caracterizaciÓn electroencefalogrÁfica de la ruta

CARACTERIZACIÓN

ELECTROENCEFALOGRÁFICA DE LA

RUTA SUBCORTICAL COLÍCULO

SUPERIOR – AMÍGDALA, VÍA TÁLAMO,

DURANTE LA ASOCIACIÓN DE

ESTÍMULOS CONDICIONADO E

INCONDICIONADO

Evaluación de la integración sensorial multimodal en

colículo superior y amígdala

Melissa Andrea Netsash Cárdenas Molano

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina

Maestría en Neurociencias

Bogotá, Colombia 2020

CARACTERIZACIÓN

ELECTROENCEFALOGRÁFICA DE LA

RUTA SUBCORTICAL COLÍCULO

SUPERIOR – AMÍGDALA, VÍA TÁLAMO,

DURANTE LA ASOCIACIÓN DE

ESTÍMULOS CONDICIONADO E

INCONDICIONADO

Evaluación de la integración sensorial multimodal en

colículo superior y amígdala

Melissa Andrea Netsash Cárdenas Molano

Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Neurociencias

Director:

Alejandro Múnera Galarza

Co-directores:

Manuel Rojas Barreto

Fernando Cardenas P.

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina, Maestría en Neurociencias

Bogotá, D.C., Colombia

2020

Dedico este trabajo a mi familia, amigos y todo aquél que esté en este campo de conocimiento

Agradecimientos Agradezco la elaboración de este trabajo a todas las personas que

participaron de manera activa o pasiva en el mismo:

Fernando Cárdenas, Alejandro Múnera, Manuel Rojas, Rodrigo Martínez,

Marisol Lamprea, Manuel Suárez, Jonathan Muñoz, Karen Corredor,

Alexandra Elbakyan, Amori Molina, Io Catalina Gezeth Cárdenas, Jorge

Martínez, Christian Camilo García, Víctor Huerta, Cécile Gauthier, Magda

López y Comité Asesor de la Maestría en Neurociencias de la Universidad

Nacional.

INTRODUCCIÓN 14

Resumen El Colículo Superior (CS) tiene gran relevancia para la supervivencia de los vertebrados pues es

capaz de desencadenar comportamientos reflejos ante estímulos visuales sorpresivos. Se asocia

anatómico-funcionalmente a otras estructuras encargadas del procesamiento emocional de

estímulos potencialmente aversivos, como la Amígdala (AM). Sin embargo, a la fecha poco se

sabe de la actividad electrofisiológica de dichas estructuras ante la presentación emparejada de

estímulos visuales y somatosensoriales en ratas anestesiadas. El objetivo de esta investigación fue

comparar la respuesta electrofisiológica en CS y AM frente a la presentación emparejada y no-

emparejada de estímulos visuales y somatosensoriales en ratas bajo anestesia (uretano, 1,5 g/kg).

Se utilizaron 8 ratas Wistar (380 ± 20gr, con comida y agua ad libitum, ciclo luz-oscuridad de

12:12h y temperatura 20±2˚C) con electrodos de registro unilateralmente implantados en CS y AM

y electrodos de estimulación en el parche de vibrisas contralateral. Se caracterizaron los

componentes estables de los potenciales provocados en CS y AM por estímulos luminosos

(destello de luz) y somatosensoriales (choque eléctrico en las vibrisas) no-emparejados. La

presentación emparejada del estímulo visual con el somatosensorial indujo cambios en los

potenciales provocados visuales en AM, pero no en CS, con respecto a la presentación no-

emparejada: 1) aumento significativo de la amplitud pico a pico del componente P1N1a; y 2)

aumento significativo de la potencia espectral absoluta en todas las bandas de frecuencia (a

excepción de la banda theta). Al volver a presentar el estímulo visual de forma no-emparejada, los

cambios anteriormente citados se revirtieron, llegando al nivel basal; además, esta segunda

presentación no-emparejada del estímulo visual, provocó: 1) aumento significativo del área bajo

la curva del componente N2 en CS; y 2) disminución significativa del área bajo la curva del

componente P2 en AM. Estos resultados indican que los componentes tempranos del potencial

provocado en AM son sensibles al emparejamiento del estímulo visual, mientras que los

componentes tardíos de los potenciales provocados en CS y AM son sensibles al

desemparejamiento del mismo.

Palabras clave

Rata, Aprendizaje, Amígdala, Colículo superior, Electrofisiología

vii

Abstract Superior Colliculus (SC) is a crucial structure for vertebrate survival given its role in organizing

behavioral responses to unexpected visual stimuli. SC is anatomically and functionally connected

with aversive stimuli processing structures such as the amygdala (AM). However, little is known

about their electrophysiological activity in response to paired presentation of visual and

somatosensory stimuli in anaesthetized rats. The main purpose of the present study was to compare

electrophysiological activity in SC and AM during paired and unpaired presentation of visual and

somatosensory stimuli in rats under anesthesia (urethane, 1,5 g/kg) Eight males Wistar rats (380 ±

20gr, with ad libitum access to food and water, 12:12h light-dark cycle and temperature 20±2˚C)

were implanted with unilateral recording electrodes in SC and AM and stimulating electrodes at

the contralateral whisker pad. Stable components of unpaired visual (light flash) and

somatosensory (whisker pad electric shock) stimuli evoked potentials in SC and AM were

characterized. Paired presentation of visual and somatosensory stimuli induced significant changes

in AM, but no SC visual-evoked potential: 1) increasing of P1N1a peak-to-peak amplitude; and,

2) increasing of absolute spectral power for all frequency band (except theta). A second round of

unpaired presentations of visual stimuli induced reversion of the above mentioned changes; in

addition, unpairing of visual stimuli induced another significant changes: 1) increased N2 area

under the curve in SC; and, 2) diminished P2 area under the curve in AM. Taken together such

results indicate that early components of AM evoked potential are sensitive to visual stimuli

pairing, while late components of both SC and AM evoked potentials are sensitive to visual stimuli

unpairing.

Key words

Rat, Learning, Amygdala, Superior colliculus, Electrophysiology

viii

Tabla de Contenidos

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................................................. X

LISTA DE TABLAS .............................................................................................................................................. XII

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................ 14

CAPÍTULO 1: CONSIDERACIONES PARTICULARES SOBRE EL SISTEMA VISUAL ...................................................... 18

CAPÍTULO 2: CONSIDERACIONES ANATOMOFISIOLÓGICAS DE LAS RESPUESTAS EMOCIONALES ......................... 22

RUTA SUBCORTICAL COLÍCULO SUPERIOR – AMÍGDALA VÍA TÁLAMO: UNA APROXIMACIÓN ANATÓMICA Y ELECTROFISIOLÓGICA ......... 24

DEFINICIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................................... 35

OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................................................................... 36

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................................................. 36

HIPÓTESIS ................................................................................................................................................................... 37

DEFINICIÓN DE VARIABLES .............................................................................................................................................. 38

Variables independientes .................................................................................................................................... 38

Variables dependientes ....................................................................................................................................... 38

METODOLOGÍA ................................................................................................................................................. 39

MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................................................... 40

Sujetos ................................................................................................................................................................. 40

Cirugía ................................................................................................................................................................. 40

Instrumentos ....................................................................................................................................................... 41

Procedimiento ..................................................................................................................................................... 42

Extracción de cerebros para análisis histológico ................................................................................................ 44

Análisis estadístico .............................................................................................................................................. 45

Consideraciones bioéticas ................................................................................................................................... 45

Productos esperados ........................................................................................................................................... 46

RESULTADOS ..................................................................................................................................................... 47

HISTOLOGÍA ................................................................................................................................................................ 47

EFECTO DE LA DURACIÓN DEL ESTÍMULO LUMINOSO Y LA INTENSIDAD DEL ESTÍMULO SOMATOSENSORIAL SOBRE LOS POTENCIALES

PROVOCADOS EN EL COLÍCULO SUPERIOR Y EN LA AMÍGDALA BASOLATERAL .............................................................................. 48

Estimulación lumínica 10 ms vs 20 ms ................................................................................................................ 48

Estimulación eléctrica en parche de vibrisas 0,5 mA vs 2 mA ............................................................................. 51

EVOLUCIÓN DEL POTENCIAL PROVOCADO EN LA AMÍGDALA Y EL COLÍCULO SUPERIOR COMO FUNCIÓN DE LA PRESENTACIÓN NO-

EMPAREJADO DE UN ESTÍMULO VISUAL QUE PREVIAMENTE HABÍA SIDO EMPAREJADO ................................................................. 55

COMPARACIÓN DE LOS PODERES ESPECTRALES ................................................................................................................... 57

Potencias Relativas ............................................................................................................................................. 57

Potencias absolutas ............................................................................................................................................ 62

EVOLUCIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA AMÍGDALA Y EL COLÍCULO SUPERIOR COMO FUNCIÓN DE LA PRESENTACIÓN NO-EMPAREJADA DE UN

ESTÍMULO VISUAL QUE PREVIAMENTE HABÍA SIDO EMPAREJADO – SEÑAL TRATADA CON TRANSFORMADA Z .................................... 67

DISCUSIÓN ........................................................................................................................................................ 76

SELECCIÓN DE LA DURACIÓN DEL ESTÍMULO LUMÍNICO ......................................................................................................... 76

ix

SELECCIÓN DE LA INTENSIDAD DEL ESTÍMULO ELÉCTRICO ....................................................................................................... 77

CAMBIOS EN LA RESPUESTA LUEGO DEL EMPAREJAMIENTO ................................................................................................... 78

PODER ESPECTRAL ........................................................................................................................................................ 83

CONCLUSIONES ................................................................................................................................................. 84

LIMITACIONES ................................................................................................................................................... 85

TRABAJOS A FUTURO ........................................................................................................................................ 86

ANEXO A - ADMINISTRACIÓN DE SUSTANCIAS – PROTOCOLO .......................................................................... 100

ANEXO B - CIRUGÍA ESTEREOTÁXICA PARA IMPLANTACIÓN DE ELECTRODOS– PROTOCOLO ............................. 105

ANEXO C – EMPAREJAMIENTO DE ESTÍMULOS– PROTOCOLO .......................................................................... 110

ANEXO D - EUTANASIA POR INYECCIÓN DE KCL – PROTOCOLO ........................................................................ 114

ANEXO E - CARTA AVAL COMITÉ DE BIOÉTICA .................................................................................................. 117

ANEXO F – TABLAS DE RESULTADOS ESTADÍSTICOS ......................................................................................... 120

x

Lista de Figuras

FIGURA 1. ESQUEMA DE LAS VÍAS VISUALES DESDE LA RETINA HASTA LOS DIFERENTES CENTROS ENCEFÁICOS DE PROCESAMIENTO VISUAL EN

HUMANOS (TOMADO Y MODIFICADO DE (MIROCHNIK & PEZARIS, 2019) ........................................................................... 20

FIGURA 2. ESQUEMA DE LAS DIVISIONES PRINCIPALES DE LA AMÍGDALA (MIROLLI, MANNELLA, & BALDASSARRE, 2010). .................... 27

FIGURA 3. ESQUEMA DE VÍAS AMÍGDALO-CORTICALES Y AMÍGDALO-TALÁMICA RELACIONADAS DURANTE EL CONDICIONAMIENTO AVERSIVO

VISUAL (SHI & DAVIS, 2001). .................................................................................................................................... 31

FIGURA 4. POTENCIALES EVOCADOS POR ESTÍMULO AUDITIVO DE 82 DB Y DE 102 DB (GARCIA, PAQUEREAU, VOUIMBA & JAFFARD,

1998). .................................................................................................................................................................. 33

FIGURA 5. ARREGLO EXPERIMENTAL PARA LA ESTIMULACIÓN LUMINOSA ..................................................................................... 42

FIGURA 6. UBICACIÓN DE LOS ELECTRODOS EN (A) COLÍCULO SUPERIOR (40X) Y EN (B) AMÍGDALA (20X). ........................................ 47

FIGURA 7. PROMEDIOS INTERSUJETOS DE LOS POTENCIALES PROVOCADOS POR UN ESTÍMULO LUMINOSO DE 20MS ............................. 49

FIGURA 8. POTENCIAL PROVOCADO POR ESTÍMULOS LUMINOSOS DE DIFERENTE DURACIÓN (10 VS. 20MS) ........................................ 50

FIGURA 9. GRANDES PROMEDIOS DE LA SEÑAL COMPARANDO EL EFECTO DE UN ESTÍMULO ELÉCTRICO EN PARCHE DE VIBRISAS (0,5 VS 2

MA) EN (A) CS Y (B) AM. ......................................................................................................................................... 52

FIGURA 10. GRANDES PROMEDIOS DE LA SEÑAL COMPARANDO LOS SP (SPIKE POTENTIAL) DE UN ESTÍMULO ELÉCTRICO EN PARCHE DE

VIBRISAS (0,5 VS 2 MA) EN (A) CS Y (B) AM. ............................................................................................................... 54

FIGURA 11. GRANDES PROMEDIOS DE LA SEÑAL COMPARANDO EL EFECTO DE UN ESTÍMULO LUMÍNICO 20 MS PARA NO EMPAREJADO 1,

EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2, EN CS (A) Y AM (B). (A). ......................................................................................... 56

FIGURA 12. COMPARACIÓN DE POTENCIAS RELATIVAS PARA LAS SEÑALES CAPTADAS EN CS Y AM DURANTE LA APLICACIÓN DE DIFERENTES

ESTÍMULOS, LUZ 10 MS Y 20 MS (A Y B). ...................................................................................................................... 58

FIGURA 13. COMPARACIÓN DE POTENCIAS RELATIVAS DE LAS SEÑALES CAPTADAS DURANTE LA PRESENTACIÓN DE UN ESTÍMULO LUMÍNICO

DE 20 MS DE DURACIÓN EN CS VS AM. ........................................................................................................................ 59

FIGURA 14. COMPARACIÓN DE POTENCIAS RELATIVAS PARA LAS SEÑALES REGISTRADAS EN CS Y AM DURANTE LA APLICACIÓN DE UN

ESTÍMULO LUMÍNICO NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 (A Y B)............................................................ 61

FIGURA 15. COMPARACIÓN DE POTENCIAS ABSOLUTAS PARA LAS SEÑALES CAPTADAS EN CS Y ABL DURANTE LA APLICACIÓN DE DIFERENTES

ESTÍMULOS, LUZ 10 MS Y 20 MS (A Y B). ...................................................................................................................... 63

FIGURA 16. COMPARACIÓN DE POTENCIAS ABSOLUTAS DE LAS SEÑALES REGISTRADAS DURANTE LA PRESENTACIÓN DE UN ESTÍMULO

LUMÍNICO DE 20 MS DE DURACIÓN EN CS VS AM. ......................................................................................................... 64

FIGURA 17. COMPARACIÓN DE POTENCIAS ABSOLUTAS PARA LAS SEÑALES REGISTRADAS EN CS Y AM DURANTE LA APLICACIÓN DE

ESTÍMULO LUMÍNICO NO EMPAREJAADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 (A Y B). ......................................................... 66

FIGURA 18. GRANDES PROMEDIOS DE LA SEÑAL LUEGO DE LA TRANSFORMADA Z COMPARANDO EL EFECTO DE UN ESTÍMULO LUMÍNICO 20

MS PARA NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 EN CS (A) Y AM (B). ......................................................... 67

FIGURA 19. COMPARACIÓN DEL EFECTO DE UN ESTÍMULO LUMÍNICO 20 MS PARA NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2

EN CS PARA P1N1(A), N1P2 (B), P2N2 (C). .............................................................................................................. 69

FIGURA 20. COMPARACIÓN DEL EFECTO DE UN ESTÍMULO LUMÍNICO 20 MS PARA NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2

EN AM PARA P1N1A (A), N1AN1B (B), N1BP2 (C). .................................................................................................... 70

FIGURA 21. GRANDES PROMEDIOS DE LA SEÑAL POSITIVA LUEGO DE LA TRANSFORMADA Z COMPARANDO EL EFECTO DE UN ESTÍMULO

LUMÍNICO 20 MS PARA NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 EN CS (A) Y ABL (B). ..................................... 71

FIGURA 22. COMPARACIÓN DEL EFECTO DE UN ESTÍMULO LUMÍNICO 20 MS EN LA SEÑAL POSITIVA PARA NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO

Y NO EMPAREJADO 2 EN CS PARA P1N1(A), N1P2 (B), P2N2 (C). ................................................................................. 72

FIGURA 23. COMPARACIÓN DEL EFECTO DE UN ESTÍMULO LUMÍNICO 20 MS EN LA SEÑAL POSITIVA PARA NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO

Y NO EMPAREJADO 2 EN AM PARA P1N1A (A), N1AN1B (B), N1BP2 (C). ....................................................................... 73

FIGURA 24. COMPARACIÓN DEL EFECTO DE UN ESTÍMULO LUMÍNICO 20 MS EN EL ÁREA BAJO LA CURVA PARA NO EMPAREJADO 1,

EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 EN CS PARA P1N1(A), N1P2 (B), P2N2 (C). ............................................................... 74

xi

FIGURA 25. COMPARACIÓN DEL EFECTO DE UN ESTÍMULO LUMÍNICO 20 MS EN EL ÁREA BAJO LA CURVA PARA NO EMPAREJADO 1,

EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 EN ABL PARA P1N1A (A), N1AN1B (B), N1BP2 (C). .................................................... 75

xii

Lista de Tablas

TABLA 1. COMPARACIONES DE LA AMPLITUD PICO A PICO DE LOS DIFERENTES COMPONENTES DEL POTENCIAL EVOCADO POR DOS

ESTÍMULOS LUMÍNICOS EN COLÍCULO SUPERIOR ............................................................................................................ 121

TABLA 2. COMPARACIONES DE LA AMPLITUD PICO A PICO DE LOS DIFERENTES COMPONENTES DEL POTENCIAL EVOCADO POR DOS

ESTÍMULOS LUMÍNICOS EN AMÍGDALA ........................................................................................................................ 121

TABLA 3. COMPARACIONES DE LA AMPLITUD PICO A PICO DEL COMPONENTE NP1 DEL POTENCIAL EVOCADO POR DOS ESTÍMULOS

LUMÍNICOS EN COLÍCULO SUPERIOR Y EN AMÍGDALA ...................................................................................................... 121

TABLA 4. COMPARACIONES DE LA AMPLITUD PICO A PICO DE LOS POTENCIALES DE ACCIÓN POBLACIONALES SUSCITADOS POR DOS

ESTÍMULOS ELÉCTRICOS EN COLÍCULO SUPERIOR Y EN AMÍGDALA ...................................................................................... 122

TABLA 5. COMPARACIONES DE LOS COMPONENTES DE LOS POTENCIALES EVOCADOS SUSCITADOS POR UN ESTÍMULO LUMÍNICO DE 20 MS

NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJAD 2 PARA COLÍCULO SUPERIOR ............................................................... 122

TABLA 6. COMPARACIONES DE LOS COMPONENTES DE LOS POTENCIALES EVOCADOS SUSCITADOS POR UN ESTÍMULO LUMÍNICO DE 20 MS

NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJAD 2 PARA COLÍCULO SUPERIOR ............................................................... 122

TABLA 7. COMPARACIONES DE LAS BANDAS DE FRECUENCIA RELATIVAS ENTRE UN ESTÍMULOS LUMÍNICOS (10 MS VS 20 MS) Y LUZ DE

DURACIÓN 20 MS EN LAS FASES DE NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 PARA COLÍCULO SUPERIOR .............. 123

TABLA 8. COMPARACIONES DE LAS BANDAS DE FRECUENCIA RELATIVAS ENTRE UN ESTÍMULOS LUMÍNICOS (10 MS VS 20 MS) Y LUZ DE

DURACIÓN 20 MS EN LAS FASES DE NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 PARA AMIGDALA ........................... 123

TABLA 9. COMPARACIONES DE LAS BANDAS DE FRECUENCIA RELATIVAS DURANTE UN ESTÍMULO LUMÍNICO DE 20 MS DE DURACIÓN PARA

COLICULO SUPERIOR VS AMIGDALA ............................................................................................................................ 124

TABLA 10. COMPARACIONES DE LAS BANDAS DE FRECUENCIA ABSOLUTAS ENTRE UN ESTÍMULOS LUMÍNICOS (10 MS VS 20 MS) Y LUZ DE

DURACIÓN 20 MS EN LAS FASES DE NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 PARA COLÍCULO SUPERIOR .............. 124

TABLA 11. COMPARACIONES DE LAS BANDAS DE FRECUENCIA ABSOLUTAS ENTRE UN ESTÍMULOS LUMÍNICOS (10 MS VS 20 MS) Y LUZ DE

DURACIÓN 20 MS EN LAS FASES DE NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 PARA AMIGDALA ........................... 124

TABLA 12. COMPARACIONES DE LAS BANDAS DE FRECUENCIA ABSOLUTAS DURANTE UN ESTÍMULO LUMÍNICO DE 20 MS DE DURACIÓN PARA

COLÍCULO SUPERIOR Y AMÍGDALA .............................................................................................................................. 125

TABLA 13. COMPARACIONES DE AMPLITUD PICO A PICO DE TRES DIFERENTES RANGO DE LA SEÑAL REGISTRADA EN COLÍCULO SUPERIOR (40

-70 MS, 70 150 MS Y 150 300 MS) DURANTE LA PRESENTACIÓN DE UN ESTÍMULO LUMINOSO DE 20 MS NO EMPAREJADO 1,

EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 ............................................................................................................................ 125

TABLA 14. COMPARACIONES DE AMPLITUD PICO A PICO DE TRES DIFERENTES RANGO DE LA SEÑAL REGISTRADA EN AMÍGDALA (30 - 60 MS,

60- 100 MS Y 100 - 200MS) DURANTE LA PRESENTACIÓN DE UN ESTÍMULO LUMINOSO DE 20 MS NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO

Y NO EMPAREJADO 2 .............................................................................................................................................. 125

TABLA 15. COMPARACIONES DE AMPLITUD PICO A PICO DE TRES DIFERENTES RANGO DE LA SEÑAL POSITIVA REGISTRADA EN COLÍCULO

SUPERIOR (40 -70 MS, 70 150 MS Y 150 300 MS) DURANTE LA PRESENTACIÓN DE UN ESTÍMULO LUMINOSO DE 20 MS NO

EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 ..................................................................................................... 126

TABLA 16. COMPARACIONES DE AMPLITUD PICO A PICO DE TRES DIFERENTES RANGO DE LA SEÑAL POSITIVA REGISTRADA EN AMÍGDALA (30

- 60 MS, 60- 100 MS Y 100 - 200MS) DURANTE LA PRESENTACIÓN DE UN ESTÍMULO LUMINOSO DE 20 MS NO EMPAREJADO 1,

EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 ............................................................................................................................ 126

TABLA 17. COMPARACIONES DEL AREA BAJO LA CURVA DEL PICO A PICO DE TRES DIFERENTES RANGO DE LA SEÑAL POSITIVA REGISTRADA EN

COLÍCULO SUPERIOR (40 -70 MS, 70 150 MS Y 150 300 MS) DURANTE LA PRESENTACIÓN DE UN ESTÍMULO LUMINOSO DE 20 MS

NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2 ................................................................................................. 126

TABLA 18. COMPARACIONES DEL AREA BAJO LA CURVA DEL PICO A PICO DE TRES DIFERENTES RANGO DE LA SEÑAL POSITIVA REGISTRADA EN

AMÍGDALA (30 - 60 MS, 60- 100 MS, 100 - 200MS Y 200 A 300MS) DURANTE LA PRESENTACIÓN DE UN ESTÍMULO LUMINOSO DE

20 MS NO EMPAREJADO 1, EMPAREJADO Y NO EMPAREJADO 2. ...................................................................................... 127

Introducción - 14

Introducción

La relación que el animal establece con su medio ambiente se da a partir de sus sistemas

sensoriales, los cuales son muy variados, dependiendo en gran medida de las características de

los nichos en que se desarrollaron. Existen de diferentes entradas sensoriales que facilitan la

interacción del sujeto con su ambiente, estas permiten que la información llegue a estructuras

que pueden integrar diferentes modalidades sensoriales de los estímulos externos y esto en

últimas está relacionado con los procesos de aprendizaje. El sistema visual de los vertebrados

posee diferentes características propias a la adaptación del sujeto a su entorno. El procesamiento

visual es realizado en diferentes regiones del encéfalo. La información captada por los

fotorreceptores presentes en la retina (conos y bastones) es transmitida en paralelo, por el nervio

óptico, hacia varios centros encefálicos de procesamiento. Cada uno de estos diferentes centros

de procesamiento (corteza occipital, colículos superiores, núcleo supraquiasmático del

hipotálamo, núcleos motores del tronco cerebral y núcleo pretectal) posee una función particular

(Purves, Augustine, Fitzpatrick, Klajn, & Argüelles Luis, 2017).

En general, el procesamiento realizado en la corteza occipital lleva a la percepción

consciente y la función discriminativa visual, mientras que el procesamiento en los colículos

superiores permite la realización de reflejos rápidos de acomodación de ojos y cabeza ante

estímulos sorpresivos. El procesamiento realizado en las otras estructuras se relaciona con el

control de los ritmos circadianos – para el núcleo supraquiasmático – con reflejos oculares de

acomodación a la luz y a la distancia – en el caso del núcleo pretectal – y con la ejecución de

otros reflejos visuales (Lent, 2010; Splittgerber & Snell, 2019).

Introducción - 15

Por su parte, la vía que parte de la retina llegando hasta el colículo superior, se relaciona

con la ejecución de movimientos reflejos de orientación de la cabeza, el cuello y el cuerpo, hacia

objetos presentes en el campo visual (Dean & Redgrave, 1984; Westby, Keay, Redgrave, Dean,

& Bannister, 1990). La información que da inicio a estas actividades reflejas es específicamente

el cambio súbito de las representaciones retinianas, que pueden estar señalizando el movimiento

de aproximación rápida de un objeto (Boehnke et al., 2011; Maior et al., 2011). Por esta razón,

los estímulos que más efectivamente excitan las neuronas del colículo superior son cambios muy

rápidos de la iluminación (destellos lumínicos) y no cambios en la intensidad de los estímulos

(overton, Dean, & Redgrave, 1985; Dyer & Annau, 1977).

Se ha demostrado que la organización laminal del colículo superior (que será analizada

en mayor detalle posteriormente), implica que las capas profundas reciben específicamente

información proveniente de la retina, mientras que en las capas profundas confluye información

visual y de otras modalidades sensoriales, tales como auditiva y somatosensorial. Esta

organización, permite una primera integración polimodal en las capas profundas, pero no en las

superiores. Esta especialización funcional fue reportada por Gharaei y colaboradores en 2018, al

demostrar que las neuronas de las capas superficiales respondes exclusivamente ante estímulos

visuales, mientras que en las capas profundas existen neuronas que pueden responder ante

estímulos visuales y somatosensoriales (en este caso, provenientes del parche de vibrisas),

permitiendo suponer así una posible integración polimodal en las capas intermedias y profundas

(Gharaei, Arabzadeh, & Solomon, 2018).

El hecho de que una gran parte de la información proveniente de la retina esté

relacionada con la realización de reflejos visuales, mientras que otra parte se relacione con la

emisión de respuestas instrumentales, implica que los estímulos visuales suscitan reacciones

Introducción - 16

emocionales que eventualmente pueden estar implicadas en la activación de estructuras de

integración multimodal como la amígdala y el colículo superior (Josselyn & Frankland, 2018).

Es bien sabido que estos estímulos visuales han sido utilizados para generar respuestas

emocionales una vez condicionados (Koutalidis, Foster, & Weisz, 1988; Leal-Campanario,

Delgado-Garcia, & Gruart, 2006; Debiec & LeDoux, 2004; LeDoux, Iwata, Pearl, & Reis, 1986;

Root et al., 2009), esto puede ser evaluado a través de diferentes medidas como por ejemplo el

sobresalto o de vocalizaciones (Pezze, Marshall, Domonkos, & Cassaday, 2016; Walker et al.,

2009).

En relación con la emisión de respuestas emocionales, se sabe que la amígdala es la

estructura crucial, ya que a ella llega información de todas las modalidades sensoriales

(Splittgerber & Snell, 2019; Purves et al., 2017) y es a partir de ella que surgen algunos de los

comandos emocionales (LeDoux, 2012), sobre todo los relacionados con las reacciones de miedo

(Mobbs et al., 2019; Wigestrand, Schiff, Fyhn, LeDoux, & Sears, 2017; Campese et al., 2016;

LeDoux, 2014). Así, estudiando el sistema auditivo, Joseph LeDoux determinó que el circuito de

comunicación cuerpo geniculado medial, amígdala lateral, amígdala central y sustancia gris

periacueductal central, era el encargado, no sólo del procesamiento aversivo de los estímulos

auditivos, sino también de su aprendizaje y de su memorización (LeDoux, Sakaguchi, Iwata, &

Reis, 1986; LeDoux, Sakaguchi, Iwata, & Reis, 1985).

Igualmente, se han realizado estudios que involucran otros circuitos subcorticales

relacionados con las rutas y estructuras de procesamiento de estímulos visuales o de integración

multimodal. Muchos de estos estudios utilizaron lesiones a nivel cortical o estimulación

específica de ciertos tipos celulares (p. ej. utilizando optogenética) e inclusive ablación de las

estructuras de relevo sináptico subcortical (Le et al., 2019; Wei et al., 2015; Shi & Davis, 2001).

Introducción - 17

En todos estos estudios se ha propuesto la existencia de áreas o incluso neuronas particulares

capaces de modificar (mediante la presentación repetida y contingente) sus patrones de actividad

para responder polimodalmente.

Pese a la aparente similitud anatómica, en cuanto a la participación de los colículos –

inferiores en el caso de la audición y superiores en el caso de la visión – y de los cuerpos

geniculados del tálamo – mediales en el caso de la audición y laterales en el caso de la visión –

existe una diferencia crucial entre los dos sistemas: en el caso del sistema visual, la proyección

iniciada en los cuerpos geniculados laterales solamente alcanza la corteza occipital para el

procesamiento discriminativo y no tiene conexión con el colículo superior, contrario a la relación

que hay entre el colículo inferior y el tálamo medial (Purves et al., 2017; Redolar Ripoll, 2017).

Además, en el caso de la vía auditiva, el paso por el colículo inferior puede ser considerado

como parte de un sistema de comunicación serial, mientras que, en el caso de la vía visual, el

paso por el colículo superior hace parte de una comunicación en paralelo.

De hecho, hasta este momento no es totalmente claro cómo las rutas subcorticales que

llevan información a la amígdala están implicadas en la mediación de los procesos plásticos

requeridos para el aprendizaje y memoria de las cualidades emocionales asociadas a eventos

visuales, mediados por esta estructura (Wei et al., 2015; De & Codispoti, 2015; Harris et al.,

2015; Maior et al., 2011; Doron & LeDoux, 1999). En este punto vale la pena mencionar los

trabajos realizados por Rüdiger Linke y colaboradores (Linke, De Lima, Schwegler, & Pape,

1999; Yilmazer-Hanke, Faber-Zuschratter, Linke, & Schwegler, 2002), quienes, con el uso de

marcadores anterógrados y retrógrados demostraron la existencia de una proyección desde el

colículo superior hasta el núcleo suprageniculado y algunos núcleos talámicos adyacentes y

desde todos ellos hasta la amígdala lateral. Esta vía podría ser una de las responsables de la

Capítulo 1: Consideraciones particulares sobre el sistema visual - 18

transmisión de la información visual hacia la amígdala para su procesamiento emocional. Sin

embargo, hasta la fecha no se tienen datos en profundidad sobre su funcionamiento de estas rutas

subcorticales en ratas Wistar. Sin embargo, se sabe que la estimulación de neuronas particulares

de las capas superficiales del colículo superior ocasiona cambios electrofisiológicos en regiones

del tálamo, tales como el geniculado lateral posterior como en la amígdala lateral en ratones

(Wei et al., 2015).

De acuerdo con este vacío en el conocimiento en este trabajo se buscó determinar los

cambios electrofisiológicos en la ruta que va de colículo superior hacia la amígdala luego de la

presentación asociativa de un estímulo lumínico y un estímulo eléctrico en el parche de vibrisas.

La existencia de este cambio de la actividad electrofisiológica indicaría un proceso de plasticidad

sináptica en dicha estructura que podría permitir una mejor comprensión de los mecanismos

celulares que median la formación de memorias aversivas, ya que se ha demostrado que la

amígdala es la estructura crucial para la formación de dichas memorias (LeDoux, 2003).

Buscando comprender mejor el papel de la amígdala en el procesamiento de estímulos

potencialmente aversivo, se realizará a continuación una breve revisión de este particular.

Capítulo 1: Consideraciones particulares sobre el sistema

visual

El sistema visual de los vertebrados corresponde a un sistema de percepción de

distancia y por tanto posee algunas características particulares compartidas por otros sistemas de

distancia, tal como el auditivo y el olfativo. Una de estas características es la presencia de

receptores sensoriales capaces de activarse diferencialmente por una amplia variedad de


estímulos, en este caso estímulos visuales, correspondientes específicamente a una pequeña

porción de la radiación electromagnética, denominada “radiación luminiscente”. Para cada

especie, dependiendo de las cualidades de sus propios fotorreceptores, la gama de esta radiación

que es percibida puede variar (Schiffman, 2004; Goldstein, Blanco, & Sampedro Suárez, 2009).

Además de la visión de características como los bordes, los contrastes y el movimiento, muchos

animales pueden ver el color. Para la visión del color, los fotorreceptores poseen algunos

pigmentos particulares que les permiten reaccionar selectivamente ante determinadas longitudes

de onda. En el caso de los seres humanos, los conos pueden poseer uno de tres pigmentos y a

partir de las diversas combinaciones de fotorreceptores alcanzados por los estímulos visuales, se

obtiene la visión de color, llamada visión cromática (Goldstein et al., 2009; Schiffman, 2004). En

el caso de las ratas, por ejemplo, el único pigmento existente en sus fotorreceptores le hace que

su visión no sea cromática, de forma que no hay visión de color, salvo algunas tonalidades de

rojo oscuro y grises (Whishaw & Kolb, 2005).

Las retinas de los mamíferos poseen, varias capas de células, organizadas de forma tal

que son las células ganglionares, las que poseen axones largos que, al salir de la retina, forman el

nervio óptico (Splittgerber & Snell, 2019). De esa forma, una vez realizado el proceso de

transducción de la estimulación visual en los fotorreceptores, se da un procesamiento local en la

retina que alcanza a esta capa de células ganglionares. Existen tres diferentes tipos de células

ganglionares denominadas X, Y e W, presentes en muchos mamíferos. Las células ganglionares

del tipo W predominan en la periferia de la retina y su función es la detección de movimientos

rápidos, mientras que las células ganglionares del tipo X, predominan en la mácula y su función

se relaciona más con la percepción del color. Ya las células del tipo Y se relacionan más con la

percepción de las variaciones súbitas de la intensidad lumínica (Purves et al., 2017). Dentro de


esta diversidad de células ganglionares de la retina, existe un grupo de células ganglionares que

mandan información únicamente a cuerpo geniculado lateral y al colículo superior (Kay et al.,

2011).

Entonces, esta salida de información desde la retina, origina un sistema de procesamiento

distribuido o en paralelo que garantiza el procesamiento simultáneo de diversos aspectos visuales

por diferentes regiones del encéfalo (Purves et al., 2017). La figura 1 muestra un dibujo de las vías

visuales desde la retina hasta los diferentes centros encefálicos de procesamiento.

Figura 1. Esquema de las vías visuales desde la retina hasta los diferentes centros encefáicos de procesamiento visual en humanos (tomado y modificado de (Mirochnik & Pezaris, 2019)

En concreto, el nervio óptico avanza por la base del cerebro formando el quiasma óptico

y dando lugar a varias proyecciones:

- Una primera vía termina, luego de un relevo en el núcleo geniculado lateral del

tálamo, en la corteza occipital. El procesamiento en la corteza occipital permite la

percepción “consciente” del estímulo visual, generando el proceso de discriminación

visual (Reinagel, 2001; Petruno, Clark, & Reinagel, 2013; Reinagel, 2001) y

permitiendo percepción de tridimensionalidad y de colores (Kraft et al., 2014), los

Nervio óptico y

tracto óptico

Radiaciones ópticas

Córtex visual

Retina

Núcleo geniculado

lateral (NGL)


cuales se dan más allá de la corteza visual primaria, en las cortezas extraestriadas

(Redolar Ripoll, 2017; Purves et al., 2017).

- Una segunda vía, termina en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo y es la

encargada del control de los ritmos circadianos de actividad principalmente

endocrina (Urtubia, 2006; Redolar Ripoll, 2017).

- Existe una tercera vía que termina en los núcleos pretectales, o pretectum

mesencefálico (núcleo pretectal anterior, núcleo pretectal medial, núcleo pretectal

posterior, núcleo del tracto óptico, núcleo limitante posterior, núcleo olivar pretectal

y el área comisural pretectal). Esta vía está encargada de la generación de varios

reflejos visuales incluyendo, por ejemplo, aquellos relacionados con la acomodación

a la luz y a la distancia, por medio del control parasimpático del núcleo de Edinger-

Westphal (Purves et al., 2017); con la coordinación del movimiento y los ajustes

necesarios para el mantenimiento de la imagen en la mácula, a través del núcleo del

tracto óptico (Konno & Ohtsuka, 1997); con la mediación de los reflejos vestíbulo-

oculares, por medio del núcleo el tracto óptico y su comunicación con el núcleo

reticular tegmental pontino (Watanabe, Kato, Sato, & Norita, 1993; Kyojimaekawa,

Toshiakitakeda, Maekawa, & Takeda, 1975). Los núcleos pretectales están

relacionados incluso con los movimientos oculares rápidos presentes durante el

sueño (Miller, Miller, Obermeyer, Behan, & Benca, 1999).

- La última vía que inicia también en las neuronas ganglionares de la retina termina en

las capas superficiales de los colículos superiores (CS). Esta vía está principalmente

encargada de otros aspectos reflejos tales como la acomodación de cabeza, cuello y

cuerpo a través del tracto tecto-espinal (Dean & Redgrave, 1984; Goodale &

Capítulo 2: Consideraciones anatomofisiológicas de las respuestas emocionales - 22

Murison, 1975). Algunos reflejos que involucran movimientos de tipo sacádico

también son realizados por activación de neuronas en los colículos superiores

(Redolar Ripoll, 2017).

Como se verá posteriormente, por sus conexiones particulares con la amígdala, esta

última vía puede estar ampliamente implicada en el procesamiento y aprendizaje de reflejos

visuales de connotación emocional. La actividad eléctrica del colículo superior en ratas se ha

caracterizado electrofisiológicamente desde 1969, año en que Jervin Sefton estimuló

eléctricamente el nervio óptico y registró la actividad en CS (Sefton, 1969). Años después, Dyer

y Annau (1977), estimularon lumínicamente la retina de ratas y registraron la actividad eléctrica

de la capa gris superficial del CS. El potencial evocado generado por dicha estimulación posee

cinco picos positivos y nodos negativos (P1-28.3ms, N3-34ms, P3-40.2ms, N4-51.7ms, P4-

61.2ms, N5-69.2ms, P5-173.2), extendiéndose el potencial hasta los 240 ms (Dyer & Annau,

1977). Adicionalmente, existen estudios que apuntan a que el colículo superior procesa

información de forma multimodal. Las capas superficiales, como ya visto, responden a estímulos

visuales, pero, de forma interesante, las capas profundas además de responder a estímulos

auditivos y también responden a estímulos somatosensoriales en las vibrisas (Gharaei et al.,

2018; Ito & Feldheim, 2018).

Capítulo 2: Consideraciones anatomofisiológicas de las

respuestas emocionales

La respuesta emocional frente a estímulos ambientales ofrece un aporte muy importante

para la supervivencia. Por lo general los reflejos rápidos que involucran los sistemas


neurovegetativos (sistema nervioso autónomo), normalmente con mayor actividad en la rama

simpática que en la parasimpática (por ejemplo, aumento del ritmo cardiaco o presión arterial)

pueden estar ligados con las respuestas emocionales, las cuales poseen también un componente

cognitivo y uno motor. Estos tres componentes de la emoción son llamados a menudo canales de

expresión emocional, siendo el componente cognitivo, por lo general, sinónimo del aspecto

subjetivo de la emoción (Purves et al., 2017).

Uno de los primeros estudios que relacionan el papel de la amígdala y la actividad

simpática fue llevado a cabo en 1968 por Holdstock, quien realizó lesiones en la amígdala y en

área septal en ratas Wistar y evaluó características de la respuesta simpática tales como la

frecuencia cardíaca y la respuesta galvánica de la piel. Sus resultados mostraron que la respuesta

galvánica de la piel se veía disminuida luego de la remoción de la amígdala y del área septal, en

comparación al grupo control (Holdstock, 1969). Las respuestas emocionales relacionadas con la

activación autónoma iniciarían por vías de proyección desde la amígdala central hasta estructuras

como el hipotálamo lateral (LeDoux, Iwata, Cicchetti, & Reis, 1988). De cualquier forma, estos

resultados son controversiales debido a que actualmente se asume que la respuesta galvánica de

la piel es mediada por el nivel de sudoración, al disminuir la resistencia de ésta al paso de

corriente y las ratas carecen de glándulas sudoríparas. Sin embargo, es posible que existan

algunos factores de humedad relativa de la piel asociados a cambios en el flujo sanguíneo que no

fueron evaluados en este estudio.

Debido a que en este trabajo se indagó por la integración de dos estímulos

pertenecientes a dos modalidades sensoriales distintas (visual y táctil) en la ABL, luego de la

presentación asociativa repetida, se realizará a continuación una breve revisión de los principios

teóricos que tradicionalmente se emplean para la comprensión de este proceso de integración. En


la literatura se encuentran varios reportes que sugieren la existencia de aprendizaje y

condicionamiento durante la anestesia, tanto en humanos como en otros animales (Samuel, Taub,

Paz, & Raz, 2018; Cork, Heaton, Campbell, & Kihlstrom, 1996; Bonebakker et al., 1996;

Deeprose, Andrade, Varma, & Edwards, 2004) de forma que resulta de interés determinar si es

posible que en la ABL se dé un proceso de plasticidad e integración polimodal bajo anestesia.

Ruta subcortical Colículo Superior – Amígdala vía tálamo: una aproximación

anatómica y electrofisiológica

Quizá el primer reporte que se tiene acerca del papel de la amígdala en el procesamiento

emocional sea el trabajo de Brown y Schäffer, de 1888, en el cual se reportan los efectos de la

lesión de los lóbulos temporales en el mono (Brown & Shäffer, 1888). Posteriormente, en 1956,

Weiskrantz demostró la importancia de la amígdala en el aprendizaje asociativo al generar una

lesión bilateral de dicha estructura en Macaca mulatta (Weiskrantz, 1956). Sin embargo,

podemos afirmar que fueron los trabajos clásicos de Kluver y Bucy (1955) los que abrieron la

puerta al estudio acerca del papel de la amígdala en el procesamiento emocional.

Anatómicamente, la amígdala es una estructura compuesta por diferentes núcleos,

divididos en dos grandes regiones: la región cortico-medial (núcleos cortical, central y medial) y

la región basolateral (núcleos lateral, accesorio basal y basal). La región basolateral está

compuesta por neuronas glutamatérgicas de tipo piramidal (en su mayoría, ubicadas

perpendicularmente a la corteza) e interneuronas de tipo GABAérgicas (Rosenkranz & Urban,

2020), que a su vez, pueden ser de dos tipos, las de feed-back y las feed-forward, según sus

características electrofisiológicas (Sah, Faber, Lopez de, & Power, 2003). Por ejemplo, Woodson

y colaboradores, 2000, mostraron que algunas conexiones entre el tálamo y amígdala lateral

pueden estar dadas en las interneuronas GABAérgicas, desencadenando una inhibición de tipo


feed-forward. Dichas conexiones se encontraron entre el tálamo auditivo y las dendritas distales

de las interneuronas (Woodson, Farb, & LeDoux, 2000). Los investigadores presumen que este

tipo de inhibición de los circuitos locales es importante para controlar la actividad de la amígdala

lateral frente a estímulos externos. Otros estudios revelaron que existen allí interneuronas

bipolares positivas para colina acetil transferasa e incluso otros tres tipos de neuronas no

piramidales, positivas para colesistoquinina, somatostatina – calbindina y para parvalbumina –

calbindina (Rosenkranz & Urban, 2020).

El soma y los segmentos iniciales de los axones de las neuronas del complejo

basolateral de la amígdala están inervados por axones en su mayoría provenientes de

interneuronas GABAérgicas, los cuales forman sinapsis simétricas, que tienen un papel

inhibitorio o neuromodulador. De igual forma, proyecciones monoaminérgicas provenientes

desde el tallo cerebral y proyecciones colinérgicas desde el prosencéfalo basal forman sinapsis

simétricas en la amígdala basolateral. Por otra parte, están las entradas excitatorias o sinapsis

asimétricas que se forman a partir de los axones terminales glutamatérgicos provenientes de la

corteza cerebral, línea media y núcleos intralaminares del tálamo, además de las conexiones intra

e internucleares de la amígdala (Rosenkranz & Urban, 2020).

Debido a que esta región perisomática (soma, cono axónico y dendritas proximales) es

el lugar en que se generan los potenciales de acción dependientes de sodio, se presenta una gran

cantidad de entradas GABAérgicas encargadas de la regulación de la actividad excitatoria de

estas células. En contraste, en las dendritas más distales las entradas inhibitorias regulan

principalmente la interacción dendrítica (Rosenkranz & Urban, 2020) y la plasticidad sináptica

(Freund & Katona, 2007).


Josselyn y Frankland, en 2018 sugieren que el conjunto de neuronas de tipo piramidal

en la amígdala lateral son grupos de neuronas con la capacidad de hacer una interconectividad en

red (engrama) y se asocian a la formación de aprendizajes asociativos, como es en el caso del

condicionamiento aversivo auditivo o, inclusive, el condicionamiento apetitivo. A un nivel

neuronal el condicionamiento al miedo involucra una convergencia de un estímulo nociceptivo,

como el choque y uno auditivo hacia el complexo basolateral (Josselyn & Frankland, 2018).

Aunque la mayoría de dichas neuronas de tipo piramidal reciben esta convergencia de entradas,

el engrama se encuentra principalmente en aquellas que exhiben una mayor excitabilidad

(Rosenkranz & Urban, 2020; Josselyn & Frankland, 2018). Se presume que dicho engrama

involucra fortalecimiento de la sinapsis y esto aumenta la probabilidad de que el mismo patrón

de actividad (o similar) dentro de este conjunto de células se puede reconstruir en un momento

posterior, lo que resulta en la recuperación de esa memoria (Josselyn & Frankland, 2018;

Josselyn, Kohler, & Frankland, 2015; Josselyn, Kohler, & Frankland, 2017; Schacter, 2011;

Tonegawa, Liu, Ramirez, & Redondo, 2015).

La mayoría de las entradas del sistema sensorial que se comunican con la amígdala

lateral vienen de las áreas de asociación, más que directamente de núcleos talámicos, sin

embargo su transmisión sináptica es relativamente demorada por la cantidad de sinapsis

involucradas (LeDoux, 2007). La figura 2 muestra un esquema de la organización de la amígdala

en la rata.

La diferenciación anatómica de la amígdala tiene correspondencia con la funcionalidad

de los núcleos que la componen. Se ha reportado que la amígdala lateral es la más implicada en

una tarea de aprendizaje emocional (LeDoux, Cicchetti, Xagoraris, & Romanski, 1990), sin

embargo la amígdala central también es importante para este proceso y, sobre todo, para la


generación de la respuesta emocional ya que posee conexiones con el hipotálamo y tallo cerebral

que a su vez se conectan con áreas relacionadas con comportamientos como respuestas

emocionales ante miedo (Wilensky, Schafe, Kristensen, & LeDoux, 2006). Adicionalmente,

estudios como los de Maren (1999), mostraron que la lesión de la amígdala lateral no impide la

adquisición del miedo condicionado cuando este es suscitado mediante un sobreentrenamiento,

resultado que dirigió la atención de los investigadores a la búsqueda de otras estructuras

candidatas. Posteriormente Zimmerman y colaboradores (Zimmerman, Rabinak, McLachlan, &

Maren, 2007), realizaron lesiones en la amígdala central y demostraron la importancia de esta

estructura para la adquisición y la expresión de las respuestas condicionadas clásicamente

(Rabinak, Orsini, Zimmerman, & Maren, 2009). Además, la amígdala central está estrechamente

involucrada con un tipo de condicionamiento particular que involucra el cerebelo, denominado

“condicionamiento de parpadeo del ojo dependiente de cerebelo”. Además, la amígdala central

está conectada con el tálamo medial (Farley, Albazboz, De Corte, Radley, & Freeman, 2018) lo

cual podría explicar porque está implicada en ciertos tipos de condicionamientos si los estímulos

condicionados son de tipo auditivo.

Figura 2. Esquema de las divisiones principales de la amígdala (Mirolli, Mannella, & Baldassarre, 2010). En verde, el complejo amigdalino basolateral (BLAc) que está compuesto por amígdala lateral (LA), basal (B) y accesorio basal (AB), que, a su vez, estos dos últimos B y AB conforman el núcleo basolateral (BL). En anaranjado, complejo


amigdalino central (CEAc) dividido en, central medial (CM), central lateral (CL), subdivisión capsular lateral (CLC) y núcleo basal de la estría terminal (BNST). En amarillo la amígdala medial (MEA) compuesta por amígdala medial dorsal (Md) y amígdala medial ventral (Mv).

Muchos reportes pueden encontrarse en la literatura acerca del papel de diferentes

estructuras cerebrales en la mediación del comportamiento emocional. Entre ellas, la amígdala ha

sido particularmente estudiada en la mediación, procesamiento, adquisición y evocación de las

respuestas emocionales en muchas especies (Cisler & Koster, 2010; Freitas-Ferrari et al., 2010;

Pechtel & Pizzagalli, 2011; Rosen & Rich, 2010; Sharpley, 2010; Teicher & Samson, 2016;

Bindi, Baldo, & Canteras, 2018; Canteras, Resstel, Bertoglio, Carobrez, & Guimaraes, 2010),

respuestas que pueden ser desencadenadas por varios tipos de estímulos, entre ellos, estímulos

visuales.

Estudios electrofisiológicos en humanos han mostrado un aumento de la potencia de la

banda Gamma en la amígdala luego de la presentación de imágenes con valencia emocional

negativa, lo que evidencia su participación en el procesamiento y reconocimiento de emociones.

También ha sido reportado que existe una disminución en la banda Delta al ser presentadas

imágenes dinámicas de la misma naturaleza (Oya, Kawasaki, Howard, III, & Adolphs, 2002)

(Fedele et al., 2020). A partir de esto es posible suponer el papel de la amígdala en el

reconocimiento de las características aversivas de las informaciones visuales.

Desde hace mucho tiempo se sabe que la información visual específica que ocasiona

actividad en los colículos superiores es el cambio súbito de la representación espacial de los

objetos en la retina: objetos que se aproximan o que se mueven a cierta velocidad generan

actividad de las neuronas del colículo superior (Dean & Redgrave, 1984).

La importancia de la información visual procesada en los colículos superiores en el

procesamiento emocional fue demostrada inicialmente por Goodale y Murison (1975), quienes


realizaron ablación de los colículos y de la corteza visual en ratas y observaron que se presentaba

una incapacidad para localizar estímulos visuales en el espacio y una pérdida de los movimientos

sacádicos. Sin embargo, aquellos animales que sólo recibían ablación de la corteza visual no

perdían totalmente la capacidad para responder emocionalmente a estímulos visuales, fenómeno

similar al visto en pacientes humanos luego de una lesión en el córtex occipital, más conocido

como blindsight o “visión ciega” (Isa & Yoshida, 2009). Estudios llevados a cabo en Macaca

fuscata y Macaca mulata mostraron evidencia de la participación de la vía que va desde el

colículo superior hacia la amígdala pasando por el núcleo pulvinar, en el mantenimiento de los

movimientos sacádicos visualmente guiados en el modelo de visión ciega (Kinoshita et al.,

2019). Adicionalmente, se ha reportado que la presentación de imágenes de rostros es capaz de

suscitar cambios en la potencia de la frecuencia Gamma de las neuronas de las capas

superficiales del colículo superior, lo que puede tener una correspondencia con la actividad de

las ondas Gamma en el núcleo pulvinar en Macaca mulata (Le et al., 2019)

Las neuronas de las capas profundas de los colículos superiores están en contacto con

las neuronas de las capas superficiales y poseen axones largos que terminan en diferentes núcleos

del tálamo como el lateral posterior y lateral posterior limitante (LeDoux, Farb, & Ruggiero,

1990). Utilizando técnicas de marcación tanto retrógradas como anterógradas, Linke y sus

colaboradores encontraron que los núcleos talámicos suprageniculados, peripedunculares y

posteriores intralaminares, no sólo recibían aferencias provenientes de los colículos superiores,

sino que también enviaban proyecciones hacia la amígdala en modelo murino (Linke et al.,

1999). Adicionalmente, en Macaca mulatta y en humanos también se evidencia una ruta que

conecta el colículo superior y la amígdala haciendo relevo sináptico en el núcleo pulvinar (Rafal

et al., 2015).


Changjun Shi y Michael Davis, en el 2001, hicieron estudios de condicionamiento

aversivo visual y olfativo con ratas Sprague Dawley, lesionando estructuras del tálamo como el

geniculado lateral y el geniculado lateral posterior luego de haber establecido el emparejamiento

de estímulos. Estas lesiones mostraron una reducción de la respuesta de sobresalto condicionado

en respuesta al estímulo visual pero no al estímulo olfatorio. Adicionalmente, tras marcaciones

anterógradas desde el geniculado posterior mostraron, conexiones directas en áreas amígdalo-

corticales (área TE2 y corteza dorsal perirrinal) y directas hacia el complejo basolateral (núcleo

lateral). Estos estudios sugirieron que el estímulo visual previamente condicionado podría estar

siendo trasmitido hacia la amígdala por diferentes vías, desde el geniculado lateral a la corteza

visual V1 y V2 a TE2 y la corteza perirrinal y desde el geniculado lateral posterior a la corteza a

V2, TE2 y corteza perirrinal o de forma directa desde el tálamo lateral posterior a la amígdala

lateral, como se puede observar en la figura 3 (Shi & Davis, 2001). Paralelamente, estudios

realizados con ratones, relacionan las vías mencionadas anteriormente, colículo-tálamo-

amigdalinas, con comportamientos defensivos, tales como congelamiento y aumento de

respuesta cardiaca, ante la imagen de un posible predador (Wei et al., 2015). Estos hallazgos

apoyan la idea que existe una ruta subcortical desde colículo su

perior hacía la amígdala que está relacionada con el rápido procesamiento de estímulos

emocionales (Wei et al., 2015).

Pese a haber transcurrido ya muchos años desde estas primeras descripciones

anatómicas, aún no se han realizado estudios que identifiquen una concordancia entre la

actividad eléctrica del colículo superior, el tálamo y la amígdala lateral durante la presentación

de estímulos visuales emocionalmente relevantes en ratas Wistar. Adicionalmente, durante la

búsqueda bibliográfica realizada no se encontraron estudios que hayan definido las


características de potenciales evocados por estímulos lumínicos en la amígdala. Sólo se han

reportado algunos datos acerca de potenciales evocados por estímulos auditivos más adelante

citados.

Figura 3. Esquema de vías amígdalo-corticales y amígdalo-talámica relacionadas durante el condicionamiento aversivo visual (Shi & Davis, 2001). Siglas en inglés: Visual CS (estímulo condicionado visual), SC (colículo superior), LGD (núcleo geniculado lateral), LP (geniculado lateral posterior), V1 (área cortical visual primaria), V2 (área cortical visual secundaria), TE2 (área cortical temporal secundaria) PR (área cortical peririnal) Footshock US (choque en pata estímulo incondicionado), BLA (complejo amigdalino basolateral), CE (amígdala central), Startle stimulus (reacción de sobresalto al estímulo), Ear (oreja), CRN (neuronas de la raíz cocleares), PnC (núcleo reticular pontino caudal), Spinal Cord (medula espinal).

Muchos trabajos han demostrado la relevancia de la amígdala en el aprendizaje

aversivo, en paradigmas tales como el condicionamiento clásico y en la formación de memorias


emocionales a largo plazo, por lo general patológicas, tales como las fobias y los trastornos de

estrés post traumático (Wiemer & Pauli, 2016; Jacques et al., 2019; Reznikov et al., 2018;

Wellman, Fitzpatrick, Machida, & Sanford, 2014; Protopopescu et al., 2005; Chaaya et al., 2019;

LeDoux & Brown, 2017; Kim & Cho, 2017; Campese et al., 2016; Janak & Tye, 2015).

Todas estas formas de aprendizaje requieren de la presencia de plasticidad sináptica,

entendida como la modificación estructural de la sinapsis en respuesta a la exposición repetida a

estímulos y fundamentada en cambios a largo plazo. En la literatura se encuentran muchos

reportes acerca de los mecanismos moleculares asociados a los procesos de plasticidad realizada

en el amígdala, en respuesta a la exposición a situaciones inductoras de miedo, los cuales

permiten ver que es un proceso similar al encontrado en hipocampo y en otras regiones

cerebrales, como parte del proceso de aprendizaje (Mitra, 2019; Ito & Morozov, 2019; Ressler &

Maren, 2019; Ryan et al., 2018; Izquierdo, Furini, & Myskiw, 2016; Blair, Tinkelman, Moita, &

LeDoux, 2003; Blair, Schafe, Bauer, Rodrigues, & LeDoux, 2001).

Pese a que desde el punto de vista electrofisiológico existen algunos reportes acerca de

la aparición de potenciales evocados en la amígdala basolateral durante el aprendizaje

pavloviano en ratas, se observa una preferencia de la comunidad científica en la evaluación de la

actividad amigdalina suscitada por los estímulos auditivos, siguiendo la línea de trabajo iniciada

por Joseph LeDoux en 1986 (Kim, Kong, Jo, Kim, & Choi, 2015; Kuniecki, Coenen, & Kaiser,

2002; Chaaya et al., 2019; Staib & Bach, 2018; Park et al., 2016; Kim et al., 2015; Choi, Cain, &

LeDoux, 2010). En 1998, por ejemplo, García y colaboradores pudieron identificar potenciales

evocados durante una tarea de miedo condicionado a un sonido (102 dB), encontrando un

potencial con tres picos positivos (P1-10 ms, P2-20 ms y P-30 ms) y tres componentes negativos

(N1-13 ms, N2-30 ms y N3-50 ms) (Garcia, Paquereau, Vouimba, & Jaffard, 1998).


Figura 4. Potenciales evocados por estímulo auditivo de 82 dB y de 102 dB (Garcia, Paquereau, Vouimba & Jaffard, 1998).

En relación con el sistema visual, se ha reportado que la activación de los colículos

superiores lleva a respuestas emocionales, quizá por inducir actividad del complejo basolateral

de la amígdala (Maior et al., 2011). Adicionalmente, los colículos superiores parecen estar

involucrados con el proceso de condicionamiento clásico (de, de Oliveira, Falconi-Sobrinho, da

Silva, Jr., & Coimbra, 2017; Cohen & Castro-Alamancos, 2010; Cohen & Castro-Alamancos,

2007; Oh & Disterhoft, 2010; Domjam, 2010). De esta forma, existe un claro interés por

entender cómo ocurre la función integradora de la amígdala cuando recibe dos estímulos de

diferentes modalidades sensoriales y, sobre todo, cuando uno de ellos es potencialmente

aversivo. Frente a esto, diferentes estudios han mostrado cambios anatómicos y funcionales en la

amígdala como consecuencia del emparejamiento de estímulos (Blair, Sotres-Bayon, Moita, &

LeDoux, 2005; Blair et al., 2003; Blair et al., 2001; Schafe, Nader, Blair, & LeDoux, 2001;

Maren, 2017; Maren & Quirk, 2004; Maren, 2001; Pitkanen, Savander, Nurminen, & Ylinen,

2003).


Ledoux y colaboradores (Wilensky, Schafe, & LeDoux, 2000; LeDoux, 2000), hallaron

cambios en la actividad de las neuronas de la amígdala basolateral y amígdala central de ratas

luego de varios ensayos de emparejamiento aversivo de un estímulo auditivo, dichos cambios

fueron observables al presentar el estímulo condicionado en ausencia del estímulo

incondicionado (Wilensky et al., 2006), demostrando así la importancia de ambos núcleos

amigdalinos para la respuesta visual condicionada.

Pese a que el grueso de los trabajos se ha desarrollado utilizando estímulos auditivos, se

sabe que la información sensorial utilizada para la formación de las memorias emocionales

condicionadas puede provenir de todos los sistemas sensoriales. En el caso particular del

condicionamiento con estímulos visuales, es posible que la información provenga tanto de la

corteza visual como de los colículos superiores. Las informaciones provenientes de los colículos

superiores pasan antes por algunos núcleos talámicos como el supra geniculado, el geniculado

medial y el intralaminar (Iwata, LeDoux, Meeley, Arneric, & Reis, 1986; LeDoux et al., 1986;

LeDoux, Ruggiero, & Reis, 1985; Linke et al., 1999).

Está bien determinado que las eferencias que salen desde la corteza occipital llegan

preferencialmente a otras áreas corticales asociativas (Doron & LeDoux, 1999). De acuerdo a

estos estudios podría pensarse que parte de la información visual alcanzará a la amígdala a través

del tálamo y los núcleos suprageniculados desde el colículo superior. Esta ruta de información

sería de crucial importancia para el procesamiento emocional visual. Esto se ve soportado por

estudios de conectividad realizados en humanos, en lo que se ha demostrado una actividad

coordinada del tálamo con la amígdala durante un condicionamiento aversivo visual.

Adicionalmente, la conectividad entre el tálamo, el área fusiforme y el giro parahipocampal, se

ve modificada durante la presentación de un estímulo condicionado en contraste con la

Definición y planteamiento del problema - 35

presentación de estímulos neutros. Esto reafirma la importancia que tienen el tálamo y la

amígdala para el aprendizaje asociativo de tipo pavloviano y muestra cómo otras áreas corticales

pueden estar asociadas a este proceso según la valencia emocional (Lithari, Moratti, & Weisz,

2015). No obstante, algunas áreas corticales que juegan un papel importante en el proceso de

aprendizaje emocional como la porción anterior de la corteza del cíngulo y la ínsula de humanos

(Shalev, Paz, & Avidan, 2018), podrían estar relacionadas con la modulación del aprendizaje y

no tanto con su adquisición.

Definición y planteamiento del problema

Pese a que diferentes investigadores, entre ellos Rüdiger Linke y colaboradores lograron

detectar conexiones anatómicas entre el colículo superior y la amígdala, hasta el momento no ha

sido realizada ninguna caracterización electrofisiológica de esta ruta.

Tampoco se ha caracterizado en detalle la respuesta electrofisiológica en la amígdala en

relación a la integración de estímulos sensoriales polimodales y no existen trabajos que

evidencien la correspondencia de la actividad eléctrica entre el colículo superior y la amígdala

bajo dichas condiciones en ratas Wistar.

Por esta razón, y en vista de que no existen en la literatura estudios sistemáticos en ese

modelo murino del papel que juega esta ruta en la evaluación emocional de la información visual

a nivel electrofisiológico, se propuso en este trabajo caracterizar la actividad eléctrica en la

amígdala, ocasionada por un estímulo visual, luego de su emparejamiento con un estímulo

eléctrico. Se plantea el estudio en animales anestesiados, de forma que se logre el mayor control

posible de las variables que pueden introducir interferencias. Esta aproximación para la


realización de condicionamientos, en ausencia de la totalidad funcional del animal, sigue la línea

de los trabajos desarrollados tradicionalmente en especies como Aplysia (Hawkins, Clark, &

Kandel, 2006; Hawkins, Greene, & Kandel, 1998; Antonov, Antonova, Kandel, & Hawkins,

2001; Bao, Kandel, & Hawkins, 1998; Nargeot, Petrissans, & Simmers, 2007; Reyes,

Mozzachiodi, Baxter, & Byrne, 2005), Hermissenda (Blackwell & Alkon, 1999; Cavallo,

Hamilton, & Farley, 2014; Cavallo, Hamilton, & Farley, 2014; Crow & Tian, 2006; Farley &

Alkon, 1987; Redell, Xue-Bian, Bubb, & Crow, 2007; Werness, Fay, Blackwell, Vogl, & Alkon,

1992) y otras especies como Lymnaea (Sunada, Lukowiak, & Sakakibara, 2012), tortugas

(Keifer, Zheng, & Mokin, 2008; Zheng & Keifer, 2009) y ranas (Tonge et al., 2008).

De esta forma, el trabajo aquí propuesto, implica un avance en el conocimiento de la

actividad eléctrica en la amígdala luego de un emparejamiento de estímulos durante anestesia, así

como un desarrollo metodológico que puede ser utilizado en la investigación de otros problemas

similares.

Objetivo general

Caracterizar los cambios en la actividad eléctrica en la amígdala y colículo superior

asociada a la integración de diferentes modalidades sensoriales luego de un emparejamiento

contingente de un estímulo visual con un estímulo eléctrico en el parche de vibrisas en ratas

Wistar machos bajo anestesia.

Objetivos específicos


- Caracterizar, en machos de ratas Wistar anestesiados, los potenciales de campo

provocados en las capas superficiales del colículo superior y en el complejo

amigdalino por un estímulo visual (destello de luz).

- Caracterizar, en machos de ratas Wistar anestesiados, los potenciales de campo

provocados en las capas superficiales del colículo superior y en el complejo

amigdalino por un estímulo eléctrico administrado en el parche de vibrisas.

- Caracterizar, en machos de ratas Wistar anestesiados, la forma en que la

presentación emparejada y contingente con estímulos eléctricos en el parche de

vibrisas modifica los potenciales de campo provocados en las capas superficiales del

colículo superior y en el complejo amigdalino por un estímulo visual.

Hipótesis

- Estímulos lumínicos de diferente duración generarán respuestas electrofisiológicas

diferentes en colículo superior y amígdala en machos de ratas Wistar anestesiados.

- Diferentes intensidades de un estímulo eléctrico generarán respuestas

electrofisiológicas diferentes en colículo superior y amígdala en machos de ratas

Wistar anestesiados.

- El emparejamiento entre un estímulo lumínico (40 Lux, 20 ms) y un estímulo

eléctrico (2 mA), no ocasionará cambios en la señal electrofisiológica en el colículo

superior en machos de ratas Wistar anestesiados.

- El emparejamiento entre un estímulo lumínico (40 Lux, 20 ms) y un estímulo

eléctrico (2 mA), ocasionará cambios en la señal electrofisiológica en la amígdala en

machos de ratas Wistar anestesiados.


- La presentación repetida del estímulo lumínico en ausencia del estímulo eléctrico

previamente emparejado ocasionará cambios en la señal electrofisiológica del

colículo superior en machos de ratas Wistar anestesiados.

- La presentación repetida del estímulo lumínico en ausencia del estímulo eléctrico

previamente emparejado ocasionará cambios en la señal electrofisiológica de la

amígdala en machos de ratas Wistar anestesiados.

Definición de variables

Para el presente trabajo las variables fueron definidas de la siguiente manera:

Variables independientes

Estimulación lumínica

Se usó un destello lumínico de luz blanca de (40 lux de intensidad) con una duración de

10 y 20 ms.

Estimulación somatosensorial

Se usó un pulso eléctrico de corriente directa de 0,5 mA o 2.0 mA de intensidad con una

duración de 100 s, aplicado en el parche de las vibrisas contralateral a las áreas de interés

(colículo superior y amígdala).

Variables dependientes

Las variables dependientes fueron observadas en el registro electrofisiológico como

cambios en la señal que, a su vez, pueden ser descritas por medio de diferentes características.

Las características de la señal fueron definidas de la siguiente manera:

Picos máximo y mínimo

Metodología - 39

Se usa la palabra pico máximo y mínimo para referirse a la mayor deflexión positiva o

negativa de una señal electrofisiológica (Luck, 2014). Esta característica está definida por un

voltaje (o amplitud) expresado en milivoltios (mV). El momento de aparición del pico, es su

latencia y ésta es expresada en milisegundos (ms). Por tanto, con referencia a los picos máximos

y mínimos de la señal tendremos las siguientes características:

Amplitud de pico a pico: Sumatoria de los valores absolutos del pico y el antipico,

determinando la distancia en milivoltios entre ambos.

Latencia del componente: Momento exacto de la aparición del pico o antipico en cierto

rango temporal de la señal posterior al estímulo, medido en milisegundos.

Vale la pena resaltar que durante la descripción del potencial evocado a los picos se les

da valores ordinales según el momento de aparición en la señal.

Poder espectral

Los datos pueden ser reorganizados con ayuda de transformadas de Fourier para

analizar la magnitud absoluta y relativa de las frecuencias que componen la señal analizada. Por

lo general, se consideran cinco bandas de oscilaciones en la actividad electrofisiológica neuronal:

delta (0,5-3 Hz), theta (3-8 Hz), alpha (8-13 Hz), beta (13-25 Hz) y gamma (25-100 Hz) (Chang-

Hwan, 2018). Adicionalmente se incluyó un análisis de las oscilaciones de alta frecuencia (HFO:

HFO1 de 100 a 250 Hz o ripples y HFO2 de 250 a 500 Hz o fast ripples), asociadas

normalmente a aumento en la cantidad de potenciales localizados (Engel Jr, Bragin, Staba, &

Mody, 2009; Scheffer-Teixeira, Belchior, Leao, Ribeiro, & Tort, 2013).

Metodología

Metodología - 40

Materiales y métodos

Sujetos

Se utilizaron 8 ratas macho Wistar con un peso de 380-450 g, provenientes del bioterio

central de la Universidad Nacional de Colombia. Los animales se alojaron, en el Laboratorio de

Aprendizaje y Comportamiento Animal de la Facultad de Ciencias Humanas, en cajas hogar

estándar, en grupos de cuatro por caja, con un ciclo luz-oscuridad 12:12 h (luz encendida a las

07:00 h) y a una temperatura de 20 ± 2˚C, con libre acceso a agua y comida.

Cirugía

Los sujetos recibieran anestesia con una mezcla de Uretano al 25% (1,5 g/Kg) y de

Xilacina al 2% (10 mg/Kg), administrada por vía intraperitoneal. Previamente a la inducción del

estado anestésico en plano quirúrgico se inyectó atropina 1% (0,05 mg/Kg). Adicionalmente, se

hizo inyección subdérmica de solución salina convencional (0.9%) para mantener el animal

hidratado, ver anexo A.

Al alcanzar el plano quirúrgico de anestesia (definido por la pérdida de reflejos postural,

corneal y de retirada), los animales se colocaron en un marco estereotáxico y se cubrieron con

una manta térmica para mantener su temperatura. Se realizaron los procedimientos tradicionales

de cirugía estereotáxica para implantación de electrodos, utilizando el atlas estereotáxico del

cerebro de la rata de Paxinos y Watson, ver anexo B.

A todos los sujetos se les implantó unilateralmente un electrodo de registro en el

colículo superior izquierdo, AP = 2.7 mm; ML = +1.5 mm (con relación al plano medio

interaural) y se descendió 3.2 mm a partir de la superficie pial. Por otro lado, en la amígdala

Metodología - 41

izquierda se implantó un electrodo de registro, AP = 5.2 mm; ML = +5.4 mm, (con relación al

plano medio interaural); y se descendió 7 mm desde la superficie pial (Paxinos & Watson, 2007).

Adicionalmente se insertó un par de electrodos en las porciones rostral y caudal del

labio superior derecho para estimular sincrónicamente las fibras mecanorreceptoras de las

vibrisas mistaciales. Los electrodos de tierra y referencia se insertaron en la musculatura nucal

del animal, de acuerdo con los protocolos seguidos en el Laboratorio de Neurofisiología

Comportamental, de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia. Todos

los registros, luego de la implantación de los electrodos, se realizaron con los animales bajo

anestesia profunda y posicionados en el marco estereotáxico. Este fue un procedimiento terminal.

Instrumentos

Registro

Los electrodos de registro se conectaron a un sistema de pre-amplificación (NEX1)

acoplado en corriente alterna con una ganancia de 100. La señal preamplificada se llevó a un

acondicionador de señales (CyberAmp, Axon Instruments) donde se hizo una segunda etapa de

amplificación con una ganancia de 50 (logrando una ganancia total de 5.000) y se pasó por un

filtro pasa-banda con frecuencias de corte 0,1 Hz y 10 kHz y un filtro notch centrado a 60 Hz

para eliminar el ruido de la línea eléctrica. La señal así acondicionada se digitalizó con una

frecuencia de muestreo de 10 kHz en un convertidor análogo-digital (Digidata, Axon

Instruments). Se usaron programas informáticos para controlar el acondicionador de señales

(CyberControl, Axon Instruments) y convertidor análogo-digital (Axoscope, Axon Instruments).

Una vez evaluada la calidad de la señal en ambos canales se dio inicio al procedimiento.

Metodología - 42

Los electrodos de registro fueron elaborados con un hilo de cobre 100 de diámetro

aislados por un material no conductor, dispuesto en el interior de una cánula guía de 6 cm de

largo de un calibre 22G.

Estimulación

Se utilizaron electrodos de estimulación conectados a un generador de pulso (Isolator-

11, Axon Instruments). Se aplicó una corriente eléctrica de hasta 2.0 mA con una duración de

100 s en el parche de las vibrisas contralateral a los electrodos de registro.

Los electrodos de estimulación fueron de acero inoxidable de 100 m recubiertos por

teflón.

Procedimiento

Luego de la ubicación de los electrodos se oscureció el entorno del sujeto colocando una

caja negra de plástico corrugado alrededor del marco estereotáxico, con la finalidad de bloquear

el paso de luz externa (ver figura 4). Un LED (3.6 V) de chorro de luz blanca (40 Lux) fue

colocado al frente de cada ojo, para dirigir un haz de luz de forma directa a los ojos del sujeto.

Figura 5. Arreglo experimental para la estimulación luminosa. El animal, montado en el marco estereotáxico, es rodeado por una pantalla negra y una cortina, de forma que llegara luz ambiental que hiciera interferencia.

Metodología - 43

El registro electrofisiológico se dividió en cinco etapas:

Etapa I: Evaluación del efecto de la duración del estímulo luminoso y de la intensidad

del estímulo somatosensorial sobre las respuestas provocadas en el colículo superior y en la

amígdala: Como estímulos visuales se utilizaron dos destellos de 10 ms o 20 ms de duración con

intensidad de 40 Lux. Como estímulos sensoriales potencialmente aversivos, su utilizaron

estímulos eléctricos de intensidades de 0,5 mA y 2 mA con duración de 100 s. Los estímulos

fueron presentados 100 veces y las respuestas fueron promediadas para la obtención de los

potenciales evocados. Inmediatamente luego de la aplicación de los estímulos, se escogieron

aquellos que generaron la mayor activación, de acuerdo con la intensidad de la respuesta

obtenido para cada uno. Los estímulos seleccionados, fueron entonces utilizados para el

emparejamiento.

Etapa II: Línea de base del potencial provocado en la amígdala y el colículo superior

por un estímulo visual no emparejado: En esta etapa se registró la actividad eléctrica inducida

por los estímulos en las dos estructuras. Para esto, se registró la actividad eléctrica en el colículo

superior y en la amígdala frente a 100 presentaciones del estímulo visual (destello de luz de color

blanco, 40 Lux; 20 ms de duración; con un intervalo inter-estímulo de 5 s).

Etapa III: Evolución del potencial provocado en la amígdala y el colículo superior por

un estímulo visual como función de su emparejamiento contingente con un estímulo

somatosensorial: Se realizó el emparejamiento de los dos estímulos, presentando

inicialmente el destello de luz seguido, 100 ms después, por el estímulo eléctrico en el

parche de vibrisas. Troncoso, Munera y Delgado García (2004) demostraron que es

posible utilizar un estímulo eléctrico fuerte en el parche de las vibrisas como estímulo

Metodología - 44

incondicionado en procesos de aprendizaje asociativo. Se realizaron 300 repeticiones de

este emparejamiento con un intervalo inter-ensayo de 5 s. El parámetro de las 300

repeticiones fue seleccionado tras hacer pilotajes hasta observar la diferencia en el voltaje

de la señal captada en la amígdala, adicionalmente los 5 segundo de intervalo se tomaron

para garantizar la recuperación de las estructuras luego de un estímulo. El

emparejamiento se realizó de acuerdo con los procedimientos tradicionales

emparejamiento de estímulos (Domjam, 2010) reportados en el protocolo específico del

condicionamiento se encuentra en el anexo C, donde se ven las especificaciones del

emparejamiento.

Etapa IV: Evolución del potencial provocado en la amígdala y el colículo superior

como función de la presentación no-emparejada de un estímulo visual que previamente había

sido emparejado: Para esto se realizaron 600 presentaciones del estímulo visual, con un intervalo

inter-estímulo de 5 s. Se promediaron las primeras 100 presentaciones del estímulo visual y las

100 últimas para analizar la variación de la respuesta ante el estímulo lumínico con relación a la

cantidad de presentaciones.

Extracción de cerebros para análisis histológico

Al finalizar la toma de los datos, se inyectó una solución de KCl saturada intracardiaca

(ver anexo D) como procedimiento final de eutanasia. El lugar preciso de ubicación de cada

electrodo fue marcado mediante la realización de una lesión electrolítica por medio de la

aplicación de una corriente de 24 A durante cinco minutos. En ese momento los cerebros

fueron limpiados con solución salina (0.9 %) y fijados con paraformaldehído (4 %) y retirados.

Los cerebros fueron mantenidos en paraformaldehído (4 %) durante, al menos cuatro días, antes

Metodología - 45

de su procesamiento histológico. Para el análisis histológico se hicieron cortes en tajadas

coronales de 50 m de espesor, usando un vibrátomo (VIBRATOME 1000). Posteriormente los

tejidos fueron analizados en un estereoscopio de marca Olympus SZX16 y se tomaron las fotos

acoplando este a una cámara fotográfica convencional Sony Cybershot. Todos los animales con

electrodos en ubicaciones diferentes a las deseadas fueron retirados del experimento.

Análisis estadístico

Una vez recolectados los datos se procedió a su análisis para establecer que cumplieran

con los supuestos de normalidad (Shapiro-Wilk). En caso de que éstos fueran cumplidos, se

procedía a la realización de la estadística paramétrica. Cuando los supuestos de normalidad no

fueran cumplidos, se procedía a la realización de la estadística no paramétrica equivalente. Vale

la pena mencionar que en todos los casos el alfa fue definido en 0,05.

De acuerdo con las etapas mencionadas en este texto, la estadística se realizó de la

siguiente manera:

Etapa I: Tanto para la comparación de los efectos de las dos duraciones de estimulación

lumínica de 10 ms o 20 ms como para la comparación de las señales de estimulación eléctrica en

el parche de vibrisas 0,5 o 2 mA se realizaron pruebas t.

Etapas II y IV: Los efectos del emparejamiento de los estímulos lumínico y eléctrico

fueron analizados con ANOVA de medidas repetidas.

Consideraciones bioéticas

Esta investigación tuvo el aval otorgado por el comité de Bioética de la Facultad de

Medicina Veterinaria y Zootecnia por medio del Acta 08 del 05 de septiembre del 2017, con

numero de radicado CB-FMVZ-UN-051-17 (ver anexo E).

Metodología - 46

Durante la realización de este proyecto se cumplieron las normas éticas y legales

exigidas para la investigación con animales de laboratorio en Colombia (Ley 84 de 1989 y

Resolución No. 8430 de 1993 del Ministerio de Salud). Se garantizó que los animales

mantuvieran agua y comida (LabDiet) ad libitum durante todo el experimento. Se respetó la

declaración universal de los derechos de los animales proclamada por la Liga Internacional de

los Derechos del Animal, Ginebra, Suiza (1989) y los principios éticos de la experimentación

animal enunciados por el International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS).

Adicionalmente, se tuvo en cuenta la Guía para el Cuidado y Uso de los Animales de

Laboratorio (National Research Council, 2011 Guía para el cuidado y uso de animales de

laboratorio. Ediciones UC.)

Productos esperados

- Por el carácter de original y novedoso tanto del diseño como de los resultados

obtenidos en este trabajo, se espera, una vez finalizado el proceso de entrega del

material a biblioteca, el envío de un manuscrito a una revista indexada,

preferiblemente cuya área de cobertura incluya temas en integración sensorial y

electrofisiología.

- Resultados parciales de este trabajo fueron presentados en modalidad de nano-

simposio en la reunión anual de la Society for Neuroscience, en Chicago en 2019.

- Resultados preliminares fueron mostrados en la modalidad de poster en Escuela

Internacional de Neurociencia IBRO en Villa de Leyva

- Resultados parciales fueron presentados en la modalidad de poster en el evento

“Expopsicología”, organizado por la Universidad Católica de Colombia, Bogotá.

Resultados - 47

Resultados

Histología

La Figura 6 presenta las ubicaciones de los electrodos en los colículos superiores (A) y

en la amígdala (B) para todos los sujetos.

Figura 6. Ubicación de los electrodos en (A) colículo superior (40X) y en (B) amígdala (20X). A la izquierda, microfotografías de secciones coronales que contienen la lesión electrolítica que indica la ubicación de la punta del

1 mm

1 mm

Resultados - 48

electrodo de registro; a la derecha, diagrama del corte coronal correspondiente que muestra las ubicación de los electrodos en cada uno de los sujetos experimentales. Los diagramas son tomados y adaptados del atlas estereotáxico The Rat Brain in stereotaxic coordinates (Paxinos & Watson, 2007)

Tras el análisis de la histología, y tomando en cuenta la calidad de las señales obtenidas,

se decidió retirar el sujeto 5 del experimento.

Efecto de la duración del estímulo luminoso y la intensidad del estímulo

somatosensorial sobre los potenciales provocados en el colículo superior y

en la amígdala

Estimulación lumínica 10 ms vs 20 ms

A partir de la estimulación lumínica se determinaron los componentes estables del

potencial de campo tanto para colículo superior, como para amígdala. En el caso del colículo

superior se determinaron tres componentes positivos (P1, P2 y P3), cuyas latencias de aparición

son de aproximadamente 30 ms, 80 ms y 100 ms. Se encontraron además tres componentes

negativos (N1, N2 y N3) con latencias de aparición aproximada de 60 ms, 90 ms y 125 ms

respectivamente. Para la amígdala se encontraron dos componentes positivos (P1 y P2) con

latencias de aparición 30 ms y 110 ms, respectivamente, también se encontraron dos

componentes negativos (N1a y N1b) con latencias de aparición aproximadas en 70 ms y 90 ms

(ver Figuras 7 y 8).

Resultados - 49

Figura 7. Promedios intersujetos de los potenciales provocados por un estímulo luminoso de 20ms en (A) coliculo superior (CS) y (B) amígdala (AM). Se ilustra la media +/- el error estándar de la media (SEM).

A

P1

AM

Resultados - 50

Figura 8. Potencial provocado por estímulos luminosos de diferente duración (10 vs. 20ms) en coliculo superior (CS) y amígdala (AM). (A) Comparación de los potenciales provocados en CS por estímulos luminosos de diferente duración. (B) Diagrama de barras comparando la amplitud pico a pico de los componentes principales de los potenciales provocados en CS por estímulos luminosos de diferente duración. (C) Comparación de los potenciales provocados en AM por estímulos luminosos de diferente duración. (D) Diagrama de barras comparando la amplitud pico a pico de los componentes principales de los potenciales provocados en AM por estímulos luminosos de diferente duración. Las flechas y líneas punteadas indican el comienzo del estímulo lumínico. Las diferencias significativas entre 10 ms y 20 ms están indicadas por * (p <005).

Usando pruebas t de Student, se comparó la amplitud de los componentes P1N1, P2N2

y P3N3 en los potenciales provocados por estímulos luminosos de diferente duración (10 ms y

Resultados - 51

20 ms). En el colículo superior se encontró que la amplitud pico a pico de los N1P1 (t[6]=-3,179;

p=0,019) y P2N2 (t[6]= -2,556; p= 0,043) fue significativamente mayor tras un estímulo de 20

ms; la duración del estímulo luminoso no afectó la amplitud pico a pico del componente N3P3.

La duración del estímulo luminoso no tuvo efectos significativos sobre los componentes estables

del potencial provocado en la amígdala (ver Anexo F - Tablas 1 y 2).

Estimulación eléctrica en parche de vibrisas 0,5 mA vs 2 mA

A partir de la estimulación eléctrica se determinaron los componentes positivos y

negativos del potencial de campo tanto para colículo superior, como para amígdala. En el

caso del colículo superior se determinó un componente negativo (N1), cuya latencia de

aparición es de aproximadamente a los 10 ms, además se encontró un componente

positivo (P1), con latencia de aparición aproximada de 50 ms. Para la amígdala se

encontró un componente negativo (N1) con latencia de aparición aproximadamente de 10

ms y un componente positivo (P1) con latencia de aparición aproximada de 50 ms (ver

Figura 9).

Resultados - 52

Figura 9. Grandes promedios de la señal comparando el efecto de un estímulo eléctrico en parche de vibrisas (0,5 vs 2 mA) en (A) CS y (B) AM. (A). Comparación del potencial provocado en CS por estímulos eléctrico de diferente intensidad. (B) Diagrama de barras comparando la amplitud pico a pico del componente principale del potencial provocado en CS por estímulos eléctricos de diferente intensidad. (C) Comparación del potencial provocado en AM por estímulos eléctrico de diferente intensidad. (D) Diagrama de barras comparando la amplitud pico a pico del componente principal del potencial provocado en AM por estímulos eléctricos de diferente intensidad. Las flechas y líneas punteadas indican el comienzo del estímulo lumínico. Las diferencias significativas entre 0,5 mA y 2 mA están indicadas por * (p <005).

C

Resultados - 53

Usando pruebas t de Student se comparó la amplitud de los componentes N1P1 en los

potenciales provocados por estímulos eléctricos de diferente intensidad (0,5 mA vs 2 mA). En el

colículo superior, no se encontraron diferencias significativas entre para la amplitud del pico a

pico N1P1, la intensidad del estímulo eléctrico no tuvo efectos significativos sobre el

componente estable del potencial provocado. No obstante, en la amígdala se encontró que la

amplitud pico a pico del componente N1P1 (t[3]= -6,338; p= 0,008) fue significativamente mayor

tras un estímulo de 2 mA (ver Anexo F - Tabla 4).

Se midieron también las amplitudes de pico a pico de los potenciales de acción

poblacionales suscitados por la aplicación de 0,5 mA y 2 mA para colículo superior y amígdala,

estas mediciones también fueron evaluadas con pruebas t para medidas repetidas (ver Figura 10).

Resultados - 54

Figura 10. Grandes promedios de la señal comparando los SP (spike potential) de un estímulo eléctrico en parche de vibrisas (0,5 vs 2 mA) en (A) CS y (B) AM. Comparación de los SP en CS por estímulos eléctrico de diferente intensidad. (B) Diagrama de barras comparando la amplitud pico a pico del componente principal del potencial provocado en CS por estímulos eléctricos de diferente intensidad. (C) Comparación del potencial provocado en AM por estímulos eléctrico de diferente duración. (D) Diagrama de barras comparando la amplitud pico a pico del componente principale del potencial provocado en AM por estímulos eléctricos de diferente duración. Las flechas y líneas punteadas indican el comienzo del estímulo lumínico. Las diferencias significativas entre 0,5 mA y 2 mA están indicadas por * (p <005)

10 ms

10 ms

Resultados - 55

Usando pruebas t de Student se comparó la amplitud del potencial del spike o potential

spike (PS) provocados por estímulos eléctricos de diferente intensidad (0,5 mA a 2 mA). En el

colículo superior, se encontró que la amplitud pico a pico del SP (t[3]= -3,540; p= 0,038) fue

significativamente mayor teas un estímulo de 2 mA; así como en la amígdala (t[3]= -4,786; p=

0,017) (ver Anexo E - Tabla 4).

Evolución del potencial provocado en la amígdala y el colículo superior como

función de la presentación no-emparejado de un estímulo visual que

previamente había sido emparejado

Usando un ANOVA de una vía para medidas repetidas se comparó la amplitud de los

componentes P1N1, P2N2 y P3N3 en los potenciales provocados por un estímulo luminoso (20

ms) no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 en colículo superior, así mismo para los

componentes P1N1a, N1aN1b y N1bP2, en amígdala (ver Figura 11).

Resultados - 56

Figura 11. Grandes promedios de la señal comparando el efecto de un estímulo lumínico 20 ms para no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2, en CS (A) y AM (B). (A). Comparación de los potenciales provocados en CS por un estímulos lumínico no emparejado1, emparejado y no emparejado 2. (B) Diagrama de barras comparando la amplitud pico a pico de los componentes principales de los potenciales provocados en CS por un estímulos lumínico no emparejado1, emparejado y no emparejado 2. (C) Comparación de los potenciales provocados en AM por un estímulos lumínico no emparejado1, emparejado y no emparejado 2. (D) Diagrama de barras comparando la amplitud pico a pico de los componentes principales de los potenciales provocados en AM por un estímulos lumínico no emparejado1, emparejado y no emparejado 2. Las flechas y líneas punteadas indican el comienzo del estímulo lumínico. Las diferencias significativas entre 10 ms y 20 ms están indicadas por * (p <005).

D

Resultados - 57

La presentación del estímulo lumínico no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2

no tuvo efectos significativos sobre los componentes estables del potencial provocado en

colículo superior y en amígdala (ver Anexo F - Tablas 5 y 6).

Comparación de los poderes espectrales

Potencias Relativas


Usando pruebas t de Student se comparó las diferencias en las bandas de frecuencia

relativas Delta, theta, Alpha, Beta, Gamma, HFO1 y HFO 2 para diferentes estimulaciones

lumínicas (10 ms y de 20 ms). La duración del estímulo luminoso no tuvo efectos significativos

sobre las bandas de frecuencia relativas en colículo superior y en amígdala (ver Tablas 7 y 8,

Figura 12).

Resultados - 58

Figura 12. Comparación de potencias relativas para las señales captadas en CS y AM durante la aplicación de diferentes estímulos, luz 10 ms y 20 ms (A y B). Las siglas CS y ABL son iguales a las usadas en la figura 6. Las barras de error son el error estándar.

Po

ten

cia

rela

tiva

AM

10

vs

20

ms

(%)

Resultados - 59

Por otro lado, al hacer la comparación de las bandas de frecuencia relativas de las dos

estructuras (colículo superior y amígdala) con pruebas t de Student durante la estimulación

lumínica de 20 ms de duración, se encontró un aumento significativo en la banda Delta

(t[14]=3,579; p=0,003) de amígdala. Para las bandas Alpha (t[14]=4,727; p<0,001) y Beta

(t[14]=-2,144; p=0,050) se encontró un aumento significativamente mayor en colículo superior,

ver Figura 13 y Anexo F - Tabla 9.

Figura 13. Comparación de potencias relativas de las señales captadas durante la presentación de un estímulo lumínico de 20 ms de duración en CS vs AM. Las siglas CS y AM son iguales a las usadas en la figura 6. Las barras de error son el error estándar. Las diferencias significativas. Las diferencias significativas entre AM y CS están indicadas por * (p <0.05).

Comparación entre estímulo lumínico 20 ms no emparejado 1, emparejado y no

emparejado 2

AM

CS

Po

ten

cia

rela

tiva

CS

vs A

M 2

0 m

s (%

)

Resultados - 60

Usando ANOVA para medidas repetidas se compararon las bandas de frecuencia

relativa de la señal frente a un estímulo lumínico (20 ms) no emparejado 1, emparejado y no

emparejado 2. En la amígdala se encontró que para las bandas de frecuencia HFO1

(F[2,21]=16,383; p<0,001) y HFO2 (F[2,21]=25,759; p<0,001) hubo un aumento significativamente

mayor tras presentar el estímulo lumínico no emparejado 2 (ver Anexo F - Tabla 7, Figura 14).

El análisis post hoc mostró que para la banda HFO1 hubo un aumento en no emparejado 2

comparado con el no emparejado 1 y con emparejado. Para la banda de frecuencia HFO2, hubo

un aumento en emparejado con respecto al no emparejado 1. Igualmente se encontró un aumento

en emparejado 2 con respecto a emparejado y no emparejado 1. La presentación de ninguno de

los tres estímulos tuvo efectos significativos sobre las bandas de frecuencia relativas en colículo

superior.

Resultados - 61

Figura 14. Comparación de potencias relativas para las señales registradas en CS y AM durante la aplicación de un estímulo lumínico no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 (A y B). Las siglas CS y AM son iguales a las usadas en la figura 6. Las siglas no empa 1 (no emparejado 1), empa (emparejado) y no empa 2 (no emparejado 2). Las barras de error son el error estándar. Las diferencias significativas entre emparejamiento y no emparejamiento 2 están indicadas por * (p <0.05) para A y B las diferencias significativas entre no emparejado 1 y emparejado están indicadas por + (p <0.05) para A y B.

Po

ten

cia

rela

tiva

AM

no

em

pa

1, e

mp

a, n

o e

mp

a 2

Resultados - 62

Potencias absolutas


Usando pruebas t de Student se comparó las diferencias en las bandas de frecuencia

absolutas Delta, theta, Alpha, Beta, Gamma, HFO1 y HFO 2 para diferentes estimulaciones

lumínicas (10 ms y de 20 ms). En amígdala se encontró un aumento significativamente mayor en

las bandas Delta (t[14]=2,929; p=0,011) y Alfa (t[14]= 2,153; p=0,049). La duración del estímulo

luminosos no tuvo efectos significativos sobre las bandas de frecuencia del colículo superior (ver

Figura 15 y Anexo E - Tabla 11).

Resultados - 63

Figura 15. Comparación de potencias absolutas para las señales captadas en CS y ABL durante la aplicación de diferentes estímulos, luz 10 ms y 20 ms (A y B). Las siglas CS y AM son iguales a las usadas en la figura 6. Las barras de error son el error estándar. Las diferencias significativas entre 10 ms y 20 ms están indicadas por * (p <005) para A y B

Po

ten

cia

abso

luta

AM

- 1

0 v

s 2

0 m

s (m

V2

/Hz)

Resultados - 64

Por otro lado, al hacer la comparación de las bandas de frecuencia absolutas de las dos

estructuras (colículo superior y amígdala) por medio de pruebas t de Student durante la

estimulación lumínica de 20 ms de duración, se encontró un aumento significativo en las bandas

Delta (t[14]=5,855; p<0.001), Theta (t[14]=4,168; p<0.001), Alpha (t[14]=3,494; p=0,004), Beta

(t[14]=2,648; p=0,019), Gamma (t[14]=3,792; p=0,002) y HFO2 (t[14]=2,173; p=0,047) de amígdala

(ver Figura 16 y Anexo F - Tabla 12).

Figura 16. Comparación de potencias absolutas de las señales registradas durante la presentación de un estímulo lumínico de 20 ms de duración en CS vs AM. Las siglas CS y AM son iguales a las usadas en la figura 6.. Las barras de error son el error estándar. Las diferencias significativas entre ABL y CS están indicadas de la misma forma que en la figura 12.

Comparación entre estímulo lumínico 20 ms no emparejado 1, emparejado y no

emparejado 2

AM

CS

Po

ten

cia

abso

luta

CS

vs A

M (

20

ms)

Resultados - 65

Usando ANOVA para medidas repetidas se compararon las bandas de frecuencia

absolutas de la señal frente a un estímulo lumínico (20 ms) no emparejado 1, emparejado y no

emparejado 2. En la amígdala se encontró que para las bandas de frecuencia Delta

(F[2,21]=10,112; p<0.001), Alpha (F[2,21]=3,908; p=0,036), Beta (F[2,21]=3,685; p=0,042); Gamma

(F[2,21]=5,65; p=0,011), HFO1 (F[2,21]=-68,897; p<0,001) y HFO2 (F[2,21]=47,326; p<0,001), ver

(Anexo F - Tabla 11, Figura 17). El análisis Post Hoc indicó que hubo un aumento en la potencia

de todas las bandas para emparejado, con relación al no emparejado 1 y no emparejado 2. La

presentación de ninguno de los tres estímulos tuvo efectos significativos sobre las bandas de

frecuencia absolutas en colículo superior.

Resultados - 66

Figura 17. Comparación de potencias absolutas para las señales registradas en CS y AM durante la aplicación de estímulo lumínico no emparejaado 1, emparejado y no emparejado 2 (A y B). Las siglas CS y AM son iguales a las usadas en la figura 6. Las barras de error son el error estándar. Las diferencias significativas para A, B están indicadas de la misma forma que en la figura 13 y las siglas son iguales a las usadas en la figura 13

Po

ten

cia

abso

luta

AM

no

em

pa

1, e

mp

a, n

o e

mp

a 2

(mV

2/H

z)

Resultados - 67

Evolución de la actividad de la amígdala y el colículo superior como función

de la presentación no-emparejada de un estímulo visual que previamente

había sido emparejado – señal tratada con transformada Z

Inicialmente, se realizó una normalización de la señal con respecto al promedio de la

actividad registrada en los 50 ms anteriores a la estimulación (línea base), posteriormente a cada

valor se restó la media de la línea base y el residuo fue dividido por la desviación estándar de esa

misma línea base, (transformada Z), ver Figura 18. Una vez que se tuvo la señal normalizada se

seleccionaron los componentes, para colículo superior (P1N1, N1P2 y P2N2) y amígdala

(P1N1a, N1aN1b y N1bP2) de los cuales se calculó la amplitud del pico a pico.

Figura 18. Grandes promedios de la señal luego de la transformada Z comparando el efecto de un estímulo lumínico 20 ms para no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 en CS (A) y AM (B). Las siglas CS y AM son iguales a las usadas en la figura 6.

Usando un ANOVA de una vía se comparó la amplitud de los de los componentes

P1N1, N1P2 y P2N2 de en los potenciales provocados por un estímulo luminoso (20 ms) no

AM transformada Z

Tiempo (ms)

Resultados - 68

emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 en colículo superior. Se observó un aumento de la

amplitud pico a pico significativamente mayor para el estímulo lumínico no emparejado 2

comparado con el emparejado, únicamente en la amplitud pico a pico de P2N2 (F[2,18]= 5,704;

p=0,022), ver Tabla 13 Figura 19. Por otro lado, para amígdala se observó un aumento de la

amplitud pico a pico significativamente mayor para el estímulo lumínico emparejado con

relación al no emparejado 1 y no emparejado 2 en el rango de P1N1a (F[2,18]= 7,217; p=0,005)

ver Tabla 14, Figura 18. El análisis post hoc reveló que el aumento de la amplitud se presentó en

el estímulo lumínico emparejado comparándolo con no emparejado 1 (p=0,004) y no emparejado

2 (p=0,049). Adicionalmente, se observó un aumento de la amplitud pico a pico

significativamente mayor del componente N1bP2 para el estímulo lumínico emparejado con

relación al no emparejado 2 (F[2,18]= 4,379; p=0,028) (ver Tabla 14, Figura 20).

Resultados - 69

Figura 19. Comparación del efecto de un estímulo lumínico 20 ms para no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 en CS para P1N1(A), N1P2 (B), P2N2 (C). La sigla CS es la misma usada en la figura 6. Las diferencias significaticas están marcadas con * (p<0.05)

Resultados - 70

Figura 20. Comparación del efecto de un estímulo lumínico 20 ms para no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 en AM para P1N1a (A), N1aN1b (B), N1bP2 (C). La sigla AM es la misma usada en la figura 6). Las siglas CS y AM son iguales a las usadas en la figura 6.Las diferencias significaticas están marcadas con * (p<0.05)

Posteriormente, esa señal fue elevada al cuadrado y se midieron la amplitud pico a pico

y el área bajo la curva en los rangos P1N1, N1P2 y P2N2 para colículo superior y P1N1a,

N1aN1b, N1bP2 y P2N2 para amígdala (ver Figura 21).

A B

C

AM P1N1a transformada Z AM N1aN1b transformada Z

AM N1bP2 transformada Z

Resultados - 71

Figura 21. Grandes promedios de la señal positiva luego de la transformada Z comparando el efecto de un estímulo lumínico 20 ms para no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 en CS (A) y ABL (B). Las siglas CS y ABL son iguales a las usadas en la figura 6.

Usando un ANOVA de una vía se encontró en colículo superior que la amplitud pico a

pico presente durante el componente P2N2 fue significativamente mayor para no emparejado 2

comparado con el emparejado (F[2,18]= 5,051; p=0,018), ver Tabla 15, Figura 22.

Adicionalmente, se observó que el área bajo la curva presente durante el rango de P2N2 fue

significativamente mayor para no emparejado 2 comparado con emparejado (F[2,18]= 5,681;

p=0,012), ver Tabla 17, Figura 24. Para amígdala se encontró que el área bajo la curva presente

durante el rango de P2N2 fue significativamente mayor para emparejado comparado con no

emparejado 2 (F[2,18]= 3,648; p=0,047), ver Tabla 18, Figura 25.

AM LEP poder

Resultados - 72

Figura 22. Comparación del efecto de un estímulo lumínico 20 ms en la señal positiva para no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 en CS para P1N1(A), N1P2 (B), P2N2 (C). La sigla CS es la misma usada en la figura 6.Las diferencias significaticas están marcadas con * (p<0.05)

A B

C

Resultados - 73

Figura 23. Comparación del efecto de un estímulo lumínico 20 ms en la señal positiva para no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 en AM para P1N1a (A), N1aN1b (B), N1bP2 (C). La sigla AM es la misma usada en la figura 6)..Las diferencias significaticas están marcadas con * (p<0.05)

A B

C

AM P1N1a señal positiva AM N1aN1b señal positiva

AM N1bP2 señal positiva

Resultados - 74

Figura 24. Comparación del efecto de un estímulo lumínico 20 ms en el área bajo la curva para no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 en CS para P1N1(A), N1P2 (B), P2N2 (C). La sigla CS es la misma usada en la figura 6. Las diferencias significaticas están marcadas con * (p<0.05)

A B

C

Resultados - 75

Figura 25. Comparación del efecto de un estímulo lumínico 20 ms en el área bajo la curva para no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 en ABL para P1N1a (A), N1aN1b (B), N1bP2 (C). La sigla AM es la misma usada en la figura 6.Las diferencias significaticas están marcadas con * (p<0.05)

A B

C

AM P1n1a area bajo la curva AM N1aN1b area bajo la curva

AM N1bP2 area bajo la curva

DISCUSIÓN - 76

DISCUSIÓN

Selección de la duración del estímulo lumínico

Los datos obtenidos demostraron para las dos duraciones del estímulo lumínico la

existencia de cambios en la señal electrofisiológica registrada tanto en el colículo superior como

en la amígdala, lo cual confirmó por un lado la integridad de las vías y por otro, la ausencia de

interferencia de la anestesia sobre la señal. Si bien esto ya ha sido previamente confirmado en

condiciones de anestesia con isoflurano y con otros anestésicos para estímulos auditivos y

somatosensoriales y en córtex cerebral (Kortelainen et al., 2014; Land, Engler, Kral, & Engel,

2012; Rojas, Navas, Greene, & Rector, 2008) era importante, como primer paso, demostrar que

la duración del estímulo lumínico que se utilizaría era realmente efectiva para evocar una

respuesta clara bajo la anestesia con uretano.

Históricamente los estímulos utilizados para evocar cambios en la actividad

electrofisiológica en colículo superior han sido muy diversos, pudiendo ser bastante cortos (en el

rango de decenas o centenas de microsegundos) hasta decenas de milisegundos (Hetzler,

McLester-Davis, & Tenpas, 2019; Dyer & Annau, 1977). De esta forma y con la finalidad de

determinar la duración óptima del estímulo lumínico para evitar la pérdida de la respuesta, se

decidió evaluar y comparar los efectos de dos duraciones reportadas como exitosas para la

evocación de la respuesta en la literatura: 10 ms y 20 ms. La señal obtenida en el colículo

superior fue similar a la reportada con anterioridad por otros autores en lo relacionado a sus

componentes positivos y negativos (Dyer & Annau, 1977; Xintaras, Ulrich, Sobecki, & Terrill,

1966; Gharaei et al., 2018), comenzando alrededor de los 30 ms y finalizando a las 100 ms. El

DISCUSIÓN - 77

estímulo lumínico de 20 ms de duración indujo un aumento amplitud pico a pico de los

componentes P1N1 y P2N2 mayor que la inducida por el estímulo de 10 ms de duración.

La revisión de la literatura realizada durante la preparación de este trabajo no mostró

reportes acerca de potenciales evocados por estimulación visual en la amígdala en ratas Wistar.

De esta forma, se optó por caracterizar este potencial, utilizando el estímulo lumínico de 20 ms

de duración. Para la definición de los componentes se tomó como ejemplo el de potenciales

evocados por estímulos auditivos (Garcia et al., 1998). Se definió entonces la existencia de un

potencial evocado por el estímulo visual caracterizado por una primera deflexión positiva a los

30 ms, seguida por dos deflexiones negativas (que denominamos N1a y N1b) a los 70 ms y 90

ms, respectivamente. Finalmente, a los 110 ms se encontró una deflexión positiva (P2).

Al utilizar el estímulo lumínico de 10 ms de duración se comprobó que se mantenían los

mismos componentes, pese a mostrar una amplitud menor, pero esta disminución no fue

significativa para ninguno de los componentes.

De acuerdo con todo lo anterior, se optó por utilizar la duración de 20 ms, ya que

ocasionaba una respuesta estable y evidente que no desaparecería luego de la aplicación repetida

del estímulo (300 veces durante el procedimiento de emparejamiento y 600 veces durante el

procedimiento de no emparejamiento 2), a la vez que generaría, en la señal obtenida en la

amígdala, una serie clara de componentes para el análisis.

Selección de la intensidad del estímulo eléctrico

La aplicación del estímulo eléctrico en el parche de las vibrisas también se asocia con la

ocurrencia potenciales provocados en ambas estructuras. Estos cambios, correspondieron a la

aparición inicial de un potencial de acción poblacional (spike) entre 2 ms y 5 ms

DISCUSIÓN - 78

(aproximadamente) en las dos estructuras y la posterior aparición de componentes lentos, uno

inicial negativo, seguido por uno positivo. La amplitud de estos componentes fue mayor con el

estímulo sensorial de 2,0 mA y por tal razón éste fue tomado para el procedimiento, asumiendo

que – al igual que para el estímulo lumínico – su presentación repetida no ocasionaría la

disminución de la respuesta. Estudios registrando la actividad en colículo superior luego de un

estímulo somatosensorial muestran diferencias en el inicio del potencial evocado, al compararse

con las latencias obtenidas en nuestro trabajo. Estas diferencias podrían ser explicadas por el tipo

de estímulo aplicado en el parche de vibrisas. Por ejemplo, Gharaei y colaboradores utilizaron

estímulos de vibración aplicados en la punta de la vibrisa, mientras que en nuestro estudio, se

utilizó estimulación directa en el terminal nervioso, de forma que era esperable una diferencia en

la latencia (Gharaei et al., 2018).

Cambios en la respuesta luego del emparejamiento

En el campo del estudio del aprendizaje asociativo, se ha reportado en la literatura la

posibilidad de inducir este tipo de aprendizajes condicionados en ratas anestesiadas. El estudio

de la formación de condicionamientos bajo anestesia fue inicialmente reportado por Rosenkrantz

y Grace (2002) y por Laviolette y colaboradores (2005) y dio paso a muchas investigaciones en

varias especies y con el empleo de diversos paradigmas. Sin embargo, aún no es clara la

contribución particular de muchas estructuras para la formación de este tipo de aprendizaje

(Rosenkranz & Grace, 2002; Laviolette, Lipski, & Grace, 2005).

Podría inferirse que las mismas estructuras cuya lesión interfiere sobre la formación de

las memorias en animales despiertos, deben ser claves en la formación de las mismas memorias

durante la anestesia. Sin embargo, esto no excluye la posibilidad de que existan rutas alternas

DISCUSIÓN - 79

que permitan asociar los efectos de diversos estímulos, tal como se demostró por el grupo de

Fanselow al evidenciar que la amígdala basolateral podría ser “saltada” en la formación de una

memoria al contexto, siempre y cuando se realizaran muchos ensayos de entrenamiento

(Ponnusamy, Poulos, & Fanselow, 2007).

En el estudio del condicionamiento pavloviano bajo anestesia, es particularmente

amplio el estudio del papel de la amígdala lateral y de sus conexiones con otras estructuras,

como por ejemplo, el córtex prefrontal (Fenton, Spicer, Halliday, Mason, & Stevenson, 2013;

Rosenkranz & Grace, 2002; Laviolette, Lipski, & Grace, 2005). Desde este marco, el presente

trabajo buscó determinar si tras el emparejamiento repetido de un estímulo lumínico con uno

somatosensorial, se modificaría la respuesta inicial frente al lumínico.

En contraste, con relación al engrama, definido en estudios anteriores como la

activación de un grupo neuronal asociado a un evento que se da como resultado un cambio

persistente en la actividad neuronal (Josselyn et al., 2015), y dada la evidencia científica que

apunta a la formación de engramas en la amígdala, se podría asumir que los cambios observados

en la amígdala pueden corresponder a la formación de un engrama relacionado con la asociación

de los estímulos visual y somatosensorial. Esto tiene relevancia ya que la activación simultanea

de las neuronas que componen el engrama durante el proceso de generación de nuevas memorias

involucra también la evocación de estas memorias, así, el engrama estará de forma latente

durante la decodificación y en la evocación (Josselyn et al., 2015). Estudios registrando la

actividad de neuronas en la amígdala lateral dorsal, antes, durante y después de un

condicionamiento aversivo auditivo mostraron cambios en la actividad eléctrica de estas

neuronas en comparación a un grupo experimental que no tuvo el mismo condicionamiento

DISCUSIÓN - 80

(Repa et al., 2001), así, estableciendo un paralelo con lo hallado en este trabajo, es posible que la

respuesta eléctrica captada, esté relacionada a los engramas situados en la amígdala lateral.

Los resultados para el colículo superior mostraron que los componentes (P1N1, P2N2 y

P3N3) del potencial evocado por el estímulo lumínico no cambiaron tras el emparejamiento. Esto

es consistente con la literatura, ya que se sabe que el colículo superior cumple fundamentalmente

una función de entrada sensorial visual multimodal (capas superficiales de tipo lumínico y capas

profundas de tipo somato sensorial provenientes de vibrisas) (Gharaei et al., 2018) y no es clara

su participación en procesos de aprendizaje asociativo, no obstante, esta estructura se conecta

con la amígdala como ya reportado en diferentes estudios (Linke et al., 1999; Rafal et al., 2015)

(LeDoux, 2003). Por otro lado, cuando se evaluó un potencial tardío (150 ms a 300 ms) se

encontró un aumento significativo de la actividad eléctrica luego de la presentación repetida del

estímulo lumínico en ausencia del eléctrico (emparejado 2) comparado con el estímulo

emparejado en el componente N2P2. Estos datos sugieren una posible pérdida del efecto

inhibitorio (probablemente GABAérgico), como consecuencia de la estimulación eléctrica

repetida durante el periodo de emparejamiento, así acoplándose a un modelo de fatiga por

exposición al mismo estímulo (Boehnke et al., 2011; Gharaei et al., 2018).

En el caso de la amígdala, se evidenciaron cambios en los componentes estables del

potencial provocado por el estímulo lumínico. Los datos fueron analizados realizando una

normalización con respecto al promedio de la actividad de la línea base (50 ms antes del estímulo

luminoso) para ser expresados en términos de transformada Z. Este análisis mostró que, luego

del emparejamiento, hubo diferencias en la amplitud de los componentes del potencial en la

amígdala. Luego de la aplicación repetida del estímulo lumínico en ausencia del estímulo

eléctrico estas diferencias desaparecieron. Esto indica que el proceso de emparejamiento entre un

DISCUSIÓN - 81

estímulo lumínico y uno eléctrico puede llevar a cambios electrofisiológicos relacionados con el

aprendizaje asociativo dado que son registrados en la amígdala, la cual ha sido tradicionalmente

vinculada a este proceso (LeDoux, 2003), no obstante estos datos pudieron haber sido afectados

gracias a la inhibición latente o preexposición al estímulo condicionado.

Este fenómeno corresponde a que el proceso de familiarización con un estímulo

disminuye la facilidad con la que éste puede ser asociado con otro, en el momento en que se

desee establecer un aprendizaje asociativo utilizándolo (Lubow, Rifkin, & Alek, 1976). En este

trabajo, se requirió de la presentación del estímulo lumínico 100 veces en una duración de 10 ms

y 100 veces en una duración de 20 ms, antes de su asociación con el estímulo eléctrico. Por

tanto, era plausible suponer que se establecería una familiaridad con él y de esta forma su

asociación con el estímulo eléctrico se vería perjudicada. Por esta razón, se realizaron 300

ensayos de emparejamiento. Resulta imposible determinar si este número de emparejamientos

resultó insuficiente para la realización del aprendizaje o si el efecto esperado podría verse tras un

aumento en el número de ensayos de emparejamiento.

Por otra parte, se ha reportado también que la pre-exposición al estímulo que se va a

utilizar como “incondicionado”, en el caso del condicionamiento pavloviano, también interfiere

con la facilidad para la formación del aprendizaje asociativo. Igualmente, en nuestro caso, se

debió presentar el estímulo eléctrico 200 veces (100 para cada nivel de intensidad: 0,5 mA y 2

mA), lo cual también creó una familiaridad con el estímulo que pudo haber interferido con la

formación de la asociación.

El hecho de haber encontrado cambios claros en las señales eléctricas, tanto en colículo

superior como en amígdala, frente a la presentación de los estímulos lumínicos como eléctricos,

parece confirmar la idea de que la ausencia de cambios significativos luego de la asociación

DISCUSIÓN - 82

puede haberse debido a los fenómenos mencionados de inhibición latente y de preexposición al

estímulo incondicionado.

En general se puede afirmar que el emparejamiento de los dos estímulos utilizados

condujo a que algunas de las neuronas en la amígdala respondieran diferencialmente frente al

estímulo luminoso, como consecuencia de su emparejamiento con el estímulo eléctrico, pero este

efecto no fue claro. De esta forma, se recomienda la realización de nuevos experimentos que

busquen minimizar la variabilidad reportada aquí.

En varias especies, incluidas ratas y humanos (adultos y niños), se ha demostrado la

existencia de un potencial tardío, relacionado con eventos emocionales, denominado N150

(Knippenberg et al., 2008). Este potencial fue descrito en ratas, frente a la presentación de

estímulos auditivos aversivos de alta intensidad (>100 dB), pero ha sido demostrado también en

varios tipos de condicionamiento pavlovianos, tanto aversivos como apetitivos (Knippenberg et

al., 2008; Knippenberg, Maes, Coenen, & van, 2009). Este potencial tardío parece señalar el

valor emocional de un estímulo que ha sido previamente asociado con un estímulo inicialmente

neutro, posiblemente induciendo un estado de ansiedad anticipatoria(Knippenberg et al., 2008).

Contrario a la literatura, en este trabajo no resultó evidente la presencia de este componente,

razón por la cual no se realizaron análisis estadísticos. No debe excluirse la posibilidad de que la

familiaridad con los dos estímulos utilizados (lumínico o eléctrico) haya llevado a una

disminución de este potencial tardío. Los datos que se recolectaron aquí no permiten confirmar o

rechazar esta posibilidad.

Resulta llamativo que este componente tampoco fuera visible ante la estimulación

eléctrica en el parche de las vibrisas, ni con 0,5 mA ni con 2 mA. En algunos reportes se ha

detectado su presencia en promedios tomados de 40 presentaciones y se demostró también que

DISCUSIÓN - 83

luego de 200 presentaciones del estímulo condicionado (ruido blanco de 85 dB y 8 segundos de

duración) el componente N150 iba perdiendo intensidad paulatinamente (Knippenberg et al.,

2008).

De acuerdo con lo anterior, una recomendación a futuro sería la realización de

experimentos que disminuyan el número de presentaciones de los estímulos a utilizar, para

impedir los fenómenos de inhibición latente y de preexposición al estímulo incondicionado, así

como para impedir la desaparición (o atenuación) del componente emocional N150.

Poder espectral

De forma general se encontraron diferencias significativas en las comparaciones de las

bandas de frecuencia al analizar los valores absolutos y en menor medida al analizar los valores

relativos. Frente a las diferencias de los poderes espectrales absolutos al comparar un estímulo

lumínico de 10 ms vs 20 ms se identifica una constancia en la actividad en el colículo superior,

lo cual está acorde con lo mencionado anteriormente de la funcionalidad de esta estructura ante

estímulos de dichas características. Por otro lado, la amígdala no muestra similitud con el

colículo superior, y se ven aumentadas las bandas Delta y Alpha, para el estímulo de 10 ms.

Cambios significativos se ven en mayor medida con relación a la respuesta de la amígdala frente

a un estímulo emparejado. Los resultados revelan que estos cambios ocurren en casi todas las

bandas con excepción a Theta como visto anteriormente, lo que podría estar relacionado con un

aumento de la actividad de esta estructura que finalmente está relacionado con la consolidación

de ciertas memorias (Pare, 2003; Fenton et al., 2013). Adicionalmente, se observó un aumento de

las bandas de frecuencia de HFO 1 y HFO 2 que están relacionadas con oscilaciones rápidas (o

fast ripples) en ciertas partes de la corteza o inclusive en hipocampo de ratas (Scheffer-Teixeira

CONCLUSIONES - 84

et al., 2013). Esto sugiere que existió un aumento del porcentaje de fast ripples en la amígdala

ante el estímulo visual, como consecuencia del emparejamiento de este con el estímulo

somatosensorial, aumento que se mantuvo inclusive luego de la presentación repetida del

estímulo lumínico aislado (no emparejado 2). Podría tratarse de un aumento de la conectividad

sináptica en esa región, posiblemente como resultado de la plasticidad.

Adicionalmente, Oya y colaboradores (2002) midieron la distribución de las bandas de

frecuencias en la amígdala durante la presentación de estímulos visuales de diferentes valencias

emocionales en humanos. Este estudio reveló que ante estímulos de valencia emocional negativa

la amígdala presentó una actividad gamma significativamente diferente a la presentada a

estímulos visuales de valencia emocional neutro o positiva (Oya, Kawasaki, Howard, &

Adolphs, 2002). Estudios mas recientes apoyan los hallazgos de Oya y colaboradores, en donde

se observó el aumento de la banda de frecuencia Gamma en amígdala tras la presentación de

imágenes dinámicas con valencia negativa, interesante encontraron que la frecuencia Delta se vio

disminuida con este mismo tipo de estímulo, contrario a lo encontrado en este experimento

(Fedele et al., 2020).

CONCLUSIONES

1. Se definen por primera vez los componentes de un potencial evocado por

estimulación lumínica de 20 ms en la amígdala en ratas Wistar.

2. La presentación de un estímulo luminoso emparejado con uno somatosensorial

en el parche de vibrisas induce cambios electrofisiológicos en la amígdala, en

animales anestesiados

Limitaciones - 85

3. El emparejamiento de un estímulo luminoso con uno somatosensorial en el

parche de vibrisas causó un cambio en la potencia espectral absoluta las bandas

de frecuencia, que se revirtió cuando el estímulo luminoso de 20 ms volvió a ser

presentado de forma repetitiva y en ausencia del choque

4. La amígdala es sensible a la presentación contingente de estímulos de diferentes

modalidades sensoriales

5. A diferencia de la amígdala el colículo superior no muestra cambios

electrofisiológicos asociados a la presentación contingente de estímulos

polimodales en potenciales tempranos. Sin embargo, se presentó un aumento en

un componente tardío luego de la presentación repetida del estímulo visual en

ausencia del eléctrico

Limitaciones

En la realización de este trabajo se presentaron algunos inconvenientes e imprevistos.

Entre ellos uno muy importante se relacionó con los sujetos experimentales ya que había gran

variabilidad en los pesos en que ellos llegaban al laboratorio y esta variabilidad aumentaba el

nivel de dificultad quirúrgico.

Otro problema pudo haber estado en la calidad de los electrodos, ya que al fabricarlos a

mano y con toda la rigurosidad que podría ser aplicada en ese momento, siempre había la

posibilidad de que no quedaran adecuados para el registro.

Es importante limitar el experimento en trabajos futuros ya que varios problemas

surgieron por la cantidad de horas que el animal permaneció en cirugía, la muerte prematura

Trabajos a futuro - 86

durante el experimento fue una de ellas. Es importante mencionar también la cantidad de

fármaco administrado para mantener los sujetos bajo anestesia, no se sabe a lo cierto como pueda

interactuar el Uretano con la actividad eléctrica de colículo superior y amígdala bajo esas mismas

condiciones.

Trabajos a futuro

Se proponen los siguientes trabajos a futuro:

-Actividad electrofisiológica de la amígdala en ratas anestesiadas ante un estímulo condicionado

lumínico de 20 ms de duración previamente (animal despierto) emparejado con un estímulo

eléctrico de 2 mA, este trabajo podría mostrar mejor la actividad de la amígdala y podría ser un

excelente complemento para el actual trabajo.

-Análisis de la actividad electrofisiológica de la amígdala suscitado por un estímulo lumínico no

emparejado vs uno emparejado durante un bloqueo temporal de la funcionalidad del colículo

superior y de la corteza occipital en ratas anestesiadas.


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Anexo A - Administración de sustancias – Protocolo - 100

Anexo A - Administración de sustancias – Protocolo


1. INVASIVIDAD

De acuerdo con la USDA Pain and Diestress Categories, este procedimiento se ubica en la

categoría C, ya que es un procedimiento invasivo pero que causa malestar momentáneo.

2. OBJETO

Establecer las instrucciones a seguir para la aplicación de la inyección intraperitoneal, y

subcutanea en ratas Wistar del Laboratorio de Neurofisiología de la Universidad Nacional de

Colombia.

3. ALCANCE

La finalidad de este instructivo es proveer los conocimientos básicos y las mínimas instrucciones

para realizar una inyección intraperitoneal y subcutanea en ratas Wistar. Este procedimiento puede

ser ejecutado por el personal técnico e investigativo del Laboratorio de Neurofisiología de la

Universidad Nacional de Colombia. Se necesita como mínimo un manejo de las ratas Wistar,

manejo de sustancias y manejo con instrumentos como las agujas.

4. DEFINICIONES

Intraperitoneal: Que está localizado en el interior de la cavidad peritoneal.

Cavidad peritoneal: Espacio abdominal, revestido por el peritoneo posterior y por el peritoneo de

la pared abdominal anterior, de la pelvis y de los diafragmas, que contiene en su interior el

hígado, el bazo, el estómago, el colon, el yeyuno y el íleon, el apéndice, el epiplón y los órganos

genitales internos femeninos.

El término parenteral hace referencia a la vía de administración de los fármacos. Esto es,

atravesando una o más capas de la piel o de las membranas mucosas mediante una inyección.

5. INYECCIÓN INTRAPERITONEAL

La inyección intraperitoneal es utilizada para administrar cantidades grandes de sustancias, en

especial, analgésicos. Se utiliza cuando se necesita que la sustancia sea absorbida rápidamente y

cuando la vía intravenosa o la vía oral no son las apropiadas. Esta inyección no es recomendada


para los animales que se encuentren en tiempo de gestación, ya que la aguja puede penetrar el

útero y hacer daño a la rata. Tampoco es recomendable para otro tipo de animales que no sean

roedores.

5.1. Utilice los implementos de seguridad básicos que exige el laboratorio

5.2. Separe la rata que quiere inyectar de su caja hogar. Asegúrese que la nueva caja cuente con

suficiente aserrín y sea una “caja transporte” (estas cajas son especiales para procedimientos

específicos).

5.3. Una vez separada la rata, proceda a alistar la jeringa (de preferencia una jeringa para

insulina, la aguja estándar es de 1/2 pulgada de largo, ya que es más pequeña que una jeringa

común, entonces tiene un manejo más fácil y hace menos daño a la rata) con la droga que va a

utilizar.

5.4. De acuerdo con el peso de la rata, se establece las medidas en ml (mililitros) de cada droga

o fármaco.

5.5. Inmovilización de la rata: Tome la rata y sosténgala gentilmente por 2 minutos, para que

se habitúe a su presencia y a su olor así será mucho más fácil inyectarla. Luego con la mano

contraria a la que normalmente utiliza para inyectar, sostenga el animal para inmovilizarlo de tal

forma que quede expuesto el abdomen.

5.6. Introduzca la aguja (de preferencia una para insulina, la aguja estándar es de 1/2 pulgada

de largo, rápidamente con un ángulo de 45° ligeramente a la izquierda de la línea media

5.7. Hale el embolo 0.05 mm para asegurarse que no tiene comprometido ningún órgano interno

de la rata (intestino, vejiga o musculo), si al aplicar presión negativa el embolo hala sustancias

como sangre, deberá sacar la aguja y volver a inyectar hasta estar en la cavidad. Empuje la

sustancia al interior del animal.

5.8. Retire la aguja despacio, deposite la rata en la caja transporte.

6. OTRO TIPO DE PROCEDIMIENTO PARA INYECCIÓN INTRAPERITONEAL

6.1. Cuando la rata esté muy exaltada y no se pueda inmovilizar de la manera explicada

anteriormente, entonces se procede a inmovilizarla con un pedazo de tela dispuesta en la cabeza.

6.2. Levante la cola y ubique el punto dispuesto anteriormente (a la izquierda de la línea media

a un ángulo de 45° entre los muslos de la rata) y siga con los procedimientos 3.8 y 3.9.


7. INYECCIÓN SUBCUTANEA

La inyección subcutánea se utiliza principalmente para la “administración parenteral” de

fármacos u otras substancias. Esta vía se caracteriza por ser de lenta absorción.

7.1. Utilice los implementos de seguridad básicos que exige el laboratorio

7.2. Separe la rata que quiere inyectar de su caja hogar. Asegúrese que la nueva caja cuente con

suficiente viruta y sea una “caja transporte” (estas cajas son especiales para procedimientos

específicos).

7.3. Una vez separada la rata, proceda a alistar la jeringa (de preferencia una jeringa para

insulina, la aguja estándar es de 1/2 pulgada de largo.

7.4. De acuerdo con el peso de la rata, se establece las medidas en ml (mililitros) de cada

fármaco.

7.5. Ponga la rata en una superficie que sea en malla metálica, la rata se mantendrá sujeta de

está y la inmovilización será mucho más sencilla.

7.6. Inmovilización de la rata: Asegúrese de tomar la rata con la mano contraria a la que

normalmente utiliza para inyectar. Con la misma mano con la que inmoviliza la rata, utilice el

índice y el dedo pulgar, tome la piel del dorso de la rata y estírela. Vera que se forma un triángulo

con la piel.

7.7. Inyecte en la mitad del triángulo que se forma; asegurándose que la jeringa esté totalmente

perpendicular al dorso de la rata.

7.8. Empújelo a un ritmo constante. Retire despacio la aguja y haga un masaje a presión con el

pulgar en el sitio inyectado. Para asegurarse si quedó bien inyectada, sentirá en el sitio inyectado

una pequeña protuberancia dentro de la piel. Deposite la rata en la caja de transporte.

REFERENCIAS

Laboratory Animals, Refinando los procesos para administración de sustancias.

Imágenes: Tomado el 16 de abril del 2012 en

http://dc365.4shared.com/doc/02BOe7LV/preview.html

http://dc365.4shared.com/doc/02BOe7LV/preview.html


Aguja de insulina

(http://clinicians.org/images/upload/3%20Jeringas%20y%20Plumas%20LL.pdf)

Definiciones (intraperitoneal y cavidad peritoneal)

http://www.definicionesdemedicina.com/cavidad-peritoneal/

Elaboró:

Andrea Garcia

Modificado por

Melissa Cardenas

Fecha:

2012 enero

2017 junio

Reviso y Aprobó:

Alejandro Munera

Fecha:

2017 junio

http://clinicians.org/images/upload/3%20Jeringas%20y%20Plumas%20LL.pdf

http://www.definicionesdemedicina.com/cavidad-peritoneal/

Anexo B - Cirugía estereotáxica para implantación de electrodos– Protocolo - 105

Anexo B - Cirugía estereotáxica para implantación de

electrodos– Protocolo


INVASIVIDAD


categoría C, ya que es un procedimiento invasivo pero que causa malestar momentáneo, teniendo

en cuenta que el animal solo va a sentir malestar cuando se le inocula la sustancia para

anestesiarlo y que es un procedimiento de punto final, sin recuperación del plano consiente.

OBJETIVO

Instruir sobre la forma en que se debe realizar el proceso colocar electrodos en un área específica

del cerebro de la rata Wistar en el Laboratorio de Neurofisiología de la Universidad Nacional de

Colombia.

ALCANCE

Proveer los conocimientos básicos y las mínimas instrucciones para llevar a cabo el

procedimiento quirúrgico para colocar electrodos en una estructura cerebral en una rata Wistar.

Este procedimiento puede ser ejecutado por el personal técnico e investigador entrenado del

laboratorio.

PROCEDIMIENTO

Previo a la realización de la cirugía, es importante tener presente algunas consideraciones:

La persona que realice el procedimiento y quien lo asista deben usar los implementos básicos de

cirugía como guantes, bata, tapabocas, gorro para el cabello y gafas.

Las características propias del animal a operar como edad, peso, temperatura y estado general

(antes, durante y después de la cirugía).

Tipo de fármacos a utilizar, dosis, vía de administración y duración del efecto de cada uno.

Para la realización del procedimiento se usarán los siguientes instrumentos

Aparato estereotáxico (ver figura 1)

Toallas de papel absorbente

Algodón

Instrumental quirúrgico (tijeras, bisturí, pinzas, etc.

Jeringas con fármacos y/o soluciones (solución salina, anestésicos, Xilocaína con epinefrina)

Recipiente de desechos

Electrodos

Mototool Dremel 300


Pasos para la implantación de electrodos en el área del cerebro de la rata:

Luego de seleccionar el animal a operar (rata cepa Wistar), se inyecta vía intraperitoneal (ip) una

dosis de mezcla de Uretano 25%-(1,5 g/Kg) (Albert Einstein college of Medicine) como

anestésico, teniendo en cuenta el peso del animal y la concentración de cada fármaco (ver anexo

A). Se espera un tiempo aproximado de 15 minutos para que la mezcla actué en el organismo y

se pueda verificar la eficiencia de la anestesia por medio de los reflejos de la rata.

Se depila el área a operar (parte superior de la cabeza de la rata) y se desinfecta con isodine.

Se coloca al animal en el aparato estereotáxico y se insertan gentilmente las barras estereotáxicas

(ear bar) del aparato en los canales auditivos cuidando de no dañar el oído medio (ver figura 1).

Se debe inyectar en el área quirúrgica aproximadamente 0.30 ml de Xilocaína con epinefrina vía

subcutánea en la zona a realizar la incisión, con el fin de controlar el sangrado luego de la

incisión. El uso de este fármaco puede ser usado a discreción.

Figura 1. Forma de montar a una rata en un aparato estereotáxico (tomado de Krinke, 2000)


- Luego de inyectar subcutáneamente xilocaina con epinefrina en el área donde se realizará la

incisión, se remueve la piel del área preparada, retirando a su vez el tejido que pueda estar

adherido a la superficie del cráneo. Luego, limpiar constantemente con un algodón y agua

oxigenada para esterilizar la herida y facilitar la visión de las suturas del cráneo, las cuales

permitirán luego calcular las coordenadas para la apertura de el o los orificios por donde entrará

el electrodo en cierta área del cerebro del animal.

Posteriormente, con ayuda del brazo del aparato estereotáxico y una vez puesta una guía en el

porta-electrodo (electrode carrier fig 1), se calculan las coordenadas desde Bregma (punto de

unión de las suturas sagital y coronal) o Lambda (unión entre los huesos parietales y el occipital),

y se determina la ubicación de la estructura cerebral deseada utilizando el atlas estereotáxico de

Paxinos y Watson (2005), teniendo en cuenta los 3 ejes o dimensiones del estereotáxico (X-Y-Z),

pues estas generalmente están graduadas en milímetros. En el eje X se calculan las coordenadas

de forma medial-lateral, el eje Y de manera dorsal-ventral y el eje Z de forma antero-posterior.

Una vez determinados y marcados con marcador permanente de punta fina los puntos de

perforación, se toma el Mototool Dremel 300 y se abren los orificios para cada estructura.

Se ubica cada electrodo en la corteza y se hacen las mediciones respectivas para llegar al punto

diana en el eje Z (dorso-ventralmente), para cada electrodo se usa un brazo estereotáxico

diferente.

Posibles problemas

Todos están relacionados con la falta de pericia del investigador, por eso este siempre debe estar

acompañado del asesor o alguien que sepa mejor la técnica a realizar

REFERENCIAS

Albert Einstein College of Medicine Institute for Animal studies Van etten 460. Recommended

Methods of Anesthesia, Analgesia, and Euthanasia for Laboratory Animal Species


Krinke, 2000. The Laboratory Rat. The handbook of experimental Animal

Elaboró:

Melissa Cardenas

Jevrahym Castellanos

Fecha:

2017 junio

Reviso y Aprobó:

Alejando Múnera

Fecha:

2017 junio

Anexo C – Emparejamiento de estímulos– Protocolo - 110

Anexo C – Emparejamiento de estímulos– Protocolo


INVASIVIDAD


categoría C, ya que es un procedimiento invasivo pero que causa malestar momentáneo.

OBJETIVO

Establecer las instrucciones a seguir para la adecuada ejecución del protocolo de emparejamiento

con estímulos de luz y choque en ratas en el laboratorio de Neurofisiología de la Universidad

Nacional de Colombia

ALCANCE

La finalidad de este instructivo es proveer instrucciones claras y precisas para la implementación

del protocolo de emparejamiento con estímulos de luz y choque en ratas Wistar. El

procedimiento puede ser realizado por el personal técnico y los investigadores del laboratorio de

Neurofisiología de la Universidad Nacional de Colombia, que hayan tenido un entrenamiento

previo en manipulación animal y conozcan las normas éticas que rigen el trabajo con animales.

MATERIALES

Animales: Se usan ratas Wistar de 380 a 450 gramos, sin anomalías o hallazgos clínicos

evidentes.

Variables ambientales: Los animales deben tener un ciclo Luz-Oscuridad de 12h cada uno y estar

a una temperatura de 21±2 ◦C. Tendrán acceso a comida y agua ad-libitum.

Aparatos: no aplica ya que el condicionamiento se realizará bajo anestesia Uretano (Ver Anexo

A-protocolo de inoculación de sustancia).

Especificación de los estímulos:

Estimulación lumínica: Será realizada por medio de un circuito desarrollado específicamente

para tal fin, de forma que se entregue un flash de luz blanca (LED) a una intensidad de 40 Lux,

con una duración de 10 o 20ms. Se usará un LED de chorro para dirigir la luz de forma precisa al

ojo del sujeto

Estimulación eléctrica. Será realizada por medio de la presentación de estímulos de intensidad de

2mA.

PROCEDIMIENTO


Emparejamiento:

El emparejamiento de estímulos se dará mediante la asociación de dos estímulos de diferentes

modalidades sensoriales (por 300 veces), presentando el flash de luz (20ms) seguido por un

choque (2mA) en el parche de vibrisas separados por 100ms (este rango temporal se determinó

ya que el potencial evocado de las neuronas de las capas superficiales del colículo superior

termina en ese rango de tiempo).

Posibles problemas

Es posible que no se localicen adecuadamente las agujas para la estimulación del nervio en el

parche de vibrisas, eso llevaría a una posible interrupción del aprendizaje. La solución es retirar

las agujas y volverlas a colocar, revisando siempre si se localizaron adecuadamente.

Esquema del emparejamiento de estímulos

REFERENCIAS

Domjan M. (2010). Principios de aprendizaje y conducta. Madrid thomson

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Bloque de 100

presentaciones

Bloque de 100

presentaciones

Bloque de 300

presentaciones

del

emparejamiento


Elaboró:

Melissa Cárdenas

Fecha:

2017 junio

Reviso y Aprobó:

Alejandro Munera

Fecha:

2017 junio

Anexo D - Eutanasia por inyección de KCL – Protocolo - 114

Anexo D - Eutanasia por inyección de KCL – Protocolo


1. INVASIVIDAD


categoría B ya que pese ser un procedimiento invasivo el animal debe estar bajo anestesia en

el momento del procedimiento.

2. OBJETO

Establecer las instrucciones a seguir para eutanasia por inyección de KCL para eutanasia en

Wistar del Laboratorio de Neurofisiología de la Universidad Nacional de Colombia.

3. ALCANCE

La finalidad de este instructivo es proveer los conocimientos básicos y las mínimas

instrucciones para realizar eutanasia por inyección de KCL en ratas Wistar. Este procedimiento

puede ser ejecutado por el personal técnico e investigativo del Laboratorio de Neurofisiología

de la Universidad Nacional de Colombia. Se necesita como mínimo un manejo de las ratas

Wistar.

4. DEFINICIÓN

La inyección intracardiaca de KCL (sobresaturado), genera inmediatamente un paro cardiaco

por el cambio iónico en el tejido cardiaco llevando a que haya una desregulación en la

actividad de las células y subsecuentemente mal funcionamiento de la actividad cardiaca.

5. PROCEDIMIENTO

5.1. Deje el animal sobre una superficie en decúbito suprino

5.2. Localice la tercera costilla de abajo hacia arriba del lado izquierdo del animal

5.3. Coloque la jeringa de 10mls con una solución sobresaturada de KCL(34g/100ml)

en posición vertical en el punto seleccionado anteriormente para empezar la

punción cardiaca

5.4. Ingrese con la aguja (18G) al interior de la cavidad cardiaca buscando el corazón

mientras se genera presión negativa.

5.5. Observe en la jeringa la presencia de sangre, cuando sea abundante inyecte la

solución por completo.

5.6. Revise el ritmo cardiaco


Posibles problemas

El investigador puede no encontrar el corazón al momento de la punción. Se debe retirar la

aguja y volver a intentarlo.

REFERENCIAS

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Recuperado en https://vetmed.iastate.edu/vdpam/about/production-animal-medicine/dairy/dairy-

extension/humane-euthanasia/humane-euthanasia/exsanguination-pithing-intravenous-injection-

kci

Elaboró :

Melissa Cardenas

Fecha:

2017 junio

Reviso y Aprobó:

Alejando Múnera

Fecha:

2017 junio

Anexo E - Carta AVAL comité de Bioética - 117

Anexo E - Carta AVAL comité de Bioética

Anexo F – Tablas de resultados estadísticos - 120

Anexo F – Tablas de resultados estadísticos


Selección del estímulo óptimo para suscitar una respuesta evocada en el colículo

superior y en la amígdala


COLICULO SUPERIOR (CS)

10 ms vs 20 ms

Componente T[6] p

PN1 -3,17 0,019*

PN2 -2,556 0,043*

PN3 0,776 0,467

Tabla 1. comparaciones de la amplitud pico a pico de los diferentes componentes del potencial evocado por dos estímulos lumínicos en colículo superior

AMIGDALA (AM)

10 ms vs 20 ms

Componente T[6] p

P1Na -2,11 0,079

NaNb -1,501 0,184

NbP2 -2,11 0,079

Tabla 2. comparaciones de la amplitud pico a pico de los diferentes componentes del potencial evocado por dos estímulos lumínicos en amígdala

Estimulación eléctrica en parche de vibrisas 0,5 mA vs 2 mA

COLICULO SUPERIOR (CS) AMIGDALA (AM)

0,5 mA vs 2 mA PS - 0,5 mA vs 2 mA

Componente T[3] p T[3] p

PN1 -1,463 0,24 -6,338 0,008*

Tabla 3. comparaciones de la amplitud pico a pico del componente NP1 del potencial evocado por dos estímulos lumínicos en colículo superior y en amígdala

COLICULO SUPERIOR (CS) AMIGDALA (AM)

PS - 0,5 mA vs 2 mA PS - 0,5 mA vs 2 mA


Componente T[3] p T[3] p

Pico a pico -3,54 0,038* -4,786 0,017*

Tabla 4. Comparaciones de la amplitud pico a pico de los potenciales de acción poblacionales suscitados por dos estímulos eléctricos en colículo superior y en amígdala

Comparaciones de los componentes de los potenciales evocados suscitados por un

estímulo lumínico de 20 ms no emparejado 1, emparejado y no emparejad 2


no empa 1 vs empa vs no empa 2

componentes F[2,8] p

PN1 1,866 0,216

PN2 2,181 0,175

PN3 0,597 0,573

Tabla 5. Comparaciones de los componentes de los potenciales evocados suscitados por un estímulo lumínico de 20 ms no emparejado 1, emparejado y no emparejad 2 para colículo superior

AMIGDALA (AM)



P1Na Chi-sq.= 2,800 0,247

NaNb Chi-sq.= 3,600 0,165

NbP2 0,519 0,608

Tabla 6. Comparaciones de los componentes de los potenciales evocados suscitados por un estímulo lumínico de 20 ms no emparejado 1, emparejado y no emparejad 2 para colículo superior

Comparación de los poderes espectrales

Potencias relativas



Estímulo lumínico

no empa 1, empa, no

empa2

banda de frecuencia T[14] p F[2,21] p

Delta 1,337 0,202 0,0705 0,932

Theta 0,366 0,720 0,143 0,868

Alpha 0,0200 0,984 3,34 0,055

Beta 0,549 0,592 0,234 0,793

Gamma 0,967 0,350 0,0835 0,92

HFO1 1,319 0,208 0,199 0,821

HFO2 1,171 0,261 0,72 0,498

Tabla 7. Comparaciones de las bandas de frecuencia relativas entre un estímulos lumínicos (10 ms vs 20 ms) y luz de duración 20 ms en las fases de no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 para colículo superior

AMIGDALA (AM)

Estímulo lumínico

no empa 1, empa, no

empa2


Delta 0,378 0,711 0,65 0,532

Theta 0,0249 0,981 0,293 0,749

Alpha 0,886 0,391 0,357 0,704

Beta 0,579 0,572 0,413 0,667

Gamma 0,404 0,692 0,178 0,838

HFO1 1,273 0,224 16,383 <0,001*

HFO2 1,046 0,313 25,759 <0,001*

Tabla 8. Comparaciones de las bandas de frecuencia relativas entre un estímulos lumínicos (10 ms vs 20 ms) y luz de duración 20 ms en las fases de no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 para amigdala

CS vs ABL

banda de frecuencia T[14] p

Delta 3,579 0,003*

Theta 0,375 0,713

Alpha 4,727 <0,001*

Beta -2,144 0,050*

Gamma -1,401 0,183

HFO1 1,579 0,137

HFO2 1,742 0,103


Tabla 9. Comparaciones de las bandas de frecuencia relativas durante un estímulo lumínico de 20 ms de duración para coliculo superior vs amigdala

Potencias absolutas


Estímulo lumínico Fase


Delta 1,750 0,102 0,0312 0,969

Theta 0,407 0,690 0,267 0,769

Alpha 0,516 0,614 2,179 0,138

Beta 0,138 0,892 0,466 0,634

Gamma 0,408 0,689 0,0343 0,966

HFO1 1,529 0,148 0,163 0,851

HFO2 1,234 0,238 0,54 0,591

Tabla 10. Comparaciones de las bandas de frecuencia absolutas entre un estímulos lumínicos (10 ms vs 20 ms) y luz de duración 20 ms en las fases de no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 para colículo superior

AMIGDALA (AM)

Estímulo lumínico Fase


Delta 2,929 0,011* 10,112 <0,001*

Theta 1,407 0,181 2,021 0,158

Alpha 2,153 0,049* 3,908 0,036*

Beta 1,125 0,280 3,685 0,042*

Gamma 1,416 0,179 5,65 0,011*

HFO1 -0,847 0,411 68,897 <0,001*

HFO2 -0,446 0,662 47,326 <0,001*

Tabla 11. Comparaciones de las bandas de frecuencia absolutas entre un estímulos lumínicos (10 ms vs 20 ms) y luz de duración 20 ms en las fases de no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2 para amigdala

CS vs AM

banda de frecuencia T[14] p

Delta 5,855 <0,001*

Theta 4,168 <0,001*


Alpha 3,494 0,004*

Beta 2,648 0,019*

Gamma 3,792 0,002*

HFO1 1,882 0,081

HFO2 2,173 0,047*

Tabla 12. Comparaciones de las bandas de frecuencia absolutas durante un estímulo lumínico de 20 ms de duración para colículo superior y amígdala

Evolución de la transformada Z de la señal en la amígdala y el colículo superior como

función de la presentación no-emparejada de un estímulo visual que previamente había sido

emparejado




40 70 0.0422 0.959

70 150 0.668 0.525

150 300 7.365 0.005*

Tabla 13. Comparaciones de amplitud pico a pico de tres diferentes rango de la señal registrada en colículo superior (40 -70 ms, 70 150 ms y 150 300 ms) durante la presentación de un estímulo luminoso de 20 ms no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2

AMIGDALA (AM)



30 60 7.217 0.005

60 100 2.19 0.141

100 200 4.379 0.028*

Tabla 14. Comparaciones de amplitud pico a pico de tres diferentes rango de la señal registrada en amígdala (30 - 60 ms, 60- 100 ms y 100 - 200ms) durante la presentación de un estímulo luminoso de 20 ms no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2





40 70 0.0121 0.988

70 150 1.152 0.338

150 300 5.051 0.018*

Tabla 15. Comparaciones de amplitud pico a pico de tres diferentes rango de la señal positiva registrada en colículo superior (40 -70 ms, 70 150 ms y 150 300 ms) durante la presentación de un estímulo luminoso de 20 ms no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2

AMIGDALA (AM)



30 60 2.507 0.110

60 100 1.727 0.206

100 200 2.267 0.132

Tabla 16. Comparaciones de amplitud pico a pico de tres diferentes rango de la señal positiva registrada en amígdala (30 - 60 ms, 60- 100 ms y 100 - 200ms) durante la presentación de un estímulo luminoso de 20 ms no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2




40 70 0.145 0.866

70 150 2.519 0.109

150 300 5.681 0.012*

Tabla 17. Comparaciones del area bajo la curva del pico a pico de tres diferentes rango de la señal positiva registrada en colículo superior (40 -70 ms, 70 150 ms y 150 300 ms) durante la presentación de un estímulo luminoso de 20 ms no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2

AMIGDALA (AM)



30 60 2.345 0.124

60 100 1.377 0.278

100 200 2.518 0.109

200 300 3.648 0.047*


Tabla 18. Comparaciones del area bajo la curva del pico a pico de tres diferentes rango de la señal positiva registrada en amígdala (30 - 60 ms, 60- 100 ms, 100 - 200ms y 200 a 300ms) durante la presentación de un estímulo luminoso de 20 ms no emparejado 1, emparejado y no emparejado 2.

caracterizaciÓn electroencefalogrÁfica de la ruta

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