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CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA DE CEPAS DE Fusarium AISLADAS DE LESIONES DE ANIMALES, HUMANOS Y PLANTAS.

MARÍA FERNANDA VALENCIA GUERRERO

Trabajo de grado

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

Microbióloga Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá D.C.

FEBRERO DE 2009

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NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario

al dogma y la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales

contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar verdad y

justicia”.

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CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA DE CEPAS DE Fusarium AISLADAS DE LESIONES DE ANIMALES, HUMANOS Y PLANTAS.

MARÍA FERNANDA VALENCIA GUERRERO

APROBADO

___________________________

Balkys Quevedo Ingeniera Química M.sc.

Directora

__________________________

María Ximena Rodríguez Microbióloga Ph.D.

Codirectora

____________________________

Aura Marina Pedroza Bacterióloga Ph.D.

Jurado

___________________________

Melba Linares. Bacterióloga.

Jurado

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CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA DE CEPAS DE Fusarium AISLADAS DE LESIONES DE ANIMALES, HUMANOS Y PLANTAS.

MARÍA FERNANDA VALENCIA GUERRERO

APROBADO

___________________________

Ingrid Schuler Ph.D.

Decana Académica Facultad de Ciencias

__________________________

Janeth Arias M.sc.

Directora de Carrera Microbiología Industrial

5

A Dios por darme la inmensa voluntad y capacidad de entrega para hacer las cosas

con amor y dedicación.

A mis padres Fátima y Didier y a mis hermanos Fernando y Mauricio por su gran

cariño, confianza, apoyo, consejos y su constante exigencia factores que conllevaron a

formar a la persona que soy.

A Adriana, Katherine y Lorena por su grandiosa e invaluable amistad.

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AGRADECIMIENTOS

A Balkys Quevedo M.sc. Directora de este trabajo a la cual le agradezco el

haber guiado el desarrollo del mismo así como su confianza, su paciencia y

sobre todo su gran aporte en mi formación académica y personal.

A María Ximena Rodríguez Ph.D. Codirectora de este trabajo a la cual le

agradezco su invaluable enseñanza y su disposición permanente e

incondicional en aclarar mis dudas.

A mis compañeros del laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia

Universidad Javeriana que de una u otra manera colaboraron en el desarrollo

de este trabajo.

7

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 17

2. MARCO TEÓRICO .......................................................................................... 21

2.1. Generalidades del género Fusarium ......................................................... 21

2.1.1. Fusarium ........................................................................................... 21

2.1.2. Fusarium oxysporum ......................................................................... 23

2.1.3. Fusarium solani ................................................................................. 23

2.1.4. Fusarium verticillioides (moniliforme) ................................................. 23

2.2. Clasificación taxonómica de Fusarium ...................................................... 24

2.3. Patogénesis en animales, humanos y plantas .......................................... 24

2.4. Mecanismos de patogénesis .................................................................... 30

2.5. Desarrollo de la enfermedad ..................................................................... 31

2.6. Penetración del patógeno ......................................................................... 32

2.6.1. Penetración a través de heridas ........................................................ 32

2.6.2. Penetración a través de la superficie intacta ...................................... 33

2.6.3. A través de aberturas naturales ......................................................... 34

2.7. Degradación enzimática de sustancias contendidas en las barreras

celulares.............................................................................................................. 34

2.7.1. Actividad amilolítica ........................................................................... 36

2.7.2. Actividad celulolítica .......................................................................... 37

2.7.3. Actividad lipolítica .............................................................................. 38

2.7.4. Actividad pectinolítica ........................................................................ 40

2.7.5. Actividad proteolítica ......................................................................... 41

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA................................................................. 43

4. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 44

5. OBJETIVOS .................................................................................................... 46

5.1. Objetivo General ....................................................................................... 46

5.2. Objetivos Específicos ............................................................................... 46

6. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 47

6.1. Microorganismos y medio de cultivo ......................................................... 47

8

6.2. Inducción del preinóculo ........................................................................... 48

6.3. Pruebas de caracterización cualitativa ...................................................... 48

6.3.1. Actividad amilolítica ........................................................................... 48

6.3.2. Actividad celulolítica .......................................................................... 49

6.3.3. Actividad lipolítica .............................................................................. 49

6.3.4. Actividad pectinolítica ........................................................................ 50

6.3.5. Actividad cualitativa Proteolítica ........................................................ 50

6.4. Pruebas de caracterización cuantitativa.................................................... 50

6.4.1. Determinación indirecta de la actividad amilolítica, celulolítica y

pectinolítica...................................................................................................... 51

6.4.2. Determinación de la actividad lipolítica .............................................. 52

6.4.3. Determinación de la actividad proteolítica .......................................... 53

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 56

7.1. Pruebas de Caracterización Enzimáticas. ................................................. 56

7.1.1. Actividad amilolítica ............................................................................... 56

7.1.2. Actividad celulolítica ............................................................................... 62

7.1.3. Actividad lipolítica .................................................................................. 71

7.1.4. Actividad pectinolítica ............................................................................ 79

7.1.5. Actividad proteolítica .............................................................................. 89

7.2. Consideraciones finales ......................................................................... 102

8. CONCLUSIONES .......................................................................................... 107

9. RECOMENDACIONES.................................................................................. 109

10. REFERENCIAS ............................................................................................. 111

11. ANEXOS ....................................................................................................... 121

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Actividad enzimática amilolítica cualitativa. ............................................. 56

Figura 2. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en

caldo almidón de las cepas provenientes de animales. .......................................... 59

Figura 3. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en

caldo almidón de las cepas provenientes de humanos. .......................................... 60

Figura 4. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en

caldo almidón de las cepas provenientes de plantas. ............................................. 61

Figura 5. Actividad enzimática celulolítica cualitativa. ............................................ 63

Figura 6. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar

carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de animales. ............... 63

Figura 7. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar

carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de humanos. .............. 64

Figura 8. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar

carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de plantas. ................. 65

Figura 9. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en

caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de animales. ....................... 67

Figura 10. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en

caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de humanos. ....................... 68

Figura 11. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en

caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de plantas. .......................... 69

Figura 12. Actividad cualitativa lipolítica. ................................................................ 71

Figura 13. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de

huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de animales. ..................................... 72

Figura 14. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de

huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de humanos. ..................................... 73

Figura 15. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de

huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de plantas. ....................................... 74

Figura 16. Características macroscópicas del género en agar yema de huevo. ..... 75

Figura 17. Actividad enzimática cualitativa pectinolítica. ........................................ 80

10

Figura 18. Actividad hidrolítica de las cepas en agar pectina revelado con lugol. a.

cepa 209. b. cepa 201. c. Cepa 156. ...................................................................... 80

Figura 19. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar pectina al

1% (p/v) de las cepas aisladas de animales. .......................................................... 81

Figura 22. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de

incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de animales. ............................ 84

Figura 23. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de

incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de humanos. ............................ 85

Figura 24. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de

incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de humanos. ............................ 87

Figura 25. Actividad cualitativa proteolítica. ........................................................... 90

Figura 26. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche

descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de animales. .................................. 91

Figura 27. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche

descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de humanos. .................................. 92

Figura 28. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche

descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de plantas. ..................................... 93

Figura 29. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y

caseína de las cepas aisladas de animales. ........................................................... 94

Figura 30. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de

caldo leche descremada y caldo caseína de las cepas aisladas de animales. ........ 95

Figura 31. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y

caldo caseína de las cepas aisladas de humanos. ................................................. 96

Figura 32. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de

caldo leche descremada y caseína de las cepas aisladas de humanos. ................. 98

Figura 33. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y

caldo caseína de las cepas aisladas de plantas. .................................................... 99

Figura 34. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de

caldo leche descremada y caseína de las cepas aisladas de plantas. .................. 100

11

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Cepas codificadas según su procedencia. ................................................ 47

Tabla 2. Cepas con mayor actividad enzimática celulolítica, pectinolítica y

proteolítica cualitativa. .......................................................................................... 102

Tabla 3. Cepas con mayor actividad enzimática amilolítica, celulolítica, pectinolítica

y proteolítica cuantitativa. ..................................................................................... 103

Tabla 4. Cepas destacadas en la determinación enzimática amilolítica, celulolítica,

pectinolítica y proteolítica. ..................................................................................... 106

12

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Medios De Cultivo ................................................................................. 121

Anexo 2. Curvas de Calibración ........................................................................... 125

Anexo 3. Resultados prueba de actividad enzimática amilolítica cuantitativa. ...... 129

Anexo 4. Resultados prueba de actividad enzimática celulolítica cualitativa. ....... 130

Anexo 5. Resultados prueba actividad enzimática celulolítica cuantitativa. .......... 131

Anexo 6. Resultados pruebas actividad enzimática lipolítica cualitativa. .............. 132

Anexo 7. Resultados prueba enzimática pectinolítica cualitativa. ......................... 133

Anexo 8. Resultados prueba actividad enzimática pectinolítica cuantitativa. ........ 134

Anexo 9. Resultados prueba actividad enzimática proteolítica cualitativa. ........... 135

Anexo 10. Resultados prueba actividad enzimática proteolítica cuantitativa. ....... 136

Anexo 11. Análisis Estadístico ............................................................................. 137

13

RESUMEN

Recientemente el género Fusarium ha sido reconocido como un modelo de

patogénesis multihospedero por su capacidad de infectar tanto a plantas

como animales y humanos, tal capacidad esta asociada a factores de

virulencia los cuales se despliegan determinando el potencial y la magnitud

de la infección, dentro de estos factores de virulencia asociados a los hongos

multihospedero se destaca el papel de las enzimas las cuales le permiten a

los hongos con capacidad multihospedero degradar constituyentes

importantes de las barreras de protección externa de sus hospederos,

permitiéndole al hongo penetrar y colonizar tejidos, causando de esta forma

enfermedad en su hospedero. La importancia de este trabajo radicó en la

determinación de las actividades amilolíticas, celulolíticas, lipolíticas,

pectinolíticas y proteolíticas para cada una de las cepas evaluadas. Siendo

no posible para fines de este estudio la determinación de la actividad lipolítica

bajo las condiciones de ensayo. Las cepas 205 y 208 aisladas de lesiones

humanas, mostraron la mayor actividad enzimática amilolítica referente a

concentración liberada de glucosa en g/L para los días 2 y 4 de lectura. En la

actividad enzimática celulolítica las cepas 202 y 155 aisladas de una lesión

humana y animal respectivamente, mostraron la mayor actividad referente a

concentración liberada de glucosa en g/L para los días 2 y 4

respectivamente. En cuanto a la actividad enzimática pectinolítica, las cepas

314 y 156 aisladas de una lesión de planta y animal respectivamente,

mostraron la mayor actividad referente a concentración liberada de ácido

galacturónico en g/L para los días 2 y 4 de lectura respectivamente. La

determinación de las actividades amilolíticas, celulolíticas y pectinolíticas

sugiere la posible capacidad de las cepas aisladas de lesiones animales y

humanas de degradar sustratos vegetales así mismo confirma la capacidad

de las cepas aisladas de lesiones de plantas de degradar estos sustratos,

constituyentes principales de la pared vegetal. En cuanto a la actividad

14

proteolítica las cepas 210 seguida de la 111 y la 310 mostraron la mayor

actividad. La determinación de esta actividad indica la posible capacidad de

las cepas aisladas de lesiones animales y humanas de degradar sustratos

proteicos vegetales, siendo más importante la posible capacidad de las

cepas aisladas de plantas de causar infección en animales y humanos si se

les presenta la oportunidad, debido a la degradación de sustratos

queratináceos presentes en la epidermis este tipo de hospederos. Los

resultados obtenidos de los perfiles enzimáticos amilolíticos, celulolíticos,

pectinolíticos y proteolíticos para cada una de las cepas evaluadas,

indistintamente de su procedencia de aislamiento (lesiones de animales,

humanas y plantas), pueden ser correlacionados con la posible capacidad

que tienen estas cepas de producir infección cruzada en diferentes

hospederos. Además dichas determinaciones sugirieron ser un posible

mecanismo de patogenicidad utilizado por los hongos con capacidad

multihospedero.

15

ABSTRACT

Recently the sort Fusarium has been recognized as a model of pathogenesis

multihost by its capacity to infect so much to plants as animals and human.

This capacity is associated to factors of virulence which determining the

potential and the magnitude of the infection. Inside these factors of virulence

associated to the capacity multihost fungi stand out the role of the enzymes

which allow to the fungi degrade constituent of the external protection barriers

of its host, allowing to the fungi to penetrate and to colonize tissue, causing

illness. The importance of this work resided in the determination of activities

amillolytics, celullolytics, lipolytics, pectinolytics and proteolytics, for each one

of the evaluated strains. Being not possible for purpose of this study the

determination of the activity lipolytic under the test conditions. The strains

isolated 205 and 208 of human lesions, showed the biggest activity enzymatic

amilolytics with respect to liberated concentration of glucose in g/L for the

days 2 and 4 of reading. In the activity enzymatic celullolytics the strains

isolated 202 and 155 of a human and animal lesion respectively, showed the

biggest activity with respect to liberated concentration of glucose in g/L for the

days 2 and 4 respectively. For the activity enzymatic pectinolytics, the strains

isolated 314 and 156 of a plant and animal lesion respectively, showed the

biggest activity with respect to liberated concentration of galacturonic acid in

g/L for the days 2 and 4 of reading respectively. The determination of the

activities amillolytics, celullolytics and pectinolytics suggest the possible

capacity of the isolated strains of animals and human lesions of degrading

plant substrates likewise it confirms the capacity of the isolated strains of

lesions of plants to degrade these substrates, constituent main of the plant

cell wall. For the protelytics activity the strains 210 followed by 111 and the

310 showed the biggest activity. The determination of this activity indicates

the possible capacity of the isolated of lesions animals and human of

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degrading protein plant substrates, being more important the possible

capacity of the isolated strains of plants to cause infection in animals and

human if they are presented the opportunity, due to the degradation of

substrates keratinaceous present in the skin of this type of host. The

obtained results of the profiles enzymatic amillolytics, celullolytics,

pectinolytics and proteolytics for each one of the evaluated strains, indistinctly

of their origin (injure of animals, humans and plants), can be correlated with

the possible capacity that this strains of producing crossed infection in

different host. This determinations also suggested to be a possible

mechanism of pathogenesis used by the fungi with capacity multihost.

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1. INTRODUCCIÓN

La epidermis es un ambiente natural para diferentes bacterias y algunos

hongos. Entre estos microorganismos se encuentran algunos patógenos

oportunistas que causan enfermedades cuando las defensas naturales del

hospedero son débiles.

Un grupo importante de microorganismos patógenos son los hongos. Entre

sus numerosos y variados factores de virulencia, en discusión, existe el papel

de las enzimas las cuales podrían ayudar a este grupo de microorganismos a

colonizar e infectar a animales, plantas y humanos.

Los hongos son una clase considerablemente versátil de organismos

comprendida principalmente por saprófitos que crecen sobre material

orgánico en descomposición. Un número relativamente pequeño de especies

de hongos ha desarrollado un estilo de vida parasitario, asociado con la

habilidad de reconocer y penetrar a un hospedero específico, aprovechando

sus nutrientes de reserva, superando las respuestas innatas de defensa del

hospedero para de esta forma causar enfermedad. La lista de organismos

que son atacados por los hongos abarca distintos grupos evolutivos de los

eucariotas. Entre los principales hospederos se encuentran las plantas,

insectos y mamíferos incluyendo humanos. Para causar enfermedad los

hongos patógenos tienen un arsenal de factores de virulencia, los cuales se

despliegan espacialmente y temporalmente determinando el potencial de

patogénesis básico y la magnitud de la infección, respectivamente (Ortoneda

et al., 2004).

Por otra parte, los hongos inocuos del ambiente, típicamente causan

enfermedad en hospederos susceptibles, después de estar expuestos. Los

hongos patógenos de animales y plantas adquiridos del ambiente

probablemente afrontan presiones de selección como las condiciones físicas,

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la competencia microbiana y la predación. Para algunos hongos patógenos

de animales o humanos los factores de virulencia aparecen por selecciones

de sobrevivencia ambiental ocasionando enfermedad en mamíferos más por

casualidad o por accidente (Casadevall, 2007).

Considerando que muchas enfermedades fúngicas emergentes reflejan la

interespecie de la enfermedad y el salto entre reinos, lo anterior sugiere que

el patógeno puede tener factores de virulencia específicos que le permiten

infectar a animales, humanos y plantas al mismo tiempo. Este hallazgo, si es

muy bien estudiado con el paso del tiempo podría ayudar a prever y

prepararse para futuras amenazas microbianas (Casadevall, 2007).

El género Fusarium comprende un amplio y diverso grupo de especies de

distribución mundial, frecuentemente aislados como saprófitos en aguas,

suelos y substratos orgánicos en descomposición (Sanabria et al., 2002). Tal

distribución de este género se le atribuye a su capacidad para crecer en

diferentes sustratos y a sus eficientes métodos de dispersión (Díaz de Castro

et al., 2007).

Muchas especies son importantes, como contaminantes en la industria de

alimentos, ya que durante su ciclo de vida producen micotoxinas. Como

patógenos de humanos se les responsabiliza de causar queratomicosis o

úlceras de la córnea, infecciones cutáneas, meningoencefalitis, onicomicosis,

tumores malignos, peritonitis y micosis superficiales (Bushelman, et al., 1995;

Sanabria et al., 2002).

Como fitopatógenos, las especies de este género infectan un gran número de

cultivos de importancia económica. La presencia de especies fitopatógenas

de Fusarium sp. en el suelo es uno de los principales impedimentos para la

siembra continua de los campos (Agrios, 2005; Sanabria et al., 2002).

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En numerosos trabajos se han descrito los diversos factores de virulencia de

los que disponen agentes infecciosos como Aspergillus niger (Coca, et al.,

2001; Roilides, et al., 2007), Fusarium oxysporum (Roncero et al., 2000;

Ortoneda et al., 2004) Fusarium solani (Bushelman et al., 1995) y

Scedesporium spp. (Roilides et al., 2007). También se han publicado

experiencias que demuestran el importante papel que desempeñan algunos

de estos factores, como las enzimas con actividad fosfolípidica y proteolítica,

en la patogénesis de las infecciones producidas por ellos (Echevarría et al.,

2002).

Estas enzimas tienen la capacidad de dañar la membrana celular de las

células del hospedero, al degradar los lípidos que la constituyen. La

producción o no de estas enzimas puede, entonces, ser un importante

determinante en la capacidad de los microorganismos en este caso de

hongos para producir infecciones invasoras en determinados grupos de

pacientes, como los inmunocomprometidos (Echevarría et al., 2002).

La participación de enzimas que digieren las barreras celulares en la

penetración de los tejidos animales, humanos y vegetales está respaldada

por cuantiosa evidencia circunstancial. Sin embargo, la extensión con que la

producción de dichas enzimas determina la capacidad invasora del patógeno

es dudosa todavía. Probablemente, aclarar este punto requiere de estudios

donde se puedan explicar las funciones específicas de estas enzimas como

su regulación, síntesis y secreción. Todavía no está demostrado que una

determinada enzima desempeñe un papel esencial en la penetración. Por el

contrario se cree que es posible que sean varias las enzimas que actúan

sinérgicamente en la degradación de las barreras de defensa de los

hospederos, y que la pérdida de una sola de las actividades enzimáticas no

determina un cambio significativo en la capacidad de invasión (Echevarría et

al., 2002).

20

Distintos autores han diseñado y publicado diferentes metodologías para

detectar la producción y liberación de enzimas en hongos filamentosos pero

la mayoría se lleva a cabo de forma cuantitativa y molecular.

Por otra parte las micosis que presentan agricultores causadas por

fitopatógenos principalmente se está convirtiendo en un problema de salud

ocupacional que al parecer ha sido subestimado (Spiewak, 1998). Estas

micosis a pesar de producir cambios desagradables en la piel, puede llevar a

una alergia secundaria que puede promover la invasión de bacterias y virus

en el cuerpo humano. Spiewak (1998) considera que una enfermedad es

profesional u ocupacional si el factor causante está presente en el medio

ambiente activo.

A pesar de que actualmente existen considerables avances tecnológicos,

existen muchos aspectos acerca de la patogénesis fúngica que permanecen

poco estudiados. Un asunto inquietante es la especificidad del hospedero.

Ciertamente existen hongos que causan enfermedades a una sola especie

de hospedero mientras que otros tienen un amplio rango de hospederos.

Dada la gran habilidad de este hongo para causar enfermedad tanto en

plantas como animales y humanos, en este trabajo se plantea resolver si es

posible que la capacidad enzimática amilolítica, celulolítica, lipolítica,

pectinolítica y proteolítica, pueda ser estudiada como un modelo fúngico de

mecanismo de virulencia. Y de esta forma hacer una aproximación acerca de

la relación que tienen los factores de virulencia enzimáticos con la capacidad

multihospedera de Fusarium.

21

2. MARCO TEÓRICO

2.1. Generalidades del género Fusarium

El género Fusarium es el agente causal del marchitamiento vascular,

enfermedad que afecta una gran variedad de cultivos (ajo, algodón, arveja,

banano, brócoli, calabacita, cebolla, chile, fresa, linaza, melón, ornamentales-

clavel, crisantemos, gladiolos, tulipanes, repollo, tomate, etc.)

económicamente importantes alrededor de todo el mundo (Ortoneda, et al.,

2004; Groenewald, 2006). Aunque su actividad como patógeno de plantas ha

sido bien estudiada, Fusarium es conocido actualmente como un patógeno

emergente de animales y humanos; haciendo de tal forma en el caso de los

humanos que se incremente el número de casos severos reportados

(Bushelman, et al., 1995). Fusarium actualmente representa el segundo

hongo más frecuente, causante de infección fúngica invasiva en pacientes

inmunocomprometidos, frecuentemente con resultados letales (Bushelman et

al., 1995; Ortoneda et al., 2004).

El gran número de especies y poblaciones no identificadas en este género se

debe al alto grado de variación en sus características morfológicas y

fisiológicas, y esto explica la capacidad que tiene Fusarium para colonizar

variados nichos ecológicos en distintas áreas geográficas (Díaz de Castro et

al., 2007)

2.1.1. Fusarium

Fusarium crece rápidamente en agar papa dextrosa a 250C, produciendo un

micelio algodonoso e incoloro al principio, pero conforme madura adquiere un

22

color crema o amarillo pálido y bajo ciertas condiciones adquiere una

tonalidad rosa pálido, rojo o púrpura (Díaz de Castro et al., 2007).

Este patógeno produce un micelio septado hialino que produce tres tipos

diferentes de esporas asexuales. Los microconidios son producidos en el

micelio aéreo solo o en cadenas, tiene de una a dos células y son las

esporas que el hongo produce con mayor frecuencia y abundancia en todas

las condiciones. Estas esporas son las que el hongo forma con más

frecuencia en el interior de los vasos de de las plantas infectadas, o en el

torrente sanguíneo en el caso de animales y humanos (Díaz de Castro et al.,

2007). Las macroconidias son esporas típicas de Fusarium, están

constituidas por 3 o 5 células, que se adelgazan gradualmente y se encorvan

hacia ambos extremos. Aparecen con gran frecuencia sobre la superficie de

plantas que han sido destruidas por el patógeno, estas macroconidias son

producidas en una estructura especializada, el esporodoquio, una masa de

monofiálides cortas que sostienen las macroconidias. Además pueden

producirse en el micelio aéreo ya sea en monofiálides o polifiálides. El último

tipo de espora son las clamidosporas, que están constituidas por una o dos

células, son esporas redondas de pared gruesa lisa o rugosa y contienen un

material lipídico que le permite al hongo sobrevivir en situaciones adversas.

Pueden estar solas, en pares, cadenas o grupos. Estos tres tipos de esporas

se forman en los cultivos del hongo y quizá también en el suelo, aunque cabe

decir que sólo las clamidosporas sobreviven en este último sustrato durante

más tiempo (Díaz de Castro et al., 2007).

Fusarium oxysporum junto a Fusarium solani y Fusarium verticillioides

(moniliforme), son los responsables prácticamente de todos los casos de

infecciones invasivas en animales y humanos así mismo producen lesiones

diseminadas como queratomicosis, úlceras y onicomicosis, además de ser

los principales patógenos de plantas (Pontón et al., 2000; Chade et al., 2003;

Ortoneda et al., 2004).

23

2.1.2. Fusarium oxysporum

Las colonias presentan un aspecto velloso en el centro y difuso en la

periferia, de crecimiento lento, 6 cm a los ocho días, inicialmente son de color

blanco y luego se tornan púrpura. Posee microconidias hialinas en forma oval

con una a dos células, en falsas cabezas, monofialides. Los conidióforos

pueden ser cortos, simples o ramificados. Las macroconidias se forman en

esporodoquios, generalmente de tres a cinco septos. Las clamidosporas son

terminales o intercalares, generalmente redondeadas (Sanabria et al., 2002,

Agrios, 2005;).

2.1.3. Fusarium solani

Se caracteriza por presentar colonias de color crema a durazno, con leves

tintes púrpura, de crecimiento rápido, de 9 cm a los ocho días de incubación.

Las macroconidias se forman abundantemente sobre microconidióforos

largos, en falsas cabezuelas hialinas, cilíndricas de una a dos células. Las

macroconidias se forman sobre conidióforos bien desarrollados, ramificados

o no ramificados, monofiálides, cilíndricas a falcadas es decir que forma una

curvatura semejante a la de la hoz, con células basales y apicales diferentes

a las de la conidia. Las clamidosporas van desde redondas hasta ovaladas,

de paredes lisas a levemente rugosas, generalmente en pares terminales o

intercaladas (Sanabria et al., 2002; Agrios, 2005;).

2.1.4. Fusarium verticillioides (moniliforme)

Las colonias son de crecimiento moderadamente rápido, de 8 cm a los ocho

días, de color blanco a durazno. Las microconidias son abundantes,

generalmente de una célula, de oval a ovoide, en largas cadenas o en falsas

cabezas. Los conidióforos son largos, no ramificados y ramificados,

24

monofialides y polifialides. Las macroconidias están presentes pero son

escasas, y varían levemente de su forma curva a casi rectas, de paredes

delgadas. Las clamidosporas están ausentes (Sanabria et al., 2002; Agrios,

2005;).

2.2. Clasificación taxonómica de Fusarium

Reino Fungi

Phylum Ascomycota

Clase Deuteromycete

Orden Hypocreales

Familia Hypocreaceae

Género Fusarium

Especies Fusarium oxysporum

Fusarium solani

Fusarium verticillioides

Clasificación taxonómica de Fusarium según Groenewald (2006) y Díaz de

Castro et al., (2007).

2.3. Patogénesis en animales, humanos y plantas

La patogenicidad está definida como la capacidad en este caso de un

microorganismo para causar daño en un hospedero. Por lo anterior un

microorganismo patógeno causa enfermedad sólo cuando el daño incurrido

en su hospedero es tal que afecta su estado de equilibrio (Casadevall y

Pirofski, 1999). Presuntuosamente, el daño causado al hospedero puede

25

ocurrir como consecuencia de la acción microbiana directa sobre los tejidos o

como consecuencia de la respuesta de defensa del microorganismo o ambos

(Casadevall y Pirofski, 1999).

Sin embargo una diferencia importante entre la patogénesis de vegetales y

animales es que estos últimos tienen sistemas inmunológicos adaptables que

pueden responder ante antígenos fúngicos en caso de infecciones. Aunque

el sistema inmunológico puede mediar la protección también puede producir

respuestas que aporten al aumento de la enfermedad (MacDonald et al.,

2002).

Un factor de virulencia se define como un componente microbiano que

perjudica al hospedero. Lo anterior abarca todas las sustancias microbianas

que son directamente tóxicas al hospedero como por ejemplo los antígenos

los cuales son responsables del daño inmunológico (Pirofski, 2001).

Los factores de virulencia son de gran interés en las patogénesis microbianas

porque estos son a menudo el objetivo de la respuesta inmune que

neutralizan la acción de factores de virulencia y además ofrecen protección

contra futuros ataques (Pirofski, 2001).

Al respecto de los factores de virulencia de hongos patógenos de animales

es importante notar la enorme diversidad de vida animal que es susceptible a

enfermedades fúngicas. Aunque los hongos son los principales patógenos

tanto de vertebrados como de invertebrados (Retallick et al., 2004). De modo

interesante Casadevall (2005) reportó que especialmente los mamíferos

incluyendo al hombre son relativamente más resistentes a enfermedades

fúngicas en contraste con enfermedades bacterianas o parásitas.

La asociación entre una alta temperatura y una sensibilidad relativamente

baja a enfermedades fúngicas puede ser una respuesta a la cual los

mamíferos incluyendo el hombre son un poco más resistentes a las

26

patologías fúngicas. Lo anterior parte del hecho que la mayoría de los

hongos tienen como temperatura óptima de crecimiento aproximadamente

entre 220C-280C; además si se compara su tasa de crecimiento con la de las

bacterias la de los hongos es mucho más baja (Carlile, 1994), lo que sugiere

que la elevada temperatura de los animales proporciona una barrera de

protección térmica que excluye la posibilidad que la mayor parte de las

especies fúngicas sean patógenas para esta clase de hospederos

(Casadevall 2005).

Entre los hongos patógenos de animales, los más estudiados han sido

aquellos que causan enfermedades a humanos. Aunque la experiencia

humana es seguramente un muy pequeño subconjunto más, de las

interacciones entre animales y hongos (hospedero-patógeno) esto

proporciona un punto de partida y comparación en la recolección de

información (Casadevall, 2007).

En contraste con las enfermedades bacterianas, parásitas y virales, las

enfermedades fúngicas son esporádicas y se observan principalmente en

individuos con una deficiencia inmune, una alteración socio-ambiental, o una

exposición alta y desproporcional a un inóculo (enfermedad ocupacional)

(Spiewak, 1998; Escobar y Carmona–Fonseca, 2003; Casadevall, 2007).

Aunque anteriormente se mencionó que la temperatura dérmica de los

animales endotérmicos (sangre caliente) y humanos era una barrera de

protección contra los hongos patógenos, la termotolerancia a las

temperaturas de sus hospederos mamíferos parece no ser una exigencia

crítica aplicable a hongos que causan enfermedad en plantas o en animales

ectotérmicos (de sangre fría) (Casadevall, 2005).

Desde que las plantas como los animales tienen poderosos e innatos

mecanismos de inmunidad, es razonable pensar que estos dos grupos de

especies poseen la capacidad de soportar o resistir los estragos de los

27

sistemas inmunológicos innatos, que incluyen dependiendo el hospedero,

péptidos microbicidas, rupturas oxidativas, células fagocitarias, y privación

nutritiva (Casadevall, 2005).

De modo interesante, el análisis de los mecanismos de virulencia de hongos

patógenos de animales, humanos y plantas ha mostrado que estos

microorganismos tienen el mecanismo que puede abrir la respuesta de

adaptabilidad inmune (Casadevall, 2007).

A pesar de la precisión evidente con la cual ciertos mecanismos de virulencia

en hongos patógenos de animales y humanos incapacita la respuesta

inmune del hospedero, según Casadevall (2007) es improbable que estos

determinantes de virulencia surgieran con el objetivo exclusivo de invadir solo

hospederos mamíferos ya que no requieren de manera imprescindible del

paso al hospedero para poder sobrevivir o replicarse.

Los hongos fitopatógenos aunque no tienen que competir con un sistema

inmunológico tan desmedido como el de los animales o humanos, debe

poseer, en cambio, poderosos mecanismos físicos y enzimáticos para

perforar la pared celular de la planta (Casadevall, 2007). Aunque en el caso

de las dermatitis o queratinolitis causada en animales y humanos el hongo

patógeno también requiere de la producción de un gran conjunto de enzimas

que le permitan atravesar aquellas barreras físicas.

Tanto los patógenos de animales y humanos como los de plantas residen en

los suelos y en ambientes extremos donde ellos deben competir con otros

microorganismos, y sobrevivir a las extremas condiciones climáticas además

de sobrevivir a la depredación ocasionada por organismos como las amebas

o pequeños animales como los nematodos (Klein, 2003). Según Steenbergen

(2001) para varios hongos patógenos de humanos ha sido demostrado que

los factores de virulencia necesarios para ocasionar patogenicidad en

animales y humanos son también importantes para sobrevivir a la

28

depredación por amebas o nematodos. Estas asociaciones han sugerido que

algunos factores de virulencia de estos hongos fueron al principio

seleccionados como mecanismos para sobrevivir contra depredadores

(Casadevall et al., 2003).

Muchos de los factores de virulencia identificados para los hongos patógenos

de humanos parecen ser determinantes en el sentido que ellos permiten la

supervivencia en el ambiente y el establecimiento del microorganismo en el

hospedero mamífero. Es probable que este principio pueda extenderse

también a los hongos fitopatógenos por lo cual los factores de virulencia para

estos también funcionarían con el propósito de proteger la célula fúngica de

los rigores y los peligros del ambiente y del suelo (Casadevall, 2006).

Para que un microorganismo sea capaz de causar virulencia en un

hospedero debe tener los factores de virulencia apropiados. En esta

formulación la capacidad que tenga el hongo para causar patogenicidad

puede ser un proceso completamente al azar que requiere la acumulación

fortuita de factores de virulencia apropiados para permitir que el hongo pueda

establecerse en un hospedero susceptible. De ahí, que cada microorganismo

tiene un conjunto de rasgos que pueden servir como factores de virulencia en

algunos hospederos (Casadevall, 2006).

Actualmente se desconoce hasta qué punto están congregados los

mecanismos de infección en estos grupos de hospederos. Una de las

principales causas de esta falta de conocimiento es la ausencia de modelos

fúngicos que permitan el análisis simultáneo de la virulencia en ambas clases

de organismos. Estudios previos en bacterias han demostrado la gran utilidad

de disponer de una cepa patógena capaz de infectar tanto plantas como

animales. La principal ventaja de este tipo de modelo (conocido como modelo

de patogénesis multihospedero), es poder utilizar los mismos mutantes en

29

múltiples sistemas de infección, sin tener que recurrir a dos especies

patógenas diferentes (Di Prieto y Roncero, 2005).

Por lo anterior Di Prieto y Roncero (2005) aplicaron un abordaje similar al

estudio de los patógenos fúngicos utilizando a F. oxysporum ya que reúne,

en principio, todas las características necesarias para ello. Además de ser el

causante de la fusariosis vascular en plantas, F. oxysporum es un emergente

patógeno oportunista de humanos. Junto con F. solani y F. verticillioides, F.

oxysporum es responsable de prácticamente todos los casos clínicos de

fusariosis diseminada en humanos (Ortoneda et al., 2004). El creciente

interés de F. oxysporum, F. solani y F. verticillioides como patógenos

animales y humanos no se debe solamente al incremento en el número de

infecciones, muchas de las cuales conllevan a un fatal desenlace, sino

también a su resistencia generalizada a los antifúngicos clínicos actualmente

disponibles en el mercado (Guarro et al., 1999).

En el ser humano, Fusarium puede causar enfermedad oportunista localizada

o generalizada. En la enfermedad localizada las puertas de entrada pueden

ser la piel, las uñas, la vía aérea o los ojos en que él número de

microorganismos y la profundidad de la penetración determinan el curso de la

infección. La inoculación generalmente es traumática con material vegetal;

además, en el caso de los ojos, la infección se puede adquirir por el uso

inadecuado de soluciones oftálmicas y lentes de contacto que fácilmente se

contaminan con esporas de hongo (Mayayo, 2004; Díaz de Castro et al.,

2007).

La enfermedad oportunista generalizada se inicia frecuentemente con la

colonización de heridas de la piel, como sitios de inserción de catéteres,

quemaduras, heridas quirúrgicas o ulceraciones. Igualmente puede

comenzar por los senos paranasales. Cuando el huésped tiene una

respuesta inmune defectuosa, la reacción inflamatoria en el sitio inicial de la

30

infección es limitada y el hongo crece y se disemina. El crecimiento de las

hifas puede resultar en lesiones granulomatosas y alcanzar la luz de los

vasos sanguíneos, producir émbolos infecciosos con necrosis de los tejidos o

formación de abscesos (Díaz de Castro et al., 2007).

En la interacción del sistema inmune con Fusarium, los granulocitos y

macrófagos son la base de la respuesta de defensa. Los granulocitos inhiben

el crecimiento de las hifas, mientras que los macrófagos inhiben, además, la

germinación de los conidios. La infección oportunista diseminada es más

frecuente en pacientes con enfermedades inmune comprometedoras. Es así

como la particular susceptibilidad del hospedero, es el factor determinante

para el establecimiento de la infección, pero es claro también que Fusarium

posee varias características celulares y moleculares como la producción de

toxinas, enzimas y factores de adherencia que le confieren diferentes grados

de virulencia (Díaz de Castro et al., 2007)

2.4. Mecanismos de patogénesis

Se cree que los hongos patógenos perjudican las células de su hospedero

causando enfermedad mediante la acción individual o combinada de cuatro

mecanismos fundamentales de patogénesis (Llácer et al., 2000):

La producción y liberación de enzimas que degradan barreras

celulares.

La producción y liberación de substancias (toxinas) que interfieren con

el metabolismo o que afectan la estructura normal del citoplasma

(animal y humano) y protoplasma (plantas).

La producción y liberación de substancias que interfieren con el control

normal del crecimiento y desarrollo (compuestos hormonales, anti

hormonales, u otros).

31

La interferencia con los movimientos normales del agua, nutrientes y

metabolitos.

2.5. Desarrollo de la enfermedad

La infección es el proceso mediante el cual los patógenos entran en contacto

con las células o tejidos susceptibles de un hospedero y en el que se

producen nutrientes suficientes para ambos. Durante la infección, los

patógenos se desarrollan o reproducen dentro de los tejidos de las plantas,

animales o humanos e invaden a éstos en forma variable. De esta manera, la

invasión del patógeno sobre los tejidos, el crecimiento y reproducción

(colonización) en los tejidos infectados constituyen dos fases concurrentes en

el desarrollo de una enfermedad dentro del proceso infectivo (Llácer et al.,

2000).

Durante la infección en plantas, el fitopatógeno obtiene sus nutrientes a partir

de células vivas que con frecuencia no son destruidas, otros destruyen a las

células y utilizan sus contenidos conforme las invaden, y otros matan a las

células y desorganizan a los tejidos que se encuentran alrededor de ellos.

Durante la infección, los patógenos liberan en el hospedero ciertas

sustancias biológicamente activas (por ejemplo, enzimas, toxinas y

reguladores del crecimiento) que afectan la integridad estructural de las

células del hospedero o bien sus procesos fisiológicos. En respuesta a los

patógenos, las plantas reaccionan con una gran variedad de mecanismos de

defensa que dan como resultado diferentes grados de protección de la planta

ante el patógeno (Agrios, 2005; Llácer et al., 2000). Aunque las infecciones

efectivas dan como resultado la formación de zonas necróticas o de zonas

decoloradas y malformadas (Ortoneda et. al., 2004).

En el caso de los animales y humanos el desarrollo de la enfermedad

comienza principalmente por estructuras asociadas al contagio, como los

32

conidios, que tienen la capacidad de soportar las altas temperaturas, que se

presentan si están entre escamas de piel o restos de cabellos. Una vez los

conidios germinan y empiezan a desarrollar hifas, estas se adhieren a los

tejidos queratináceos y tratan de penetrar las partes más profundas de la

piel, por medio de la liberación de enzimas, las cuales se han asociado con el

desarrollo de signos y síntomas de la enfermedad fúngica (Pérez, 2005).

Entre las enzimas que juegan un papel importante en el proceso de

penetración están las proteasas, las cuales producen alteración del

citoesqueleto por lisis de las membranas celulares. Otras enzimas que

juegan un papel importante son las lipasas las cuales tiene la capacidad de

desdoblar ácidos grasos en presencia de calcio (Pérez, 2005).

2.6. Penetración del patógeno

Los hongos invaden los tejidos vegetales mediante un proceso activo de

penetración, que puede tener lugar:

A través de heridas naturales o artificiales.

Directamente a través de la superficie intacta.

A través de aberturas naturales.

2.6.1. Penetración a través de heridas

Existe un número apreciable de especies fúngicas que penetran a sus

hospederos a través de heridas. Entre ellas son de destacar las que invaden

tejidos lignificados o celulolíticos en el caso de las plantas (Llácer et al.,

2000). Las heridas pueden ser causadas por procesos naturales (caída de

hojas, formación de raíces secundarias, etc.), prácticas agrícolas (poda,

recolección, etc.). Las heridas naturales o artificiales pueden dar lugar a la

33

exudación de nutrientes y a la exposición directa del xilema, hacia el cual son

absorbidos los propágulos fúngicos (Llácer et al., 2000).

Por otra parte la infección por Fusarium en animales y humanos, puede

acontecer a través de una herida o una lesión en la piel causada por

catéteres contaminados, procesos de trasplantes o quemaduras también

que permitirían no solo la fácil penetración de las hifas sino también la

diseminación de las microconidias producidas por el patógeno (Pontón et al.,

2000).

2.6.2. Penetración a través de la superficie intacta

La mayoría de los hongos patógenos pueden penetrar directamente a través

de la superficie intacta de su hospedero. En algunos casos particularmente,

la penetración tiene lugar por medio del ápice del tubo germinativo o de la

hifa, que invaden directamente a través de las células epidérmicas. Sin

embargo, la mayor parte de los hongos desarrollan estructuras

especializadas denominadas apresorios para penetrar tejidos intactos (Llácer

et al., 2000).

El apresorio es generalmente el ápice del tubo germinativo morfológicamente

modificado y engrosado, que proporciona al patógeno la capacidad de

adherencia a la superficie del huésped en preparación para la invasión

subsecuente. Desde la base del apresorio en contacto con la superficie del

huésped se diferencia una hifa especializada llamada hifa de penetración la

cual crece en el interior del tejido a infectar El apresorio presenta una alta

producción de enzimas líticas y glicerol para aumentan la presión, lo que

permite penetración de los tejidos de la cutícula por actividad química y

física. (Llácer et al., 2000).

34

2.6.3. A través de aberturas naturales

Considerando el pequeño tamaño de las microconidias de Fusarium, las vías

respiratorias a menudo se presume, pueden ser la puerta de entrada inicial

de la enfermedad en animales y humanos. Luego de que se presenta la

entrada de las microconidias al organismo, la infección puede desarrollarse

principalmente en los pulmones seguida de la piel o la sangre (Pontón et al.,

2000).

2.7. Degradación enzimática de sustancias contendidas en las barreras

celulares

Las enzimas son grandes moléculas proteicas que catalizan todas las

reacciones interrelacionadas de una célula viva. Para cada tipo de reacción

química que tiene lugar en una célula hay una enzima distinta que cataliza

esa reacción (Agrios, 2005).

En general, las enzimas que degradan las barreras celulares son

consideradas porque juegan un papel importante en la patogénesis animal,

humana y vegetal causada por hongos, debido a que estas enzimas facilitan

la penetración y colonización tisular, para dar paso a continuación a los

determinantes de virulencia los cuales van a ser responsables del desarrollo

de los síntomas una vez inicie el crecimiento del hongo dentro del hospedero

(Agrios, 2005).

La mayoría de los fitopatógenos secretan enzimas durante toda su existencia

al entrar en contacto con un sustrato. Habitualmente, el primer contacto que

se establece entre los patógenos y sus hospederos se lleva a cabo en la

superficie. Dichas superficies pueden estar constituidas fundamentalmente

de celulosa (que es la unidad estructural de la pared de las células

35

epidérmicas de la planta) o de lípidos y proteínas en el caso de las

membrana celular (Agrios, 2005, Echevarría, 2002).

Las paredes de las células epidérmicas suelen contener también proteínas y

lignina. La penetración de los patógenos en los tejidos parenquimatosos y la

desintegración de éstos se efectúa mediante la degradación de sus partes

celulares (que constan de celulosa, pectinas y hemicelulosas) y de la lámina

media, constituida en su mayor parte por pectinas. La desintegración total de

los tejidos de una planta incluye, además, la degradación de los polisacáridos

de reserva como los gránulos de almidón (Agrios, 2005).

En el caso de las patogénesis en plantas se cree que las enzimas

degradativas de la pared parecen ser liberadas en secuencia, comenzando

por poligalacturonasas degradativas de la lámina media, seguidas por

celulasas de diversa naturaleza según las especies fúngicas (Llácer et al.,

2000). Así, varias enzimas, pueden actuar sinérgicamente durante la

degradación de la cutícula y la pared celular vegetal, por lo que la falta de

actividad de una de ellas puede no originar cambios acusados en el proceso

de infección y colonización.

En cuanto a las células animales y humanas estás están rodeadas de una

membrana celular (membrana plasmática) que por lo general está compuesta

de una bicapa de moléculas de fosfolípidos en la que las moléculas proteicas

están inmersas. Las cadenas hidrocarbonadas se unen a las proteínas de

membrana para formar glucoproteínas o a lípidos de membranas para formar

glucolípidos. Por lo anterior estas moléculas son los blancos preferidos de un

conjunto de enzimas conocidas como fosfolípasas y proteasas capaces de

penetrar y destruir las membranas celulares pertenecientes al hospedero (Hill

et al., 2006).

El ataque de la membrana por estas enzimas (proteasas y fosfolipasas)

ocasiona aberturas en estas membranas, causando la desorganización de

36

todas las funciones celulares y favoreciendo así la invasión del tejido

(Coutinho y Paula, 2000).

Las observaciones realizadas por Llácer et al. (2000), en los tejidos

afectados durante la infección y colonización por algunas micosis, indican

que las enzimas que degradan las barreras celulares desempeñan un papel

importante en la penetración y colonización fúngica de los tejidos, sean de

animales, de humanos o de plantas. Sin embargo, la extensión con que

dichas enzimas determinan individualmente la patogenicidad parece no estar

establecida de manera definitiva (Llácer et al., 2000).

2.7.1. Actividad amilolítica

El almidón es el principal polisacárido de reserva que predomina en las

plantas y comúnmente se presenta en gránulos con una típica estructura en

capas. Es movilizado hacía los tallos, bulbos, hojas y semillas y es

sintetizado en los cloroplastos y en órganos no fotosintéticos como los

amiloplastos. El almidón es un polímero de glucosa y esta compuesto de dos

formas: amilosa, una molécula lineal esencial, y amilopectina, una gran

molécula ramificada de varias cadenas cortas (Frioni, 1999).

La mayoría de los patógenos utilizan el almidón, y otras reservas de

polisacáridos, en sus actividades metabólicas. La degradación del almidón es

llevada a cabo por la acción de enzimas llamadas amilasas, las cuales al

actuar producen diversos productos como dextrinas, maltosa o glucosa,

siendo esta última el resultado completo de la hidrólisis, la cual finalmente es

usada por los patógenos directamente (Agrios, 2005).

Las amilasas se dividen en dos categorías las endoamilasas y las

exoamilasas. Las endoamilasas como la α-amilasa y α-1,6 glucosidasa

catalizan la hidrólisis al interior de la molécula en forma aleatoria, atacando

los enlaces α-1,4 glucosídicos y α-1,6 glucosídicos (ramificación), esta acción

37

causa la formación de oligasacáridos y dextrinas (Uhlig, 1998; Gupta et al.,

2003).

Las exoamilasas como la β-amilasa y la amiloglucosidasa actúan a partir del

extremo libre no reductor catalizando la hidrólisis al exterior de la molécula

cada dos o cada una unidad de glucosa, produciendo maltosa y glucosa

respectivamente. De esta forma la acción de cada una de las enzimas

mencionadas anteriormente, logra una degradación completa del almidón,

así mismo su acción es inducible y su producción depende del tipo del

almidón empleado (Uhlig, 1998; Gupta et al., 2003).

La enzima amilolítica con mayor distribución entre los microorganismos es la

α-amilasa, la cual tiene mayor importancia industrial entre la familia de las

amilasas. (Gupta et al., 2003).

2.7.2. Actividad celulolítica

La celulosa es también un polisacárido, compuesto por cadenas de

moléculas de glucosa. Las cadenas de glucosa se mantienen unidas entre sí

a través de un gran número de puentes de hidrógeno. En todas las plantas

superiores, la celulosa constituye el armazón de las paredes celulares y se le

encuentra a manera de microfíbrillas. El contenido de celulosa en los tejidos

varía desde casi un 12% en los tejidos no leñosos de las gramíneas hasta

alrededor del 50% en los tejidos leñosos maduros, e incluso hasta más de un

90% en las fibras del algodón. Los espacios que se forman entre las

microfibrillas y las núcelas o cadenas de celulosa dentro de las microfibrillas,

pueden llenarse con pectinas y hemicelulosa y probablemente también con

una cierta cantidad de lignina durante la maduración (Agrios, 2005; Bayer et

al., 2006).

La degradación enzimática de la celulosa da como resultado final la

producción de moléculas de glucosa. La hidrólisis se lleva a cabo mediante

38

una serie de reacciones enzimáticas catalizadas por varias celulasas. La

endo-β-1,4-glucanasa ataca los enlaces β-1,4, en las regiones amorfas

internas de la macromolécula dando como resultado largos fragmentos

solubles de oligosacáridos. La exo-β-1,4-glucanasa separa el disacárido

celobiosa de los extremos de la macromolécula, después son atacadas por

un tercer grupo de celulasas las β-glucosidasas las cuales hidrolizan la

celobiosa hasta glucosa (Christakopoulos et al., 1995).

Se ha demostrado que las enzimas que degradan a la celulosa (celulasas)

son producidas por varios hongos fitopatógenos. Los hongos saprofitos, en

particular ciertos grupos de basidiomicetos, causan la degradación de la

mayor parte de la celulosa descompuesta en la naturaleza. Sin embargo, en

los tejidos vegetales vivos, las enzimas celulolíticas que secretan los hongos

patógenos tienen una importancia en el ablandamiento y desintegración de la

pared celular y, además permiten que el patógeno penetre y se propague en

los tejidos del hospedero, causando la desintegración de la pared celular, lo

cual facilita el desarrollo de la enfermedad. Además, las enzimas celulolíticas

participan de manera indirecta en el desarrollo de las enfermedades, al

liberar de las cadenas de celulosa, azúcares solubles que sirven de alimento

para el patógeno y, en las enfermedades vasculares, al liberar en el

corrientes vasculares grandes moléculas de celulosa que dificultan el

movimiento normal del agua en la planta (Agrios, 2005).

2.7.3. Actividad lipolítica

Varios tipos de lípidos están presentes en las paredes celulares de plantas

aunque en menor proporción, en lo que respecta a los fosfolípidos y

glicolípidos, los cuales junto con las proteínas son los constituyentes

estructurales de todas las membranas celulares de animales y humanos.

Las grasas y los aceites se encuentran en muchas células, especialmente en

el caso de las plantas en las semillas donde estas funcionan como fuente de

39

almacenamiento de energía. La característica común de todos los lípidos es

que están compuestos de ácidos grasos los cuales pueden estar saturados o

insaturados (Agrios, 2005).

Algunos hongos producen extracelularmente lipasas y fosfolípasas las cuales

hidrolizan lípidos y fosfolípidos a glicerol y ácidos grasos que luego pueden

ser asimilados por el hongo (Stehr et al., 2003).

Carlile et al. (1994) sugiere que la actividad fosfolipasa está implicada en la

patogénesis de algunos hongos, debido a que esta actividad permite la

degradación de las membranas plasmáticas de células hospederas, por lo

anterior se ha encontrado que esta actividad puede ser un importante factor

de virulencia en animales y humanos.

Debido a la β-oxidación de los ácidos grasos, es de suponer que la entrada

de estos al ciclo de los ácidos tricarboxilicos permite que los hongos usen los

intermediarios del ciclo para que actúen como fuentes de carbono. Además

estos ácidos orgánicos proporcionan sales, como potasio, sodio o amonio,

que evitan que el medio se acidifique (Carlile et al., 1994).

Entre los efectos más importantes que causan estas lipasas o fosfolipasas,

está la destrucción de la matriz fosfolípidica de las membranas celulares del

músculo esquelético del hospedero, lo que expone el interior de las células y

permite la desorganización de las proteínas de membrana y otros

componentes de la células (Carlile et al., 1994).

Las fosfolípasas extracelulares facilitan la habilidad del patógeno para

lesionar, agredir e invadir al hospedero. Además las fosfolípasas pueden

remover los antígenos presentes en la superficie de las células, así mismo

estas enzimas contribuyen a la virulencia debido a que tienen la capacidad

de lisar las células del hospedero o cambiar las características superficiales

40

de las células de este último, con el fin de que la adhesión y penetración

sean facilitadas (Ibrahim et al., 1995).

Aunque todavía no es muy claro cómo actúan exactamente las fosfolípasas

como factores de virulencia de los hongos patógenos, lo que sí es claro es

que estas enzimas ayudan en la penetración de las barreras físicas del

hospedero, las cuales son ricas en fosfolípidos. Las fosfolípasas tienen

actividad extracelularmente (reduciendo la tensión superficial de los tejidos)

como intracelularmente (la interrupción de los compartimentos intracelulares

de células fagocitarias) (Stehr et al., 2003).

2.7.4. Actividad pectinolítica

La pectina, presente en tejidos intercelulares de plantas jóvenes y frutas, está

constituida principalmente de una mezcla de ácido poligalacturónico con

ramificaciones de muchas azúcares. Está presente en las paredes celulares

precisamente en la mitad de la lámina.

La pectina existe en numerosas formas y es degradada por enzimas como

las protopectinasas que degradan la protopectina dando como resultado una

pectina soluble altamente polimerizada; las depolimerasas catalizan la

hidrólisis del enlace α-1,4-glucosídico permitiendo el rompimiento de las

cadenas de ácido galacturónico produciendo oligómeros o monómeros de

ácido galacturónico. Dentro de este grupo se encuentran las

poligalacturonasas las cuales han sido más estudiadas dentro de la familia

de las enzimas pectinolíticas. Las pectinestearasas catalizan la des-

esterificación de la pectina, por la eliminación de los esteres y metanol y por

último están las pectinliasas las cuales hidrolizan las cadenas de ácido

galacturónico por transferencia de protones (transeliminación) (Carrillo, 2003;

Agrios, 2005; Jayani et al., 2005).

41

Se cree que todas estas enzimas juegan un rol importante en la patogénesis

en plantas producidas por algunos hongos. Estas enzimas son las

responsables de la maceración tisular debido a la degradación de pectinas

encontradas en medio de la lámina, causando indirectamente muerte celular

(Agrios, 2005).

2.7.5. Actividad proteolítica

Las paredes y membranas celulares contienen diferentes e innumerables

proteínas, las cuales juegan diversos roles como catalizadores de reacciones

celulares (enzimas) o como material estructural (en membranas y paredes

celulares) (Agrios, 2005).

Los aminoácidos, junto con las proteínas, son usualmente considerados

principalmente como fuentes de nitrógeno, aunque también pueden actuar

como única fuente de carbono para algunos hongos. La mayoría de los

hongos son capaces de asimilar un gran rango de aminoácidos, aminas y

amidas. Un constituyente común en los medios de cultivo para la detección

de proteasas es la caseína, la cual al ser hidrolizada da como resultado todos

los aminoácidos comunes, exceptuando el triptófano que es destruido

durante la hidrólisis (Carlile et al., 1994).

Todos los patógenos parecen ser capaces de degradar muchos tipos de

proteínas moleculares. Las enzimas involucradas en la degradación de

proteínas son similares a aquellas encontradas en plantas o animales las

cuales son llamadas proteasas o proteínasas u ocasionalmente peptidasas.

Las proteasas excretadas por los microorganismos producen aminoácidos y

oligopéptidos al hidrolizar los enlaces peptídicos. Los péptidos son

hidrolizados por las exopeptidasas y las endopeptidasas. Las exopeptidasas

se dividen en dos grupos, las que comienzan su acción por el enlace

peptídico adyacente al grupo amino terminal y las que lo hacen por el

42

cercano al carboxilo terminal. Las otras hidrolizan los enlaces del interior de

la cadena y son muy específicas (Castillo, 2003).

Considerando la gran importancia de las proteínas como constituyentes de

membranas celulares (animales y humanos) y componentes estructurales de

las paredes celulares de las plantas (extensinas) la degradación de un gran

número de proteínas por enzimas proteolíticas secretadas por patógenos

puede afectar profundamente la organización y función de un gran número

de células (Roncero et al., 2000; Juge, 2006).

La naturaleza y el rango de tales efectos no ha sido muy investigado hasta

ahora por lo anterior el papel que desempeñan en la infección y el desarrollo

de la enfermedad no es muy conocido (Pekkarinen et al., 2000).

43

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

El hongo patógeno Fusarium para poder infectar debe penetrar y degradar

las barreras constitutivas de su hospedero, la importancia de este trabajo es

determinar si este hongo que ha sido denominado recientemente como

multihospedero tiene la capacidad enzimática o las enzimas necesarias

hablando en términos de factores o mecanismos de virulencia para de esta

forma causar infección.

Por lo anterior se pretende determinar si enzimas como las amilasas,

celulasas, lipasas, pectinasas y proteasas están presentes en cada una de

las cepas de Fusarium aisladas de lesiones de animales, humanos y plantas

para correlacionarlo así con su capacidad de producir patogénesis en

diferentes hospederos.

44

4. JUSTIFICACIÓN

Un gran número de especies de hongos se caracteriza por tener la habilidad

de infectar y causar enfermedad en organismos vivientes. Cerca de 10.000

especies de hongos son patógenos conocidos de plantas, considerando que

se han reportado aproximadamente 400 especies patógenas de mamíferos

(Prados et al., 2006). Tanto los patógenos de plantas como los de mamíferos

han desarrollado mecanismos de virulencia que les permite detectar la

presencia del hospedero, adherirse a su superficie, penetrar debajo de los

tejidos e interferir con las funciones celulares del hospedero causando de

esta forma la enfermedad (Prados et al., 2006).

El hongo saprófito Fusarium es el agente causal del marchitamiento vascular

de las plantas, enfermedad que provoca importantes pérdidas en una gran

variedad de cultivos. Fusarium a su vez también está emergiendo como

patógeno de animales y humanos, y ha aumentado el número de casos en

pacientes inmunocomprometidos, frecuentemente con resultados letales.

Debido a esto y a su extraordinario rango de hospederos (animales,

humanos y plantas), Fusarium ha sido usado recientemente como un modelo

fúngico patógeno multihospedero permitiendo estudios acerca de los factores

de virulencia asociados a la capacidad de un agente patógeno de infectar

diferentes hospederos.

Entre los factores de virulencia postulados se encuentran la liberación de

toxinas, producción de enzimas y adherencia a sustratos. Sin embargo

algunos autores creen tener evidencia definitiva de que esta reciente

capacidad de ser patógeno de animales y humanos está asociada al factor

de producir enzimas, especialmente proteasas y fosfolipasas. Sin embargo el

rol que juegan estas u otras enzimas en la patogénesis humana y animal

causada por Fusarium no ha sido determinada (Roilides et al., 2007).

45

Debido a lo anterior, es de suponer que estas enzimas líticas son un

mecanismo de virulencia del hongo, que permite por medio de la degradación

de constituyentes importantes de las barreras de protección externa de los

hospederos, la penetración y la colonización de tejidos por parte del

patógeno dentro del hospedero.

Por lo anterior surgió la necesidad de determinar perfiles enzimáticos

amilolíticos, celulolíticos, lipolíticos, pectinolíticos, proteolíticos en cada una

de las 32 cepas evaluadas del género Fusarium indistintamente de su

procedencia, lo cual no solo confirmaría la capacidad multihospedero del

género, sino que además indicaría que dichas actividades enzimáticas son

uno de tantos mecanismos de virulencia asociado a la capacidad

multihospedero de Fusarium.

46

5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo General

Determinar perfiles enzimáticos amilolíticos, celulolíticos, lipolíticos,

pectinolíticos y proteolíticos de cepas de Fusarium procedentes de animales,

humanos y plantas.

5.2. Objetivos Específicos

Determinar la actividad amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y

proteolítica de cada una de las 32 cepas, aisladas de animales,

humanos y plantas a través de pruebas enzimáticas cualitativas.

Determinar la actividad amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y

proteolítica de cada una de las 32 cepas, aisladas de animales,

humanos y plantas a través de pruebas enzimáticas cuantitativas.

47

6. MATERIALES Y MÉTODOS

El presente trabajo de grado se realizó en las instalaciones del Laboratorio

de Biotecnología Aplicada de la Facultad de Ciencias de la Pontificia

Universidad Javeriana.

Este trabajo hace parte del proyecto Caracterización patogénica de cepas de

Fusarium oxysporum y F. solani, aisladas de lesiones en plantas, animales y

humanos, el cual tiene como objetivo general evaluar la capacidad de los

aislamientos de Fusarium oxysporum y F. solani de infectar varios

hospederos y caracterizarlos enzimática y molecularmente. Este proyecto

está financiado por la Vicerrectoría Académica de la Pontificia Universidad

Javeriana

6.1. Microorganismos y medio de cultivo

Las cepas que se utilizaron en este estudio, pertenecientes al género

Fusarium, fueron aisladas de lesiones de animales, humanos y plantas

(Tabla 1). Estas cepas las proporcionó el Cepario del Laboratorio de

Micología de la Pontificia Universidad Javeriana, conservadas en tubos de

16*150 con agua destilada estéril, en los cuales se depositaron cuadros de

agar con el hongo crecido. Estas cepas fueron aisladas y seleccionadas por

trabajos de grados previos (Camacho y Gil, 2008).

Tabla 1. Cepas codificadas según su procedencia.

Procedencia Codificación Cepas

Animales 1 108,111,121,131,155,156,159,160,161,162

Humanos 2 201,202,203,204,205,206,207,208,209,210

Plantas 3 302,303,305,308,309,310,311,312,313,314,315,317

48

La recuperación de las cepas se realizó a partir de cuadros de agar con el

hongo crecido sembradas en medio Agar Papa Dextrosa (PDA) e incubadas

a 300C durante 10 días.

6.2. Inducción del preinóculo

A partir de las cepas reconstituidas, se tomaron discos de agar con el hongo

crecido y se sembraron en cajas de petri con agar almidón, celulosa, leche,

pectina y yema de huevo (Anexo 1) y se incubaron a 300C durante 8 días. La

inducción se realizó con el fin de adaptar las cepas al medio y de esta forma

inducir la actividad enzimática.

6.3. Pruebas de caracterización cualitativa

A partir de los cultivos en caja, en los respectivos medios, se tomaron discos

de agar con el hongo crecido y se sembraron por triplicado en cajas de petri

con agar almidón, celulosa, leche, pectina y yema de huevo (Anexo 1) y se

incubaron durante 6 días a una temperatura de 300C. Se hicieron lecturas,

por medio de medición de tamaño de halos, de cada una de las actividades

enzimáticas a evaluar a los días 2, 4 y 6. Todas las pruebas se realizaron por

triplicado.

6.3.1. Actividad amilolítica

La actividad amilolítica se determinó por la presencia de zonas de

aclaramiento alrededor de las colonias debido a la hidrólisis del almidón, para

esto se adicionó a las cajas 5 mL de lugol, y se dejó actuar durante 5

minutos.

Como controles positivos de la actividad se utilizaron microorganismos

amiloliticos reportados en literatura Rhizoctonia solani (Snech et al., 1998)

49

Trichoderma harzianum (Peña, 2002) los cuales fueron obtenidos del Cepario

del laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad

Javeriana.

6.3.2. Actividad celulolítica

La actividad celulolítica se determinó por la presencia de zonas de

aclaramiento debido a la hidrólisis de la celulosa, para esto se adicionaron 5

mL de rojo congo al 1% (p/v) y se dejó actuar durante 15 minutos,

posteriormente se retiró el exceso de colorante y se adicionaron 5 mL de

NaCl 0.1M, que se dejó actuar durante 15 minutos, a continuación se retiró y

se llevó a refrigeración durante 24 horas.

Como control positivo de la actividad se utilizó un microorganismo celulolítico

reportado en literatura Pleurotus ostreatus (Valásková y Baldrian, 2006), el

cual fue obtenido del Cepario del laboratorio de Biotecnología Aplicada de la

Pontificia Universidad Javeriana.

6.3.3. Actividad lipolítica

En el caso de la actividad lipolítica se determinó directamente por zonas de

aclaramiento alrededor de las colonias, debido a la degradación de la yema

de huevo.

Como control positivo de la actividad se utilizó un microorganismo lipolítico

reportado en literatura, Trychophyton mentagrophytes (Mitola et al., 2001), el

cual fue obtenido del Cepario del laboratorio de Micología de la Pontificia

Universidad Javeriana.

50

6.3.4. Actividad pectinolítica

La actividad pectinolítica se determinó por la presencia de zonas de

aclaramiento alrededor de las colonias debido a la hidrólisis de la pectina,

para esto se adicionaron 5 mL de lugol, y se dejó actuar durante 5 minutos.

Como control positivo de la actividad se utilizó un microorganismo

pectinolítico reportado en literatura, Colletotrichum sp. (Agrios, 2005), el cual

fue obtenido del Cepario del Laboratorio de Micología de la Pontificia

Universidad Javeriana.

6.3.5. Actividad cualitativa Proteolítica

La actividad proteolítica se determinó directamente por la observación de

zonas de aclaramiento alrededor de las colonias debido a la hidrólisis de la

caseína.

Como controles positivos de la actividad se utilizaron microorganismos

proteolíticos reportados en literatura Aspergillus niger (Saran et al., 2007) y

Trychophyton mentagrophytes (Mitola et al., 2001), el cual fue obtenido del

Cepario del laboratorio de Biotecnología Aplicada y del laboratorio de

Micología de la Pontificia Universidad Javeriana respectivamente.

6.4. Pruebas de caracterización cuantitativa

Se realizó caracterización cuantitativa de las cinco actividades enzimáticas

evaluadas en este estudio (amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y

proteolítica) por cada uno de los aislamientos. Esto se realizó con el fin de

confirmar las actividades enzimáticas observadas en las pruebas cualitativas.

Todas las pruebas se realizaron por triplicado.

51

Para lo anterior se tomaron tres discos de agar con el hongo crecido y se

inocularon en frascos de capacidad de 120 ml con 25 mL de caldo almidón,

celulosa, caseína, leche descremada, pectina y yema de huevo (Anexo 1).

Estos cultivos se llevaron a condiciones de agitación constante a 150 rpm

durante 4 días a 300C para el caso de las actividades amilolíticas,

celulolíticas y pectinolíticas en las cuales se evaluó indirectamente la

actividad enzimática por degradación del sustrato a través del tiempo,

cuantificada por medio de la cantidad de glucosa liberada para los días 2 y 4.

En el caso de la actividad lipolítica y proteolítica se evaluó la actividad

enzimática mediante la reacción del extracto crudo con los respectivos

sustratos. Para la actividad lipolítica se evaluó el extracto obtenido después

de 8 días de fermentación y para la actividad proteolítica se evaluó el

extracto crudo obtenido después de 2 días de fermentación.

6.4.1. Determinación indirecta de la actividad amilolítica, celulolítica y

pectinolítica

Teniendo en cuenta que luego de la degradación de estos polímeros, se

obtienen azúcares reductores, estos se midieron por medio de la técnica del

3,5 ácido di-nitro-salicílico (DNS) (Miller, 1959).

Las muestras retiradas en los días 2 y 4, se centrifugaron a 5.000 rpm

durante 15 minutos, después de esto se recuperó el sobrenadante de las

muestras para los ensayos de la cuantificación de la actividad amilolítica,

celulolítica y pectinolítica. Estas mediciones se realizaron por triplicado.

En el sobrenadante se determinó la concentración de azúcares reductores,

para lo cual se adicionaron en tubos, 0.25 ml de muestra y se adicionaron

0.25 ml de reactivo DNS, luego los tubos se colocaron a ebullición durante 5

minutos y pasado el tiempo de ebullición se sumergieron rápidamente en un

baño de hielo durante 5 minutos, a continuación se adicionó a cada tubo 2.5

52

mL de agua destilada y se procedió a leer en espectrofotómetro a 540 nm.

Como blanco se usó 0.25 mL de reactivo de DNS más 2.75 mL de agua

destilada. La curva de calibración se realizó usando soluciones de 0.5 a 2 g/L

de glucosa para cuantificar azúcares reductores (glucosa) producidos por la

actividad amilolítica y celulolítica. Para el caso de la actividad pectinolítica se

realizó una curva de calibración usando soluciones de 0.5 a 2 g/L de ácido

galacturónico para cuantificar azúcares reductores por DNS producidos por la

actividad pectinolítica (Anexo 2).

Las actividades enzimáticas equivalentes a almidón, celulosa y pectina se

cuantificaron como la cantidad de glucosa o ácido galacturónico liberado en

g/L respectivamente, Así mismo se expresaron como porcentaje de

rendimiento neto de glucosa o ácido galacturónico, respectivamente, al

primer y segundo día de lectura, bajo las condiciones de la prueba (Taniguchi

et al., 2005).

El rendimiento neto de glucosa o ácido galacturónico se calculó usando las

siguientes ecuaciones:

1. % RNG =Concentraci ón de Glucosa ×162

Concentraci ón de Almid ón×180 × 100

2. % RNG =Concentraci ón de Glucosa ×162

Concentraci ón de Celulosa ×180 × 100

3. % RNAG =Concentraci ón de Ácido Galactur ónico ×176

Concentraci ón de Pectina ×194× 100

6.4.2. Determinación de la actividad lipolítica

Las muestras se retiraron al octavo día de fermentación, esto porque en los

días 2, 4 y 6 no se obtuvieron resultados positivos, luego se centrifugaron a

5.000 rpm durante 15 minutos, después de esto se recuperó el sobrenadante

de las muestras para realizar los ensayos de cuantificación de la actividad

lipolítica.

53

En un tubo de ensayo se adicionaron 100 μL del extracto crudo enzimático

proveniente de cada uno de los aislamientos a evaluar, a continuación se

adicionaron 900 μL de p-nitrofenil-palmitato como sustrato a una

concentración de 3mg/ml disuelto en acetona (Ateslier y Metin, 2006). Lo

anterior se realizó con el fin de cuantificar el p-nitrofenol liberado como

resultado de la degradación del p-nitrofenil-palmitato por la acción de las

lipasas. Posteriormente, se incubó a 300C durante 3 horas y luego se leyó en

espectrofotómetro a 450 nm, utilizando como blanco 100 μL de acetona con

una adición de 900μL de p-nitrofenil-palmitato. La curva de calibración se

realizó usando soluciones de 0.3 a 0.9 μmol/ml de p-nitrofenol en buffer

fosfato a una concentración de 0.1M pH 7.0 (Anexo 2) (Gilham y Lehner,

2005; Ateslier y Metin, 2006; Ertugrul et al., 2007).

La determinación de la actividad lipolítica se determinó con base a la

cuantificación del p-nitrofenol liberado por la acción de las lipasas. Una

unidad lipolítica (UL) se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1

μmol de p-nitrofenol por minuto bajo las condiciones de la prueba.

6.4.3. Determinación de la actividad proteolítica

Las muestras se retiraron al segundo día de fermentación y fueron

centrifugadas a 5000 rpm durante 15 minutos, después de esto se recuperó

el sobrenadante de las muestras para realizar los ensayos de cuantificación

de la actividad proteolítica.

En un tubo de ensayo se mezcló 1 mL del extracto crudo enzimático con 1

mL de solución de caseína a una concentración de 1% (p/v) disuelta en

buffer fosfato 0.1 M pH 7.0. Se incubó a 300C durante 60 minutos y se

adicionó 1 mL de ácido tricloro acético a una concentración de 15 % (p/v). Lo

anterior se realizó con el fin de precipitar las proteínas que no fueron

degradadas en el proceso y obtener un sobrenadante en el que estén

54

presentes los aminoácidos. Posteriormente, se centrifugó a 5.000 rpm

durante 5 minutos, el sobrenadante obtenido se leyó en espectrofotómetro a

280 nm, utilizando como blanco 1 ml de solución de caseína al 1% (p/v)

disuelta en buffer fosfato 0.1 M pH 7.0, con una adición de 1 mL de ácido

tricloro acético. La curva de calibración se realizó usando soluciones de 0.1 a

1μmol/mL de tirosina en buffer fosfato 0.1 M pH 7.0 (Anexo 2) (Hübner,

1991).

La determinación de la actividad proteolítica se determinó con base a la

cuantificación del aminoácido tirosina liberado por la acción de las proteasas.

Una unidad proteolítica (UP) se define como la cantidad de enzima capaz de

liberar 1 μmol de tirosina liberada por minuto bajo las condiciones de la

prueba.

6.5. Hipótesis y análisis estadístico

Se plantearon las siguientes hipótesis que con los resultados obtenidos

permitirán seleccionar las cepas que presenten una mayor actividad

enzimática.

HO: Cada uno de los aislamientos provenientes de animales tiene actividad

amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.

HA: Ninguno de los aislamientos provenientes de animales tiene actividad

amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.

HO: Cada uno de los aislamientos provenientes de humanos tiene actividad

amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.

HA: Ninguno de los aislamientos provenientes de animales tiene actividad

amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.

HO: Cada uno de los aislamientos provenientes de plantas tiene actividad

amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.

55

HA: Cada uno de los aislamientos provenientes de plantas tiene actividad

amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.

Una vez obtenidos los valores de las variables, se procedió a su análisis

utilizando medidas de tendencia central como el promedio y desviación

estándar.

Teniendo en cuenta los resultados de las pruebas enzimáticas cualitativas y

cuantitativas se realizó un análisis estadístico de varianza (ANOVA) con una

prueba de comparaciones de medias de Tukey, con el fin de seleccionar las

cepas que presentaron mayor actividad enzimática, teniendo en cuenta que

los parámetros establecidos fueran similares estadísticamente.

De igual manera se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) con una prueba

de comparaciones de medias de Tukey, para establecer si existieron

diferencias estadísticamente significativas al comparar las actividades

enzimáticas obtenidas por cada día de lectura, así mismo para establecer

diferencia estadísticamente significativa en la actividad enzimática

proteolítica de cada una de las cepas, al comparar los medios de cultivo

leche descremada y caseína.

Los resultados que presentaron homogeneidad de varianzas fueron

analizados con la prueba no paramétrica con una prueba de comparaciones

de medias.

Se asumió que un valor P<0.05 significaría que entre las cepas analizadas

habría diferencia significativa. Por el contrario valores de P>0.05 significaría

que entre las cepas analizadas no habría diferencia estadística significativa.

En todos los análisis estadísticos se utilizaron los programas Stadistix for

windows y Excel 2007 para Windows (Anexo 11).

56

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1. Pruebas de Caracterización Enzimáticas.

7.1.1. Actividad amilolítica

No fue posible determinar la actividad enzimática cualitativa por medio de la

producción de halos de hidrólisis, ya que al realizar la lectura a los días 2, 4 y

6 no se evidenciaron halos de hidrólisis alrededor de las colonias de ninguna

de las 32 cepas evaluadas.

En el caso del control positivo usado Rhizoctonia solani se evidenciaron

halos de hidrólisis a partir del 4 día con un tamaño promedio de 0.1 cm y

para el día 6 un halo de tamaño promedio de 0.5 cm.

Figura 1. Actividad enzimática amilolítica cualitativa.

a. Cepa 303 en agar almidón sin revelar. b. Cepa 309 en agar almidón revelado. c. Control positivo T. harzianum

La no visualización de halos de hidrólisis en las pruebas cualitativas tal vez

se debió al uso de agentes gelatinizantes como el agar-agar, el cual pudo

actuar como inhibidor de las enzimas amilolíticas (Uhlig, 1998), además

57

durante las lecturas realizadas al día 2, 4 y 6 no se evidenció un crecimiento

normal en cuanto a velocidad radial de crecimiento, sin embargo se

evidenciaron características macroscópicas similares a las que se presentan

cuando las cepas crecen en agar PDA. Lo anterior posiblemente se debió a

que las enzimas amilolíticas no degradaron el sustrato presente,

ocasionando la falta de liberación de glucosa la cual no pudo ser usada por

los hongos directamente, causando posiblemente que este sustentara su

crecimiento a partir de reservas energéticas o impurezas que contuviera el

medio de cultivo.

Por otra parte Gupta et al. (2003) reportaron que las fuentes de nitrógeno

orgánicas son las preferidas para la producción de enzimas como las α-

amilasas. También Pedersen y Nielsen (2000) reportaron que el uso de

extracto de levadura en el caso de Aspergillus orizae incrementa la

productividad de la α-amilasa de un 110 a un 150% cuando es usada como

fuente de nitrógeno adicional al sulfato de amonio.

Otras fuentes de nitrógeno orgánico como peptona, caseína, y extracto de

carne han sido usadas para aumentar la producción de enzimas amilolíticas

en varias bacterias y hongos. Aunque se ha reportado que la presencia de

aminoácidos provenientes de fuentes de nitrógeno orgánicas induce y

aumenta la producción de estas enzimas, no se ha podido esclarecer

realmente cual es el papel que desempeñan (Gupta et al., 2003). Lo anterior

resulta importante ya que la adición de fuentes de nitrógeno orgánicas fue un

parámetro que no se tuvo en cuenta al determinar la composición de los

medios de cultivo, lo anterior para evitar que el microorganismo usara la

fuente de nitrógeno orgánica para sustentar su crecimiento y no produjera

enzimas.

Lo anterior sugiere que la utilización de un sustrato sólido para evidenciar la

actividad enzimática y la falta de una fuente de sustrato orgánico, pudo ser

58

un factor limitante para la expresión de las enzimas amilolíticas de las cepas

provenientes del género Fusarium. Al realizar las pruebas cuantitativas en

caldo almidón, se obtuvieron resultados que demuestran la expresión de

enzimas amilolíticas debido a la producción de azúcares reductores como

maltosa o glucosa que surgen de la hidrólisis del enlace α-1,4-gucosídico

causado por las α-amilasas o la acción hidrolítica de las β-amilasas o

glucosidasas (Nigam y Singh 1995; Gupta et al., 2003). La actividad

amilolítica de las cepas fue determinada por medio de la técnica de DNS por

la que se cuantificó el incremento de los azúcares reductores al día 2 y 4 por

cada una de las cepas (Gupta et al., 2003).

La inducción de estas enzimas en caldo almidón a pesar de usar fuente de

nitrógeno inorgánico probablemente se debió a que la agitación permite

mayor contacto entre el sustrato y la enzima; además mejor transferencia de

oxígeno, lo cual pudo ocasionar un aumento de la producción enzimática, sin

importar las variaciones en la morfología micelial como consecuencia de la

agitación (Gupta et al., 2003).

Además es preciso mencionar que el almidón no es un componente de la

pared celular vegetal sino que este se encuentra como gránulos de reserva

los cuales viajan a través del sistema vascular, localizándose en raíces,

bulbos y semillas, por lo anterior esto podría ser una de las explicaciones de

porque este tipo de enzimas producidas por este género no se expresan en

sustratos sólidos (Frioni, 1999).

La actividad cualitativa arrojó resultados negativos por lo tanto estos se

verificaron por la prueba cuantitativa, los cuales no coincidieron ya que se

demostró la actividad amilolítica de las cepas por la cantidad de azúcares

reductores liberados expresados como maltosa o glucosa, dichos valores

obtenidos para cada una de las cepas en el día 2 y 4 fue comparado con un

control Trichoderma harzianum, el cual mostró una actividad enzimática de

59

0.247 g/L de glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de glucosa del

2.2% para el día 2 y 4.541 g/L de glucosa y un porcentaje de rendimiento

neto de glucosa del 40.8% para el día 4. A su vez los valores obtenidos por

cada una de las cepas fue comparado con un control negativo Trichophyton

mentagrophytes el cual mostró una actividad enzimática de 0.050 g/L de

glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de glucosa del 0.45% para el

día 2 y 0.048 g/L de glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de glucosa

del 0.43% para el día 4 (Anexo 3) (Figura 2, 3 y 4).

Figura 2. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo almidón de las cepas provenientes de animales.

La actividad enzimática de las cepas que estuvieron por debajo del valor

obtenido por el control negativo para el día 2 fueron las cepas 160, 121, 159

con valores de 0.031 g/L, 0.030 g/L y 0.028 g/L de glucosa y porcentajes de

rendimiento neto de glucosa del 0.28%, 0.27% y 0.25% respectivamente.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

108 111 121 131 155 156 159 160 161 162

Co

ncen

tració

n d

e G

luco

sa (

g/L

)

Cepas

CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 2 DIA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 4 DIA

60

Aunque estas cepas mostraron valores numéricamente superiores al día 4,

no hubo diferencias significativas (P>0.05) con respecto a los presentados al

día 2 según la prueba de comparaciones de medias de Tukey (95%), al igual

que las cepas 203, 308, 311 y 310, las cuales a pesar de mostrar valores de

0.071 g/L, 0.086 g/L, 0.115 g/L y 0.075 g/L de glucosa y porcentajes de

rendimiento neto de glucosa del 0.63%, 0.77%, 0.67% y 1% respectivamente

para el día 2, resultaron no tener diferencia estadísticamente significativa

(P>0.05) con el control negativo (Anexo 3) (Figura 2,3,4).

Figura 3. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo almidón de las cepas provenientes de humanos.

Al mismo tiempo la prueba de comparación de medias de Tukey (95%)

demostró que el día en el que se analicen las muestras es dependiente de

cada cepa, aunque existió homogeneidad de grupos la concentración de

azúcares reductores liberados resultó independiente para cada cepa.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

201 202 203 204 205 206 207 208 209 210

Co

ncen

tració

n d

e G

luco

sa (

g/L

)

Cepas

CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 2 DIA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 4 DIA

61

Figura 4. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo almidón de las cepas provenientes de plantas.

Las cepas que mostraron mayor actividad en comparación al control positivo

en el 2 día fueron la 155, 205 y 313 con valores de 1.021 g/L, 1.685 g/L y

1.016 g/L de glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de glucosa del

9.18%, 15.16% y 9.14% respectivamente; y para el 4 día fueron la 108, 208,

y la 315 con valores de 1.346 g/L, 2.882 g/L, y 1.774 g/L de glucosa y un

porcentaje de rendimiento neto de glucosa del 12.11%, 25.93% y 15.96%. Lo

anterior indica que las cepas 205 y 208 procedentes de aislamientos de

humanos mostraron las mayores actividades amilolíticas de las 32 cepas,

seguidas de las cepas 313 y 315 provenientes de plantas y finalmente las

cepas 108 y 155 provenientes de animales (Anexo 3) (Figura 2, 3, 4).

Lo anterior podría sugerir que tanto las cepas provenientes de animales,

humanos y plantas tienen la capacidad enzimática para degradar un sustrato

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317

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g/L

)

Cepas

CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 2 DIA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 4 DIA

62

como el almidón. Para fines de este estudio los resultados obtenidos a partir

de cada una de las cepas provenientes de animales y humanos, podría

indicar la posible capacidad de estos dos grupos de causar infección cruzada

en plantas y lo que es aún más interesante, indicar que posiblemente en un

principio la procedencia de estas cepas era de origen vegetal.

Figueira et al. (2003) reporta a Fusarium verticillioides (F.moniliforme) como

uno de los fitopatógenos micotoxigénicos, más prevalente en las semillas de

granos, especialmente en las semillas de maíz. A su vez sugiere que esta

capacidad infectiva esta asociada directamente con la expresión de enzimas

amilolíticas.

Por otra parte, las amilasas de este género no pertenecen al grupo de

enzimas degradadoras de pared (CWDE’s), por lo que la actividad amilolítica

de este hongo no esta asociada directamente con los síntomas de

marchitamiento vascular, ocasionado en cultivos de tomate o clavel. Sin

embargo esta característica enzimática, la de poseer enzimas capaces de

degradar sustratos como el almidón, está relacionado con la agresividad del

patógeno, lo que es clave para la producción indirecta de síntomas como el

marchitamiento vascular, así que la capacidad amilolítica puede contribuir al

desarrollo de la enfermedad en función de facilitar la colonización e invasión

del patógeno dentro de los tejidos de las plantas, más no le da la capacidad

al patógeno de degradar o penetrar la barrera estructural, que es la pared

celular de las plantas.

7.1.2. Actividad celulolítica

La actividad enzimática cualitativa fue posible determinarla por medio de la

medición de halos de hidrólisis para los días 2,4 y 6, aunque para este último

día existieron inconvenientes de lectura, debido a que el tamaño de la colonia

63

ocupaba toda la caja, impidiendo visualizar si en estos casos existía actividad

enzimática expresada en halos de hidrólisis para el día 6.

Figura 5. Actividad enzimática celulolítica cualitativa.

Agar carboximetilcelulosa revelado con rojo Congo. a. Cepa 313. b. Control positivo P. ostreatus. c. Cepa 161.

Figura 6. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de animales.

0,0

0,2

0,4

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108 111 121 131 155 156 159 160 161 162

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de H

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(cm

)

Cepas

HALO DE HIDRÓLISIS 2 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DIA DE LECTURA

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA

a

.

b

.

c

.

64

Como se observa en la Figura 6, 7 y 8 no se obtuvo lectura de actividad

enzimática para las cepas 155, 156, 203, 206, 209 y 302 para el día 6 lo cual

se debió a que para ese día la colonia del hongo había ocupado en su

totalidad la caja de petri impidiendo de esta manera saber si existía actividad

enzimática para ese día (Anexo 4) (Figura 7, 8 y 9).

Los resultados obtenidos en la actividad enzimática cualitativa para cada

grupo evaluado, presentaron homogeneidad de varianzas por lo que fueron

analizados con la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis (95%), la cual no

detectó diferencias significativas (P>0.05), entre los días de muestreo ni

entre las cepas evaluadas, sugiriendo que el día en el que se evalúe la

actividad enzimática cualitativa de las cepas es totalmente independiente de

la actividad, aunque varíe numéricamente en cada día de muestreo

independientemente de que sea mayor o menor.

Figura 7. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de humanos.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

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201 202 203 204 205 206 207 208 209 210

Halo

de H

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lis (

cm

)

Cepas

HALO DE HIDRÓLISIS 2 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DIA DE LECTURA

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA

65

Las pruebas de actividad enzimática cualitativa, demostraron la actividad

celulolítica de las cepas por medio de halos o zonas claras de hidrólisis

alrededor de las colonias las cuales eran observables gracias al contraste del

colorante rojo Congo. Cada uno de los resultados fue comparado con un

control positivo Pleurotus ostreatus el cual mostró halos de 0.2 cm, 0.6 cm y

1 cm de diámetro para los días 2,4 y 6 respectivamente. A su vez cada halo

producido por cada una de las cepas fue comparado con un control negativo

Trichophyton mentagrophytes el cual no mostró crecimiento radial ni

actividad enzimática, por lo cual su actividad enzimática cualitativa fue de 0

cm de diámetro para cada uno de los días de lectura (Anexo 4).

Figura 8. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de plantas.

Las cepas que tuvieron mayor actividad enzimática cualitativa para el día 2

fueron la 160, 206, 314 con mediciones de 1 cm, 0.8 cm y 1.1 cm de

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317

Halo

de H

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lisis

(cm

)

Cepas

HALO DE HIDRÓLISIS 2 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DIA DE LECTURA

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA

66

diámetro respectivamente, para el día 4, la 161, 203 y 314 con mediciones

de 1.1 cm, 0.6 cm y 0.8 cm respectivamente y para el 6 día de lectura fueron

la 111, 161, 204 y 314 con mediciones de 1.1 cm, 1.1 cm, 0.4 cm y 1 cm de

diámetro respectivamente (Anexo 4) (Figura 7, 8 y 9).

Por lo anterior se puede inferir que la cepa 314 proveniente de planta se

mantiene como la mejor con actividad enzimática cualitativa durante los tres

días de lectura, mostrando un mejor comportamiento que el control positivo

usado. Sin embargo, los halos producidos por P. ostreatus para cada día de

muestreo fueron más consistentes y la zona de hidrólisis fue más clara en

comparación a cada una de las cepas evaluadas, lo cual sugirió en un

principio que podría tener una mayor actividad enzimática cuantitativa (Anexo

4).

Por otra parte, las pruebas de actividad enzimática cuantitativa, demostraron

la actividad celulolítica de las cepas por la liberación de azúcares reductores

equivalente a glucosa, debido a la producción de enzimas que degradaron la

celulosa contenida en el medio permitiendo que el resultado de su

degradación fuera usado por el hongo para su crecimiento (Agrios 2005).

Para estas pruebas se utilizaron dos controles positivos los cuales fueron T.

harzianum y P. ostreatus. Estos mostraron valores para el día 2 de 0.108 g/L

y 0.481 g/L de glucosa y un porcentaje de degradación de 0.97% y 4.32%

respectivamente, y para el día 4 0.167 g/L y 0.665 g/L y un porcentaje de

rendimiento neto de glucosa de 1.50% y 5.98% respectivamente. De igual

manera los valores obtenidos por cada una de las cepas fue comparado con

un control negativo, T. mentagrophytes, el cual mostró un valor para el día 2

de 0 g/L de glucosa y 0% de degradación y para el día 4 mostró un valor de

0.055 g/L de glucosa y 0.49% de rendimiento neto de glucosa, de tal manera

que si se compara con los resultados obtenidos con la actividad enzimática

67

cualitativa este hongo no demostró tener ninguna actividad enzimática

celulolítica (Anexo 5).

Figura 9. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de animales.

Lo anterior es de gran importancia para fines de este estudio, ya que siendo

T. mentagrophytes un hongo patógeno que causa severas dermatomicosis

en animales y humanos no posee enzimas celulolíticas que le permitan

colonizar sustratos de este tipo, en contraste con las cepas evaluadas

provenientes de lesiones de animales y humanos, en las cuales se observa

una significativa actividad enzimática celulolítica, por lo que se infiere que

estas cepas si tendrían la capacidad de colonizar y degradar sustratos

celulolíticos, es decir, causar posiblemente enfermedad en plantas o lo que

0,0

0,1

0,2

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108 111 121 131 155 156 159 160 161 162

Co

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)

Cepas

CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 2 DIA CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 4 DIA

68

es aún más interesante indicar, que antes de infectar a un hospedero animal

o humano posiblemente su origen era vegetal.

Figura 10. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de humanos.

Todas las cepas mostraron en el día 2 valores superiores a 0.200 g/L y

porcentajes de rendimiento neto de glucosa mayores al 1%, sugiriendo que

todas las cepas evaluadas son celulolíticas.

Las cepas que mostraron mayor actividad al día 2 fueron 161, 202 y 312 con

valores de 0.527 g/L, 0.614g/L y 0.490 g/L de glucosa, con porcentajes de

rendimiento neto de glucosa de 4.74%, 5.52% y 4.41% respectivamente. Por

otra parte, las cepas que mostraron mayor actividad enzimática al día 4

fueron 155, 206 y 305 con valores de 0.683 g/L, 0.671 g/L y 0.628 g/L de

glucosa con porcentajes de rendimiento neto de glucosa del 6.14%, 4.27% y

5.64% respectivamente (Anexo 5) (Figura 10, 11 y 12).

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

201 202 203 204 205 206 207 208 209 210

Co

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)

Cepas

CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 2 DIA CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 4 DIA

69

Figura 11. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de plantas.

Si se compara lo anterior con los valores mostrados por los dos controles

positivos usados superan totalmente la actividad mostrada por P. ostreatus,

el cual mostró al día 2 de 0.108 g/L de glucosa con un porcentaje de

rendimiento neto de glucosa del 0.97% y al día 4 0.167 g/L de glucosa y un

porcentaje de rendimiento neto de glucosa de 1.5%. En el caso del otro

control positivo usado, T. harzianum, el cual mostró al día 2 0.481 g/L de

glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de 4.32% y al día 4 0.665 g/L de

glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de 5.98%, se sugiere que

aunque existieron diferencias numéricas con las cepas que mostraron la

mayor actividad enzimática celulolítica no hubo diferencias significativas

(P>0.05) (Anexo 5).

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317

Co

ncen

tració

n d

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sa (

g/L

)

Cepas

CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 2 DIA CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 4 DIA

70

Según la prueba de comparaciones de media de Tukey (95%) ninguna cepa

evaluada resultó tener diferencia estadísticamente significativa (P>0.05) con

el control negativo, a excepción de las cepas 315, 311 y 310 evaluadas en el

día 2. A si mismo la prueba de comparación de medias de Tukey (95%)

demostró que la mayor o menor concentración de glucosa obtenida en el día

2 o en el día 4 será dependiente de cada una de las cepas evaluadas.

Aunque existió homogeneidad de grupos, la concentración de azúcares

reductores liberados resulta independiente numéricamente para cada cepa.

Por otra parte el género Fusarium ha sido ampliamente reportado como un

hongo con actividad enzimática celulolítica, lo cual le permite establecerse en

la superficie de la planta constituida principalmente de celulosa, ocasionando

ablandamiento por la desintegración de los componentes de la pared celular,

permitiendo la penetración y propagación del patógeno en los tejidos de su

hospedero causando el colapso y desintegración de su estructura celular

(Agrios, 2005). Así mismo Norkrans (1963) y Agrios (2005) reportan el papel

de las celulasas en el marchitamiento vascular inducido por Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici, debido a la liberación de grandes moléculas de

celulosa dentro del torrente de transpiración que interfiere con el movimiento

normal del agua dentro de los vasos del xilema.

Christakopoulos et al. (1994) reporta la presencia de tres tipos de enzimas

celulolíticas en Fusarium oxysporum, endo-1,4-β-D-glucanasa (1,4-β-D-

glucan glucanohidrolasa), exo-1,4-β-D-glucanasa (1,4,-β-D-glucan

celobiohidrolasa) y β-glucosidasa (β-D-glucosido glucohidrolasa), enzimas

que trabajan sinergísticamente, para obtener el máximo grado de hidrólisis

de la celulosa nativa.

Igualmente Roncero et al. (2003) incluye a las enzimas celulolíticas al grupo

de enzimas degradadoras de paredes celulares (CWDE’s) asociadas a la

71

fitopatógenicidad de este género, las cuales son reguladas por inducción de

sustrato y represión catabólica.

Por otra parte Panagiotou et al. (2003 y 2005) reportan la purificación y

caracterización de tres endoglucanasas y una β-glucosidasa en Fusarium

oxysporum para su uso como metabolito de interés industrial en la

sacarificación y fermentación simultánea de celulosa.

7.1.3. Actividad lipolítica

No fue posible determinar la actividad enzimática cualitativa de todas las

cepas evaluadas por medio de la producción de halos de hidrólisis, ya que al

realizar la lectura en los días 2, 4, 6 y 10 no se evidenciaron halos de

hidrólisis alrededor de las colonias de todas las cepas.

Figura 12. Actividad cualitativa lipolítica.

Agar yema de huevo. a. Control negativo Colletotrichum sp. b. Control positivo T.

mentagrophytes. c. Cepa 161. d. Cepa 210. e. Cepa 155. f. Cepa 311.

72

Los halos de hidrólisis observados durante las lecturas no tuvieron tendencia

y no se presentaron de manera continua durante los días evaluados, no

existió un comportamiento constante o de aumento o disminución de la

actividad enzimática en cuanto avanzaba el tiempo de incubación,

presentándose en algunos casos halo de hidrólisis solo para un día de

lectura, lo que ocasiono falta de confiabilidad en los resultados obtenidos

para todas las cepas evaluadas independientemente de que hallan mostrado

actividad enzimática medida en halos de hidrólisis para cualquier día de

lectura.

Figura 13. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de animales.

Aún así el análisis estadístico de los resultados mostró que había

homogeneidad de varianza, por lo que fue necesario analizar los resultados

con la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis (95%), la cual no detectó

0,0

0,2

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0,6

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108 111 121 131 155 156 159 160 161 162

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Cepas

HALO DE HIDRÓLISIS 2 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DIA DE LECTURA

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 10 DIA DE LECTURA

73

diferencia significativas(P>0.05) entre cada una de las cepas evaluadas que

dió resultado positivo en cada uno de los días de lectura.

En el caso de control positivo, T. mentagrophytes, se evidenciaron a partir del

primer día halos de hidrólisis de 0.5 cm, 0.7 cm, 0.6 cm y 0.5 cm para los

días 2, 4, 6, y 10, respectivamente, los cuales fueron difusos y no bien

definidos.

Por otra parte Colletotrichum sp. no fue un buen ejemplo de control negativo

debido a que durante el periodo de incubación mostró actividad lipolítica

cualitativa ya que para los días 4, 6, y 10 mostró tamaños de halo de 0.2 cm,

0.3 cm, y 0.4 cm respectivamente los cuales fueron muy claros y definidos.

Figura 14. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de humanos.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

201 202 203 204 205 206 207 208 209 210

Halo

de

Hid

roli

sis

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)

Cepas

HALO DE HIDRÓLISIS 2 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DIA DE LECTURA

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 10 DIA DE LECTURA

74

Según se observa en las figuras 13, 14 y 15 las cepas que no mostraron

ningún tipo de actividad lipolítica cualitativa durante el tiempo de incubación

fueron las cepas 111,156, 160, 162, 201, 202, 204, 208, 209, 305, 308, 309,

313 y 317. Las cepas que mostraron actividad para cualquier día de lectura

fueron la 108, 121, 131, 155, 159, 161, 203, 205, 206, 207, 210, 302, 303,

310, 311, 312, 314 y 315 (Anexo 6) (Figura 14, 15 y 16).

Figura 15. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de plantas.

Aún así se observó que cada una de las cepas evaluadas presentaron un

buen crecimiento durante el tiempo de incubación, mostrando todas las

características macroscópicas comunes que identifican a este género.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317

Halo

de H

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(cm

)

Cepas

HALO DE HIDRÓLISIS 2 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DIA DE LECTURA

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 10 DIA DE LECTURA

75

Figura 16. Características macroscópicas del género en agar yema de huevo.

Por lo anterior se estableció que para la prueba cuantitativa, el extracto crudo

se obtendría por la fermentación de cada cepa en caldo yema de huevo 2%

(v/v) durante 8 días, para luego medir la actividad lipolítica del extracto

enzimático por reacción en un tiempo de 3 horas.

Por otra parte es preciso mencionar que la concentración empleada de yema

de huevo al 2% (v/v) fue en la que se encontraron mejores resultados visibles

de actividad lipolítica después de evaluar concentraciones de 10% (v/v) y 1%

(v/v) (resultados no mostrados). A su vez, en todas las concentraciones

evaluadas se evidenció un crecimiento normal y rápido en cada una de las

cepas evaluadas.

Al realizar las pruebas de actividad lipolítica cualitativa se encontró que la

concentración evaluada de yema de huevo al 10% (p/v) contenía una alta

cantidad de sustrato, lo cual, pudo no permitir que se expresaran las enzimas

y por consiguiente no se evidenciaran halos de hidrólisis. Por otra parte la

concentración evaluada de yema de huevo al 1% (p/v), hizo que las placas

de agar quedaran muy claras, lo cual dificultó evidenciar el halo de hidrólisis

ocasionado por la degradación del sustrato contenido en el medio de cultivo.

Adicionalmente, la concentración escogida coincide con las concentraciones

usadas por Coca et al. (2001), quienes reportan el uso de concentraciones

76

de 2% (v/v) de sustratos lipídicos como aceite de oliva y aceite de girasol

usados como fuente de carbono para la producción y caracterización de

lipasas de Aspergillus niger y A. fumigatus.

Además de evaluar la concentración de yema de huevo, se estudió si la

adición de sales de sodio como el cloruro de sodio (NaCl) inhibía la actividad

lipolítica (Rapp, 1995), por lo que se obtuvo un resultado negativo en cuanto

no se evidenció halos de hidrólisis en las cepas de prueba (cepas evaluadas

en el estudio escogidas al azar), cuando se usaba esta sal para homogenizar

la yema de huevo.

Adicionalmente se evaluó la influencia del agar usado comúnmente frente al

agar purificado, con el fin de descartar si el primero presentaba algún tipo de

impureza en la que el hongo podría sustentar su crecimiento al usarlo como

nutriente dejando a un lado la utilización de un sustrato lipídico, lo que

implicaría la producción de una maquinaria enzimática más compleja, pero

los resultados fueron iguales sin importar el tipo de agar usado.

Finalmente, se evaluó si el uso de fuentes de nitrógeno orgánicas induciría la

producción de enzimas lipolíticas, por lo anterior se probó la adición en el

medio de cultivo de peptona, extracto de levadura y peptona con extracto de

levadura, a una concentración de 2.5 g/L. Los resultados indicaron que el uso

de peptona o extracto de levadura si inducía la producción de la enzima,

siendo visiblemente mejor en la prueba el extracto de levadura, lo cual

corresponde en cierto modo por lo evidenciado por Rapp (1995), quien

reporta que el uso de peptona como fuente de nitrógeno orgánica en el

medio de cultivo incrementa la expresión de estas enzimas, deduciendo que

estos sustratos tal vez contienen lípidos o aminoácidos capaces de inducir la

formación de lipasas en Fusarium (estos resultados no son presentados).

Se seleccionó yema de huevo como sustrato lipídico para poder evidenciar la

actividad lipídica o fosfolipídica de cada una de las cepas evaluadas, debido

77

a que la yema de huevo tiene dentro de sus componentes lipídicos la lecitina

que es un fosfolípido cuyo nombre menos común es fosfatidilcolina, la cual

es un componente primordial de las bicapas lipídicas de las membranas

celulares (Wabel, 1998; Peña y Riesgo 2005).

Por lo anterior, la utilización de la yema de huevo como sustrato permitiría

relacionar de manera directa la acción degradativa e infectiva de los hongos

evaluados sobre los tejidos epiteliales de animales o humanos. Tal acción

estaría directamente relacionada con la posible desestabilización de

membranas, lisis celular y liberación de lípidos que actúan como mensajeros

secundarios. Además existe evidencia substancial que indica el rol de las

lipasas y fosfolipasas extracelulares como un factor de virulencia en las

infecciones fúngicas (Cox et al., 2001; Panizo et al., 2005).

Las pruebas de actividad enzimática cuantitativa no permitieron encontrar la

actividad lipolítica de las cepas evaluadas, incluyendo el control positivo T.

mentagrophytes. En cuanto al control negativo, Colletotrichum sp., que arrojó

resultados de actividad lipolítica a nivel cualitativo, no se encontró actividad

lipolítica cuantitativa.

Por otra parte, no se puede desestimar que tanto el sustrato como el solvente

empleado en la reacción enzimática, pudieron en cierta, forma inhibir la

expresión de las posibles enzimas producidas por estas cepas del género

Fusarium, igualmente no se podría concluir con base a los resultados que

este tipo de enzimas no son expresadas por los hongos de este género, ya

que diferentes autores han reportado la expresión de enzimas lipolíticas en el

género Fusarium, enzimas que son usadas como catalizadores de uso

industrial (Hasan et al., 2006).

78

Por ejemplo, Rapp (1995) reporta la buena actividad lipolítica de Fusarium

oxysporum f. sp. vasinfectum y la estabilidad de la enzima cuando se usa

acetona y etanol al 25% (v/v). De igual forma Nagao et al. (2002) reportan la

termoestabilidad de las enzimas lipolíticas de Fusarium heterosporum. Mase

et al. (1995) reportan la purificación y caracterización de una lipasa de

Fusarium sp. y Maia et al., (2001) reporta a los hongos como productores de

lipasas y se centra en el caso del género Fusarium como uno de los hongos

que ha sido ampliamente reconocido como productor de lipasas, por lo que

utilizan a Fusarium solani como productor de lipasas, reportando actividades

enzimáticas de 0.88 U/ml y 0.78 U/ml usando como sustratos de

fermentación aceite de sésamo y trioleina respectivamente.

Sin embargo, se ha referenciado que la estabilidad de algunas lipasas

producidas por hongos se ve más afectada por el uso de solventes

hidrófilicos, como la acetona, que hidrófobicos como los alcanos (Essamri et

al., 1998). Además Christakopoulos et al. (1998) reporta la producción de una

estearasa por Fusarium oxysporum encontrando que cuando se usa como

sustrato p-nitrofenil-laurato y p-nitrofenil-palmitato la actividad de la enzima

es nula, lo que no ocurrió cuando uso p-nitrofenil-butirato y p-nitrofenil-

acetato, ya que obtuvo una actividad enzimática del 100% y 24%

respectivamente; sugiriendo que el uso de ésteres de cadena larga limita la

actividad enzimática o en su defecto la expresión de la enzima, impidiendo la

determinación de enzimas lipolíticas (Christakopoulos et al., 1998; Gilham y

Lehner 2005).

Lo anterior pudo ocasionar la no determinación de lipasas en las pruebas de

actividad enzimática, ya que se usó p-nitrofenil-palmitato (éster de cadena

larga), como sustrato de reacción, el cual permitiría medir la actividad

enzimática de las cepas por la intensidad del color amarillo formado por la

liberación de p-nitrofenol (Gupta et al., 2004). Además Rapp (1995) y Maia et

al. (2001) reportan que las lipasas producidas por hongos del género

79

Fusarium son las enzimas que más necesitan ser inducidas por el uso de

sustratos inductores como aceites.

Por otra parte, la obtención de resultados poco confiables que no aseguran la

presencia de enzimas lipolíticas genera nuevos planteamientos, en los que

se sugiere en próximos estudios realizar ensayos preliminares que indiquen

la presencia o ausencia de estas enzimas. Tales ensayos evaluarían la

expresión de las enzimas, al usar diferentes sustratos para llevar a cabo la

reacción enzimática, así como realizar pruebas en las que se determine el

solvente más adecuado para disolver el sustrato, igualmente probar nuevos

sustratos de fermentación que indicarían si la yema de huevo es o no un

buen sustrato de inducción para estas enzimas.

A pesar de no haber tenido resultados positivos en este estudio es

importante continuar investigando, ya que las lipasas extracelulares juegan

un papel importante durante las infecciones fúngicas. Se cree que la

presencia de estas enzimas lipolíticas permite que estos hongos se

conviertan en patógenos oportunistas, lo que les daría la propiedad de

colonizar tejidos de animales y humanos. Durante el proceso de infección las

lipasas le permiten al hongo sustentar su crecimiento permitiendo la

colonización de este sobre el tejido epitelial, lo cual indica que la actividad

lipolítica es importante para la nutrición adhesión, colonización y

diseminación del hongo en estas ubicaciones superficiales (Stehr et al.,

2003).

7.1.4. Actividad pectinolítica

La actividad enzimática cualitativa se determinó por medio de la medición de

halos de hidrólisis para los días 2,4 y 6.

80

Figura 17. Actividad enzimática cualitativa pectinolítica.

Agar pectina revelado con lugol. a. Cepa 121. b. Cepa 308. c. Cepa 108. d. Cepa

202. e. Cepa 208. f. Cepa 311.

Figura 18. Actividad hidrolítica de las cepas en agar pectina revelado con lugol. a. cepa 209. b. cepa 201. c. Cepa 156.

Como se observa en las figuras 19, 20 y 21 no hubo formación de halos de

hidrólisis para las cepas 156, 162, 303, 310 y 313 en el día 2 de lectura, de

igual forma las cepas 201, 203, 209 y 303 no presentaron actividad

enzimática medida en halos de hidrólisis para el día 6 de lectura, sin

81

embargo estas cepas mostraron actividad enzimática la cual no fue medible,

debido a que simplemente se observó un aclaramiento del medio debajo de

la colonia del hongo que sugería un consumo de sustrato el cual debió ser

hidrolizado previamente, esto se evidenció como ya se mencionó, por la

presencia de zonas claras (Figura 18).

Figura 19. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar pectina al 1% (p/v) de las cepas aisladas de animales.

Lo anterior tal vez se debió a que al momento de realizar las respectivas

lecturas durante el tiempo de incubación, el hongo ya había colonizado el

sustrato degradado ocasionando de esta manera un falso negativo.

Los resultados obtenidos para cada grupo de cepas evaluadas, no presentó

homogeneidad de varianzas por lo que fueron analizados con la prueba no

paramétrica de Kruskall Wallis (95%), la cual no detectó diferencias

significativas (P>0.05), entre los días de muestreo ni entre las cepas

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

108 111 121 131 155 156 159 160 161 162

Halo

de H

idro

lisis

(cm

)

Cepas

HALO DE HIDRÓLISIS 2 DÍA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA

82

evaluadas indicando que el día en que se realice la lectura de los halos de

hidrólisis es totalmente independiente de la actividad enzimática expresada

por cada una de las cepas evaluadas. Las pruebas de actividad enzimática

cualitativa, demostraron la actividad pectinolítica de las cepas por medio de

halos o zonas claras de hidrólisis alrededor de las colonias. Cada uno de los

resultados obtenidos en las pruebas cualitativas fue comparado con un

control positivo, Colletotrichum sp., el cual mostró halos de hidrólisis de 0.1

cm para el día 2 y 4 de lectura y de 0.2 para el día 6. A su vez cada resultado

obtenido por cada una de las cepas fue comparado con un control negativo

T. mentagrophytes el cual mostró halos de 0.1 cm, 0.5 cm y 1 cm para los

días 2, 4 y 6 de lectura, resultando tener mayor actividad cualitativa

pectinolítica que el control positivo. Las cepas que mostraron mayor actividad

pectinolítica cualitativa fueron la 108, 201, y la 311 con valores de 0.9 cm, 1.2

cm y 1.6 cm de halo de hidrólisis respectivamente para el día 2 de lectura,

para el día 4 se encontró nuevamente a la cepa 108 junto a la cepa 160 y las

cepas 207 y 313 con valores de 0.9 cm, 0.9 cm, 0.6 cm y 1 cm de de halo de

hidrólisis, para el día 6 de lectura se encontraron las cepas 111, 206 y 311

con valores de 1.6 cm, 1.8 cm y 1.6 cm de tamaño de halos de hidrólisis. En

general se podría decir que cada una de las cepas evaluadas mostró

actividad pectinolítica, independientemente del resultado numérico obtenido

en la realización de la prueba. En cuanto a los resultados obtenidos en las

pruebas de actividad enzimática cuantitativas, estas demostraron la actividad

pectinolítica de las cepas debido a la liberación de azúcares reductores

equivalentes a ácido galacturónico, el cual es liberado por la acción de

enzimas pectinolíticas que actúan sobre un sustrato específico permitiendo

que el resultado de esta hidrólisis sea usado por el hongo para sustentar su

crecimiento (Agrios, 2005). Para las pruebas cuantitativas se utilizaron dos

controles positivos, Colletotrichum sp. y Aspergillus niger, los cuales

mostraron para el día 2 de lectura valores de 2.485 g/L y 0.242 g/L de ácido

galacturónico con un porcentaje de rendimiento neto de ácido galacturónico

83

de 22.5% y 1.4% respectivamente; y para el día 4 de lectura mostraron

valores de 2.168 g/L y 0.159 g/L de ácido galacturónico con un porcentaje de

rendimiento neto de ácido galacturónico de 19.7% y 1.44% respectivamente,

lo anterior indica que el hongo que tuvo mejor actividad pectinolítica

cuantitativa fue Colletotrichum sp., resultado que no se evidenció en las

pruebas cualitativas. A su vez cada resultado obtenido en la pruebas de

actividad cuantitativa fue comparado con un control negativo, el cual fue

nuevamente T. mentagrophytes, que mostró valores de 0.090 g/L de ácido

galacturónico con un porcentaje de rendimiento neto de ácido galacturónico

de 0.81% para el día 2 de lectura, y para el día 4 de lectura mostró valores

de 2.355 g/L de ácido galacturónico y un porcentaje de rendimiento neto de

ácido galacturónico de 21.4%. Tales valores concuerdan con la actividad

mostrada por el hongo en las pruebas cualitativas, en las que se usó como

control negativo, sugiriendo desde esta forma no ser un control negativo de la

prueba (Anexo 8).

La mayoría de las cepas mostraron actividad pectinolítica en el día 2 de

lectura, aunque existieron valores numéricamente bajos de concentración de

ácido galacturónico 0.024 g/L con porcentajes de rendimiento neto de ácido

galacturónico de 0.22%.

84

Figura 20. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de animales.

Las cepas que mostraron mayor actividad fueron las cepas 111, 202 y 314

para el día 2 de lectura, con valores de 2.295 g/L, 1.361 g/L y 2.507 g/L de

ácido galacturónico liberado, con porcentajes de rendimiento neto de ácido

galacturónico de 20.8%, 12.3% y 22.7% respectivamente. Las cepas que

mostraron mayor actividad enzimática para el día 4 de lectura fueron la 156,

210 y 311 con valores de 1.145 g/L, 0.213 g/L y 0.653 g/L de ácido

galacturónico liberado con porcentajes de rendimiento neto de ácido

galacturónico de 10.4%, 1.9% y 4% respectivamente (Anexo 8) (Figura 22,

23 y 24).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

108 111 121 131 155 156 159 160 161 162Co

ncen

tració

n d

e Á

cid

o G

ala

ctu

ron

ico

(g

/L)

Cepas

CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 2 DÍA

CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 4 DÍA

85

Figura 21. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de humanos.

Al comparar los resultados obtenidos por las cepas que mostraron mayor

actividad enzimática cuantitativa con el control positivo, Colletotrichum sp., se

tiene que aunque existieron diferencias numéricas no existió diferencias

significativas (P>0.05)

De igual manera los resultados obtenidos por cada una de las cepas

evaluadas en las pruebas de actividad enzimática cuantitativa presentaron

homogeneidad de varianzas por lo que los resultados fueron analizados con

la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis (95%), la cual no detectó

diferencias significativas (P>0.05), entre los días de muestreo ni entre las

cepas evaluadas, sugiriendo que el día en el que se evalúe la actividad

enzimática cuantitativa de las cepas es totalmente independiente de la

actividad, aunque varíe numéricamente para cada día de lectura. Según la

prueba de comparaciones de medias (95%), ninguna cepa evaluada resultó

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

201 202 203 204 205 206 207 208 209 210

Co

ncen

tració

n d

e Á

cid

o g

ala

ctu

ron

ico

(g

/L)

Cepas

CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 2 DÍA

CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 4 DÍA

86

tener diferencia estadísticamente significativa (P>0.05) con el control

negativo ni con el control.

Sin embargo, se observa en algunos casos una tendencia de disminución

para el día 4 de lectura, lo que sugiere que los azucares reductores hayan

sido consumidos por el hongo rápidamente a partir del tercer día de

fermentación, ocasionando que para el correspondiente día de evaluación no

hubiese lectura de azúcares.

Lo anterior podría indicar una fuerte actividad enzimática por parte del hongo

en las primeras 24 horas de fermentación que sugeriría una degradación del

sustrato en un tiempo más corto, en comparación con los resultados

obtenidos en las otras actividades, lo que pudo ocasionar que para el día 2

de lectura (48 horas de fermentación) el hongo hubiese podido consumir

parte de los azúcares reductores liberados dando como resultado una

actividad pectinolítica de 0 g/L de ácido galacturónico liberado, como podría

ser el caso de las cepas 203, 206, 208, 302 y 303 las cuales presentaron

actividad enzimática cualitativa más no cuantitativa (Anexo 8) (Figura 23 y

24).

Lo anterior se podría corroborar de cierta forma si se analizan los resultados

obtenidos por las cepas 108, 111, 121, 131, 159, 162, 201, 202, 204, 207,

210, 308, 309, 311, 313, y 314, en las cuales se observa una considerable

liberación de ácido galacturónico para el primer día de lectura y un gran

consumo para el segundo día de lectura, ya que se obtienen valores muy

cercanos a 0 g/L, o en su defecto iguales a 0 g/L de ácido galacturónico

liberado para el día 4 de lectura (96 horas de fermentación). Lo anterior

también podría dar una explicación de lo que sucedió en las pruebas de

actividad enzimática cualitativa, sugiriendo que la liberación de azúcares

reductores sustentaba el crecimiento y el desarrollo del hongo lo cual

87

ocasionaba el rápido cubrimiento de los halos de hidrólisis generados por la

acción hidrolítica de las enzimas (Anexo 8) (Figura 22, 23 y 24).

Figura 22. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de humanos.

El género Fusarium ha sido reportado como un gran productor de enzimas

pectinolíticas, Jayani et al. (2005) reportan endopoligalacturonasas y

pectatoliasas en Fusarium moniliforme, además de exopoligalacturonasas en

Fusarium oxysporum, siendo esta última capaz de liberar ácido

monogalacturónico como el principal producto de su hidrólisis, a diferencia de

la enzima producida por bacterias cuyo principal producto de degradación es

el ácido digalacturónico. Así mismo los autores reportan el aislamiento de

una exopoligalacturonasa de Fusarium oxysporum f. sp. lycoperscila, la cual

tiene una alta estabilidad y actividad enzimática a pH 11 y a temperaturas

mayores de 400C.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317

Co

ncen

tració

n d

e Á

cid

o G

ala

ctu

ron

ico

(g

/L)

Cepas

CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 2 DÍA

CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 4 DÍA

88

Igualmente Gómez y Martínez (2005) reportan la presencia de pectatoliasas

y endopoligalacturonasas en Fusarium oxysporum f. sp. dianthi como

causantes del conocido marchitamiento vascular ocasionado por esta

especie, enfermedad que altera las funciones normales de la planta e inhibe

su crecimiento hasta llegar a ocasionar su muerte. Además reportan que las

enzimas pectinolíticas son las primeras enzimas producidas por los hongos

fitopatógenos para romper y atacar los polímeros de la pared y la lámina

media de la planta.

La presencia de enzimas de tipo pectinolíticas en cada una de las cepas

evaluadas pertenecientes al género Fusarium indica que estas son capaces

de colonizar a las plantas de las cuales son patógenos, penetrando a través

de las raíces e invadiendo de esta manera su sistema vascular, gracias a la

secreción de estas enzimas líticas, las cuales depolimerizan todos los

componentes de las paredes vegetales, como son las pectinas, permitiéndole

de esta manera al hongo invadir la barrera que es la pared celular vegetal, la

cual debe ser vencida por cualquier fitopatógeno. Se cree que cuando estos

hongos encuentran una planta hospedera apropiada, el fitopatógeno penetra

cada capa de la corteza de la raíz hasta alcanzar el sistema vascular por el

cual le es posible colonizar la planta rápidamente extendiéndose hacia los

vasos del xilema provocando los síntomas característicos de marchitamiento

vascular (Roncero et al., 2003; Roncero et al., 2000).

Las enzimas pectinolíticas como las pectinmetilestearasas, pectinliasas,

pectatoliasas, endopoligalacturonasas y exopoligalacturonasas juegan un rol

importante en la fitopatógenicidad de esta especie debido a que estas

enzimas son uno de los principales factores de virulencia presentes en el

hongo como fitopatógeno (Juge, 2006).

Por otra parte estas enzimas están siendo potencialmente estudiadas a nivel

de biología molecular, con el fin de entender de manera más precisa el

89

mecanismo de infección del patógeno, como la señalización entre planta-

patógeno, resistencia al mecanismo de defensa de la planta y la producción

de fitotoxinas (Roncero et al., 2003)

7.1.5. Actividad proteolítica

Fue posible determinar la actividad proteolítica cualitativa de las cepas por

medio de la medición de halos de hidrólisis para los días 2,4 y 6 de lectura,

sin embargo se presentaron inconvenientes al momento de hacer las

respectivas lecturas, en primer lugar el rápido crecimiento del hongo debido a

la utilización de un sustrato tan rico como lo es la leche descremada

ocasionó que algunos halos hidrólisis no fueran observados debido a que el

micelio se extendió rápidamente sobre el halo de hidrólisis, y en segundo

lugar, para el día 6, el tamaño de la colonia ocupaba toda la caja impidiendo

visualizar si en este caso existía actividad enzimática expresada en halos de

hidrólisis. Por lo anterior es que los valores numéricos de los halos de

hidrólisis obtenidos por cada una de las cepas evaluadas son numéricamente

menores si se comparan con los obtenidos en las pruebas de actividad

cualitativa de celulolíticos y pectinolíticos.

90

Figura 23. Actividad cualitativa proteolítica.

Agar leche descremada. a. Cepa 111. b. Cepa 131. c. Cepa 156. d. Cepa 162. e. Cepa 161. f. Cepa 314.

En las figura 25, 26 y 27 se observan las cepas que no presentaron actividad

para alguno de los días evaluados o en su defecto para los tres como es el

caso de la cepa 303, la cual no reportó actividad enzimática cualitativa para

ninguno de los tres días de lectura. Así mismo las cepas 206, 207, 208, 210,

310 y 311 no presentaron actividad enzimática proteolítica para el día 4 de

lectura, y para el día 6 de lectura no se obtuvo actividad enzimática para la

cepa 205, así mismo para las cepas 206, 207, y 311 (Anexo 9).

91

Figura 24. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de animales.

Los resultados obtenidos en la actividad enzimática cualitativa para cada

grupo de cepas aisladas de animales, humanos y plantas presentaron

homogeneidad de varianza por lo que los datos fueron analizados con la

prueba no paramétrica de Kruskal Wallis (95%), la cual no detectó diferencias

significativas (P>0.05) entre los días de muestreo ni entre las cepas

evaluadas, sugiriendo que el día en el que se evalué la actividad enzimática

cualitativa de las cepas es totalmente independiente de la actividad, aunque

varíe numéricamente en cada día de muestreo independientemente de que

sea mayor o menor.

Las pruebas de actividad enzimática cualitativa demostraron la actividad

proteolítica de las cepas por medio de halos o zonas claras de hidrólisis

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

108 111 121 131 155 156 159 160 161 162

halo

de H

idro

lisis

(cm

)

Cepas

HALO DE HIDRÓLISIS 2 DÍA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA

92

alrededor de las colonias. Cada uno de los resultados obtenidos por las

cepas evaluadas fue comparado con un control positivo, T. mentagrophytes,

el cual mostró halos de hidrólisis de 0.2 para los días 2,4 y 6 de lectura. A su

vez cada halo de hidrólisis fue comparado con un control negativo, P.

ostreatus, el cual a pesar de mostrar crecimiento durante el tiempo de

incubación no mostró actividad proteolítica alguna (Anexo 9).

Figura 25. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de humanos.

Las cepas que mostraron mayor actividad cualitativa para el día 2 de lectura

fueron la 108, 156, 208 y la 314 con valores de 0.2 cm, 0.2 cm, 0.2 cm y 0.8

cm de halos de hidrólisis respectivamente, para el día 4 de lectura fueron la

161, 203 y 314 con valores de 0.3 cm, 1.2 cm y 1.6 cm de halos de hidrólisis

respectivamente y para el día 6 de lectura fueron la 108, 156, 203, y 314 con

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

201 202 203 204 205 206 207 208 209 210

Halo

de H

idro

lisis

(cm

)

Cepas

HALO DE HIDRÓLISIS 2 DÍA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA

93

valores de 0.6 cm, 0.6 cm 0.7 cm y 0.5 cm de halos de hidrólisis

respectivamente (Anexo 9) (Figuras 26, 27 y 28).

Figura 26. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de plantas.

Por lo anterior se infiere que la cepa 314 proveniente de aislamiento de

planta, se mantiene durante el tiempo de incubación como la mejor cepa con

actividad enzimática proteolítica dentro de su grupo, mostrando un mejor

comportamiento en comparación con todas las cepas evaluadas y a su vez

con el control positivo usado, T. mentagrophytes, que a pesar de no producir

halos de hidrólisis grandes, estos fueron consistentes y traslúcidos,

sugiriendo que sin importar el tamaño numérico de los halos producidos su

actividad enzimática cuantitativa podría ser mayor.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317

Halo

de H

idro

lisis

(cm

)

Cepas

HALO DE HIDRÓLISIS 2 DÍA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA

94

Figura 27. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y caseína de las cepas aisladas de animales.

Lo anterior es de gran importancia para fines del estudio ya que al ser T.

mentagrophytes un hongo patógeno que causa severas dermatomicosis en

animales y humanos, se espera que posea enzimas proteolíticas las cuales

se cree le ayudan en la penetración, colonización e invasión de tejidos

epidérmicos (constituídos por queratina). Por lo anterior, las pruebas

cualitativas realizadas sugieren que todas las cepas tienen actividad

proteolítica independientemente del tamaño del halo de hidrólisis observado

por cada una de ellas. La actividad proteolítica fue más visible para las cepas

aisladas de lesiones de animales que para los demás grupos de cepas. Aún

así la capacidad enzimática observada por las cepas provenientes de plantas

sugiere una posible capacidad de colonizar sustratos proteolíticos causando

de esta manera enfermedades en animales o humanos.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

108 111 121 131 155 156 159 160 161 162

Co

ncen

tació

n d

e T

iro

sin

a (

um

ol/m

l)

Cepas

CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)

CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Caseína)

95

Por otro lado, la rápida dispersión del micelio en las pruebas cualitativas

sugiere que el sustrato proteico puede inducir la rápida propagación o

proliferación del hongo originando así que se den dermatomicosis o lo que es

mucho peor una invasión infecciosa.

Figura 28. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de caldo leche descremada y caldo caseína de las cepas aisladas de animales.

Las pruebas de actividad enzimática cuantitativa mostraron la capacidad

proteolítica de las cepas por la liberación de tirosina, debido a la producción

de proteasas que degradaron el sustrato proteico permitiendo que el

resultado de la degradación fuera tomado por el hongo para poder

desarrollarse.

Las cepas que mostraron mayor actividad realizando la fermentación en

caldo leche descremada fueron la 111, 210 y 310 con valores de 1.569

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

108 111 121 131 155 156 159 160 161 162

Un

idad

es P

rote

olíti

cas (

U/L

)

Cepas

UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)

UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Caseína)

96

μmol/mL, 1.942 μmol/mL y 1.388 μmol/mL de tirosina liberada con una

actividad proteolítica de 26.1 U/L, 32.4 U/L y 23.1 U/L respectivamente. Las

cepas que mostraron mayor actividad realizando la fermentación en caldo

caseína fueron 111, 203 y 315 con valores de tirosina liberada de 1.770

μmol/mlL, 2.423 μmol/mlL y 1.555 μmol/mlL con una actividad proteolítica de

29.5 U/L, 40.4 U/L y 25.9 U/L respectivamente (Anexo 10) (Figuras 29, 30,

31, 32, 33 y 34).

Figura 29. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y caldo caseína de las cepas aisladas de humanos.

Si se comparan los resultados con los controles usados se tiene que las

cepas que tuvieran mayor actividad enzimática superan los resultados

obtenidos por el control positivo, T. mentagrophytes, el cual mostró 0.651

μmol/mlL de tirosina liberada con una actividad enzimática de 10.9 U/L y

0.695 μmol/mL de tirosina liberada con una actividad enzimática de 11.6 U/L

para cultivos realizados en caldo leche descremada y caldo caseína

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

201 202 203 204 205 206 207 208 209 210

Co

ncen

tració

n d

e T

iro

sin

a (

um

ol/m

l)

Cepas

CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)

CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Caseína)

97

respectivamente. De igual forma se compararon los resultados obtenidos por

el control negativo usado, Colletotrichum sp., el cual mostró resultados de

0.501 μmol/mL de tirosina liberada con una actividad enzimática de 8.4 U/L y

0.366 μmol/mL de tirosina liberada con una actividad enzimática de 6.1U/L

para cultivos realizados en caldo leche descremada y caldo caseína

respectivamente. Aún así aunque existieron diferencias numéricas con

algunas cepas, en general no hubo diferencia estadísticas (P> 0.05) entre los

controles y las cepas evaluadas (Anexo 10).

Según la prueba de comparaciones de medias de Tukey (95%) la mayoría de

las cepas evaluadas resultaron no tener diferencia estadísticamente

significativas (P>0.05) con respecto a ellas mismas ni con el control positivo

ni con el control negativo, además de no encontrarse diferencia estadística

entre usar caldo leche descremada o caldo caseína, a excepción de las

cepas 155, 156, 160, 203, 204, 210, 310 y 317 para las cuales existió

diferencia estadísticamente significativa (P<0.05) y numérica si la

fermentación se realizaba en caldo leche o en caldo caseína (Anexo 10).

Siendo para las cepas 155, 156, 160, 210 y 310 mejor numéricamente el

resultado obtenido de la actividad enzimática en caldo leche descremada a

diferencia de las cepas 203, 204 y 317 en las cuales resultó mejor

numéricamente el resultado de la actividad enzimática en caldo caseína

(Anexo 10) (Figuras 29, 30, 31, 32, 33 y 34).

98

Figura 30. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de caldo leche descremada y caseína de las cepas aisladas de humanos.

A si mismo la prueba de comparación de medias de Tukey (95%) demostró

que la mayor o menor concentración de tirosina liberada es dependiente de

cada una de las cepas evaluadas. Aunque existió homogeneidad de grupos,

la concentración de tirosina liberada resulta independiente numéricamente

para cada cepa.

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

201 202 203 204 205 206 207 208 209 210

Un

ida

de

s P

rote

olí

tic

as (

u/L

)

Cepas

UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)

UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Caseína)

99

Figura 31. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y caldo caseína de las cepas aisladas de plantas.

La determinación proteolítica de los extractos enzimáticos obtenidos a partir

de caldo leche descremada y caseína se realizó, debido a que en el

momento de evaluar la actividad proteolítica a partir del extracto enzimático

obtenido en caldo leche descremada el blanco abiótico de la prueba (caldo

leche descremada en las mismas condiciones de la prueba 30ºC y 150 rpm)

arrojó una lectura de concentración de tirosina de 1.626 μmol/mL por lo que

se realizó la misma prueba usando caldo caseína asumiendo que esta no

tendría lectura de concentración de tirosina, sin embargo el resultado mostró

una concentración de 2.187 μmol/mL, valor superior al obtenido en caldo

leche descremada. Este resultado no era esperado teniendo en cuenta que

este sustrato era caseína tipo reactivo, que se asume no debería contener

impurezas (aminoácidos). Estos valores mencionados anteriormente fueron

restados a cada una de las tres lecturas obtenidas de la réplica de cada

cepa, tanto para las pruebas en que la fermentación fue en caldo leche

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317Co

ncen

tració

n d

e T

iro

sin

a (

um

ol/m

l)

Cepas

CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)

CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Caseína)

100

descremada como para las pruebas en las que la fermentación se realizó en

caldo caseína.

Figura 32. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de caldo leche descremada y caseína de las cepas aisladas de plantas.

Aún así la determinación de la actividad proteolítica de las cepas, sugiere

que tanto las cepas provenientes de animales, humanos y plantas tienen la

capacidad enzimática de degradar sustratos proteínicos.

Para fines de este estudio estos resultados son de gran relevancia, ya que

estos indican la posible capacidad de las cepas provenientes de aislamientos

de lesiones de plantas, para causar enfermedad en animales y humanos,

pues la presencia de estas enzimas es uno de los factores enzimáticos

necesarios para poder causar infección en estos hospederos.

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317

Un

idad

es E

nzim

áti

cas (

U/L

)

Cepas

UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)

UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Caseína)

101

En cuanto a las cepas de animales y humanos podría indicar la posible

capacidad de estos dos grupos, de causar infección cruzada en plantas y lo

que es aún más importante, confirma lo esperado, de que las cepas

provenientes de aislamientos de lesiones animales y humanas, tengan

actividad proteolítica, pues son aislamientos de dermatomicosis, lo que indica

una posible adaptación de su metabolismo a sustratos proteicos.

En cuanto a la acción de estas enzimas proteolíticas como factores de

virulencia en la patogénesis causada en animales y humanos, se cree que

trabajan junto a las lipasas y fosfolipasas ya que la liberación de ácidos

grasos ocasionada por la actividad de las enzimas lipolíticas crea el ambiente

óptimo, debido al cambio de pH para que sean secretadas las enzimas

proteolíticas (Stehr et al., 2003).

Por otra parte la penetración y colonización de las plantas por hongos

fitopatógenos del género Fusarium por lo general está asociada a la

secreción de enzimas degradadoras de carbohidratos, recibiendo menos

importancia las proteasas extracelulares las cuales han sido reconocidas

como un prerrequisito fundamental para la excelente penetración de la planta

por parte del hongo. Dentro de los posibles blancos que pueden ser atacados

por estas enzimas se encuentran las glicoproteínas como las extensinas la

cuales son responsables del ensamblaje de la pared celular y la extensión de

la misma (Pekkarinen, et al., 2000; Roncero et al., 2000; Juge, 2006).

La secreción de estas enzimas también permite al patógeno la inactivación

de componentes proteicos de la planta como quitinasas y β-1,3-glucanasas,

enzimas hidrolíticas liberas como respuesta de defensa a la acción infectiva

del patógeno (Roncero et al., 2000).

102

7.2. Consideraciones finales

Los resultados obtenidos de los perfiles enzimáticos amilolíticos, celulolíticos,

pectinolíticos y proteolíticos para cada una de las cepas evaluadas,

indistintamente a que pertenecieran a aislamientos de lesiones en animales,

humanos y plantas, pueden ser correlacionados con la posible capacidad que

tienen estas cepas de producir infección cruzada en diferentes hospederos.

Tabla 2. Cepas con mayor actividad enzimática celulolítica, pectinolítica y proteolítica cualitativa.

ACTIVIDAD CELULOLÍTICA

PROCEDENCIA LECTURAS CEPAS HALO DE HIDRÓLISIS

(cm)

ANIMAL

DÍA 2 160 1

DÍA 4 111 1,1

DÍA 6 111 1,1

HUMANO

DÍA 2 206 0,8

DÍA 4 203 0,6

DÍA 6 204 0,4

PLANTA

DÍA 2 309 1,3

DÍA 4 314 0,8

DÍA 6 314 1

ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA

ANIMAL

DÍA 2 108 0,8

DÍA 4 108 0,9

DÍA 6 111 1,6

HUMANO

DÍA 2 201 1,2

DÍA 4 207 0,7

DÍA 6 206 1

PLANTA

DÍA 2 313 1,3

DÍA 4 311 1

DÍA 6 314 1,6

ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA

ANIMAL

DÍA 2 108 0,2

DÍA 4 161 0,3

DÍA 6 108 0,6

HUMANO

DÍA 2 208 1,2

DÍA 4 203 1,2

DÍA 6 203 0,7

PLANTA

DÍA 2 314 0,8

DÍA 4 314 1,6

DÍA 6 314 0,5

103

Lo anterior parte del hecho que la capacidad enzimática amilolítica,

celulolítica, y pectinolítica están asociadas directamente con hongos

fitopatógenos, en este caso, propiedades enzimáticas que se creería solo

debieron expresarse en las cepas provenientes de aislamientos de lesiones

de plantas, pero que asimismo se expresaron en las cepas provenientes de

aislamientos de animales y humanos, mostrando para estas determinaciones

enzimáticas la mayor actividad para alguno de los días de lectura (Tablas 2 y

3)

Tabla 3. Cepas con mayor actividad enzimática amilolítica, celulolítica, pectinolítica y proteolítica cuantitativa.

ACTIVIDAD AMILOLÍTICA

PROCEDENCIA LECTURAS CEPAS CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA g/L

ANIMAL DÍA 2 155 1,021

DÍA 4 108 1,346

HUMANO DÍA 2 205 1,685

DÍA 4 208 2,882

PLANTA DÍA 2 313 1,016

DÍA 4 315 1,774

ACTIVIDAD CELULOLÍTICA

PROCEDENCIA LECTURAS CEPAS CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA g/L

ANIMAL DÍA 2 161 0,527

DÍA 4 155 0,683

HUMANO DÍA 2 202 0,614

DÍA 4 206 0,671

PLANTA DÍA 2 312 0,490

DÍA 4 305 0,628

ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA

PROCEDENCIA LECTURAS CEPAS CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO

GALACTURÓNICO g/L

ANIMAL DÍA 2 111 2,295

DÍA 4 156 1,145

HUMANO DÍA 2 202 1,361

DÍA 4 210 0,213

PLANTA DÍA 2 314 2,507

DÍA 4 311 0,653

ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA

PROCEDENCIA CEPAS CONCENTRACIÓN DE TIROSINA μmol/ml

ANIMAL 111 1,569

HUMANO 210 2,423

PLANTA 310 1,388

104

Como se observa en la tabla 3, las cepas 205 y 208 aisladas de lesiones

humanas, mostraron la mayor actividad enzimática amilolítica referente a

concentración liberada de glucosa en g/L para los días 2 y 4 de lectura.

En la actividad enzimática celulolítica las cepas 202 y 155 aisladas de una

lesión humana y animal respectivamente, mostraron la mayor actividad

referente a concentración liberada de glucosa en g/L para los días 2 y 4

respectivamente, aún así las figuras 9, 10, y 11 muestran una

comportamiento de la actividad enzimática numéricamente similar, aunque si

se analizara el comportamiento de la actividad enzimática por origen

posiblemente resultaría diferente, debido a que las cepas fueron aisladas de

hospederos diferentes.

En cuanto a la actividad enzimática pectinolítica, las cepas 314 y 156

aisladas de una lesión de planta y animal respectivamente, mostraron la

mayor actividad referente a concentración liberada de ácido galacturónico en

g/L para los días 2 y 4 de lectura respectivamente.

Por otra parte, la determinación de la actividad enzimática proteolítica, para

cada una de las 32 cepas evaluadas, haciendo énfasis en las cepas aisladas

de lesiones de plantas, no solo indica la capacidad de éstas de degradar

barreras constitutivas de su hospedero de origen, como son las extensinas

(proteínas constitutivas de la pared celular de las plantas), sin embargo, lo

más importante, es que está capacidad enzimática esta ligada ampliamente a

la degradación de sustratos queratináceos que se encuentran como

constituyentes principales en la epidermis, barrera de suma importancia en

animales y humanos, ya que sirve de protección frente a la entrada de

agentes patógenos como los hongos causantes de dermatomicosis y

queratitis.

Se esperaba, que las cepas aisladas de lesiones de animales y humanos

presentaran mayores actividades proteolíticas, debido a que esta actividad

105

está altamente asociada a la degradación de la queratina, una

escleroproteína muy resistente, la cual integra la mayor parte del material

contenido en las células que forman la epidermis de la piel de humanos,

pelos, uñas, escamas, plumas, espinas, cuernos y pezuñas de animales

(Mitola et al., 2001). Los resultados obtenidos fueron los esperados, ya que la

cepa que tuvo mayor actividad proteolítica fue la 210 seguida de la 111 y la

310. La determinación de esta actividad indica la posible capacidad de las

cepas aisladas de lesiones animales y humanas de degradar sustratos

proteicos vegetales así mismo la posible capacidad de causar infección en

animales y humanos por parte de las cepas aisladas plantas, si se les

presenta la oportunidad de colonizar hospederos de este tipo.

Sin embargo, es importante mencionar que la expresión de complejos

enzimáticos amilolíticos, celulolíticos, pectinolíticos y proteolíticos se

presenta como una adaptación metabólica a los sustratos presentes en el

medio ambiente que el hongo coloniza. Por lo anterior, es necesario tener en

cuenta que las cepas aisladas de plantas, tenían una inducción enzimática

amilolítica, celulolítica y pectinolítica, que es de suponer no tenían las cepas

provenientes de aislamientos animales y humanos. Por otra parte las cepas

provenientes de aislamientos de animales y humanos, tenían una inducción

enzimática lipolítica que no se pudo determinar bajo la metodología descrita

en este estudio, y una inducción proteolítica que se asume no tenían en la

misma proporción las cepas provenientes de aislamientos de plantas, por lo

que todo resultado obtenido en las determinaciones enzimáticas se tomó

como positivo.

Las tablas 2 y 3 también muestran las cepas que se destacaron por encima

de su grupo de procedencia, durante la realización de las determinaciones

enzimáticas amilolíticas, celulolíticas, pectinolíticas y proteolíticas. Cepas que

se deberían tener específicamente en cuenta para posteriores estudios

acerca de la capacidad multihospedero del género Fusarium.

106

La tabla 4 muestra las cepas que mostraron simultáneamente las mayores

actividades enzimáticas amilolíticas, celulolíticas pectinolíticas y proteolíticas,

dentro de su grupo de procedencia por cada día de lectura (Tabla 4).

Tabla 4. Cepas destacadas en la determinación enzimática amilolítica, celulolítica, pectinolítica y proteolítica.

Procedencia Cepas

Animales 108,111*,155,160,161

Humanos 202,203,206*,208,210

Plantas 311,313,314*

*Cepas que prevalecieron durante los días de lectura con los mayores valores en las

determinaciones enzimáticas.

Por otra parte, el análisis estadístico de las determinaciones enzimáticas por

origen de aislamiento no se pudo realizar debido a que todas las cepas

evaluadas no pertenecen a la misma especie aunque sí al mismo género. No

obstante el análisis por origen de procedencia de las cepas, permitiría

relacionar con mayor facilidad la capacidad multihospedero del género.

Aún así, el análisis de resultados de la determinación de las actividades

enzimáticas por cepa permite relacionar la posible capacidad multihospedero

de las cepas, además los resultados de este estudio permiten hacer una

primera aproximación, para asegurar en futuros estudios que la capacidad

enzimática es un modelo de factor de virulencia asociado a hongos con

capacidad multihospedero.

107

8. CONCLUSIONES

Las cepas evaluadas provenientes de aislamientos de animales,

humanos y plantas presentaron actividad amilolítica a nivel cuantitativo

más no a nivel cualitativo usando almidón hidrosoluble como sustrato.

Las cepas evaluadas provenientes de aislamientos de animales,

humanos y plantas presentaron actividad celulolítica tanto a nivel

cualitativo como cuantitativo usando carboximetilcelulosa como sustrato.

No se encontraron cepas con actividad lipolítica al usar como sustrato de

inducción yema de huevo al 2% (v/v) y como sustrato de reacción

enzimática p-nitrofenol-palmitato.

Las cepas evaluadas provenientes de aislamientos animales, humanos y

plantas presentaron actividad proteolítica tanto a nivel cualitativo como a

nivel cuantitativo usando leche descremada como sustrato.

Se pudo establecer por medio de las pruebas cuantitativas de actividad

proteolítica, que en general el caldo leche descremada como medio de

cultivo de inducción, permite la obtención de mayores actividades

enzimáticas por cada cepa evaluada en comparación con el caldo

caseína.

La prueba de comparación de medias de Tukey (95%) no detectó

diferencia estadística (P<0.05) más si numérica, en la evaluación de tres

días de lectura en las pruebas cualitativas, sugiriendo que solo un día de

lectura es suficiente para determinar la actividad enzimática de las cepas.

108

La prueba de comparación de medias de Tukey (95%) mostró diferencia

estadística (P<0.05) y numérica en la determinación indirecta de la

actividad amilolítica, celulolítica y pectinolítica, de las cepas en los dos

días de lectura. Igualmente la prueba de comparación de medias de

Tukey (95%) mostró diferencia estadística y numérica en cuanto al

comportamiento mostrado por cada cepa en dichas actividades

enzimáticas, sugiriendo que el perfil enzimático amilolítico, celulolítico y

pectinolítico es único de cada cepa.

La prueba cuantitativa amilolítica permitió determinar la capacidad

enzimática de las cepas, mientras que las pruebas cualitativas arrojaron

resultados negativos.

Las pruebas cuantitativas permitieron determinar las actividades

enzimáticas amilolíticas, celulolíticas, pectinolíticas y proteolíticas de las

cepas evaluadas de manera eficaz y segura.

La determinación de los perfiles enzimáticos amilolíticos, celulolíticos,

pectinolíticos y proteolíticos de cada una de las cepas evaluadas

pertenecientes al género Fusarium, sugirió la capacidad de éstas,

indistintamente de su procedencia de degradar estos sustratos, además

de ser un posible mecanismo de patogenicidad utilizado por los hongos

con capacidad multihospedero.

109

9. RECOMENDACIONES

Evaluar en futuros estudios la adición de fuentes de nitrógeno orgánicas

como extracto de levadura o peptona, para determinar de esta manera si

inhiben la secreción de cada una de las enzimas evaluadas o si por el

contrario ayuda a la secreción de estas.

Evaluar la posible presencia de enzimas lipolíticas de cada una de las

cepas evaluadas, ensayando nuevas técnicas y sustratos de inducción de

enzimas y sustratos de reacción enzimática, con el fin de descartar o no

la posible capacidad lipolítica de cada hongo.

Evaluar de igual manera si la no cuantificación de actividad lipolítica se

debió a la inestabilidad de las posibles enzimas lipolíticas a solventes

orgánicos como la acetona, solvente usado en la técnica de p-nitrofenol.

Realizar cultivos enzimáticos a menos de dos días de fermentación para

las actividades enzimáticas amilolítica, celulolítica, pectinolítica y

proteolítica, debido a la alta velocidad de producción de estas enzimas.

Evaluar la actividad amilolítica, celulolítica y pectinolítica de las cepas por

reacción enzimática en sustratos específicos, debido a que son

complejos enzimáticos.

Evaluar el extracto enzimático amilolítico de cada una de las cepas en

placas de agar con el fin de evidenciar su capacidad enzimática

cualitativa.

Realizar lectura de halos de hidrólisis para las actividades celulolítica,

pectinolítica y proteolítica de las cepas después de un tiempo no mayor a

110

3 días de incubación, para evitar que la alta tasa de crecimiento del

microorganismo interfiera en la lectura.

Evaluar a futuro las actividades enzimáticas a una temperatura de 37ºC,

esto con el fin de saber si las cepas evaluadas son capaces de degradar

sustratos como el almidón, celulosa, leche descremada, yema de huevo y

pectina, a dicha temperatura, lo cual estaría directamente relacionado

con la capacidad del patógeno de superar la primera barrera de

protección por parte de los mamíferos incluyendo el hombre.

Considerar el cambio de los controles positivos como de los controles

negativos esto con el fin de tener mejor confiabilidad de los resultados

obtenidos por las cepas evaluadas para cada una de las actividades

enzimáticas.

111

10. REFERENCIAS

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121

11. ANEXOS

Anexo 1. Medios De Cultivo

Agar Papa Dextrosa

Extracto de Papa 4 g/L

Glucosa 20 g/L

Agar Agar 18 g/L

Agar Almidón

Almidón Hidrosoluble 1% (p/v)

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

Fosfato Monobasico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

Agar Agar 18 g /L

Agar Carboximetilcelulosa

Carboximetilcelulosa 1% (p/v)

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

Agar Agar 18 g /L

Agar Leche

Leche Descremada en Polvo Hi Calcium 1% (p/v)

122

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

Agar Agar 18 g /L

Agar Pectina

Péctina Citrica 1% (p/v)

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

Agar Agar 18 g /L

Agar Yema de Huevo

Yema de Huevo 2% (v/v)

Extracto de Levadura 2.5 g/L

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

Agar Agar 18 g /L

Caldo Almidón

Almidón Hidrosoluble 1% (p/v)

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

123

Fosfato Monobasico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

Agar Agar 18 g /L

Caldo Caseína

Caseína 1% (p/v)

Buffer fosfato 0.1M pH 7.0 (Solvente)

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

Fosfato Monobasico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

Caldo Carboximetilcelulosa

Carboximetilcelulosa 1% (p/v)

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

Caldo Leche

Leche Descremada en Polvo Hi Calcium 1% (p/v)

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

Caldo Pectina

Péctina Citrica 1% (p/v)

124

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

Caldo Yema de Huevo

Yema de Huevo 20 mL/L

Extracto de Levadura 2.5 g/L

Sulfato de Amonio 0.5 g/L

Cloruro de Calcio 0.5 g/L

Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L

Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L

125

Anexo 2. Curvas de Calibración

Curva patrón para la determinación de azúcares reductores

Curva patrón para la determinación de glucosa.

Se realizó una solución de glucosa a una concentración de 2 g/L. A partir del

stock se prepararon soluciones de 0.5 g/L a 2 g/L de glucosa en un volumen

final de 2 ml. A continuación se tomo 0.25 ml de cada una de las soluciones

y se le adicionó 0.25 ml de reactivo DNS. Luego se llevaron a ebullición

durante 5 minutos, pasado este tiempo, se detuvo la reacción rápidamente

metiendo los tubos a baño de hielo durante 5 minutos. Después se adicionó

2.5 ml de agua destilada y se procedió a leer en el espectrofotómetro a 540

nm utilizando como blanco 0.25 ml de agua destilada y 0.25 ml de reactivo

DNS. Finalmente se realizó la curva patrón graficando absorbancia en

función de la concentración de glucosa g/L.

y = 0,507x - 0,0008R² = 0,999

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 1 2 3

Ab

so

rbacia

540 n

m

Concentración de Glucosa (g/L)

CURVA PATRÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA

126

Curva patrón para la determinación de ácido galacturónico.

Se realizó una solución de ácido galacturónico a una concentración de 2 g/L.

A partir del stock se prepararon soluciones de 0.5 g/L a 2 g/L de ácido

galacturónico en un volumen final de 2 ml. A continuación se tomo 0.25 ml

de cada una de las soluciones y se le adicionó 0.25 ml de reactivo DNS.

Luego se llevaron a ebullición durante 5 minutos, pasado este tiempo, se

detuvo la reacción rápidamente metiendo los tubos a baño de hielo durante 5

minutos. Después se adicionó 2.5 ml de agua destilada y se procedió a leer

en el espectrofotómetro a 540 nm utilizando como blanco 0.25 ml de agua

destilada y 0.25 ml de reactivo DNS. Finalmente se realizó la curva patrón

graficando absorbancia en función de la concentración de ácido

galacturónico g/L.

y = 0,4426x + 0,0155R² = 0,9958

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Ab

so

rban

cia

540 n

m

Concentración de Ácido Galacturónico (g/L)

CURVA PATRÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE ÁCIDO GALACTURÓNICO

127

Curva patrón para la determinación de p-nitrofenol.

Se realizó una solución de p-nitrofenol fosfato a una concentración de 1

µmol/ml en buffer fosfato a 0.1 M pH. 7.0. A partir del stock se prepararon

soluciones de 0.3 µmol/ml a 0.9 µmol/ml de p-nitrofenol en buffer fosfato

0.1M pH. 7.0 volumen final de 2 ml. A continuación se procedió a leer en

espectrofotómetro a 450 nm utilizando como blanco buffer fosfato 0.1 M pH.

7.0. Finalmente se realizó la curva patrón graficando absorbancia en función

de la concentración de p-nitrofenol µmol/ml.

y = 1,1723x + 0,0218R² = 0,9995

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Ab

so

rban

cia

450 n

m

Concentración de p-nitrofenol (µmol/ml)

CURVA PATRÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE P-NITROFENOL

128

Curva patrón para la determinación de tirosina.

Se realizó una solución de tirosina a una concentración de 1 µmol/ml en

buffer fosfato a 0.1 M pH. 7.0. A partir del stock se prepararon soluciones de

0.1 µmol/ml a 1 µmol/ml de tirosina en buffer fosfato 0.1M pH. 7.0 volumen

final de 2 ml. A continuación se procedió a leer en espectrofotómetro a 280

nm utilizando como blanco buffer fosfato 0.1 M pH. 7.0. Finalmente se realizó

la curva patrón graficando absorbancia en función de la concentración de

tirosina µmol/ml.

y = 0,8978x + 0,0533R² = 0,9991

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 0,5 1 1,5

Ab

so

rban

cia

a 2

80 n

m

Concentración de Tirosina (µmol/ml)

CURVA PATRÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE TIROSINA

129

Anexo 3. Resultados prueba de actividad enzimática amilolítica cuantitativa.

CEPAS CONCENTRACIÓN

DE GLUCOSA (g/L) 2 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

% DE RENDIMIENTO

NETO DE AZÚCARES

REDUCTORES 2 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA

(g/L) 4 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

% DE RENDIMIENTO

NETO DE AZÚCARES

REDUCTORES 4 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

108 0,840 0,046 7,564 0,415 1,346 0,193 12,114 1,736

111 0,098 0,059 0,883 0,534 0,265 0,030 2,383 0,266

121 0,030 0,010 0,268 0,091 0,092 0,053 0,827 0,479

131 0,368 0,112 3,309 1,011 0,857 0,222 7,709 1,999

155 1,021 0,172 9,185 1,548 0,115 0,050 1,034 0,446

156 0,919 0,137 8,274 1,236 0,214 0,108 1,928 0,968

159 0,028 0,040 0,250 0,360 0,081 0,035 0,732 0,312

160 0,031 0,018 0,280 0,161 0,215 0,213 1,933 1,920

161 0,788 0,196 7,096 1,768 0,175 0,086 1,572 0,771

162 0,538 0,153 4,842 1,376 0,201 0,056 1,809 0,506

201 0,564 0,100 5,079 0,899 0,196 0,062 1,762 0,562

202 0,648 0,098 5,836 0,886 1,626 0,183 14,638 1,651

203 0,071 0,031 0,635 0,275 0,100 0,054 0,904 0,483

204 1,222 0,604 10,996 5,439 1,067 0,842 9,602 7,579

205 1,685 0,259 15,161 2,331 1,638 0,120 14,738 1,084

206 1,062 0,081 9,558 0,728 0,717 0,120 6,454 1,077

207 0,898 0,002 8,079 0,020 0,887 0,526 7,987 4,738

208 0,874 0,234 7,865 2,106 2,882 0,130 25,939 1,172

209 0,410 0,213 3,694 1,917 0,280 0,071 2,519 0,642

210 0,533 0,068 4,794 0,615 0,400 0,192 3,602 1,731

302 0,546 0,264 4,913 2,377 0,574 0,022 5,164 0,200

303 0,656 0,117 5,907 1,057 0,699 0,223 6,288 2,007

305 0,158 0,126 1,422 1,131 0,246 0,105 2,212 0,941

308 0,086 0,053 0,777 0,481 0,071 0,011 0,643 0,098

309 0,319 0,004 2,871 0,037 0,362 0,021 3,259 0,190

310 0,115 0,005 1,037 0,047 0,139 0,053 1,247 0,480

311 0,075 0,037 0,676 0,336 0,098 0,048 0,886 0,431

312 0,562 0,014 5,055 0,128 0,513 0,127 4,614 1,140

313 1,016 0,444 9,144 3,992 1,144 0,755 10,294 6,797

314 0,956 0,205 8,605 1,849 1,340 0,337 12,058 3,030

315 0,879 0,091 7,913 0,817 1,774 0,018 15,969 0,159

317 0,558 0,329 5,019 2,965 0,726 0,517 6,531 4,654

C+ R. solani 0,057 0,026 0,510 0,232 1,670 2,788 15,034 25,089

C-T. mentagrophytes 0,050 0,023 0,451 0,209 0,048 0,017 0,430 0,153

C Sin Inoculo 0,000 0,003 0,000 0,027 0,012 0,017 0,000 0,151

C Medio 0,000 0,000 0,000 0,000 0.000 0,000 0,000 0,000

C+T. harzianum 0,247 0,016 2,221 0,142 4,541 0,338 40,868 3,042

130

Anexo 4. Resultados prueba de actividad enzimática celulolítica cualitativa.

CEPAS HALO DE HIDRÓLISIS 2

DÍA DE LECTURA DESVIACIÓN ESTÁNDAR

HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE

LECTURA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

108 0,3 0,2 0,2 0,1 0,2 0,1

111 0,6 0,3 1,0 0,5 1,1 0,6

121 0,9 0,4 0,9 0,4 0,4 0,2

131 0,3 0,2 0,2 0,1 0,4 0,2

155 0,5 0,3 0,6 0,3 0,0 0,0

156 0,6 0,3 1,0 0,5 0,0 0,0

159 0,8 0,5 1,0 0,7 0,5 0,3

160 1,0 0,5 0,5 0,3 0,5 0,2

161 0,8 0,4 1,1 0,5 1,1 0,6

162 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,0

201 0,2 0,2 0,3 0,2 0,1 0,1

202 0,5 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1

203 0,6 0,4 0,6 0,3 0,0 0,0

204 0,1 0,1 0,2 0,1 0,4 0,2

205 0,1 0,1 0,3 0,2 0,1 0,1

206 0,8 0,4 0,5 0,3 0,0 0,0

207 0,3 0,2 0,5 0,3 0,1 0,0

208 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,0

209 0,2 0,2 0,1 0,0 0,0 0,0

210 0,0 0,0 0,5 0,3 0,0 0,0

302 0,3 0,2 0,3 0,2 0,0 0,0

303 0,7 0,4 0,3 0,2 0,5 0,2

305 0,2 0,1 0,4 0,2 0,2 0,2

308 0,7 0,4 0,8 0,4 0,5 0,3

309 1,3 0,7 0,6 0,3 0,2 0,1

310 0,4 0,2 0,5 0,3 0,2 0,1

311 0,5 0,3 0,3 0,2 0,8 0,4

312 0,3 0,2 0,5 0,2 0,2 0,1

313 0,4 0,2 0,4 0,2 0,3 0,2

314 1,1 0,6 0,8 0,4 1,0 0,6

315 0,6 0,3 0,5 0,3 0,6 0,3

317 0,3 0,2 0,4 0,2 0,2 0,1

C+ P. ostreatus 0,2 0,1 0,6 0,3 1,0 0,5

C- T. mentagrophytes

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

131

Anexo 5. Resultados prueba actividad enzimática celulolítica cuantitativa.

CEPAS

CONCENTRACIÓN TOTAL DE

GLUCOSA (g/l) 2 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

% DE RENDIMIENTO

NETO DE AZÚCARES

REDUCTORES 2 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

CONCENTRACIÓN TOTAL DE

GLUCOSA (g/l) 4 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

% DE RENDIMIENTO

NETO DE AZÚCARES

REDUCTORES 4 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

108 0,209 0,062 1,882 0,562 0,588 0,125 5,288 1,125

111 0,209 0,015 1,884 0,132 0,531 0,038 4,777 0,341

121 0,210 0,030 1,888 0,272 0,355 0,025 3,193 0,229

131 0,286 0,027 2,576 0,240 0,600 0,025 5,400 0,225

155 0,490 0,025 4,412 0,222 0,683 0,026 6,146 0,236

156 0,426 0,021 3,836 0,185 0,634 0,034 5,706 0,310

159 0,217 0,025 1,955 0,227 0,360 0,022 3,241 0,201

160 0,201 0,011 1,811 0,098 0,300 0,034 2,698 0,304

161 0,527 0,037 4,742 0,337 0,636 0,069 5,726 0,625

162 0,509 0,146 4,582 1,315 0,509 0,010 4,578 0,091

201 0,347 0,086 3,124 0,776 0,578 0,046 5,205 0,410

202 0,614 0,062 5,523 0,557 0,608 0,033 5,469 0,299

203 0,413 0,024 3,718 0,219 0,641 0,024 5,767 0,212

204 0,335 0,011 3,012 0,103 0,548 0,037 4,931 0,334

205 0,330 0,045 2,972 0,402 0,544 0,015 4,893 0,133

206 0,475 0,051 4,278 0,463 0,671 0,038 6,041 0,343

207 0,276 0,037 2,483 0,331 0,467 0,041 4,205 0,370

208 0,323 0,166 2,905 1,494 0,609 0,024 5,485 0,216

209 0,389 0,063 3,503 0,566 0,543 0,075 4,884 0,672

210 0,280 0,159 2,523 1,428 0,504 0,043 4,535 0,384

302 0,478 0,010 4,306 0,091 0,579 0,013 5,215 0,115

303 0,353 0,022 3,176 0,195 0,505 0,016 4,548 0,147

305 0,480 0,049 4,318 0,444 0,628 0,017 5,649 0,150

308 0,297 0,057 2,671 0,516 0,554 0,047 4,990 0,426

309 0,396 0,033 3,562 0,299 0,622 0,004 5,598 0,033

310 0,140 0,044 1,256 0,394 0,386 0,029 3,473 0,263

311 0,144 0,042 1,298 0,380 0,522 0,034 4,702 0,306

312 0,490 0,042 4,410 0,379 0,589 0,022 5,300 0,202

313 0,231 0,026 2,075 0,238 0,444 0,053 3,998 0,476

314 0,440 0,040 3,964 0,356 0,544 0,043 4,895 0,383

315 0,227 0,071 2,041 0,635 0,495 0,025 4,452 0,227

317 0,302 0,019 2,716 0,168 0,548 0,026 4,931 0,232

C+ P. ostreatus 0,108 0,008 0,972 0,071 0,167 0,014 1,505 0,128

C+ T. harzianum 0,481 0,012 4,325 0,104 0,665 0,028 5,986 0,253

C- T. mentagrophytes

0,000 0,000 0,000 0,000 0,055 0,017 0,495 0,151

C Sin Inoculo 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

C Medio 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

132

Anexo 6. Resultados pruebas actividad enzimática lipolítica cualitativa.

CEPAS

HALO DE HIDRÓLISIS 2

DÍA DE LECTURA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

HALO DE HIDRÓLISIS 4

DÍA DE LECTURA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

HALO DE HIDRÓLISIS 6

DÍA DE LECTURA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

HALO DE HIDRÓLISIS 10 DÍA DE LECTURA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

108 0,33 0,15 0,33 0,15 0,00 0,00 0,00 0,00

111 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

121 0,00 0,00 0,43 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00

131 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00

155 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

156 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

159 0,13 0,06 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

160 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

161 0,07 0,06 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00

162 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

201 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

202 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

203 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

204 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

205 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

206 0,00 0,00 0,93 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00

207 0,00 0,00 0,00 0,00 0,07 0,06 0,00 0,00

208 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

209 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

210 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,20 0,00

302 0,00 0,00 0,67 0,29 0,00 0,00 0,00 0,00

303 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,07 0,06

305 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

308 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

309 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

310 0,10 0,00 0,00 0,00 0,17 0,06 0,00 0,00

311 0,00 0,00 0,20 0,00 0,00 0,00 0,20 0,00

312 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00

313 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

314 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00

315 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,06 0,13 0,12

317 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

C+ T. mentagrophytes 0,50 0,10 0,73 0,57 0,50 0,00 0,53 0,06

C- Colletotrichum sp. 0,00 0,00 0,20 0,00 0,27 0,06 0,37 0,12

133

Anexo 7. Resultados prueba enzimática pectinolítica cualitativa.

CEPAS HALO DE HIDRÓLISIS 2

DÍA DE LECTURA DESVIACIÓN ESTÁNDAR

HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

108 0,8 0,1 0,9 0,1 1,1 0,1

111 0,2 0,1 0,4 0,0 1,6 0,1

121 0,3 0,2 0,8 0,1 1,2 0,1

131 0,3 0,1 0,7 0,1 0,3 0,1

155 0,6 0,1 0,0 0,1 0,5 0,0

156 0,5 0,0 0,0 0,0 0,4 0,1

159 0,2 0,1 0,3 0,1 0,2 0,0

160 0,2 0,2 0,9 0,1 0,5 0,0

161 0,5 0,0 0,6 0,1 0,5 0,1

162 0,5 0,1 0,0 0,0 0,2 0,1

201 1,2 0,1 0,2 0,1 0,0 0,0

202 0,8 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1

203 0,5 0,1 0,5 0,0 0,0 0,0

204 0,5 0,1 0,2 0,1 0,4 0,1

205 0,8 0,1 0,0 0,1 0,2 0,0

206 0,2 0,1 0,0 0,1 1,0 0,2

207 0,7 0,1 0,6 0,1 0,0 0,1

208 0,8 0,1 0,2 0,1 0,2 0,0

209 1,0 0,1 0,0 0,1 0,0 0,0

210 0,7 0,1 0,0 0,1 0,5 0,1

302 0,5 0,1 0,1 0,1 0,0 0,1

303 0,8 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0

305 1,0 0,0 0,2 0,1 0,0 0,1

308 0,8 0,1 0,2 0,1 0,5 0,0

309 0,8 0,1 0,0 0,1 0,2 0,1

310 0,8 0,1 0,0 0,0 0,2 0,1

311 1,1 0,1 1,0 0,1 1,6 0,2

312 0,7 0,1 0,3 0,1 0,0 0,1

313 1,3 0,0 0,0 0,0 0,2 0,1

314 0,8 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1

315 0,3 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1

317 0,8 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1

C+ Colletotrichum sp. 0,1 0,0 0,1 0,0 0,2 0,1

C- T. mentagrophytes 0,1 0,1 0,5 0,0 1,0 0,0

134

Anexo 8. Resultados prueba actividad enzimática pectinolítica cuantitativa.

CEPAS

CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO

GALACTURÓNICO (g/L) 2 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

% DE RENDIMIENTO

NETO DE AZÚCARES

REDUCTORES 2 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO

GALACTURÓNICO (g/L) 4 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

% DE RENDIMIENTO

NETO DE AZÚCARES

REDUCTORES 4 DÍA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

108 1,109 0,061 10,059 0,555 0,000 0,000 0,000 0,000

111 2,295 0,124 20,822 1,128 0,000 0,000 0,000 0,000

121 1,211 0,344 10,983 3,120 0,000 0,000 0,000 0,000

131 0,554 0,298 5,023 2,704 0,000 0,000 0,000 0,000

155 0,701 0,226 6,363 2,050 0,351 0,150 3,185 1,365

156 0,228 0,175 2,072 1,588 1,145 0,075 10,391 0,680

159 0,669 0,445 6,070 4,035 0,000 0,000 0,000 0,000

160 1,248 0,301 11,319 2,735 0,000 0,000 0,000 0,000

161 0,143 0,327 1,298 2,966 0,954 0,007 8,653 0,065

162 1,488 0,261 13,504 2,372 0,296 0,115 2,686 1,043

201 1,200 0,740 10,885 6,712 0,000 0,000 0,000 4,328

202 1,361 0,144 12,343 1,308 0,058 0,017 0,525 0,153

203 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

204 0,510 0,068 4,630 0,618 0,000 0,000 0,000 0,000

205 0,034 0,046 0,308 0,422 0,000 0,000 0,000 0,000

206 0,000 0,000 0,000 0,000 0,046 0,242 0,420 2,193

207 0,230 0,368 2,088 3,343 0,000 0,000 0,000 0,000

208 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

209 0,113 0,229 1,025 2,080 0,000 0,000 0,000 0,000

210 0,557 0,644 5,057 5,841 0,213 0,736 1,929 6,676

302 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

303 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

305 0,089 0,317 0,811 2,878 0,077 0,355 0,698 3,217

308 0,056 0,130 0,509 1,177 0,000 0,000 0,000 0,000

309 0,331 0,085 3,000 0,774 0,000 0,000 0,000 0,000

310 0,000 0,000 0,000 0,000 0,028 0,081 0,256 0,738

311 1,431 0,160 12,985 1,451 0,653 0,399 5,924 3,619

312 0,024 0,203 0,217 1,845 0,000 0,000 0,000 0,000

313 1,460 0,191 13,249 1,732 0,284 0,081 2,579 0,735

314 2,507 1,254 22,742 11,381 0,442 0,167 4,013 1,519

315 0,135 0,133 1,225 1,210 0,288 0,283 2,616 2,572

317 0,271 0,385 2,454 3,492 0,600 0,093 5,446 0,848

C+ Colletotrichum sp. 2,485 0,209 22,546 1,900 2,168 0,051 19,666 0,465

C- T. mentagrophytes 0,090 0,084 0,818 0,758 2,355 0,123 21,363 1,117

C Sin Inoculo 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

C Medio 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

C+ A. niger 0,242 0,061 2,199 0,555 0,159 0,124 1,442 1,128

135

Anexo 9. Resultados prueba actividad enzimática proteolítica cualitativa.

CEPAS HALO DE HIDRÓLISIS 2

DÍA DE LECTURA DESVIACIÓN ESTÁNDAR

HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

108 0,2 0,0 0,2 0,1 0,6 0,1

111 0,1 0,0 0,2 0,3 0,2 0,3

121 0,1 0,0 0,2 0,0 0,1 0,1

131 0,1 0,1 0,1 0,0 0,2 0,0

155 0,1 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1

156 0,2 0,1 0,2 0,1 0,6 0,1

159 0,2 0,1 0,2 0,0 0,3 0,2

160 0,2 0,1 0,2 0,0 0,3 0,1

161 0,1 0,0 0,3 0,2 0,5 0,2

162 0,1 0,0 0,0 0,1 0,4 0,2

201 0,1 0,0 0,2 0,1 0,2 0,1

202 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1

203 0,1 0,0 1,2 1,7 0,7 0,2

204 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

205 0,1 0,0 0,3 0,1 0,0 0,0

206 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

207 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0

208 0,2 0,1 0,0 0,0 0,0 0,1

209 0,1 0,0 0,3 0,1 0,5 0,0

210 0,2 0,0 0,0 0,0 0,2 0,2

302 0,1 0,1 0,3 0,2 0,2 0,2

303 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

305 0,7 0,2 0,4 0,1 0,2 0,0

308 0,1 0,1 0,3 0,2 0,0 0,0

309 0,3 0,1 0,3 0,2 0,0 0,1

310 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0

311 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

312 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

313 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1

314 0,8 0,2 1,6 0,4 0,5 0,3

315 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

317 0,1 0,0 0,2 0,2 0,3 0,1

C+ T. mentagrophytes 0,2 0,0 0,2 0,0 0,2 0,1

C- P. ostreatus 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

136

Anexo 10. Resultados prueba actividad enzimática proteolítica cuantitativa.

CEPAS

CONCENTRACIÓN DE TIROSINA

(umol/ml) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

UNIDADES ENZIMÁTICAS (U/L) (Cultivo

en Caldo Leche

Descremada)

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

CONCENTRACIÓN DE TIROSINA

(umol/ml) (Cultivo en Caldo Caseína)

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

UNIDADES ENZIMÁTICOS (U/L) (Cultivo

en Caldo Caseína)

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

108 1,255 0,115 20,912 1,914 0,636 0,276 10,596 4,596

111 1,569 0,576 26,148 9,592 1,770 0,288 29,492 4,808

121 0,888 0,143 14,799 2,386 1,169 0,180 19,477 2,995

131 1,116 0,418 18,592 6,975 0,660 0,229 11,004 3,818

155 1,274 0,155 21,228 2,579 0,044 0,043 0,729 0,725

156 1,193 0,171 19,881 0,000 0,065 0,028 1,083 0,000

159 0,805 0,077 13,415 1,276 0,145 0,045 2,420 0,742

160 1,016 0,194 16,936 3,235 0,153 0,067 2,550 1,115

161 1,149 0,149 19,156 2,476 1,094 0,133 18,232 2,212

162 0,602 0,035 10,033 0,589 0,295 0,069 4,910 1,152

201 1,351 0,292 22,510 4,872 0,989 0,119 16,486 1,982

202 1,652 0,249 27,527 4,155 1,445 0,062 24,085 1,032

203 0,731 0,851 12,188 14,184 2,423 0,081 40,380 1,349

204 0,806 0,133 13,433 2,211 2,382 0,074 39,693 1,241

205 1,144 0,037 19,072 0,614 0,631 0,057 10,521 0,943

206 1,432 0,145 23,866 2,415 0,854 0,048 14,237 0,797

207 0,872 0,200 14,539 3,338 0,771 0,052 12,844 0,868

208 1,169 0,119 19,490 1,987 0,673 0,084 11,209 1,407

209 1,136 0,205 18,933 3,423 0,539 0,035 8,979 0,587

210 1,942 0,887 32,373 14,786 0,094 0,053 1,566 0,876

302 0,931 0,077 15,524 1,276 1,418 0,037 23,639 0,621

303 0,797 0,067 13,275 1,118 1,172 0,045 19,533 0,742

305 0,805 0,315 13,415 5,250 1,168 0,088 19,459 1,462

308 0,682 0,119 11,371 1,979 0,813 0,062 13,550 1,032

309 0,771 0,291 12,848 4,857 0,833 0,032 13,884 0,532

310 1,388 0,685 23,129 11,414 0,000 0,039 0,000 0,643

311 0,817 0,385 13,622 6,411 0,304 0,050 5,059 0,839

312 0,877 0,043 14,622 0,725 0,768 0,430 12,807 7,165

313 0,611 0,135 10,185 2,246 0,140 0,099 2,327 1,654

314 0,510 0,129 8,497 2,146 0,903 0,029 15,055 0,483

315 1,053 0,475 17,555 7,917 1,555 0,042 25,925 0,698

317 0,563 0,099 9,380 1,650 1,532 0,167 25,534 2,775

C+ T. mentagrophytes 0,651 0,169 10,851 2,813 0,695 0,069 11,580 1,148

C- Colletotrichum sp. 0,501 0,433 8,358 7,216 0,366 0,073 6,099 1,211

C Sin Inoculo 0,000 0,349 -0,004 5,812 0,000 0,000 0,005 0,000

C Medio 0,000 0,349 -0,004 5,812 0,000 0,000 -0,004 0,000

137

Anexo 11. Análisis Estadístico

Análisis de resultados cuantitativo amilolítica de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS ONE-WAY AOV SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 23 59.9915 2.60833 150.70 0.0000 WITHIN 48 0.83077 0.01731 TOTAL 71 60.8223 SAMPLE GROUP VARIABLE MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- CN2 0.0503 3 0.0230 CP2 0.2467 3 0.0156 CN4 0.0477 3 0.0172 CP4 4.5413 3 0.3385 F1082 0.8403 3 0.0457 F1084 1.3460 3 0.1930 F1112 0.0983 3 0.0597 F1114 0.2650 3 0.0295 F1212 0.0297 3 9.713E-03 F1214 0.0920 3 0.0535 F1312 0.3677 3 0.1127 F1314 0.8563 3 0.2222 F1552 1.0207 3 0.1723 F1554 0.1150 3 0.0497 F1562 0.9197 3 0.1372 F1564 0.9197 3 0.1372 F1592 0.0280 3 0.0400 F1594 0.0813 3 0.0346 F1602 0.0310 3 0.0177 F1604 0.2150 3 0.2137 F1612 0.7883 3 0.1962 F1614 0.1747 3 0.0857 F1622 0.5383 3 0.1530 F1624 0.2010 3 0.0560 TOTAL 0.5756 72 0.1316 CASES INCLUDED 72 MISSING CASES 0

138

Análisis de resultados cuantitativos amilolítica de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS

HOMOGENEOUS

VARIABLE MEAN GROUPS

--------- ---------- -----------

CP4 4.5413 I

F1084 1.3460 .. I

F1552 1.0207 .. I I

F1562 0.9197 .... I I

F1564 0.9197 .... I I

F1314 0.8563 .... I I

F1082 0.8403 .... I I

F1612 0.7883 .... I I

F1622 0.5383 ...... I I

F1312 0.3677 ........ I I

F1114 0.2650 ........ I I

CP2 0.2467 ........ I I

F1604 0.2150 ........ I I

F1624 0.2010 ........ I I

F1614 0.1747 ........ I I

F1554 0.1150 .......... I

F1112 0.0983 .......... I

F1214 0.0920 .......... I

F1594 0.0813 .......... I

CN2 0.0503 .......... I

CN4 0.0477 .......... I

F1602 0.0310 .......... I

F1212 0.0297 .......... I

F1592 0.0280 .......... I

THERE ARE 6 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE

NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.

CRITICAL Q VALUE 5.444 REJECTION LEVEL 0.050

CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 0.4135

STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.1074

139

Análisis de resultados cualitativos celulolíticos de las cepas aisladas de animales. STATISTIX FOR WINDOWS KRUSKAL-WALLIS ONE-WAY NONPARAMETRIC AOV MEAN SAMPLE VARIABLE RANK SIZE --------- ------ ------ CN2 44.0 3 CP2 44.0 3 CN4 44.0 3 CP4 44.0 3 CN6 44.0 3 CP6 98.0 3 F1082 44.0 3 F1084 44.0 3 F1086 44.0 3 F1112 44.0 3 F1114 98.0 3 F1116 98.0 3 F1212 44.0 3 F1214 44.0 3 F1216 44.0 3 F1312 44.0 3 F1314 44.0 3 F1316 44.0 3 F1552 44.0 3 F1554 44.0 3 F1556 44.0 3 F1562 44.0 3 F1564 80.0 3 F1566 44.0 3 F1592 62.0 3 F1594 62.0 3 F1596 44.0 3 F1602 98.0 3 F1604 44.0 3 F1606 44.0 3 F1612 44.0 3 F1614 98.0 3 F1616 80.0 3 F1622 44.0 3 F1624 44.0 3 F1626 44.0 3 TOTAL 54.5 108 KRUSKAL-WALLIS STATISTIC 90.1330 P-VALUE, USING CHI-SQUARED APPROXIMATION 0.0000 TOTAL NUMBER OF VALUES THAT WERE TIED 108 MAX. DIFF. ALLOWED BETWEEN TIES 0.00001 CASES INCLUDED 108 MISSING CASES 0

140

Análisis de resultados cualitativos celulolíticos de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

COMPARISONS OF MEAN RANKS

MEAN HOMOGENEOUS

VARIABLE RANK GROUPS

--------- ---------- -----------

CP6 98.000 I

F1114 98.000 I

F1116 98.000 I

F1602 98.000 I

F1614 98.000 I

F1564 80.000 I

F1616 80.000 I

F1592 62.000 I

F1594 62.000 I

CN2 44.000 I

CP2 44.000 I

CN4 44.000 I

CP4 44.000 I

CN6 44.000 I

F1082 44.000 I

F1084 44.000 I

F1086 44.000 I

F1112 44.000 I

F1212 44.000 I

F1214 44.000 I

F1216 44.000 I

F1312 44.000 I

F1314 44.000 I

F1316 44.000 I

F1552 44.000 I

F1554 44.000 I

F1556 44.000 I

F1562 44.000 I

F1566 44.000 I

F1596 44.000 I

F1604 44.000 I

F1606 44.000 I

F1612 44.000 I

F1622 44.000 I

F1624 44.000 I

F1626 44.000 I

THERE ARE NO SIGNIFICANT PAIRWISE DIFFERENCES AMONG THE MEANS.

REJECTION LEVEL 0.050

CRITICAL Z VALUE 3.95

CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 100.92

141

Análisis de resultados cuantitativos celulolíticos de las cepas aisladas de animales.

ONE-WAY AOV

SOURCE DF SS MS F P

------- ---- --------- --------- ------ ------

BETWEEN 23 2.67957 0.11650 47.94 0.0000

WITHIN 48 0.11664 0.00243

TOTAL 71 2.79622

SAMPLE GROUP

VARIABLE MEAN SIZE STD DEV

--------- ---------- ------ ----------

CN2 3.000E-03 3 2.000E-03

CP2 0.4807 3 0.0117

CN4 0.0547 3 0.0167

CP4 0.6650 3 0.0282

F1082 0.2090 3 0.0628

F1084 0.5877 3 0.1251

F1112 0.2093 3 0.0144

F1114 0.5307 3 0.0380

F1212 0.2100 3 0.0304

F1214 0.3547 3 0.0257

F1312 0.2863 3 0.0266

F1314 0.6000 3 0.0252

F1552 0.4903 3 0.0248

F1554 0.6827 3 0.0264

F1562 0.4263 3 0.0206

F1564 0.6340 3 0.0342

F1592 0.2173 3 0.0252

F1594 0.3600 3 0.0221

F1602 0.2013 3 0.0110

F1604 0.2997 3 0.0336

F1612 0.5270 3 0.0372

F1614 0.6363 3 0.0692

F1622 0.5090 3 0.1462

F1624 0.5087 3 0.0100

TOTAL 0.4035 72 0.0493

CASES INCLUDED 72 MISSING CASES 0

142

Análisis de resultados cualitativos celulolíticos de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS

HOMOGENEOUS

VARIABLE MEAN GROUPS

--------- ---------- -----------

F1554 0.6827 I

CP4 0.6650 I I

F1614 0.6363 I I I

F1564 0.6340 I I I I

F1314 0.6000 I I I I

F1084 0.5877 I I I I

F1114 0.5307 I I I I I

F1612 0.5270 .. I I I I

F1622 0.5090 .... I I I I

F1624 0.5087 .... I I I I

F1552 0.4903 .... I I I I

CP2 0.4807 ...... I I I

F1562 0.4263 ........ I I I

F1594 0.3600 .......... I I I

F1214 0.3547 .......... I I I I

F1604 0.2997 ............ I I I

F1312 0.2863 ............ I I I

F1592 0.2173 .............. I I

F1212 0.2100 .............. I I

F1112 0.2093 .............. I I I

F1082 0.2090 .............. I I I

F1602 0.2013 ................ I I

CN4 0.0547 .................. I I

CN2 3.000E-03 .................... I

THERE ARE 11 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE

NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.

CRITICAL Q VALUE 5.444 REJECTION LEVEL 0.050

CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 0.1550

STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.0402

143

Análisis de resultados cualitativos lipolíticos de las cepas aisladas de animales. STATISTIX FOR WINDOWS KRUSKAL-WALLIS ONE-WAY NONPARAMETRIC AOV MEAN SAMPLE VARIABLE RANK SIZE --------- ------ ------ CN2 50.5 3 CP2 130.7 3 CN4 112.0 3 CP4 129.5 3 F1082 120.5 3 F1084 120.5 3 F1112 50.5 3 F1114 50.5 3 F1212 50.5 3 F1214 126.7 3 F1312 50.5 3 F1314 50.5 3 F1552 50.5 3 F1554 130.5 3 F1562 50.5 3 F1564 50.5 3 F1592 107.0 3 F1594 50.5 3 F1602 50.5 3 F1604 50.5 3 F1612 86.5 3 F1614 50.5 3 F1622 50.5 3 F1624 50.5 3 CN10 122.8 3 CN6 116.7 3 CP10 133.2 3 CP6 130.5 3 F10610 50.5 3 F10810 50.5 3 F1086 50.5 3 F11110 50.5 3 F1116 50.5 3 F12110 50.5 3 F1216 50.5 3 F13110 104.5 3 F1316 50.5 3 F15510 50.5 3 F1556 50.5 3 F15610 50.5 3 F1566 50.5 3 F1591 50.5 3 F1596 50.5 3 F1606 50.5 3 F16110 50.5 3 F1616 142.0 3 F16210 50.5 3 F1626 50.5 3 TOTAL 72.5 144 KRUSKAL-WALLIS STATISTIC 139.8417 P-VALUE, USING CHI-SQUARED APPROXIMATION 0.0000 TOTAL NUMBER OF VALUES THAT WERE TIED 141 MAX. DIFF. ALLOWED BETWEEN TIES 0.00001 CASES INCLUDED 144 MISSING CASES 0

144

Análisis de resultados cualitativos lipolíticos de las cepas aisladas de animales. STATISTIX FOR WINDOWS COMPARISONS OF MEAN RANKS MEAN HOMOGENEOUS VARIABLE RANK GROUPS --------- ---------- ----------- F1616 142.00 I CP10 133.17 I CP2 130.67 I F1554 130.50 I CP6 130.50 I CP4 129.50 I F1214 126.67 I CN10 122.83 I F1082 120.50 I F1084 120.50 I CN6 116.67 I CN4 112.00 I F1592 107.00 I F13110 104.50 I F1612 86.500 I CN2 50.500 I F1112 50.500 I F1114 50.500 I F1212 50.500 I F1312 50.500 I F1314 50.500 I F1552 50.500 I F1562 50.500 I F1564 50.500 I F1594 50.500 I F1602 50.500 I F1604 50.500 I F1614 50.500 I F1622 50.500 I F1624 50.500 I F10610 50.500 I F10810 50.500 I F1086 50.500 I F11110 50.500 I F1116 50.500 I F12110 50.500 I F1216 50.500 I F1316 50.500 I F15510 50.500 I F1556 50.500 I F15610 50.500 I F1566 50.500 I F1591 50.500 I F1596 50.500 I F1606 50.500 I F16110 50.500 I F16210 50.500 I F1626 50.500 I THERE ARE NO SIGNIFICANT PAIRWISE DIFFERENCES AMONG THE MEANS. REJECTION LEVEL 0.050 CRITICAL Z VALUE 4.08 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 139.09

145

Análisis de resultados cualitativos pectinolíticos de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

KRUSKAL-WALLIS ONE-WAY NONPARAMETRIC AOV

MEAN SAMPLE

VARIABLE RANK SIZE

--------- ------ ------

CN2 16.2 3

CP2 15.0 3

CN4 65.5 3

CN6 98.0 3

CP4 15.0 3

CP6 24.0 3

F1082 85.8 3

F1084 94.7 3

F1086 100.7 3

F1112 24.0 3

F1114 50.0 3

F1116 107.0 3

F1212 45.2 3

F1214 89.3 3

F1216 103.7 3

F1312 37.2 3

F1314 84.2 3

F1316 37.2 3

F1552 71.2 3

F1554 8.3 3

F1556 65.5 3

F1562 65.5 3

F1564 5.0 3

F1566 52.3 3

F1592 32.8 3

F1594 44.3 3

F1596 28.5 3

F1602 31.2 3

F1604 91.2 3

F1606 65.5 3

F1612 65.5 3

F1614 74.5 3

F1616 60.3 3

F1622 70.0 3

F1624 5.0 3

F1626 32.8 3

TOTAL 54.5 108

KRUSKAL-WALLIS STATISTIC 103.4584

P-VALUE, USING CHI-SQUARED APPROXIMATION 0.0000

TOTAL NUMBER OF VALUES THAT WERE TIED 103

MAX. DIFF. ALLOWED BETWEEN TIES 0.00001

CASES INCLUDED 108 MISSING CASES 0

146

Análisis de resultados cualitativos pectinolíticos de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

COMPARISONS OF MEAN RANKS

MEAN HOMOGENEOUS

VARIABLE RANK GROUPS

--------- ---------- -----------

F1116 107.00 I

F1216 103.67 II

F1086 100.67 II

CN6 98.000 II

F1084 94.667 II

F1604 91.167 II

F1214 89.333 II

F1082 85.833 II

F1314 84.167 II

F1614 74.500 II

F1552 71.167 II

F1622 70.000 II

CN4 65.500 II

F1556 65.500 II

F1562 65.500 II

F1606 65.500 II

F1612 65.500 II

F1616 60.333 II

F1566 52.333 II

F1114 50.000 II

F1212 45.167 II

F1594 44.333 II

F1312 37.167 II

F1316 37.167 II

F1592 32.833 II

F1626 32.833 II

F1602 31.167 II

F1596 28.500 II

CP6 24.000 II

F1112 24.000 II

CN2 16.167 II

CP2 15.000 II

CP4 15.000 II

F1554 8.3333 II

F1564 5.0000 .I

F1624 5.0000 .I

THERE ARE 2 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE

NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.

REJECTION LEVEL 0.050

CRITICAL Z VALUE 3.95

CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 100.92

147

Análisis de resultados cuantitativos pectinolíticos de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

KRUSKAL-WALLIS ONE-WAY NONPARAMETRIC AOV

MEAN SAMPLE

VARIABLE RANK SIZE

--------- ------ ------

CN2 22.0 3

CP2 69.7 3

CN4 67.7 3

CP4 62.7 3

F1082 51.0 3

F1084 10.0 3

F1112 66.0 3

F1114 10.0 3

F1212 51.3 3

F1214 10.0 3

F1312 35.0 3

F1314 10.0 3

F1552 39.3 3

F1554 30.7 3

F1562 27.0 3

F1564 52.3 3

F1592 36.3 3

F1594 10.0 3

F1602 52.3 3

F1604 10.0 3

F1612 23.7 3

F1614 42.3 3

F1622 57.3 3

F1624 29.3 3

TOTAL 36.5 72

KRUSKAL-WALLIS STATISTIC 68.3797

P-VALUE, USING CHI-SQUARED APPROXIMATION 0.0000

TOTAL NUMBER OF VALUES THAT WERE TIED 19

MAX. DIFF. ALLOWED BETWEEN TIES 0.00001

CASES INCLUDED 72 MISSING CASES 0

148

Análisis de resultados cuantitativos pectinolíticos de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

COMPARISONS OF MEAN RANKS

MEAN HOMOGENEOUS

VARIABLE RANK GROUPS

--------- ---------- -----------

CP2 69.667 I

CN4 67.667 I

F1112 66.000 I

CP4 62.667 I

F1622 57.333 I

F1564 52.333 I

F1602 52.333 I

F1212 51.333 I

F1082 51.000 I

F1614 42.333 I

F1552 39.333 I

F1592 36.333 I

F1312 35.000 I

F1554 30.667 I

F1624 29.333 I

F1562 27.000 I

F1612 23.667 I

CN2 22.000 I

F1084 10.000 I

F1114 10.000 I

F1214 10.000 I

F1314 10.000 I

F1594 10.000 I

F1604 10.000 I

THERE ARE NO SIGNIFICANT PAIR WISE DIFFERENCES AMONG THE MEANS.

REJECTION LEVEL 0.050

CRITICAL Z VALUE 3.74

CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 63.976

149

Análisis de resultados cualitativos proteolíticos de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

KRUSKAL-WALLIS ONE-WAY NON PARAMETRIC AOV

MEAN SAMPLE

VARIABLE RANK SIZE

--------- ------ ------

CN2 11.5 3

CN4 11.5 3

CN6 11.5 3

CP2 68.5 3

CP4 68.5 3

CP6 65.2 3

F1082 68.5 3

F1084 65.2 3

F1086 104.0 3

F1112 36.0 3

F1114 40.7 3

F1116 40.7 3

F1212 36.0 3

F1214 68.5 3

F1216 30.5 3

F1312 46.8 3

F1314 36.0 3

F1316 68.5 3

F1552 36.0 3

F1554 11.5 3

F1556 30.5 3

F1562 76.0 3

F1564 57.7 3

F1566 103.0 3

F1592 57.7 3

F1594 68.5 3

F1596 86.2 3

F1602 57.7 3

F1604 68.5 3

F1606 83.5 3

F1612 36.0 3

F1614 67.8 3

F1616 97.5 3

F1622 36.0 3

F1624 19.7 3

F1626 90.3 3

TOTAL 54.5 108

KRUSKAL-WALLIS STATISTIC 79.7650

P-VALUE, USING CHI-SQUARED APPROXIMATION 0.0000

TOTAL NUMBER OF VALUES THAT WERE TIED 107

MAX. DIFF. ALLOWED BETWEEN TIES 0.00001

CASES INCLUDED 108 MISSING CASES 0

150

Análisis de resultados cualitativos proteolíticos de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

COMPARISONS OF MEAN RANKS

MEAN HOMOGENEOUS

VARIABLE RANK GROUPS

--------- ---------- -----------

F1086 104.00 I

F1566 103.00 I

F1616 97.500 I

F1626 90.333 I

F1596 86.167 I

F1606 83.500 I

F1562 76.000 I

CP2 68.500 I

CP4 68.500 I

F1082 68.500 I

F1214 68.500 I

F1316 68.500 I

F1594 68.500 I

F1604 68.500 I

F1614 67.833 I

CP6 65.167 I

F1084 65.167 I

F1564 57.667 I

F1592 57.667 I

F1602 57.667 I

F1312 46.833 I

F1114 40.667 I

F1116 40.667 I

F1112 36.000 I

F1212 36.000 I

F1314 36.000 I

F1552 36.000 I

F1612 36.000 I

F1622 36.000 I

F1216 30.500 I

F1556 30.500 I

F1624 19.667 I

CN2 11.500 I

CN4 11.500 I

CN6 11.500 I

F1554 11.500 I

THERE ARE NO SIGNIFICANT PAIR WISE DIFFERENCES AMONG THE MEANS.

REJECTION LEVEL 0.050

CRITICAL Z VALUE 3.95

CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 100.92

151

Análisis de resultados cuantitativos proteolíticos de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

ONE-WAY AOV

SOURCE DF SS MS F P

------- ---- --------- --------- ------ ------

BETWEEN 23 15.7661 0.68548 14.14 0.0000

WITHIN 48 2.32659 0.04847

TOTAL 71 18.0927

SAMPLE GROUP

VARIABLE MEAN SIZE STD DEV

--------- ---------- ------ ----------

CCN 0.3327 3 0.0862

CCP 0.6947 3 0.0689

CLN 0.5017 3 0.4328

CLP 0.6510 3 0.1689

FC108 0.6357 3 0.2755

FC111 1.7693 3 0.2887

FC121 1.1687 3 0.1798

FC131 0.6600 3 0.2290

FC155 0.0437 3 0.0435

FC156 0.0650 3 0.0276

FC159 0.1453 3 0.0446

FC160 0.1530 3 0.0670

FC161 1.0940 3 0.1323

FC162 0.2947 3 0.0691

FL108 1.2547 3 0.1148

FL111 1.5690 3 0.5753

FL121 0.8880 3 0.1431

FL131 1.1157 3 0.4183

FL155 1.2737 3 0.1551

FL156 1.1927 3 0.1714

FL159 0.8047 3 0.0764

FL160 1.0160 3 0.1941

FL161 1.1493 3 0.1485

FL162 0.6020 3 0.0352

TOTAL 0.7948 72 0.2202

CASES INCLUDED 72 MISSING CASES 0

152

Análisis de resultados cuantitativos proteolíticos de las cepas aisladas de animales.

STATISTIX FOR WINDOWS

TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS

HOMOGENEOUS

VARIABLE MEAN GROUPS

--------- ---------- -----------

FC111 1.7693 I

FL111 1.5690 I I

FL155 1.2737 I I I

FL108 1.2547 I I I

FL156 1.1927 I I I I

FC121 1.1687 I I I I

FL161 1.1493 I I I I

FL131 1.1157 I I I I

FC161 1.0940 I I I I

FL160 1.0160 .. I I I I

FL121 0.8880 .. I I I I I

FL159 0.8047 .... I I I I I

CCP 0.6947 .... I I I I I I

FC131 0.6600 .... I I I I I I

CLP 0.6510 .... I I I I I I

FC108 0.6357 .... I I I I I I

FL162 0.6020 .... I I I I I I

CLN 0.5017 ...... I I I I I

CCN 0.3327 ........ I I I I

FC162 0.2947 .......... I I I

FC160 0.1530 ............ I I

FC159 0.1453 ............ I I

FC156 0.0650 .............. I

FC155 0.0437 .............. I

THERE ARE 8 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE

NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.

CRITICAL Q VALUE 5.444 REJECTION LEVEL 0.050

CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 0.6920

STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.1798