indican que

la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleoacutetidos que codifica

un peacuteptido sentildeal de 16 aminoaacutecidos y una proteiacutena madura de 122 residuos el

peso molecular fue de 1386 kDa y un pI de 8316 La secuencia aminoaciacutedica

contiene residuos conservados para el sitio cataliacutetico His48 Asp49 Tyr52 asiacute

como para unioacuten al Ca+2 Tyr18 Gly30 y Gly32 El modelaje tridimensional de la

PLA2 muestra que estaacute formada por tres heacutelices- una laacutemina- y un lazo de

unioacuten al Ca+2 PLA2baacutesicaLmuta mostroacute alta homologiacutea estructural con otras

sPLA2 de venenos de serpientes Finalmente los estudios revelan que la

PLA2baacutesicaLmuta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] baacutesicas de bajo peso

molecular Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y funcioacuten de

una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana

Palabras claves Fosfolipasa A2 Isoenzima Lachesis muta sitio farmacoloacutegico transcrito

2

ABSTRACT

In the present research the biochemical biological immunological as well

as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of

peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicLmuta) were studied This enzyme

was purified using ion exchange filtration and high performance

chromatographical steps respectively The enzyme was purified 412 times with

a yield of 64 SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 147 kDa

under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single

polypeptide chain Furthermore the enzyme had a optimal pH of 78 and was

inhibited by PMSF EDTA and glutation In relation to its biologic activity a

Medium Hemolytic Doses (DH50) of 435microgtube Minimum Miotoxic Doses

(MMD) of 1896microgml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 915μg were

obtained For another hand the PLA2 didnacutet show either hemorrhagic or

anticoagulant activities and was recognized and partially inhibited by monovalent

antilachesic serum (INS-Peruacute) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis

Using RT-PCR methodology and bioinformaacutetics analysis the complete

cDNA sequence of PLA2basicLmuta with 445 bp and an open reading frames of

414 nucleotides were obtained which encodes a peptide signal of 16 amino

acids and a matured protein of 122 residues with 13 86 kDa and a pI value of

83 calculated by in silico analysis The amino acidic sequence contains

conserved residues of His48 Asp49 Tyr52 in the catalytic site as well as Tyr18

Gly30 y Gly32 in the Ca+2-binding site Three-dimensional model of

PLA2basicLmuta showed that was conformed by three α-helix one β-sheet and

one Ca+2-binding ribbon PLA2basicLmuta shows a high structural homology with

other snake venom phospholipases Finally studies reveal that PLA2basicLmuta

belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49] This work is

the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom

enzyme

Key words Phospholipase A2 Isoenzyme Lachesis muta pharmacologic site

transcript

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

IacuteNDICE GENERAL

Paacuteg

RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1

ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2

INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3

ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5

OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11

MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 70

REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 72

1

IacuteNDICE DE FIGURAS

Paacuteg

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5 Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6 Figura 3 Primer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 4 Segundo paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 5 Tercer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Figura 6 Determinacioacuten del peso molecular y pureza de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphellip 36 Figura 7 pH Oacuteptimo de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36 Figura 8 Determinacioacuten de la dosis hemoliacutetica media DH50helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 9 Actividad hemoliacutetica indirecta en placa de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 10 Actividad edemaacutetica de la fosfolipasa A2 baacutesica de Lachesis mutahelliphelliphelliphellip 44 Figura 11 Actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46 Figura 12 Antigenicidad de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48 Figura 13 Neutralizacioacuten de la actividad enzimaacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 49 Figura 14 Neutralizacioacuten de la actividad hemoliacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 50 Figura 15 Neutralizacioacuten de la actividad edemaacutetica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 51 Figura 16 Neutralizacioacuten de la actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphellip 52 Figura 17 Amplificado de cDNA de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54 Figura 18 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias nucleotiacutedicas de la PLA2helliphelliphelliphelliphellip 57 Figura 19 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 58 Figura 20 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59 Figura 21 Ubicacioacuten del peacuteptido sentildeal PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 61 Figura 22 Composicioacuten de la estructura secundaria de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 62 Figura 23 Modelo propuesto de estructura tridimensional de la PLA2baacutesicaLmutahelliphellip 64 Figura 24 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias aminoaciacutedicas de las PLA2helliphelliphelliphellip 66 Figura 25 Aacuterbol filogeneacutetico de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 68

IacuteNDICE DE TABLAS

Paacuteg Tabla 1 Cuadro de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Tabla 2 Efecto de algunos iones sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 3 Efecto de algunos inhibidores sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 4 Alineamiento de la secuencia nucleotiacutedica la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 56 Tabla 5 Determinacioacuten del peacuteptido sentildeal de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 60 Tabla 6 Composicioacuten de aminoaacutecidos de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 63 Tabla 7 Alineamiento de la secuencia proteica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 65

1

RESUMEN

En la presente investigacioacuten se estudian las propiedades bioquiacutemicas

bioloacutegicas inmunoloacutegicas y moleculares de una isoforma baacutesica de Fosfolipasa

A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta

(PLA2baacutesicaLmuta) La purificacioacuten se realizoacute mediante cromatografiacutea de

intercambio ioacutenico filtracioacuten y de alta performance la enzima fue purificada 412

veces con un rendimiento de 64 Se obtuvo una uacutenica banda proteica de 147

kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras demostrando ser

una proteiacutena monomeacuterica Su pH oacuteptimo es de 78 y es fuertemente inhibida por

el PMSF EDTA y glutatioacuten En cuanto a su accioacuten bioloacutegica se obtuvo la dosis

hemoliacutetica media (DH50) en 435microg la dosis miotoacutexica miacutenima (DMM) en

1896microgml y la dosis edemaacutetica miacutenima (DEM) 2356μg La enzima no mostroacute

actividad hemorraacutegica ni accioacuten anticoagulante Adicionalmente las pruebas de

inmunodifusioacuten e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2baacutesicaLmuta es

reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilacheacutesico (INS-

Peruacute)

Empleando la metodologiacutea de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa

del cDNA de PLA2baacutesicaLmuta con 445 pb anaacutelisis bioinformaacuteticos indican que

la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleoacutetidos que codifica

un peacuteptido sentildeal de 16 aminoaacutecidos y una proteiacutena madura de 122 residuos el

peso molecular fue de 1386 kDa y un pI de 8316 La secuencia aminoaciacutedica

contiene residuos conservados para el sitio cataliacutetico His48 Asp49 Tyr52 asiacute

como para unioacuten al Ca+2 Tyr18 Gly30 y Gly32 El modelaje tridimensional de la

PLA2 muestra que estaacute formada por tres heacutelices- una laacutemina- y un lazo de

unioacuten al Ca+2 PLA2baacutesicaLmuta mostroacute alta homologiacutea estructural con otras

sPLA2 de venenos de serpientes Finalmente los estudios revelan que la

PLA2baacutesicaLmuta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] baacutesicas de bajo peso

molecular Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y funcioacuten de

una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana

Palabras claves Fosfolipasa A2 Isoenzima Lachesis muta sitio farmacoloacutegico transcrito

2

ABSTRACT

In the present research the biochemical biological immunological as well

as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of

peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicLmuta) were studied This enzyme

was purified using ion exchange filtration and high performance

chromatographical steps respectively The enzyme was purified 412 times with

a yield of 64 SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 147 kDa

under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single

polypeptide chain Furthermore the enzyme had a optimal pH of 78 and was

inhibited by PMSF EDTA and glutation In relation to its biologic activity a

Medium Hemolytic Doses (DH50) of 435microgtube Minimum Miotoxic Doses

(MMD) of 1896microgml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 915μg were

obtained For another hand the PLA2 didnacutet show either hemorrhagic or

anticoagulant activities and was recognized and partially inhibited by monovalent

antilachesic serum (INS-Peruacute) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis

Using RT-PCR methodology and bioinformaacutetics analysis the complete

cDNA sequence of PLA2basicLmuta with 445 bp and an open reading frames of

414 nucleotides were obtained which encodes a peptide signal of 16 amino

acids and a matured protein of 122 residues with 13 86 kDa and a pI value of

83 calculated by in silico analysis The amino acidic sequence contains

conserved residues of His48 Asp49 Tyr52 in the catalytic site as well as Tyr18

Gly30 y Gly32 in the Ca+2-binding site Three-dimensional model of

PLA2basicLmuta showed that was conformed by three α-helix one β-sheet and

one Ca+2-binding ribbon PLA2basicLmuta shows a high structural homology with

other snake venom phospholipases Finally studies reveal that PLA2basicLmuta

belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49] This work is

the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom

enzyme

Key words Phospholipase A2 Isoenzyme Lachesis muta pharmacologic site

transcript

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

1

IacuteNDICE DE FIGURAS

Paacuteg

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5 Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6 Figura 3 Primer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 4 Segundo paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31 Figura 5 Tercer paso de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Figura 6 Determinacioacuten del peso molecular y pureza de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphellip 36 Figura 7 pH Oacuteptimo de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36 Figura 8 Determinacioacuten de la dosis hemoliacutetica media DH50helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 9 Actividad hemoliacutetica indirecta en placa de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 42 Figura 10 Actividad edemaacutetica de la fosfolipasa A2 baacutesica de Lachesis mutahelliphelliphelliphellip 44 Figura 11 Actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46 Figura 12 Antigenicidad de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48 Figura 13 Neutralizacioacuten de la actividad enzimaacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 49 Figura 14 Neutralizacioacuten de la actividad hemoliacutetica de PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 50 Figura 15 Neutralizacioacuten de la actividad edemaacutetica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 51 Figura 16 Neutralizacioacuten de la actividad miotoacutexica de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphellip 52 Figura 17 Amplificado de cDNA de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54 Figura 18 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias nucleotiacutedicas de la PLA2helliphelliphelliphelliphellip 57 Figura 19 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 58 Figura 20 Secuencia geacutenica de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59 Figura 21 Ubicacioacuten del peacuteptido sentildeal PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 61 Figura 22 Composicioacuten de la estructura secundaria de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphellip 62 Figura 23 Modelo propuesto de estructura tridimensional de la PLA2baacutesicaLmutahelliphellip 64 Figura 24 Alineamiento muacuteltiple de las secuencias aminoaciacutedicas de las PLA2helliphelliphelliphellip 66 Figura 25 Aacuterbol filogeneacutetico de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 68

IacuteNDICE DE TABLAS

Paacuteg Tabla 1 Cuadro de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Tabla 2 Efecto de algunos iones sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 3 Efecto de algunos inhibidores sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 4 Alineamiento de la secuencia nucleotiacutedica la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 56 Tabla 5 Determinacioacuten del peacuteptido sentildeal de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 60 Tabla 6 Composicioacuten de aminoaacutecidos de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 63 Tabla 7 Alineamiento de la secuencia proteica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 65

1

RESUMEN

En la presente investigacioacuten se estudian las propiedades bioquiacutemicas

bioloacutegicas inmunoloacutegicas y moleculares de una isoforma baacutesica de Fosfolipasa

A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta

(PLA2baacutesicaLmuta) La purificacioacuten se realizoacute mediante cromatografiacutea de

intercambio ioacutenico filtracioacuten y de alta performance la enzima fue purificada 412

veces con un rendimiento de 64 Se obtuvo una uacutenica banda proteica de 147

kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras demostrando ser

una proteiacutena monomeacuterica Su pH oacuteptimo es de 78 y es fuertemente inhibida por

el PMSF EDTA y glutatioacuten En cuanto a su accioacuten bioloacutegica se obtuvo la dosis

hemoliacutetica media (DH50) en 435microg la dosis miotoacutexica miacutenima (DMM) en

1896microgml y la dosis edemaacutetica miacutenima (DEM) 2356μg La enzima no mostroacute

actividad hemorraacutegica ni accioacuten anticoagulante Adicionalmente las pruebas de

inmunodifusioacuten e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2baacutesicaLmuta es

reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilacheacutesico (INS-

Peruacute)

Empleando la metodologiacutea de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa

del cDNA de PLA2baacutesicaLmuta con 445 pb anaacutelisis bioinformaacuteticos indican que

la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleoacutetidos que codifica

un peacuteptido sentildeal de 16 aminoaacutecidos y una proteiacutena madura de 122 residuos el

peso molecular fue de 1386 kDa y un pI de 8316 La secuencia aminoaciacutedica

contiene residuos conservados para el sitio cataliacutetico His48 Asp49 Tyr52 asiacute

como para unioacuten al Ca+2 Tyr18 Gly30 y Gly32 El modelaje tridimensional de la

PLA2 muestra que estaacute formada por tres heacutelices- una laacutemina- y un lazo de

unioacuten al Ca+2 PLA2baacutesicaLmuta mostroacute alta homologiacutea estructural con otras

sPLA2 de venenos de serpientes Finalmente los estudios revelan que la

PLA2baacutesicaLmuta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] baacutesicas de bajo peso

molecular Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y funcioacuten de

una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana

Palabras claves Fosfolipasa A2 Isoenzima Lachesis muta sitio farmacoloacutegico transcrito

2

ABSTRACT

In the present research the biochemical biological immunological as well

as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of

peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicLmuta) were studied This enzyme

was purified using ion exchange filtration and high performance

chromatographical steps respectively The enzyme was purified 412 times with

a yield of 64 SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 147 kDa

under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single

polypeptide chain Furthermore the enzyme had a optimal pH of 78 and was

inhibited by PMSF EDTA and glutation In relation to its biologic activity a

Medium Hemolytic Doses (DH50) of 435microgtube Minimum Miotoxic Doses

(MMD) of 1896microgml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 915μg were

obtained For another hand the PLA2 didnacutet show either hemorrhagic or

anticoagulant activities and was recognized and partially inhibited by monovalent

antilachesic serum (INS-Peruacute) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis

Using RT-PCR methodology and bioinformaacutetics analysis the complete

cDNA sequence of PLA2basicLmuta with 445 bp and an open reading frames of

414 nucleotides were obtained which encodes a peptide signal of 16 amino

acids and a matured protein of 122 residues with 13 86 kDa and a pI value of

83 calculated by in silico analysis The amino acidic sequence contains

conserved residues of His48 Asp49 Tyr52 in the catalytic site as well as Tyr18

Gly30 y Gly32 in the Ca+2-binding site Three-dimensional model of

PLA2basicLmuta showed that was conformed by three α-helix one β-sheet and

one Ca+2-binding ribbon PLA2basicLmuta shows a high structural homology with

other snake venom phospholipases Finally studies reveal that PLA2basicLmuta

belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49] This work is

the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom

enzyme

Key words Phospholipase A2 Isoenzyme Lachesis muta pharmacologic site

transcript

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

IacuteNDICE DE TABLAS

Paacuteg Tabla 1 Cuadro de purificacioacuten de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32 Tabla 2 Efecto de algunos iones sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 3 Efecto de algunos inhibidores sobre la actividad de PLA2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 40 Tabla 4 Alineamiento de la secuencia nucleotiacutedica la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphellip 56 Tabla 5 Determinacioacuten del peacuteptido sentildeal de PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 60 Tabla 6 Composicioacuten de aminoaacutecidos de la PLA2baacutesicaLmuta helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 63 Tabla 7 Alineamiento de la secuencia proteica de la PLA2baacutesicaLmutahelliphelliphelliphelliphelliphellip 65

1

RESUMEN

En la presente investigacioacuten se estudian las propiedades bioquiacutemicas

bioloacutegicas inmunoloacutegicas y moleculares de una isoforma baacutesica de Fosfolipasa

A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta

(PLA2baacutesicaLmuta) La purificacioacuten se realizoacute mediante cromatografiacutea de

intercambio ioacutenico filtracioacuten y de alta performance la enzima fue purificada 412

veces con un rendimiento de 64 Se obtuvo una uacutenica banda proteica de 147

kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras demostrando ser

una proteiacutena monomeacuterica Su pH oacuteptimo es de 78 y es fuertemente inhibida por

el PMSF EDTA y glutatioacuten En cuanto a su accioacuten bioloacutegica se obtuvo la dosis

hemoliacutetica media (DH50) en 435microg la dosis miotoacutexica miacutenima (DMM) en

1896microgml y la dosis edemaacutetica miacutenima (DEM) 2356μg La enzima no mostroacute

actividad hemorraacutegica ni accioacuten anticoagulante Adicionalmente las pruebas de

inmunodifusioacuten e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2baacutesicaLmuta es

reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilacheacutesico (INS-

Peruacute)

Empleando la metodologiacutea de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa

del cDNA de PLA2baacutesicaLmuta con 445 pb anaacutelisis bioinformaacuteticos indican que

la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleoacutetidos que codifica

un peacuteptido sentildeal de 16 aminoaacutecidos y una proteiacutena madura de 122 residuos el

peso molecular fue de 1386 kDa y un pI de 8316 La secuencia aminoaciacutedica

contiene residuos conservados para el sitio cataliacutetico His48 Asp49 Tyr52 asiacute

como para unioacuten al Ca+2 Tyr18 Gly30 y Gly32 El modelaje tridimensional de la

PLA2 muestra que estaacute formada por tres heacutelices- una laacutemina- y un lazo de

unioacuten al Ca+2 PLA2baacutesicaLmuta mostroacute alta homologiacutea estructural con otras

sPLA2 de venenos de serpientes Finalmente los estudios revelan que la

PLA2baacutesicaLmuta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] baacutesicas de bajo peso

molecular Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y funcioacuten de

una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana

Palabras claves Fosfolipasa A2 Isoenzima Lachesis muta sitio farmacoloacutegico transcrito

2

ABSTRACT

In the present research the biochemical biological immunological as well

as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of

peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicLmuta) were studied This enzyme

was purified using ion exchange filtration and high performance

chromatographical steps respectively The enzyme was purified 412 times with

a yield of 64 SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 147 kDa

under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single

polypeptide chain Furthermore the enzyme had a optimal pH of 78 and was

inhibited by PMSF EDTA and glutation In relation to its biologic activity a

Medium Hemolytic Doses (DH50) of 435microgtube Minimum Miotoxic Doses

(MMD) of 1896microgml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 915μg were

obtained For another hand the PLA2 didnacutet show either hemorrhagic or

anticoagulant activities and was recognized and partially inhibited by monovalent

antilachesic serum (INS-Peruacute) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis

Using RT-PCR methodology and bioinformaacutetics analysis the complete

cDNA sequence of PLA2basicLmuta with 445 bp and an open reading frames of

414 nucleotides were obtained which encodes a peptide signal of 16 amino

acids and a matured protein of 122 residues with 13 86 kDa and a pI value of

83 calculated by in silico analysis The amino acidic sequence contains

conserved residues of His48 Asp49 Tyr52 in the catalytic site as well as Tyr18

Gly30 y Gly32 in the Ca+2-binding site Three-dimensional model of

PLA2basicLmuta showed that was conformed by three α-helix one β-sheet and

one Ca+2-binding ribbon PLA2basicLmuta shows a high structural homology with

other snake venom phospholipases Finally studies reveal that PLA2basicLmuta

belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49] This work is

the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom

enzyme

Key words Phospholipase A2 Isoenzyme Lachesis muta pharmacologic site

transcript

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

1

RESUMEN

En la presente investigacioacuten se estudian las propiedades bioquiacutemicas

bioloacutegicas inmunoloacutegicas y moleculares de una isoforma baacutesica de Fosfolipasa

A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta

(PLA2baacutesicaLmuta) La purificacioacuten se realizoacute mediante cromatografiacutea de

intercambio ioacutenico filtracioacuten y de alta performance la enzima fue purificada 412

veces con un rendimiento de 64 Se obtuvo una uacutenica banda proteica de 147

kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras demostrando ser

una proteiacutena monomeacuterica Su pH oacuteptimo es de 78 y es fuertemente inhibida por

el PMSF EDTA y glutatioacuten En cuanto a su accioacuten bioloacutegica se obtuvo la dosis

hemoliacutetica media (DH50) en 435microg la dosis miotoacutexica miacutenima (DMM) en

1896microgml y la dosis edemaacutetica miacutenima (DEM) 2356μg La enzima no mostroacute

actividad hemorraacutegica ni accioacuten anticoagulante Adicionalmente las pruebas de

inmunodifusioacuten e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2baacutesicaLmuta es

reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilacheacutesico (INS-

Peruacute)

Empleando la metodologiacutea de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa

del cDNA de PLA2baacutesicaLmuta con 445 pb anaacutelisis bioinformaacuteticos indican que

la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleoacutetidos que codifica

un peacuteptido sentildeal de 16 aminoaacutecidos y una proteiacutena madura de 122 residuos el

peso molecular fue de 1386 kDa y un pI de 8316 La secuencia aminoaciacutedica

contiene residuos conservados para el sitio cataliacutetico His48 Asp49 Tyr52 asiacute

como para unioacuten al Ca+2 Tyr18 Gly30 y Gly32 El modelaje tridimensional de la

PLA2 muestra que estaacute formada por tres heacutelices- una laacutemina- y un lazo de

unioacuten al Ca+2 PLA2baacutesicaLmuta mostroacute alta homologiacutea estructural con otras

sPLA2 de venenos de serpientes Finalmente los estudios revelan que la

PLA2baacutesicaLmuta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] baacutesicas de bajo peso

molecular Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y funcioacuten de

una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana

Palabras claves Fosfolipasa A2 Isoenzima Lachesis muta sitio farmacoloacutegico transcrito

2

ABSTRACT

In the present research the biochemical biological immunological as well

as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of

peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicLmuta) were studied This enzyme

was purified using ion exchange filtration and high performance

chromatographical steps respectively The enzyme was purified 412 times with

a yield of 64 SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 147 kDa

under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single

polypeptide chain Furthermore the enzyme had a optimal pH of 78 and was

inhibited by PMSF EDTA and glutation In relation to its biologic activity a

Medium Hemolytic Doses (DH50) of 435microgtube Minimum Miotoxic Doses

(MMD) of 1896microgml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 915μg were

obtained For another hand the PLA2 didnacutet show either hemorrhagic or

anticoagulant activities and was recognized and partially inhibited by monovalent

antilachesic serum (INS-Peruacute) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis

Using RT-PCR methodology and bioinformaacutetics analysis the complete

cDNA sequence of PLA2basicLmuta with 445 bp and an open reading frames of

414 nucleotides were obtained which encodes a peptide signal of 16 amino

acids and a matured protein of 122 residues with 13 86 kDa and a pI value of

83 calculated by in silico analysis The amino acidic sequence contains

conserved residues of His48 Asp49 Tyr52 in the catalytic site as well as Tyr18

Gly30 y Gly32 in the Ca+2-binding site Three-dimensional model of

PLA2basicLmuta showed that was conformed by three α-helix one β-sheet and

one Ca+2-binding ribbon PLA2basicLmuta shows a high structural homology with

other snake venom phospholipases Finally studies reveal that PLA2basicLmuta

belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49] This work is

the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom

enzyme

Key words Phospholipase A2 Isoenzyme Lachesis muta pharmacologic site

transcript

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

2

ABSTRACT

In the present research the biochemical biological immunological as well

as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of

peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicLmuta) were studied This enzyme

was purified using ion exchange filtration and high performance

chromatographical steps respectively The enzyme was purified 412 times with

a yield of 64 SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 147 kDa

under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single

polypeptide chain Furthermore the enzyme had a optimal pH of 78 and was

inhibited by PMSF EDTA and glutation In relation to its biologic activity a

Medium Hemolytic Doses (DH50) of 435microgtube Minimum Miotoxic Doses

(MMD) of 1896microgml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 915μg were

obtained For another hand the PLA2 didnacutet show either hemorrhagic or

anticoagulant activities and was recognized and partially inhibited by monovalent

antilachesic serum (INS-Peruacute) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis

Using RT-PCR methodology and bioinformaacutetics analysis the complete

cDNA sequence of PLA2basicLmuta with 445 bp and an open reading frames of

414 nucleotides were obtained which encodes a peptide signal of 16 amino

acids and a matured protein of 122 residues with 13 86 kDa and a pI value of

83 calculated by in silico analysis The amino acidic sequence contains

conserved residues of His48 Asp49 Tyr52 in the catalytic site as well as Tyr18

Gly30 y Gly32 in the Ca+2-binding site Three-dimensional model of

PLA2basicLmuta showed that was conformed by three α-helix one β-sheet and

one Ca+2-binding ribbon PLA2basicLmuta shows a high structural homology with

other snake venom phospholipases Finally studies reveal that PLA2basicLmuta

belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49] This work is

the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom

enzyme

Key words Phospholipase A2 Isoenzyme Lachesis muta pharmacologic site

transcript

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

3

INTRODUCCIOacuteN

Ameacuterica Latina presenta una amplia diversidad de serpientes una de ellas

es Lachesis muta la serpiente maacutes grande de la subfamilia Crotalinae familia

Viperidae la cual se encuentra distribuida en los troacutepicos forestales lluviosos de

Ameacuterica Central y del Sur En el Peruacute ldquoShushuperdquo como la nombran

popularmente habita las zonas de selva alta y baja donde el envenenamiento

por esta serpiente se da principalmente en la poblacioacuten rural involucrada en

faenas agriacutecolas (Ascencios y Cutti 1995) El cuadro cliacutenico que se desarrolla en

estos casos se asocia con dantildeos locales raacutepidos y prominentes diarrea edema

intenso dolor local nausea hipotensioacuten sangrado necrosis signos

neurotoacutexicos coagulopatiacuteas choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda

ocasionando de esta manera un problema de salud

A pesar que se cuenta con tratamientos siendo el principal el uso del

suero antiofiacutedico la progresioacuten del envenenamiento puede ser muy raacutepida

debido a que el veneno presenta complejos enzimaacuteticos con diferentes

propiedades fiacutesicas quiacutemicas y bioloacutegicas (incluyendo los anticuerpos que son

producidos para cada uno de estos componentes) razoacuten por la cual en algunas

ocasiones los cuadros cliacutenicos son distintos Entre estos complejos enzimaacuteticos

se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2) enzimas que presentan diferentes

efectos bioloacutegicos entre los que se destacan anti-coagulante neurotoacutexico

inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria hemorraacutegico convulsivo miotoacutexico etc

(Kini 2003) Estas proteiacutenas tambieacuten estaacuten involucradas en procesos

fisiopatoloacutegicos tales como reumatismo osteoartritis asma psoriasis shock

seacuteptico y siacutendrome distreacutes respiratorio (Touqui y Alaoui-El-azher 2001 Murakawi

y Kudo 2002)

Las PLAs de venenos de serpientes poseen caracteriacutesticas peculiares

estas pueden ser cataliacuteticamente inactivas pero bioloacutegicamente funcionales la

homologiacutea estructural que pueden poseer entre siacute no asegura que compartan

una actividad bioloacutegica similar son en su mayoriacutea monomeacutericas dependientes

de calcio con pesos moleculares que oscilan entre los 10 y 30 kDa su estructura

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

4

terciaria es estabilizada por varios enlaces disulfuros Otra peculiaridad es la

presencia de isoformas de PLA2 en un mismo veneno con funciones bioloacutegicas

totalmente distintas por lo que se considera que estas enzimas alcanzaron la

maacutexima diversidad evolutiva dentro de los venenos ofiacutedicos

Debido a la gran variabilidad de las fosfolipasas A2 en general y tomando

en cuenta la presencia de isoformas este trabajo describe el aislamiento la

caracterizacioacuten estructural bioloacutegica y molecular de una nueva isoforma de PLA2

presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta para permitir una

mayor comprensioacuten de su relacioacuten estructura-funcioacuten Ademaacutes de evaluar su

antigenicidad con el antiveneno ya que se conocen toxinas que conservan su

actividad farmacoloacutegica pese a estar formando complejos con los anticuerpos

La evidencia proporcionada por esta investigacioacuten permite inferir algunas

caracteriacutesticas de la PLA2 tanto a nivel estructural y funcional permitiendo

entender su accioacuten en el proceso de envenenamiento por Lachesis muta De

esta manera se puede plantear mejores estrategias para enfrentar los diversos

dantildeos producidos por esta enzima y evaluar su potencialidad como herramienta

biotecnoloacutegica

Se trata del primer estudio realizado en el paiacutes en el que se compara las

caracteriacutesticas moleculares bioquiacutemicas y funcionales de una proteiacutena asociada

a la toxicidad y que aparece como una isoenzima en el veneno de Lachesis

muta

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)

5

ANTECEDENTES

Desde la antiguumledad los accidentes causados por serpientes venenosas

constituyen un problema de salud a nivel mundial En el Peruacute estos accidentes

llegan a causar peacuterdidas de vidas humanas Cuando no suceden casos fatales

los afectados pueden sufrir una destruccioacuten de tejidos hasta la peacuterdida parcial o

total de alguacuten miembro (Pesantes 2000)

En el Peruacute se pueden encontrar 9 de las 11 familias de serpientes que se

conocen y 33 especies ponzontildeosas de las cuales 9 son autoacutectonas y las 24

restantes son comunes a paiacuteses vecinos (Carrillo de Espinoza e Icocheacutea 1995)

De acuerdo a la informacioacuten proporcionada por la Direccioacuten General de Salud de

las Personas del Instituto Nacional de Salud (DGSP-INS) las serpientes

venenosas de los geacuteneros Bothrops y Lachesis son las que maacutes frecuentemente

producen accidentes ofiacutedicos (figura 1 INS 2008)

Figura 1 Reporte de accidentes por serpientes en el Peruacute Periodo 1998-2009 Fuente

estadisticas DGSP-MINSA

6

En el Peruacute la serpiente Lachesis muta habita los bosques tropicales

amazoacutenicos asiacute como el flanco oriental de los Andes de Huaacutenuco Juniacuten Loreto

Madre de Dios y Ucayali Presenta un cuerpo grueso y alargado de color pardo

amarillento vientre crema disentildeos romboidales negros en la parte dorsal cola

en punta con escamas espinosas y llegan a medir hasta 4 metros (Ascencios y

Cutti 1995) (Figura 2)

Figura 2 Serpiente venenosa Lachesis muta Familia Viperidae Subfamilia Crotalinae

Los accidentes lacheacutesicos son clasificados como moderado o graves por

ser serpientes de gran tamantildeo consideraacutendose que la cantidad de veneno

inoculada es potencialmente mayor Las acciones principales del veneno

lacheacutesico son proteoliacutetica coagulante e hipotensora estas son observadas en

casos de personas que llegan precozmente a la atencioacuten seguidamente puede

producirse un shock y llegar a la muerte (MINSA 2004)

Tambieacuten se consideran otros factores de variabilidad sintomaacutetica la edad

de la serpiente la susceptibilidad del paciente asiacute como la variedad de enzimas

7

y toxinas del veneno (MINSA 2004) Dentro de esta variedad tenemos enzimas

similares a trombina hialuronidasas proteasas fosfatasas y fosfolipasas A2

entre las maacutes importantes (Yarlequeacute 2000)

Los sueros antiofidicos o antivenenos han constituido el recurso terapeacuteutico

fundamental para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpiente Calmette produjo el primer ldquoserum antivenimeuxrdquo a fines del siglo XIX

en Francia mientras que en el continente americano el renombrado cientiacutefico

brasilentildeo Osvaldo Vital Brazil fue quien produjo los primeros antivenenos en

1901 trabajando en el Instituto Butantaacuten (Vital 1987)

En la actualidad los antivenenos son evaluados mediante su capacidad de

neutralizar la actividad letal (WHO 1981) existe la necesidad de desarrollar

pruebas alternativas para probar la potencia del antiveneno mediante ensayos in

vitro como la hemaglutinacioacuten pasiva (Khupulsup et al 1981) ELISA

(Theakston y Reid 1979) y la neutralizacioacuten de la actividad de fosfolipasa A2 (Da

Silva y Goulherme 1982)

En general las fosfolipasas (EC 3114) son enzimas hidrolasas de los

fosfoliacutepidos actuacutean sobre los enlaces acil-eacutester de una variedad de

fosfogliceacuteridos siempre que su configuracioacuten quiacutemica sea la de un sn-glicero 3

fosfato oacute la de un sn-glicero 2 fosfato y dependiendo de la zona que hidroliza se

le denomina como fosfolipasa A1 que separa de modo especifico el aacutecido graso

de la posicioacuten 1 y la fosfolipasa A2 el de la posicioacuten 2 la fosfolipasa B es una

mezcla de los anteriores efectuando la separacioacuten sucesiva de los aacutecidos grasos

la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre el aacutecido fosfoacuterico y la glicerina mientras

que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar dejando el aacutecido

fosfatiacutedico De acuerdo con las caracteriacutesticas bioquiacutemicas y el origen celular las

fosfolipasas se clasifican como citosoacutelicas (cPLA2) secretoras (sPLA2) e

intracelulares (iPLA2) (Dennios 1994) Asiacute mismo las fosfolipasas A2 secretoras

son clasificadas en tres grupos de acuerdo a su estructura primaria En el grupo

I se encuentran las fosfolipasas de paacutencreas de mamiacuteferos y venenos de

serpientes pertenecientes a la familia Elapidae el grupo II esta formado por

venenos de serpientes de las familia Viperidae por su parte el grupo III esta

8

representado principalmente por venenos de abejas (Apis mellifera) y venenos

de lagartijas (Dufton y Hider 1983)

Las fosfolipasas A2 de mamiacuteferos son generalmente no toacutexicas ellas juegan

un rol importante en la fertilizacioacuten contraccioacuten muscular funciones celulares

tales como la traduccioacuten de sentildeal viacutea biosiacutentesis de prostaglandina y leucotrienos

(Verheij et al 1981 Jain y Ferg 1989 Arita et al 1991 Dennis et al 1991 Fry

et al 1992 Kudo et al 1993 Dennis 1994) En tanto que las PLA2 de venenos

de serpiente en adicioacuten a su posible rol en la digestioacuten de la presa exhibe un

amplio rango de efectos farmacoloacutegicos para interferir en procesos fisioloacutegicos

normales

Estas proteiacutenas presentan un amplio rango de pesos moleculares (11 a 31

kDa) punto isoeleacutectrico (4 a 10pI) y enlaces disulfuros (6-8) esta alta cantidad

de enlaces le confiere una gran estabilidad en su estructura tridimensional

mientras que su pH oacuteptimo se presenta en un medio alcalino Tambieacuten pueden

incrementar su actividad enzimaacutetica al unirse a iones metaacutelicos como Ca+ Fe+

Mg+

Se han encontrado en muchas especies isoformas de esta enzima con

similaridad de peso molecular y pI presentando homologiacuteas estructurales de un

40 ndash 99 de identidad en sus secuencias de aminoaacutecidos y significante

similaridad en su estructura tridimensional asiacute sus diferencias funcionales no son

faacutecilmente correlacionadas a sus estructuras Estas enzimas estructuralmente

presentan 2 sitios importantes el primero comuacuten a todas las enzimas su sitio

cataliacutetico o enzimaacutetico y dependiendo del aminoaacutecido que se ubica en la posicioacuten

49 parte principal del sitio cataliacutetico se clasifican en a) fosfolipasas

enzimaacuteticamente activas que presentan un residuo de aacutecido aspaacutertico en la

posicioacuten 49 (D-49) y b) enzimas cataliacuteticamente inactivas o deacutebilmente activas

con una lisina en posicioacuten 49 (K-49) El segundo sitio es el farmacoloacutegico o

bioloacutegico se puede localizar en distintas zonas de la estructura y puede ser

especiacutefico o no ademaacutes son los que determinan el efecto bioloacutegico como de

miotoxicidad hemoacutelisis neurotoxicidad etc Hay evidencia significativa que no

es necesaria que la PLA2 sea cataliacuteticamente activa para producir la

9

miotoxicidad el cual es el efecto bioloacutegico maacutes potente de las PLA2 (Diaz y

Gutierrez 1997)

Tambieacuten se considera que cada isoforma de la enzima presenta un efecto

especifico asiacute tenemos que las isoformas de fosfolipasa de Vipera russelli al ser

inyectadas intraperitonealmente exhiben distintos efectos una induce

hemorragia en el hiacutegado y rintildeoacuten (Vishwanath et al 1985) otra dantildea los pulmones

causando hemorragia mientras que un tercero produce siacutentomas neurotoacutexicos

letales en ratones (Kasturi y Gorda 1989) Fue de esta forma que se llegaron a

identificar inicialmente hasta 10 isoformas de fosfolipasas cada una con diferente

accioacuten bioloacutegica en una misma especie de serpiente

Uno de los primeros efectos bioloacutegicos investigados fue el efecto

hemoliacutetico provocado por el veneno de L muta el estudio sobre la estructura y

fisiologiacutea de la fosfolipasa A2 sobre eritrocitos permitieron comprender la

actividad hemoliacutetica de los venenos sirviendo estos reportes como herramientas

para localizar fosfoliacutepidos Slotta y Fraenkel-Conrat (1938-1939) reportaron el

primer aislamiento de una fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus

terrificus a la cual denominaron crotoxina con actividad neurotoacutexica En la

actualidad se han aislado purificado y secuenciado alrededor de 100

fosfolipasas de venenos con actividades miotoacutexica en Crotalus viridis viridis

(Ownby et al 1997) anticoagulante en Vipera aspis (Boffa et al 1982) citoliacutetica

e induccioacuten de edema en Naja naja (Rudrarrimaji y Gowda 1998) inhibicioacuten de la

agregacioacuten plaquetaria hipotensioacuten entre otras (Kini y Evans 1997)

Los usos biotecnoloacutegicos importantes de la fosfolipasa A2 derivan de sus

efectos bactericidas anti-VIH anti-tumoral anti-parasitaria y anti-malaria (Soares

y Giglio 2003) resaltando este uacuteltimo por su importancia en salud Se ha

reportado que las fosfolipasas A2 de abejas y de la serpiente cascabel (Moreira

et al 2002 Zieler et al 2001) muestran un efecto inhibitorio del ciclo bioloacutegico

de Plasmodium sp

10

Todas estas caracteriacutesticas hacen interesante continuar con el estudio de

estas enzimas Grupo de investigadores de Brasil purificaron dos isoformas de

fosfolipasas A2 de L muta brasilentildeas ambas de naturaleza aacutecidas la primera

LM-PLA2-I presenta un efecto miotoacutexico y el segundo LM-PLA2-II con una

potente agregacioacuten plaquetaria como edemaacutetica (Fuly et al 2002) mientras que

usando modelos de inhibicioacuten producidos por inhibidores de PLA2 aislados de

plasmas de otras serpientes revelaron la presencia de cinco isoformas de PLA2

en L muta correspondiendo a cuatro fosfolipasas aacutecidas y una baacutesica (Fortes-

Diaz et al 1999) Por otro lado Damico et al (2005a) reportaron 2 fosfolipasas

de naturaleza baacutesica

En Peruacute los primeros estudios en fosfolipasa A2 de la serpiente L muta

fueron realizados por Woll P en 1976 realizando una purificacioacuten parcial a

traveacutes de precipitacioacuten isoeleacutectrica posteriormente Mejia et al en 2006

caracterizoacute parcialmente la enzima resultando ser una proteiacutena de naturaleza

aacutecida con un peso molecular de 19 kDa En el 2009 Inga purifico y evaluoacute los

efectos bioloacutegicos presentando esta enzima un fuerte efecto hemoliacutetico indirecto

y anticoagulante ademaacutes de ser inmunogeacutenica a pesar de su bajo peso

molecular En el mismo antildeo Jimeacutenez realizoacute el primer estudio molecular

obteniendo el DNA complementario (cDNA) de la PLA2 de Lachesis muta

peruana (Jimeacutenez 2009)

Es evidente que la fosfolipasa A2 de la serpiente L muta presenta varias

isoformas En el presente trabajo se caracterizoacute a nivel bioquiacutemico bioloacutegico y

molecular una nueva isoforma de esta enzima

11

OBJETIVOS

A Objetivo General

Estudiar la estructura propiedades bioquiacutemicas funcioacuten bioloacutegica y

las secuencias geacutenica y aminoaciacutedica de una fosfolipasa A2 del

veneno de la serpiente peruana Lachesis muta asiacute como su

interaccioacuten con el antiveneno lacheacutesico

B Objetivos Especiacuteficos

Establecer el procedimiento de purificacioacuten de la isoforma baacutesica de

PLA2 presente en el veneno de L muta

Calcular el pH oacuteptimo y peso molecular de la enzima

Determinar la accioacuten de agentes quiacutemicos sobre la actividad de PLA2

para su caracterizacioacuten bioquiacutemica

Establecer la accioacuten bioloacutegica en la que estaacute involucrada la proteiacutena

en estudio

Evaluar la antigenicidad y grado de neutralizacioacuten frente al suero

antilacheacutesico

Identificar amplificar y secuenciar el gen de la isoenzima de la PLA2

Establecer la secuencia aminoaciacutedica de la enzima en estudio a partir

de su secuencia geacutenica

12

MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 MATERIALES

a) Material Bioloacutegico

Veneno

Se empleoacute veneno obtenido de la serpiente peruana Lachesis muta

procedente de Satipo departamento de Juniacuten y mantenida en cautiverio

en el serpentario Oswaldo Meneses de la UNMSM-Lima El veneno

extraiacutedo por presioacuten manual fue liofilizado y conservado a -8ordmC

Antiveneno

El antiveneno utilizado fue el suero antilacheacutesico monovalente liacutequido

producido por el Instituto Nacional de Salud-Lima (INS) Cada vial

contiene 10ml de antiveneno que neutralizan no menos de 25mg del

veneno de Lachesis muta Para los ensayos de comparacioacuten se

utilizaron ampollas de antiveneno vigentes (Lote 00300183 Fecha de

expiracioacuten agosto 2009)Todos los experimentos realizados con el

antiveneno fueron entre Junio de 2008 a Mayo de 2009

Animales de experimentacioacuten

Se emplearon ratones albinos cepa Balb C machos (18 a 22 g) criados

en el bioterio del Instituto Nacional de Salud

Material sanguiacuteneo

Se utilizoacute plasma humano para los ensayos de coagulacioacuten y para los de

hemoacutelisis se utilizaron gloacutebulos rojos humanos lavados con buffer

isotoacutenico

13

b) Material de Laboratorio

Sustratos

Emulsioacuten de lipoproteiacutena de yema de huevo

Fosfatidilcolina

Gel de agar sangre al 15

Agentes Inhibidores y Activadores

Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF)

Ditiotreitol (DTT)

Iodoacetato

Etilen diamino tetraaceacutetico (EDTA)

2-Mercaptoetanol

Aacutecido glutaacutemico Aacutecido aspaacutertico cisteina y glutation

Ca2+ y Mg2+ bajo la forma de cloruros

Estaacutendares de peso molecular

Albuacutemina Seacuterica Bovina (66000 Dalton)

Ovoalbuacutemina (45000 Dalton)

Anhidrasa Carboacutenica (29000 Dalton)

Lisozima (14300 Dalton)

Marcadores de peso molecular 1kb DNA Fermentas

Marcadores de peso molecular 100bp DNA Promega

Electroforesis

Acrilamida

Bis acrilamida

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Tetra etil metilen diamino (TEMED)

Persulfato de amonio

Azul brillante de Coomassie

Azul de bromofenol

14

Agarosa

Bromuro de etidio

Solucioacuten decolorante (metanol aacutecido aceacutetico agua)

Resinas Cromatograacuteficas

CM- Sephadex C-50

Sephadex G-50

Buffers y otros

Acetato de amonio 005M pH 50

Tris- HCl a varias molaridades y valores de pH

Solucioacuten salina (NaCl 09)

Citrato de sodio 38

Tris-HCl 01M con Cloruro de calcio 01M pH 76

Gel de agarosa al 1

Reactivo de Folin-Ciocalteu

Buffer isotoacutenico (glicina 01M NaCl 09 pH 73)

Buffer fosfato salino PBS 002M pH 74

Buffer de corrida (Tris 01M SDS 01 glicina pH 83)

Buffer de stacking (Tris 025M SDS 02 pH 68)

Buffer de resolucion (Tris 075M SDS 02 pH 88)

Buffer muestra (Tris 006M SDS 005 glicerol 10 vv azul de

bromofenol 005)

Buffer Tris Borato EDTA (TBE) 05X

Acetonitrilo de 0-60

Acido tricloroaceacutetico 01

Tubos de 6 x 05 13 x 10 15 x 12 cm

Tubos Amicon Ultra-4 con filtro para centrifugar para 10K-NMWL

Placas petri

Columnas cromatograacuteficas de 44 x 12 cm

Pipetas automaacuteticas Eppendorf 05-10ul 10-100ul 1000ul 05-5 ml

Boeco 20-200ul

15

Kit de Creatina Kinasa CK-UV (Sigma)

Kit Total RNA purification (AMRESCO)

Kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche)

Kit PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen)

c) Equipos

Equipo para cromatografiacutea liquida de alta performance (HPLC)

Agilent 1100 Bondapack columna C-18

Colector automaacutetico de Fracciones LKB-Pharmacia

Potencioacutemetro digital Orion Research

Espectrofotoacutemetro Shimadzu UV

Fotocoloriacutemetro Spectronic Bausch amp Lomb

Balanza Analiacutetica Ainsworth

Centriacutefugadora Sorvall Instruments Modelo Easy Spin

Microcentriacutefuga Denver Instrument

Liofilizador Labconco

Bantildeo de temperatura Memmen

Equipo de electroforesis vertical en placa Techware

Equipo de electroforesis horizontal Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad

Fuente de poder para electroforesis Duostat Beckman

Caacutemara Transiluminador Polaroid

Caacutemara para inmunoelectroforeacutesis Gelman Sciences

Termociclador GeneAmpreg PCR System 9700

16

2 MEacuteTODOS

21 Purificacioacuten de la Enzima por Cromatografiacutea

Para obtener la enzima se utilizoacute el meacutetodo de Mejiacutea et al (2006) modificado

Se utilizoacute 100 mg de veneno los cuales fueron disueltos en buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 y centrifugados a 3000 rpm x 15 min para eliminar

contaminantes insolubles El sobrenadante fue colocado en una columna

cromatograacutefica de intercambio catioacutenico equilibrado con buffer acetato de

amonio 005 M a pH 5 Se colectaron fracciones de 3 ml a razoacuten de 10mlh

a temperatura ambiente y se determinoacute la cantidad de proteiacutena por

absorbancia a 280nm La elusioacuten de las proteiacutenas retenidas se realizoacute por

una gradiente de NaCl de 03M a 06M Las fracciones que presentaron

mayor actividad de fosfolipasa A2 fueron juntadas y concentradas por

centrifugacioacuten con los tubos AMICON Ultra-4 a 10000 rpm por 10 minutos

para la siguiente etapa de purificacioacuten

La proteiacutena activa fue aplicada a una columna de filtracioacuten molecular

equilibrada con el buffer ya mencionado bajo las mismas condiciones Se

colectaron fracciones de 15 ml las fracciones que conteniacutean la enzima

fueron reunidas y concentradas una cantidad fue pasada por un HPLC en

una columna C-18 eluiacutedo a razoacuten de 1microl2min con una gradiente de

acetonitrilo y acido tricloroaceacutetico

22 Caracterizacioacuten bioquiacutemica

221 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas

Se cuantificoacute mediante dos meacutetodos

a) Meacutetodo de absorcioacuten de luz ultravioleta

Se utilizoacute el meacutetodo de Warburg y Christian (1941) midiendo la

absorbancia de luz UV a 280nm en un espectrofotoacutemetro para

17

determinar la densidad oacuteptica de una solucioacuten del veneno crudo a

1mgml asiacute como de las fracciones colectadas en las cromatografiacuteas

b) Meacutetodo de Lowry

Se fundamenta en la formacioacuten de una mezcla coloreada con el

reactivo de Folin-Ciocalteu 16 (RFC) solucioacuten alcalina que contienen

carbonato de sodio al 4 sulfato de cobre al 2 y tartrato de sodio y

potasio al 4 (10011) se colocoacute diferentes cantidades de la

muestra maacutes 2 ml de solucioacuten alcalina incubaacutendose a 37ordmC durante

15 minutos para luego adicionarle 05ml de RFC despueacutes de 30

minutos se cuantificoacute a 660 nm en un fotocoloriacutemetro provisto de un

fototubo y filtro infrarrojo (Lowry et al 1951)

222 Actividad de Fosfolipasa A2

Fue ensayada de acuerdo a 2 meacutetodos a) Meacutetodo de retardo de la coagulacioacuten de la yema de huevo (Vidal y

Stoppani 1971)

Usando una emulsioacuten de yema de huevo al 45 en buffer Tris-HCl 10

mM con Ca2Cl 10 mM Se evaluoacute el tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la emulsioacuten a la que se le antildeadioacute la enzima en

cantidades adecuadas se incuboacute la mezcla por 15 minutos a 37ordmC

para luego ser transferidos a un bantildeo de agua hirviente midieacutendose

el tiempo de coagulacioacuten con respecto a un blanco La actividad

especiacutefica fue calculada en base al tiempo de retardo de la

coagulacioacuten de la lipoproteiacutena de la yema de huevo por minuto y por

miligramo de proteiacutena

b) Meacutetodo espectrofotomeacutetrico (De Oliveira y Palma 1998)

Para esta prueba se empleoacute una mezcla que conteniacutea

Fosfatidilcolina Ca2Cl Rojo de Fenol Triton X-100 y Buffer Tris-HCl

001M Esta solucioacuten fue introducida en una celda de 3 ml e incubada

18

a 37ordmC por 5min luego se le agregoacute la enzima en estudio y se evaluoacute

el cambio en la densidad oacuteptica de la mezcla a 558 nm La actividad

enzimaacutetica se expresa como cambio de absorbancia por minuto por

miligramo de proteiacutena

223 Evaluacioacuten de la Pureza y Peso Molecular

Para la evaluacioacuten de la pureza de la proteiacutena asiacute como la

determinacioacuten de su peso molecular se realizoacute una electroforesis en

gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en

condiciones reductoras (con 2β-mercaptoetanol) y no reductoras de

acuerdo al meacutetodo de Laemmli (1970) con un gel de resolucioacuten al

12 y un gel de stacking al 4 manteniendo la corrida a voltaje

constante (100 voltios) durante 1 hora aproximadamente el revelado

de las bandas fue con azul brillante de Coomassie al 01 por 30

minutos y lavados con solucioacuten decolorante (metanol 25 aacutecido

aceacutetico 8 agua 67) hasta evidenciar las bandas de proteiacutena Se

usaron como marcadores de peso molecular albuacutemina seacuterica bovina

(66 kDa) ovoalbuacutemina (45 kDa) anhidrasa carboacutenica (29 kDa) y

lisozima (143 kDa)

224 Evaluacioacuten del pH oacuteptimo

Para la evaluacioacuten del pH oacuteptimo de la enzima se usoacute buffer tris HCl

001M con un rango de pH de 7 a 9 con intervalos de 02 unidades de

pH Para esta prueba se preparoacute el sustrato en cada uno de los

buffers midieacutendose a continuacioacuten la actividad de la enzima

225 Efecto de algunos iones inhibidores enzimaacuteticos y aminoaacutecidos

Se exploroacute el efecto de dos iones divalentes como son los iones Ca2+

y Mg2+ bajo la forma de cloruros a concentraciones finales de 01

19

05 1 y 5 milimolares tanto independientemente como en conjunto

Para ello se incubaron con la enzima a 37ordmC por 10 minutos para

luego ser agregados al sustrato y medir la actividad enzimaacutetica

Se analizaron los efectos de inhibidores como fenil metil sulfonil

fluoruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) Iodoacetato etilen diamino

tetraaceacutetico (EDTA) 2-mercaptoetanol asiacute como de algunos

aminoaacutecidos tales como aacutecido glutaacutemico aacutecido aspaacutertico cisteiacutena y

glutatioacuten a concentraciones finales de 25 5 10 y 20 mM los cuales

se preincubaron con la enzima a 37ordmC por 10 min Midieacutendose luego

la actividad enzimaacutetica por el meacutetodo de Vidal y Stoppani (1971)

23 Caracterizacioacuten bioloacutegica

Para la caracterizacioacuten bioloacutegica se evaluaron las actividades hemoliacutetica

(directa e indirecta) Edemaacutetica hemorragica anticoagulante y miotoacutexica

cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado

231 Determinacioacuten de la Actividad Hemoliacutetica

Se determinoacute por el meacutetodo de Condrea et al (1964) colectaacutendose

10ml de sangre humana venosa en tubos citratados al 38 los

cuales fueron centrifugados a 1000rpm x 15minutos Se retiroacute el

plasma (sobrenadante) para la prueba de accioacuten anticoagulante y el

paquete de gloacutebulos rojos fue resuspendido y lavado con NaCl al

09 pH 73 finalmente fue resuspendido en buffer isotoacutenico

a) Actividad Hemoliacutetica Directa

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 08ml de buffer isotoacutenico 01ml

de gloacutebulos rojos lavados (GRL) y 01ml de la enzima la mezcla fue

incubada a 37ordmC por 2 horas deteniendo la reaccioacuten con la solucioacuten

friacutea (NaCl al 09 pH 73 con EDTA 1mM) se centrifugoacute a 1000 rpm

por 5min y se pasoacute a leer su absorbancia a 540nm El grado de

20

hemoacutelisis total se expresa como porcentaje de hemoglobina

contenida en 01ml de GRL y hemolizados con 59ml de agua

destilada

b) Actividad Hemoliacutetica Indirecta

Se preparoacute una mezcla que conteniacutea 07 ml de buffer isotoacutenico 01ml

de GRL 01ml de lipoproteiacutena de yema de huevo al 64 y 01ml de

la enzima Se incuboacute a 37ordmC por 2 horas y se detuvo la reaccioacuten con

5ml de la solucioacuten detenedora friacutea anteriormente mencionada

procedieacutendose de la misma manera para la lectura y anaacutelisis de la

actividad

Se determinoacute la Dosis Hemoliacutetica media (DH50) la cual se define

como la concentracioacuten de veneno en microgml que es capaz de lisar el

50 de los gloacutebulos rojos bajo las condiciones experimentales

empleadas (Castantildeon et al 1993) Para ello se elaboroacute una curva

dosis-respuesta de μg de veneno vs el de hemoacutelisis empleando

una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y una escala

milimeacutetrica para el de hemoacutelisis (World Health Organization 1981)

c) Actividad hemoliacutetica Indirecta en placa

Se preparoacute una solucioacuten de agar agar al 15 final en PBS a pH 74

GRL al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de calcio 10mM La

mezcla se vertioacute a una placa Petri esteacuteril luego de su gelificacioacuten se

realizaron pocillos con ayuda de un sacabocados y se colocaron las

muestras del veneno como de la enzima en concentraciones

adecuadas para compararlas Se hicieron observaciones a las 0 12 y

24 horas para determinar la presencia de un halo hemoliacutetico el cual

fue medido en centiacutemetros (Haberman y Hardt 1972 Gutieacuterrez et al

1988a)

21

232 Determinacioacuten de la Actividad Edemaacutetica

Fue evaluada por el meacutetodo descrito por Yamakawa et al (1976) se

emplearon grupos de 6 ratones machos de 18-22g los cuales fueron

inyectados en la pata posterior derecha regioacuten subplantar con 005ml

de fosfolipasa A2 purificada a diferentes concentraciones y en la pata

posterior izquierda en la misma zona se inyectoacute solucioacuten salina

(control negativo) Despueacutes de 3 horas se sacrificoacute a los animales por

dislocacioacuten cervical se retiraron las patas las cuales fueron pesadas

comparaacutendolas con su respectivo control evaluandose el efecto

edemaacutetico por la diferencia de pesos

La dosis edemaacutetica media (DEM) se expresa en microg de proteiacutena capaz

de producir una diferencia de peso entre el miembro tratado y no

tratado equivalente al 30 Para ello se realizoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs de la diferencia de

peso producido) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de

veneno y una escala milimeacutetrica para el de peso (World Health

Organization 1981)

233 Determinacioacuten de la Actividad Hemorraacutegica

Se realizoacute seguacuten el Meacutetodo de Kondo et al (1960) donde grupos de

6 ratones (machos 18-22g) fueron inyectados intraperitonealmente

con 01ml de la muestra se observoacute a los animales anotando su

comportamiento por un lapso de 2 horas luego fueron sacrificados

por dislocacioacuten cervical Con mucho cuidado se abrioacute y se retiroacute la

piel tomando en cuenta el lado por donde se inyectoacute para determinar

el aacuterea hemorraacutegica formada si el dantildeo en la piel es esfeacuterico se mide

el diaacutemetro de la lesioacuten si el dantildeo presenta una forma irregular se

mide el tamantildeo del aacuterea hemorraacutegica dibujaacutendolo en papel

milimetrado transparente

22

Se determina el diaacutemetro de la lesioacuten hemorraacutegica mediante el

siguiente caacutelculo

Diaacutemetro = 2 x aacuterea hemorraacutegica π

La actividad hemorraacutegica se expresa como la dosis hemorraacutegica

miacutenima (DHM) definida como la menor cantidad de veneno o enzima

que induce un aacuterea hemorraacutegica de 10 mm de diaacutemetro para ello se

prepara una curva dosis-respuesta (μg de veneno vs mm diaacutemetro de

lesioacuten hemorraacutegica) empleando una escala logariacutetmica para la dosis

de veneno y una escala milimeacutetrica para el diaacutemetro de la lesioacuten

234 Determinacioacuten de la Actividad Anticoagulante

Se determinoacute por el meacutetodo descrito por Yarlequeacute et al (1989) La

mezcla de reaccioacuten conteniacutea 02ml de plasma humano y 01ml de la

enzima purificada en tubos de 10 x 75 se incubaron a 37ordmC por 5

minutos para luego agregarles 01ml de Cl2Ca 25mM midieacutendose el

tiempo de recalcificacioacuten o coagulacioacuten

La actividad anticoagulante se determinoacute por el retardo en la

coagulacioacuten o la incoagulabilidad del plasma con respecto al tiempo

de coagulacioacuten del blanco es decir al tiempo de recalcificacioacuten

235 Determinacioacuten de la Actividad Miotoacutexica

La actividad miotoacutexica fue evaluada a traveacutes de la prueba de Creatina

Kinasa (CK) estandarizada por Gutieacuterrez et al (1980) la cual fue

llevada a cabo usando el kit cineacutetico de Sigma CK-UV Se utilizaron

grupos de 4 ratones albinos de 18-22g de peso Se les inyectoacute 01ml

de la enzima purificada a diferentes concentraciones en el muacutesculo

gastrocnemius de la pata derecha se usoacute como control negativo

23

01ml de PBS 015M y como control positivo 01ml de veneno total de

Lachesis muta a 1mgml Despueacutes de 2 horas se colectoacute la sangre

de la cola en capilares con anticoagulante Se centrifugoacute por 10

minutos a 3000 rpm para separar el plasma Para la mezcla de

reaccioacuten se usaron 20 microl de plasma citratado con 1ml de kit CK

midieacutendose el cambio de absorbancia a 340nm

La actividad fue expresada en IUl una unidad es la resultante de la

fosforilacioacuten de 1mmol de creatinamin a 37ordmC Para la determinacioacuten

de la Dosis Miotoacutexica Miacutenima (DMM) se preparoacute una curva dosis-

respuesta por regresioacuten lineal (μg de veneno vs actividad de CK en

plasma) empleando una escala logariacutetmica para la dosis de veneno y

una escala milimeacutetrica para la actividad de CK Se determinoacute la dosis

de veneno en la que la actividad CK plasmaacutetica corresponde a 4

veces la actividad de CK del plasma de los ratones inyectados con

solucioacuten salina correspondiendo esta dosis a la DMM (World Health

Organization 1981)

24 Pruebas inmunoloacutegica y de neutralizacioacuten

241 Inmunodifusioacuten directa (IDD)

La prueba se llevoacute a cabo sobre geles de agarosa al 1 las cuales

fueron disueltas en buffer fosfato salino (PBS) 015M a pH 70 Luego

fue extendida en laacuteminas portaobjetos dejaacutendose gelificar para

posteriormente realizar 3 pocillos equidistantes con la ayuda de un

sacabocado Se colocoacute en el pocillo central 10microl de la enzima

purificada y en los laterales el suero Paralelamente tambieacuten se

hicieron pruebas con laacuteminas conteniendo veneno crudo La difusioacuten

se realizoacute en caacutemara huacutemeda por 48 horas a temperatura ambiente y

luego las laacuteminas fueron lavadas consecutivamente con citrato

trisoacutedico al 5 NaCl al 09 y agua destilada Despueacutes fueron

24

tentildeidas con azul brillante de Coomasie al 01 se decoloraron con la

solucioacuten decolorante (usada en la electroforesis) y finalmente se

secaron en una estufa a 37ordmC por 24 horas (Ouchterlony y Nilsson

1967)

242 Inmunoelectroforesis (IEF)

Se realizaron experimentos con la finalidad de analizar las reacciones

antiacutegeno-anticuerpo entre el veneno crudo de L muta y la enzima

purificada con el respectivo antiveneno Estas fueron preparadas en

laacuteminas cubiertas con agarosa al 1 en forma similar a la realizada

para inmunodifusioacuten Se hicieron orificios de 1 x 4mm en la agarosa

gelificada a ambos lados de una canaleta central de 1 x 56mm se

realizoacute la IEF en cubetas adecuadas en buffer glicina 005M pH 83

Se aplicoacute una corriente de 4 mAlaacutemina por una hora se tuvo como

indicador de corrida al azul de bromofenol en las muestras

Terminada la corrida se removioacute el gel de la canaleta central y se

aplicoacute el suero antilacheacutesico despueacutes las laacuteminas se colocaron en un

recipiente huacutemedo a temperatura ambiente y esteacuteril por 48h hasta

visualizar los arcos de precipitacioacuten La tincioacuten y el secado se

realizaron en condiciones similares a la inmunodifusion Ouchterlony y

Nilsson 1967)

243 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad enzimaacutetica

Para estas pruebas se utilizaron mezclas que conteniacutean 50microl de la

enzima en estudio con diferentes concentraciones de suero

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis neutralizantes de suero antilacheacutesico

monovalente (INS-Peruacute) las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por

25

30 minutos Se procedioacute a probar la actividad de fosfolipasa

empleando 50microl de la mezcla

Las cantidades de antiveneno neutralizante para todas las pruebas

fueron elegidas en base a la indicacioacuten de la ampolla que sentildeala que

10ml de dicho suero neutralizan 24mg de veneno lacheacutesico

244 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad hemoliacutetica

Para evaluar la neutralizacioacuten de esta actividad se realizoacute por el

meacutetodo de Haberman y Hard (1972) modificado por Gutieacuterrez et al

(1988a) empleando placas de agar sangre y la DH50 como control

positivo representando el 100

Se preparoacute una solucioacuten de agar al 15 final en PBS a pH 74

gloacutebulos rojos lavados al 3 yema de huevo al 5 y cloruro de

calcio 10mM Luego de su gelificacioacuten se hicieron pocillos con ayuda

de un sacabocados y se colocaron las muestras del antiveneno y la

enzima preincubadas a 37ordmC por 30 minutos a concentraciones

equivalentes a frac12 1 y 2 dosis se evaluoacute a las 12 y 24 horas

observaacutendose el grado de neutralizacioacuten por la reduccioacuten del halo de

hemoacutelisis al compararlo con el halo que forma el veneno crudo yo la

enzima purificada consideraacutendolos como el 100 de hemoacutelisis

245 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad edemaacutetica

Se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima en estudio con

concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2 dosis

neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se emplearon 50microl de la mezcla y se inyectaron en la

almohadilla plantar de las patas posteriores de los ratones como en la

26

determinacioacuten de la actividad edemaacutetica Despueacutes de 3 horas se

sacrificoacute a los animales se retiraron las patas las cuales fueron

pesadas comparaacutendolas con su respectivo control negativo (solucioacuten

salina) y un grupo de ratones que son los controles positivos

consideraacutendose la DEM se evaluoacute el efecto neutralizante en

porcentaje de reduccioacuten del edema

246 Ensayo de neutralizacioacuten para la actividad miotoacutexica

Para evaluar la capacidad neutralizante del suero antilacheacutesico frente

al efecto miotoacutexico se prepararon mezclas que conteniacutean la enzima

en estudio con concentraciones de suero equivalentes a frac12 1 y 2

dosis neutralizantes las mezclas fueron preincubadas a 37ordmC por 30

minutos Se usaron 50microl de la mezcla y se inyectaron en el muacutesculo

gastrocnemius seguacuten el meacutetodo modificado por Gutieacuterrez et al

(1980) Se consideroacute como control positivo y 100 la DMM se evaluoacute

el efecto neutralizante en porcentaje de reduccioacuten

25 Caracterizacioacuten Molecular

251 Disentildeo de primers

Para sintetizar primers especiacuteficos y amplificar los genes de la

fosfolipasa A2 se realizoacute una revisioacuten de artiacuteculos cientiacuteficos de

clonaje de genes de PLA2 de venenos asiacute como de la base de datos

de GenBank obteniendo secuencias nucleotiacutedicas del gen de PLA2

procedentes de trascritos de serpientes estas secuencias fueron

descargadas en formato FASTA y se compararon por alineamiento

muacuteltiple usando el programa Clustal X y Bioedit para el disentildeo se

27

consideroacute la longitud de cebadores temperatura de hibridacioacuten

porcentaje de GC mayor a 50 incluir el peacuteptido sentildeal para futuras

clonaciones y expresioacuten de la proteiacutena degeneracioacuten de algunos

nucleoacutetidos para una mayor probabilidad de amplificado en base al

alineamiento muacuteltiple

252 Extraccioacuten y purificacioacuten de ARN

Se extrajo 300 microl de veneno fresco sin sacrificar a la serpiente

inmediatamente se purificoacute el ARN total con reactivos libres de

ribonucleasa empleando el kit ldquoTotal RNA Purificationrdquo (AMRESCO)

de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidamente se

procedioacute a la siacutentesis de cDNA empleando la metodologiacutea de

Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa por Transcriptasa Reversa

(RT-PCR)

253 Siacutentesis de cDNA

Para la siacutentesis de los cDNA se empleoacute el kit ldquoTranscriptor First

Strand cDNA Synthesisrdquo colocando en un tubo de PCR en friacuteo 7 microl

de RNA purificado 1 microl de primer ldquoanchored-oligo(dT)18rdquo 1 microl de

primer ldquorandom hexaacutemerordquo y 4 microl de agua grado PCR Se denaturoacute la

mezcla calentando por 10 min a 65degC se detuvo la reaccioacuten por

enfriamiento brusco se continuoacute agregando 4microl de buffer de reaccioacuten

05microl de inhibidores de RNasa 2microl de deoxinucleoacutetidos y 05microl de la

transcriptasa reversa Se incuboacute la mezcla por 10 min a 25degC seguido

de 60 min a 50degC se inactivoacute la transcriptasa reversa por

calentamiento a 85degC por 5 min y se colocoacute el tubo en frio para

guardarlo de -15degC a -25degC para su posterior amplificacioacuten

28

254 Amplificacioacuten del gen de la fosfolipasa

Del cDNA sintetizado se usoacute 1microl para cada reaccioacuten PCR en un

volumen final de 25 μl La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM

MgCl2 10x de buffer PCR 2 mM de un mix de dNTP 20 pmoles de

cada primer agua grado PCR y 15 microl de Taq DNA polimerasa kit

PlatinumregTaq DNA Polymerase (Invitrogen) Las condiciones de

cada ciclo de reaccioacuten programadas en un termociclador fueron un

ciclo de desnaturalizacioacuten 95deg por 5min seguido por 32 ciclos de

desnaturalizacioacuten a 94ordmC durante 30 seg hibridacioacuten 60ordmC por 1

min y polimerizacioacuten a 72ordmC durante 1 min y finalmente se incuboacute a

72ordmC por 7 min En todos los casos se consideroacute controles negativos

de la reaccioacuten de PCR sin antildeadir cDNA molde Los productos de

PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa

al 12 en buffer TBE 05X corridos a voltaje constante de 75 V

Posteriormente se tintildeeron con bromuro de etidio y se fotografiaron

con la caacutemara Polaroid La cuantificacioacuten del ADN obtenido se realizoacute

por espectrofotometriacutea a 260 nm

255 Secuenciacioacuten y Anaacutelisis

La secuenciacioacuten de los productos amplificados se realizoacute por

solicitud de servicios a la casa comercial Invitrogen Para el anaacutelisis

de las secuencias de nucleoacutetidos obtenidas se utilizoacute los siguientes

softwares de libre acceso

- Genbank para la obtencioacuten de secuencias nucleotiacutedicas de

fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(httpwwwncbinlmnihgov)

- BLAST para encontrar regiones de similaridad para secuencias

nucleotiacutedicas y aminoaciacutedicas

(httpblastncbinlmnihgovBlastcgi)