caracterizaciÓn molecular de la ruta catabÓlica...
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UNIVERSIDADCOMPLUTENSEDEMADRID
Facultadde Farmacia
Departamentode MicrobiologíaII
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA RUTA CATABÓLICA
DEL 4-HIDROXIFENILACETATO DE Eseherichiacolí W
Memoriaqueparaoptaral GradodeDoctoren Farmaciapresenta:
M~ AUXILIADORA PRIETOJIMENEZ
Directorde la Tesis:
Dr. JoséLuis GarcíaLópez
InvestigadorCientífico
ConsejoSuperiorde InvestigacionesCientíficas
Madrid, 1995
A Rafa
A intspadres
Quleroexpresarmi agradecimientoa aquellaspersonasque mehan ayudadoen la realizacióndeestaTesis.
Especialmente,quiero agradecera mi director, JoséLuis GarcíaLópez,la formacióncientp9caquede él he recibido,siendopara mí un puntode referenciano sóloporsualto nivelcien4ficosino tambiénpor la comprensióny el respetocon el que trata a laspersonasque lerodean.Realmente,mesientoafortunadaporhabertenido la oportunidadde trabajar conélduranteestosaños.
Por otraparte, quisieramostrarmi másprofundoagradecimientoal Dr. RubensLópezpor habermeaceptadoen su laboratorio, por susvaliososconsejosy por el inmejorabletratohumanoque siempreme ha dispensado. También quiero agradecera los doctoresPedroGarciay ErnestoGarcía la gran ayudaprofesionaly moral que me han brindado en todomomento,demostrandoquesonpersonascotilas quesiempresepuedecontar.Además,quierohacermencióna la Dra. ConcepciónRonda,queen los d<fíciles momentosiniciales, supocrearun ambientede amistady compañerismoa su alrededor,facilitándome la integración en elgrupo.
De maneraespecial, agradezcosinceramentea todos mis compañerosde laboratoriocon los que he compartidomis buenosy malosmomentos,la amistad,comprensióny a vecespacienciaque siemprehan mostradohaciami. Igualmente,agradezcola valiosacolaboraciónde IsabelJadoy la excelenteasistenciatécnicade Eloisa Cano, ManuelCarrasco, PaquitaMorante, Aurelio Hurtadoy Ricardo Uña que hafacilitado considerablementela realizacióndeestetrabajo.
También quisiera agradecer al Dr Kenneth Timmis del G.B.F (Braunschweig,Alemania,) y a todo su grupo, el habermepermitido trabajar durante un tiempo en sulaboratorio, poniendoa mi disposicióntodo lo necesariopara llevar a cabo mi proyectoconéxito. Quisiera mencionarespecialmenteal Dr. EduardoDía porquesin su ayudamoral yprofesionalmi estanciaen estecentronohabríasidotanfructífera.
A los doctores Víctor de Lorenzo, Juan Luis Ramos,Miguel Vicente, Miguel AngelPeñalva,Alicia Gibelíoy AmandoGarrido Pertierra les agradezcosuayuday colaboraciónendiversosaspectosdeestetrabajo.
Mi agradecimientoal director del departamentode Microbiología de la FacultaddeFarmacia, el Dr. César Nombela, por haberfacilitado la lectura de esta Tesisy haberaceptadoserponentede la misma.
Tambiénquisiera agradecera misamigos,enparticular a losmiembrosde la NB.A yMB.A., elánimoqueen todo momentohan sabidotransmitirme.
Por último, quisieraagradecera todamifamilia el constanteapoyoy comprensiónquesiempremehan ofrecidoy particularmentea Rafa, que ha compartidocon respetoy cariñotodasmisalegríasypenasduranteestetiempo,hasta talpuntoqueen la actualidadesel únicoabogadocapazde sorprendera propiosy extrañoscon “amenas” charlas sobreel papeldeEseherichiacoIl en la descontaminaciónmedioambientat
Este trabajo ha sido realizadograciasa la concesiónde una Becade FormacióndePersonalInvestigadorde la Comunidadde Madrid
ABREVIATURAS
e coeficientede extinciónmolar
A deleción
2-HPA: ácido2-hidroxifenilacético
3 -UPA: ácido3 -hidroxifenilacético
4-HPA: ácido4-hidroxifenilacético
Api: resistenciaaampicilina
C120: catecol1,2-dioxigenasa
C230: catecol2,3-dioxigenasa
cAMP: adenosin-monofosfatocíclico
CAP: proteínareceptorade cAMP
Ci: curio
Cmt: resistenciaacloranfenicol
CoA coenzimaA
CHM 5-carboximeti!-2-hidroxi-muconato
CHMS: 5-carboximetil-2-hidroxi-mucónicosemialdehido
Da dalton
dATP: desoxiadenosin5’-trifosfato
dCTP: desoxicitosín5’-trifosfato
EDIA: etilendiaminotetraacetato
FAD: flavin-adenin-dinucleótido
FMN: flavin-mononucleótido
aceleraciónde la gravedad
HCA: ácidofenilpropiónico
HIIDD: 2-hidroxi-hept-2,4-dien-1 ,7-dioato
1-lEED: 2,4-dihidroxi-hept-2-en-1 ,7-dioato
HMS: 2-hidroxi-mucónicosemialdehido
HIPC: homoprotocatecuato
HPLC: cromatografíaliquida de altaresolución
IPTG: ¡sopropil-j3-D-tiogalactopiranósido
kb: 1000paresde bases
Kmt: resistenciaa kanamicina
LB: medio de cultivo de Lunay Bertani
MHP: ácido3-(3-hidroxifenil)propiónico
MMGs: microorganismosmodificadosgenéticamente
NADH: nicotinamida-adenin-dinucleátido
NADPH: fosfatode nicotinamida-adenín-dinucleátido
Nalt: resistenciaaácidonalidixico
OHED: 2-oxo-hept-3-en-1 ,7-dioato
ONPG: o-nitrofenil-galactósido
OPET: 5-oxo-pent-3-en-1 ,2,5-tnicarboxilato
ORF: marcodelecturaabierta
p/v: relaciónpeso/volumen
P340 protocatecuato3,4-dioxigenasa
PA: ácidofenilacético
PGA: penicilinaG acilasa
Py: piruvato
RES: sitio de unión al ribosoma
Rift: resistenciaarifampicina
SDS: dodecilsulfatosódico
SS: succinatosemialdehido
Tcr: resistenciaa tetraciclina
Tris: 2-amino-2-hidroximetilpropano-1 ,3-diol
y/y: relaciónvolumen/volumen
X-Gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fl-D-galactopiranósido
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN
1. ACUMULACIÓN DE COMPUESTOS AROMATICOS ENLA BIOSFERA.UN PROBLEMA MEDIOAMBIENTAL
2. ADAPTACIÓN INDUCIDA DE LOS MICROORGANISMOS ACOMPUESTOS AROMÁTICOS CONTAMINANTES
LOS
3. RUTAS CATABÓLICAS DE COMPUESTOSBACTERIAS
3.1. Metabolismo anaerobio3.1.1.Bacteriasfotosintéticas3.1.2.Bacterias desnitriflcantes...3.1.3. Bacteriassulfato-reductoras3.1.4.Fermentación
3.2, Metabolismo aerobio3.2.1. Rutas periféricas
3.2.1.1.Oxigenasas3.2.1.2.Compuestosaromáticoshalogenados.3.2.1.3.Compuestosnitroaromaticos3.2.1.4.Compuestosaromáticos azufrados
3.2.2. Ruta del catecol3.2.2.1.Ruta meta3.2.2.2.Ruta orto
3.2.3. Ruta del gentisato3.2.4. Regulación de las rutas catabólicas de
AROMÁTICOS EN17
compuestosaromáticos
4. AMPLIACIÓN DIRIGIDA DE LA CAPACIDAD BIODEGRADATIVABACTERIANA
171819212222262632353637374042
42
46
5. LAS ENTEROBACTERIAS Y LA BIODEGRADACIÓN DE COMPUESTOSAROMÁTICOS 4S
5.1. La capacidadbiodegradativa de E. colí 505.1.1.Rutas catabólicasde compuestosaromáticosdeE.coll 52
5.2. Fuentes naturales de los compuestosaromáticos metabolizablespor E. col! 56
13
14
15
6. OBJETIVOS . 60
II. MATERIALES Y MÉTODOS 62
1. ESTIRPESBACTERIANAS Y PLÁSMIDOS 63
2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO 64
3. PROCEDIMIENTOS DE TRANSFERENCIA GENETICA 64
3.1 Transformación 643.2. Conjugación 65
4. MANIPULACIÓN DEL DNA CON ENZIMAS DE USO COMÚN ENBIOLOGíA MOLECULAR 65
5. PREPARACIÓN DE PLÁSMIDOS Y DNA CROMOSÓMICO 65
6. ELECTROFORESIS DEL DNA EN GELES DE AGAROSA 65
7. AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE LOS FRAGMENTOS DE DNA 66
7.1. Gelesde poliacrilamida 667.2. Técnicade Geneclean 667.3. Gelesde agarosade bajo punto de fusión 677.4. Técnica de la fragarasa 67
8. SELECCIÓN DE LOS CLONES PRODUCTORESDE PGA 67
9. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE DNA 68
9.1. Técnica de Southern-bkot 689.2. Hibridación deDNA sobrefiltros de coloniascelulares 68
10. SECUENCIACIÓN DEL DNA 69
10.1. Secuenciaciónmanual 6910.2. Secuenciaciónautomática 6910.3.Análisis de la secuenciade DNA 69
11. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE CULTIVOS CELULARES 70
12. ENSAYOSDE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
12.1 Penicilina G acilasa 7012.2. 4-IIPA-liidroxilasa 71
12.2.1.Cuantificación de la oxidación del NADH 7112.2.2.Reacciónacopladacon la catecol2,3-dioxigenasa1 (C2301)
deP.pulida 7112.3.HPC-dioxigenasa 7212.4. ~-lactamasa 7212.5. ¡1-galactosidasa 72
13. IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LA REACCIÓN DELA 4-HPA-HIDROXILASA 73
14. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS CODIFICADAS POR FRAGMENTOSCLONADOS DE DNA 73
15. PURIFICACIÓN DE LA 4-IIPA-HIDROXILASA 74
16. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 74
17. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GELES DE POLIACRIAMIDA-SDS 74
18. DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA N-TERMINAL DE llpaB 75
19. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-IJpaB 75
20. TÉCNICA DE WESTERN-BLOT 76
21. AISLAMIENTO DE RNA 76
22. DETERMINACIÓN DE LOS SITIOS DE INICIACIÓN DE LATRANSCRIPCIÓN MEDIANTE EL EMPLEO DE LA TÉCNICA DEEXTENSIÓN CONUN INICIADOR 77
22.1. Marcaje del oligonucícótido con (y-32P1 ATP 77
22.2. Incorporación de [cé2iL’]dCTP 78
IR RESULTADOS . 79
1. CLONACIÓN DEL GEN pacDE E. cali ATCC 11105 SO
1.1. Localización del gen responsabledel fenotipo negro 801.2. Detecciónde las proteinas donadasen el plásmido pAJí9 83
2. CARACTERIZACIÓN DE LA HIDROXILASA 85
2.1. Identificación de los productos de la reacciónde hidroxilación .... 852.2. Estudio de los cofactoresrequeridos por la bidroxilasa 882.3. Especificidadde sustrato 882.4. Secuenciacióndel operón de la 4-HIPA-hidroxilasa 902.5. Implicación de la proteína HpaC en la actividad hidroxilasa 932.6. Purificación de la hidroxilasa llpaB 972.7. Presenciade geneshomólogosa hpaB en otros microorganismos...100
3. CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL OPERÓN meta DE LA RUTADEL 4-UPA 102
3.1. Clonación del operón metay construcción del mapa fisico de laruta del 4-HPA 102
3.2. Secuenciacióndel ciaste>’ de genesque componen la ruta del4-HPA deE. col! ATCC 11105 104
3.3. Análisis de las regiones flanqueantes a la ruta del 4-HPA ysu localización en el cromosomadc E. cali 128
3.4. Las regionesintergénicas 133
4. REGULACIÓN DEL OPERON kpaBC 136
4.1. Localización del promotor PBc 1364.2. Determinaciónde los inductores del oper黡¿paRC 1394.3. Localización de la región reguladora del operón hpaBC 1394.4. Implicación de las proteínas HpaA y HpaX en la regulación del
operónhpaBC 1404.5. Represiónpor catabolito de la 4-UPA-hidroxilasa 1414.6. Determinación de los sitios de iniciación de la transcripción de los
promotores PA y PBC 1424.7. El promotor Px 143
5. EXPRESIÓN DE LOS GENES DE LA RUTA DEL 4-HPA ENORGANISMOSHETERÓLOGOS 153
5.1 Construccióndemódulostransponiblescon los genesde la ruta del4-EPA 153
5.2 Integraciónde la rutadel 4-EPAen el cromosomade E. cali K12.. 1545.3 Producciónde la 4-HPA-hidroxilasaenP. pulida KT2442 155
IV. DISCUSION
1. CARACTERIZACIÓN DE LA 4-HPA-HIDROXILASA DE E cali W..
2. COMPARACIÓNDE LA RUTA DEL 4-EPA DE E col! W CONRUTAS CATABÓLICAS
2.1. Comparaciónde los genes¡¡pu con los genes estructuralesrutasmetabólicasdederivadosaromáticos
2.2. Los genesreguladoresde la rutadel 4-EPA
2.3. Laorganizaciónfísicade los genes
3. PERSPECTIVAS DE FUTURO EN LAUTILIZACIÓN DE LOS GENESDE LA RUTA DEL 4-HPA EN LA DESCONTAMINACIÓN MEDIO-AMBIENTAL 179
V. CONCLUSIONES 181
163
164
OTRAS168
de otras168173176
VI. BIBLIOGRAFL4. 184
Prohab¡emeftte no sw en contra de ¡a cienciasugenr que en un lugar u otro existe algúnorganismo que, bojo Wt condicionesadecuadas, pueda oxidar cualquier sustancla..(Galo, 1952)
1. INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
1. ACUMULACIÓN DE COMPUESTOS AROMÁTICOS EN LA BIOSFERA.
UN PROBLEMA MEDIOAMBIENTAL
La gran capacidad biodegradativa de los microorganismos seconocedesdehace
décadas.De hecho, el principio de infalibilidad microbiana enunciado por Gale en
1952, proponíaque, en las condicionesadecuadas,todaslas sustanciasnaturalespodían
serdegradadaspor algún microorganismo(Stanier, 1986). Ciertamente,la mayoría de
los compuestosnaturalessedegradancon facilidad, aunqueexistenclarasexcepciones
como la lignina, presenteen la maderade los árboles, que es muy resistentea la
biodegradación(Kuhady Singh, 1993). Sin embargo,esteprincipio no contemplabala
masivaintroducciónde una amplia variedadde compuestosaromáticosen la Biosfera
como consecuenciade la actividadhumanay el gran progresoindustrial desarrollado
desdemediadosdel pasadosiglo (Smith, 1990). En líneasgenerales,podemosdefinir el
términoxenobióticocomo un compuestosintético cuya estructuraquímica no ha sido
expuestaa los microorganismosa lo largode la evolución(Leisingery Brunner, 1986).
La apariciónrecientede estoscompuestosplanteael problemade su integraciónen los
grandesciclos de recambiode la materia, que conducea una acumulación,de estas
especiesquímicasdebido a la resistenciaque presentanfrenteal ataquemicrobiano.El
impacto que la acumulaciónde este tipo de contaminantespuedeprovocar en un
ecosistemavienedado por su concentracióny su grado de toxicidad, pudiendocrear
gravesproblemasdecontaminaciónambiental.
La etapalimitanteen la biodegradacióno detoxificaciónde estoscompuestoses
la eficiencia de las rutas catabólicasmicrobianas.Aunquea veces existenlas enzimas
adecuadaspara llevar a cabo la completa mineralización de ciertos compuestos
xenobióticos,estosprocesosno sonlo suficientementerápidos como para mantenerun
equilibrio entrela liberacióny eliminación de éstos,siendo la causaprincipal de este
desfasela gran cantidadde vertidosque de forma incontroladaseliberanen la Biosfera
(Smith, 1990).La eficaciay cinéticade estosprocesoscatabólicospuedeverseafectada
por diversosfactorescomo por ejemplo la accesibilidaddel sustrato,la presenciade
sustanciasadsorbentesen el suelo, o factoresfisico-quimicoscomo la temperaturadel
14
INTRODUCCIÓN
hábitat, pH, potencial redox, concentraciónde oxígeno, etc. (Swindol y cols., 1988;
Spainy van VeId, 1983;Bottomley, 1993).
2. ADAPTACIÓN INDUCIDA DE LOS MICROORGANISMOS A LOS
COMPUESTOSAROMATICOS CONTAMINANTES
La selección natural actúa favorablementesobre una población cuando las
variacionesintroducidaspermitena dichapoblaciónobtenerun crecimientomás rápido.
La continuay rápidaevolucióngenéticacaracterísticade las bacteriasha facilitado la
aparicióny diseminaciónde rutasmetabólicasparala degradaciónde una granvariedad
de hidrocarburosaromáticos(Leisinger y Brunner, 1986). Sin embargo, la masiva
liberaciónde agentesxenobióticosduranteun corto espaciodetiempo, desdeel puntode
vista evolutivo, no ha permitido a los microorganismosdesarrollarnuevaspropiedades
catabólicascon la rapidezsuficienteparapaliar el problemamedioambientaloriginado
por la acumulaciónde estoscompuestosen distintosecosistemas.
Paraacelerarlos procesosevolutivosimplicadosen la adquisiciónde nuevasrutas
catabólicassehan diseñadoen el laboratorio,medianteel uso de quimiostatos, diversos
experimentosconsistentesen la aplicacióncontroladade unapresiónselectivasobreuna
estirpe,o una comunidadmicrobiana,que metaboliceun compuestoparecidoal quese
quieredegradar(Dom y cols., 1974). Estos estudiosindican que esposible conseguir
una completamineralizaciónde ciertosagentesxenobióticossustituyendolentamentela
ffiente decarbonometabolizablepor el compuestoen estudio.El periodode exposición
al nuevo sustrato puede consistir en días o meses, denominándoseproceso de
adaptación microbiana al cambio que provoca la ampliación de la capacidad
biodegradativa(Spainy van VeId, 1983).Estasestrategiasse han utilizado con éxito en
varias ocasionesy tienen la ventaja de ser sencillas y de no ser necesariala
caracterizacióna priori de las rutas catabólicasque intervienenen el proceso. La
desventajaprincipal quepresentanesqueel resultadofinal no estotalmentepredecible.
Los mecanismosque han desarrolladolos microorganismospara llevar a cabo
estosprocesosconsisten,por una parte,en la inducciónde enzimasespecificaspara la
15
INTRODUCCIÓN
degradacióndel sustrato,y porotra, en la alteraciónde la actividadenzimáticaoriginada
porprocesosde adaptacióngenéticacomo la recombínación,transposicióno mutacion.
Tambiénpuedenestarimplicadosprocesosde transferenciagenética,de formaque, por
transformación,transduccióno conjugación,el microorganismoadquieragenesque le
permitanampliar su capacidadcatabólica(Reinekey Knackmuss,1979; van derMeer y
cols., 1992). Estos procesosse ven facilitados por el hecho de que muchasrutas
catabólicasestánlocalizadasen plásmidostransmisibleso transposones.En la tabla 1 se
muestranalgunos ejemplos de plásmidosque contienen genes implicados en rutas
catabólicasde compuestosaromáticos(Frantzy Chakrabarty,1986).
Otro procedimientoparaampliarla capacidadbiodegradativabacterianaconsiste
en la utilización de técnicasde ingenieriagenéticaparala transferenciain vi/ro de genes
donadosy/o de sistemasreguladoresconocidos(de Lorenzo y Rojo, 1994). Esto da
lugar a microorganismosmodificadosgenéticamente(MMGs) que, por su importancia,
se tratarán en otro apartado. La evolución in vi/ro requiere una caracterización
exhaustivade las rutas metabólicasque se quieren expandir, lo que justifica el gran
avancequeseha producidoen estecampodurantelas últimasdécadas.
Tabla 1. Rutas catabólicasde compuestosaromáticos localizadasen plásmidos
Plásnildo MIcroorganismo Ruta degradativa Referencia
Pseudomonasputída
1’. pitido
1±putida
P. Convexa
P. puada
E.fluorescens
Eseudornonassp.
Alcaligeneseutrophus
Eseudarnonassp.
E. pulida
Eseudo‘nonasCF600
Xileno, tolueno
salicilato
nafla Peno
nicotina,tijeotinato
35~xiIenol
estireno
anilina
2,4-diclorofenoxiacetato
3 .I~pr¿~a~~
3 -clorobenzoato
fenol
(Dngglebyy cola., 1977)
(Chakrabatty, 1972)(Yeny coPs., 1983)(Yeny coPs., 19813)
(Thackery Gunsalus,1979)
(Hoppery Kemp,1980)(Salay cola., 1984)(Bestettiy cola., 1984)
(AnsonyMackinnon,1984)
(DonyPeniberton,1981)
(Reinekey Knnckn,us,1979)
(Chatierjeey Chakrabarty,1983)
(Nordlundy coPs.,1990)
TOL
SAL>
NAH
NIC
pRA500
pEO
PC!TI
pJP4
pWRI
pAC25
pVIISO
16
INTRODUCCIÓN
3. RUTAS CATABÓLICAS DE COMPUESTOS AROMÁTICOS EN
BACTERIAS
Junto con los residuosglucosídicos,el anillo bencénicoconstituyela unidad de
estructuraquímica másdiflindida en la Naturaleza,por lo que no es extrañoque los
microorganismoshayandesarrolladorutasmetabólicasqueles permitanmineralizareste
tipo de compuestos(Smith, 1990). Sin embargo,la introducción artificial de grupos
electronegativos,cloro o nitro, en el anillo aromáticodisminuyeconsiderablementesu
biodegradabilidad(Leisingery Brunner,1986).
El usomodernodel vocabloaromáticono tiene ningunarelación con el aroma.
Aunqueel términoseoriginó en los alboresde la quimica orgánicacuandose descubrió
que muchoscompuestosque conteniananillos de bencenosecaracterizabanpor olores
fuertes,en la actualidadseasociacon compuestosque tienenuna estabilidadde indole
aromática (Streiwiesery Heathcock, 1979). Los hidrocarburosaromáticosson muy
establesdebidoa su configuraciónelectrónicapor lo querequierenuna activaciónprevia
parasermetabolizados.El mecanismode activaciónes diferentedependiendode si se
lleva acaboen un microorganismoanaerobioo aerobio.En el primercaso,las reacciones
que conllevana la desestabilizacióndel anillo aromáticoconsisten,generalmente,en una
tioesterificacióndel anillo bencénicomediantela incorporaciónenzimáticade coenzima
A (CoA). Sin embargo,los microorganismosaerobios,normalmente,desestabilizanla
estructuraresonantemedianteuna serie de reaccionesde oxidación. En amboscasos,
estasreaccionesenzimáticasconducena la formación de metabolitosintermediariosde
rutascentralescomo el ciclo de Krebs(Leisingery Brunner, 1986).
3.1. Metabolismoanaerobio
Los ecosistemasanóxicosseoriginancuandoel consumode oxígenosuperaal
suministro de éste, como sucedeen aguas estancadas,sedimentosde lagos, plantas
industrialesque producenmetanoa partir de desechosorgánicos,plantasde depuración
deaguasresiduales,tracto digestivo de los animales,sedimentode los océanos,etc. El
metabolismoanaerobiode los compuestosorgánicosy su mineralizacióna dióxido de
‘7
INTRODUCCIÓN
carbonoy metanodependede la disponibilidad de la luz y de aceptoresde electrones
inorgánicoscomonitrato, sulfatoo dióxidode carbono.
En 1934, Tarvin y Buswell demostraron,medianteevidenciasquimicas, que al
incubar un compuestoaromático en condicionesanaerobias,utilizando como medio
fango y aguasresiduales,estecompuestoeracompletamentetransformadoen metanoy
dióxido de carbono.Posteriormente,y medianteel uso de benzoatomarcadocon
Clark y Fina (1952) demostraronque, en condicionessimilares, el 50% del carbono
procedentede benzoatoera convenidoen metano, con lo que definitivamentequedó
demostradoquelos microorganismosanaerobioserancapacesde catabolizarestetipo de
compuestos.Actualmenteha surgidoun graninteréspor el estudiode estetipo de rutas
dado que muchos ecosistemasanóxicos contienen grandescantidadesde residuos
aromáticosprocedentesde desechosindustriales.
La clasificación de los microorganismosanaerobioscapacesde metabolizar
compuestosaromáticosseha diseñadoatendiendoal sistemaquela bacteriautiliza para
obtenerenergía(Evansy Fuchs,1988)(tabla2).
3.1.1.Bacteriasfotosintéticas
Desdeel punto de vistabiodegradativo,las bacteriasrojas no sulffireas son las
más interesantesdentro del grupo de bacteriasfotosintéticas.Son microorganismos
principalmentefotoheterótrofos,es decir, que utilizan la luz como frente de energíay
compuestosorgánicoscomo frente de carbono. Las bacteriasrojas no sulfrreas se
presentandemodotípico en lagosy charcasde aguadulce,dondehay materiaorgánica
pero no hay sulfitro, o está en muy baja concentración.Dentro de este grupo de
bacterias,sehan descritoalgunasespeciespertenecientesal géneroRhodopseudomonas
como R. palustris que puedenmetabolizarbenzoatoy w-alcanofenilcarboxilatosen
condicionesanaerobiasy en presenciade luz (Eldery cols., 1992). El benzoatoentraen
la célula medianteun sistemade transportedependientede energíay esconvertidoen
benzoil-CoApor una benzoil-CoAligasainducible. Posteriormente,medianteuna serie
de reaccionesenzimáticasde reduccióne hidratación,da lugar a 3-hidroxipimeil-CoA.
18
INTRODUCCIÓN
Este compuestoproducirla acetil-CoA medianteuna ruta metabólicasimilar a la f3-
oxidación de los ácidosgrasos(Evans y Fuchs, 1988; Koch y cols., 1993; Gibson y
Gibson,1992).
Otra especie interesantees 1?. gelatinosa que es capaz de mineralizar
floroglucinol. Se creeque el primer paso consisteen una deshidrogenaciónya que el
dihidrofloroglucinol se ha identificado en el medio de cultivo pero el resto de la ruta
metabólicaestáaúnpordeterminar(Whittle y cols.,1976).
3.1.2.Bacteriasdesnitrificantes
Muchasbacteriasaerobiaspuedenutilizar nitrato, en lugar de oxigeno, como
aceptor de electronescuando las condicionesson de anaerobiosis.Siempreque la
materiaorgánicasedescomponeen el suelo o en el aguay seagotael oxígenocomo
resultadode la respiraciónaeróbicamicrobiana, algunos de estos microorganismos
continuaránutilizando la materia orgánicasi hay nitrato presente,es decir, mediante
respiraciónanaerobia.En esteprocesoel nitrógenocombinadoeseliminado del sueloy
del aguacon liberaciónde N2 a la atmósfera,
En 1970, Taylor y cols. aislaron un microorganismoGram negativo que fue
clasificadocomoPsendomonasestirpePN-1, que era capazde metabolizarel benzoato
en condicionesaerobiasmedianteuna ruta que conllevaba una hidroxilación que daba
lugar al ácido protocatéquicoy posterior ruptura del anillo en posición meta. En
anaerobiosisy en presenciade nitrato estemicroorganismotambiéneracapazdeutilizar
el benzoatocomoúnicafluentede carbono.Se demostróqueel primerpasode estaruta
consisteen la formación de benzoil-CoA. Posteriormente,Blake y Hegeman(1987)
reclasificaron esta estirpe denominándola AIcailgenes xylosoxidans subespecie
desnitrWcansy demostraron,medianteexperimentosgenéticos,que la ruta anaeróbica
de degradaciónde benzoatoestabalocalizadaen el plásmido conjugativopCB1. Este
microorganismotambiénpuedemineralizar2- y 4-fluorobenzoatomedianteunareacción
de deshalogenación.
‘9
INTRODUCCIÓN
Tabla 2. Metabolismo
Obtención de energia
anaerobio de compuestosaromáticos
Microorganismo Sustrato Referencia
Bhodopseudomonas palustris benzoato (Proctory Seher,1960)
m,p-hidroxibenzoato (Dutiony Evans,1967)floroglucinol (Whittle y cols., 1976)
flesnitrificación Alceligenes xylosoxidans
Paracoccus denitr,ficans
Parococcus sp.Bacillus sp.
Eseudoinonos
Reduccióndesulfato Desuljbvibrío sp.
benzoatohidroxibenzoatosfluorobonzoatoprotocatecuatovanilatoo, p.cresolo, in, p-fialato
2-arninohenzoatofenolO, m, pcresolfenilacetato,4-hidroxifenflacetato,fenolp-cresolbenzoato
(Blakey Hegeman,1987)
(Willian,s y Evana,1975)
(Rudolphiy cok., 1991)(Aflringyeols., 1981)
(Zieglery cola.,1987)(Tschechy Pucha.1987)(Bosserty Young, 1986)(Dangel y cols., 1991)
(EvansyFnchs,1988)
Desul/bcoccus
Desulfonema
DesuI/bsarcina
hidroxibenzoatos
fenilacetato
fenolindo!
floroglucinolCaprococcus sp.
Streptococcus
Pelobacter acidigallící
E,¿bacteriurn oxidoreducens
resorcinol
galato,pirogalol
polifenoles,quereetina
(EvaiisyPucha,1988)
(Evansy Pucha, 1988)
(Baky Widdel, 1986a)(Baky Widdel, 1986b)
(Tial y Sones,1975)
(Tschechy Schink,1985)
(Schinky Pfennig,1982)
(Knmn~hoIz y Bryant, 1986)
Fermentaciónn,etanonénica Asociaciónmicrobiana:bacteriafermentativa+
bacteriaacetogénicay n,etanogéniea
ligninabenzoatotirosinacinamatoferíilpropionatofeilacetato,benzoatofenol,catecolhidroquinonaferulatovanilatosiringinatofenilalaninabenceno,toluenotuiptófano,indolclorobcncenoclorofenoleselorobenzoatosclorofenoxiacetatosnítrofenolesclorogwayacol
(Borufl’y Buswell, 1934)(Tarvin y Buswell, 1934)(Mountforty l3ryant,1982)(Balbay Evana,1980a)
(Balbay Evana,198Gb)
(Healyy Yoong,1978)
(BalbayEvans,1980e)(Healyy cola., 1980)(Kaisery Haseln,ann,1982)(Sleaty Robinson,1983)(BalbayEvans,1980a)(Grbic.Galicy X’ogel, 1987)
(Beny y cola., 1987)
(Reinekey Ki,ackn,uss,1984)(Boydycols., 1983)(Boyd y Shelton,1984)(Suflita y cola., 1982)(Suflutay t3ibson,1985)(Neilsony cols.,l987)
Fotosíntesis
R. gelatinosa
Fermentación
20
INTRODUCCIÓN
Actualmentese sabeque existenotrasestirpesdel géneroEseudomonasque, en
condicionesdesnitrificantes,degradanel benzoatoy otros compuestosaromáticoscomo
el hidroxibenzoato,el 2-aminobenzoato,el fenol, el ácidofenilacético(PA) y el ácido 4-
hidroxifenilacético(4-HPA) (Altenschmidty cols., 1991;Biegerty cols., 1993;Dangely
cols., 1991;Mohamedy cols., 1993; Mohamedy Fuchs,1993; FUer y Kelly, 1994).En
todoslos casosintervieneuna acil-CoA ligasaqueda lugaral tioéstercorrespondiente.
Mediante la intervención de diversas reaccionesenzimáticasde a-oxidación,
reduccióno carboxilaciónestoscompuestosdaránlugarabenzoil-CoAcomo metabolito
intermediariocentral que posteriormentees reducidoe hidratadoenzimáticamentepor
un mecanismosimilar al propuestoen R. palustris {Koch y Fuclis, 1992; Koch y cols.,
1993).Las acil-CoA ligasasson de vital importanciaen los primerospasosde las rutas
catabólicasanaeróbicasde derivadosaromáticosya quedesestabilizanel anillo aromático
mediantetioesterificación.
3.1.3. Bacteriassulfato-reductoras
El hábitat típico de estosmicroorganismosanaerobiosestrictosdesasimiladores
de sulfato son sedimentosanaeróbicosque contienenmateria orgánicay sulfato. Las
actividadesde estosorganismosdan como resultadouna generaciónmasivade ácido
sulfhídrico. Esto conducecon frecuenciaal desarrollo de bacteriasrojas y verdes
suibreas,que utilizan el ácido sulthidrico como donadorfotosintético de electrones,
oxidándolo a sulfato bajo condicionesanaeróbicasen presenciade luz Esta acción
combinadadeterminaun ciclo anaeróbicotípico del azufre.Los génerosDesu¿fovibrío,
Desu(fococcus,Desulfonemay Desulfosarcina,aisladosde sedimentosmarinos y de
agua salada, son capacesde metabolizar algunos derivados aromáticos como el
benzoato,el PA, el 3-fenilpropionatoy el 2-, 3-, y 4-hidroxibenzoato,pero hastaahora
se desconoceel mecanismopor el cual este tipo de bacterias mineralizan estos
compuestos(Evansy Fuchs,1988).
21
INTRODUCCIÓN
3.1.4.Fermentación
La fermentaciónpuededefinirsecomoun procesometabólicogeneradorde ATP
en el que los compuestosorgánicos sirven tanto de donadores de electrones
(oxidándose)comode aceptoresde electrones(reduciéndose).
En 1982, Schink y Pfennig aislaron de fango marino un microorganismo
pertenecientea la familia Bacteroidaceaeal que llamaronPelobacteracidigallící. Este
microorganismoes capazde convertir ácido gálico, floroglucinol, pirogalol y 2,4,6-
trihidroxíbenzoatoen acetatoy CO2 Durantelas fermentacionesno sereducíanitrato ni
sulfato. La asociaciónde estemicroorganismocon Acetobacteriurnwoodii duranteel
procesofermentativopermitíala utilización de un nuevosustratoya que estacomunidad
bacterianaconvertíae> ácidosiringico en acetato.El acoplamientode diferentesrutas
metabólicas permite a las comunidades microbianas utilizar ciertos compuestos
aromáticosque no serian degradablespor un único microorganismo.Este tipo de
asociacionesco-metabólicasexisten de forma natural en la Biosfera aumentandola
capacidadbiodegradativade los microorganismos.
3.2. Metabolismo aerobio
Como semencionóanteriormente,el mecanismogeneralde desestabilizacióndel
anillo aromáticodesarrolladopor los microorganismosaerobiosimplica una oxidación
progresivade laestructuraresonante.Actualmentese tieneun granconocimiento,a nivel
molecular, de algunas rutas catabólicas microbianas de compuestosaromáticos,
especialmentede las pertenecientesal géneroPseudomonas(van der Meer y cols.,
1992).Una comparación detallada de estas rutasmetabólicasindica que el primer paso
consisteen ¡a incorporaciónde dos gruposhidroxilo en el anillo bencénicoparalo cual
los microorganismoshan desarrolladouna serie de rutas perféricas de oxidación,
deshalogenación,desnitración o desulfitración, que dan lugar a un intermediario
dihidroxilado susceptiblea la acción de dioxigenasasespecificasque provocaránla
apertura del anillo. Estos derivadosdihidroxilados serán canalizadospor dos rutas
generales:por la ruta del catecol, en la que los intermediarioscatecólicospuedenser
22
INTRODUCCIÓN
metabolizadosa su vez mediantela ruta nieta o la ruta orto dependiendode la posición
en la que seefectúela aperturadel anillo, o por la rulo del gen/isa/o.Los metabolitos
finalesde ambasrutas entrandirectamenteen el metabolismointermediariode la célula
(figura 1).
(9¡ c120
Ruta Orto
CO? \ 0005
~
y0005
OH
O?
Catecol
OH A<N. COOH
050
‘N-- ~cetaldehido¾
Ruta Meto
OH COOH
OOH % OHC ~ÑOH
P$50COOH COOH
Píruvoto
~Sern~aIdeh~do
Protocatecuato
OH
OH
O?
O
E
0005C—COOH Fumoroto
OH .4cetoocetnto
Gentisato
Figura 1. Rutas catabólicas centrales dc compuestos aromáticos demicroorganismos aerobios. Los hidrocarburos aromáticos siguen dos rutas generales:A, la ruta del catecol y 8, la ruta del gentisato. En el primer caso,la ruptura del anilloaromáticopuedeseren posición 1,2 (nilo), o en 2,3 (meto), segúnla enzimautilizada.Abreviaturas: C>20, catecol 1 ,2-dioxigenasa;C2,30, catecol 2,3-dioxigenasa;P3,40,protocatecuato3 ,4-dioxigenasa;P4,50, protocatecuato4,5-dioxigenasa;G1.20, gentisato1,2-dioxigenasa.(de Lorenzoy Rojo, 1994).
4cetil-Cot\Succinoto
23
INTRODUOCÉÓN
En general, los genes que codifican para las enzimas responsablesde la
degradaciónde compuestosaromáticosestánestructuradosen operonesorganizadosen
agrupacioneso clusters de genes que, en muchas ocasiones,están localizados en
plásmidostransmisibleso en transposones(tabla 1), lo quepermitesu propagación.En la
figura 2 semuestrala organizaciónde algunasde estasrutascatabólicas.
1 kb 2Okb
(A 8)
DORFB AP
cotDFECBM cofA bénDCB A
8 S/9ZKOJFGETLZYX IVBAMG_ __________ 4kvmnr(MX) LNIJHTGQ ¡Ej O 1’ GB Au __________
&XFCW,84 086//Y 5 1
A,AgAsA.BC X O
A BCDEF
PKLM ‘JOPOS O OEFrI/1Z
[c<CAr ZACTON
pPO 1
pAC2~
pM<WO
NAH7
cVOmoSOtfla
cIomosecna
oromoso’na
FVIISO
MICRoOBGANISMO
Pxeudrj,rr<tin.< PSI
1’. parado AC<67
Ierarrop<rras JMPLI4
4. caa’ccoccÑCr,í
1> pulida mt-2
P~ pando PpCl
1. putido FI
A pseudoo<cdhgencs KY7O~
1<. rnendocinaKRl
Pseradornnrrasrp CF600
Figura 2. Organización física de algunas rutas catabólicas de compuestosaromáticos.E genesque formanpartede las rutasperiféricas;U, genesreguladores;LI,genesimplicadosen transporte;N, rutameta;E rutaorto; ~ rutaorto modificada. Lasflechasindican la direcciónde transcripciónde los genes.Los genescuya secuenciadenucleótidosno seconoceen su totalidadestánindicadosentreparéntesis.
ÚOMI’lJESTO
Cte robenzoalo
Clúrecatecol
D,clenofenoa,acoaalo
Benzoato
XiI,noflolue.,n
NaFaten&Sal¡eilato
Tolueno
CloroLíIen,lo
ToJugno
Fenol
RtCtILON
<ch
‘Ir
</4
co,~bcn
‘y,
no),
red
bph
‘nro
dnrp
24
INTRODUCCIÓN
La ruta catabólicamejor caracterizadaesla rutaTOL o ruta de degradaciónde
xileno y tolueno de Pseudomonasputic~a (Marquésy Ramos, 1993) Esta ruta está
localizadaen los plásmidosTOL, de los cuales,el prototipo esel plásmidopWWO que
fue descrito por primera vez en el año 1974 por Williams y Murray aunque sus
propiedadescatabólicasya habíansido observadasen 1973 por Nakazaway Yokota.
Esteplásmidoperteneceal grupo de incompatibilidadP-9 y tiene un tamañode 117 kb
de las que, aproximadamente40 kb estánimplicadasen la ruta catabólica(Downingy
Broda, 1979). El plásmído pWWO es autotransmisibley su rango de huéspedse
restringe al género Pseudomonasy algunas Enrerobacteriaceae(Nakazawa, 1978;
Ramos-Gonzálezy cols., 1991).Los genesimplicadosen estarutacatabólicadel xileno,
o genesxyl, están localizadosen el transposónTn465J de 56 kb que a su vez está
incluido en el transposónTn46S3 de 70 kb, ambospertenecientesa la familia de
transposonesTn3 (Tsuday cols., 1989).El plásmidoTOL estermosensibleya queen P.
acruginosa no puedemantenersea 420C. Hasta ahorano han sido localizadoscon
exactitudlos genesresponsablesde la replicación y transferenciaconjugativa pero se
sabeque la expresióny formacióndelpilus dependientede pWWO es constitutiva, lo
que justifica el alto grado de transferenciade esteplásmido a las estirpesreceptoras
(Ramos-Gonzálezy cola, 1991).
Los genes catabólicosde la ruta TOL están organizadosen dos operones
llamadosoperón“upper” (xylCMABN) y operón“meta” (xyIXYZLTEGFJQKJH).Los
genesxyITEGFJQKIHcodifican paraproteinasqueforman partede la ruta nieta parala
degradacióndel catecol. El resto de los genesa1 constituyenuna ruta periférica
mediantela cual el grupometilo del toluenoessecuencialmenteoxidadohastabenzoato,
o metilbenzoatosi el producto inicial es xileno, por los productosde los genesdel
operónupper; posteriormenteestoscompuestosson oxidadosy descarboxiladospara
producir catecol mediante la toluato 1 ,2-dioxigenasa (xyIXYZ) y la
dihidroxiciclohexadienodescarboxilasadeshidrogenasa(xylL), respectivamente.
25
INTRODUCCIÓN
3.2.1.Rutas periféricas
A lo largo de la evolución, los microorganismoshan ampliado su capacidad
biodegradativamediantevariacionesen las rutas periféricas como la adquisición de
nuevasenzimasy la apariciónespontáneade mutacionesque provocanun cambioen la
especificidad de sustrato de las enzimasexistentes. Normalmentela formación del
intermediario dihidroxilado en las diferentes rutas periféricas está mediada por
oxigenasasque,en muchoscasos,presentanunagran similitud en su estructuraprimaria,
lo cual indica que podríanderivar de un gen ancestralcomún(van der Meer y cols.,
1992).
En esteapartadoseexpondrán,de formageneral,los tipos de enzimasimplicadas
enlas rutasperiféricas.
3.2.1.1.Oxigenasas
Las oxigenasasson enzimasque catalizanla inserciónde oxígenomolecularen
sustratosorgánicos. Estas enzimasse clasifican en monooxigenasasy dioxigenasas,
dependiendodel número de átomos de oxígeno que incorporan en la molécula de
sustrato. Las monooxigenasasincorporansólo un átomo de oxígeno en el sustrato,
reduciendo el otro hasta agua mediante una reacción de oxidación. Debido al
acoplamientoentre las reaccionesde oxigenacióny oxidación estasenzimastambiénse
denominanoxidasasde júnción mixta. Las dioxigenasasintroducen dos átomos de
oxigenoen el sustratoy sesubdividenendioxigenasashidroxilantes, queincorporandos
residuoshidroxilo en el anillo aromático,y dioxigenasasimplicadasen la ruptura del
anillo que, a su vez, se subdividenen extradiol dioxigenasaso intradiol dioxigenasas
dependiendode si la aperturadel anillo aromáticodihidroxilado selleva a cabomediante
un procesode nieta-escisión(entre los carbonos2 y 3 en el caso del catecol)u orto-
escisión(entrelos carbonos1 y 2 en el casodel catecol)respectivamente(Harayamay
cols., 1992) (figura 1). Las dioxigenasasimplicadasen la rupturadel anillo aromáticose
tratarán en el apanado3.2.2. ya que normalmenteno forman parte de las rutas
periféricas.
26
INTRODUCCION
Tabla 3. Oxigenasasimplicadas en la hidroxilación de compuestosaromáticos
MONOOXIGENASAS
Familia Enzima Microorganismo
MONOCOMPONENTES
4-hidroxibenzoato 3-hidroxilasa4.hidroxibenzoato 3-hidroxilasa
salicilato hidroxilasa
P.fluorescens
P. puada
(Berkel y cola.,1992)
(Youycols.. 1991)
Fenol 2-hidroxilasa2,4-diclorofenol 6-monoexigetiasa
fenol 2.hidroxilasa
Alcatigenesentrophus
PseudomonasESTIQOI
(Perkinsy cola., 1990)
(Nurkycols., 1991)
Flavoproteinas no clasificadas2-nitrofenol hidroxilasa
3-hidroxibenzoato 6-hidroxilasa
1’. putidaB2
RcepaciaMicrococcussp.
(Zeyer y Kocher, 1988)
(Wangycols., 1987)(Rajasekharan y cola., 1990)
MULTICOMPONENTES
Fenol 2-hidroxilaaafenol 2-hidroxilasa
Tolueno 4-monooxigenaaa
Psen do,nonas CF600
P. mendocina
(Nordlund y cola., 1990)
(Yenycols., 1991)
4.liidroxifenilacefato 3-hidroxilasa P. pulida (Ararnachalam y cola., 1992)
Aluuil hidroxilasasxileno rnonoOxigeflasa 1’. pulida (Suzukiy cola., 1991)
DIOXICENASAS
Clase Enditan Microorganismo Referencia
Fíalato dioxigenasa
4-clorofenilacetato 3,4-dioxigenasa
4-sulfobenzoato3,4-dioxigenasa
benzoato dioxigenasa
4-metoxibenzoato 0-desnietilasa
Pirazón dioxigenasa
Benceno 1,2-dioxigenasa
Tolueno dioxigeussa
Naftaleno dioxigenasa
P. cepacia
Pseudo,,ionassp. CB53
Coinamonastestosteroni
1’. arvilla.4 cinetobaoter calcoaceuicus
JA pulida
Pseudo,nonassp.
E.peída
JA puada
P.cciida
(Batie y cola., 1987)
(Markus y cola., 1986)
(Locher y cola., 1991)
(Yamaguchi y Fujisawa, 1982)(Neidle y cola.. 1991)
(Bernhardt y cola., 1975)
(Sauber y cola., 1977)
(lrieycols., 1987)
(Gibson y cola., 1982>
(Ensley y Gibson, 1983)
Referencia
No clasificadas
lA
[FI
ItA
‘la
III
27
INTRODUCCIÓN
Las monooxigenasasy dioxigenasashidroxilantes requieren donadores de
electronesexternos como el NADH o NADPH y un centroredox, como mínimo, que
permitala activaciónde la moléculade oxigeno.Estoscofactoressuelensermetalesde
transicióncomo hierro, manganeso,cobre y cobalto, o una molécula de flavína o
pteridina. La clasificaciónactual de las hidroxilasasde derivadosaromáticosse ha
establecidoen función del pesomolecular de las subunidadesy de la similitud que
presentanestos enzimas en su estructuraprimaria (tabla 3). A diferencia de las
dioxigenasas,la mayoríade las monooxigenasassonflavoproteinasmonocomponentes,
aunquesehan descritoalgunossistemasmulticomponentescomo la fenol 2-hidroxilasa
dePseudomonasCF600que catalizala conversiónde fenol en catecoly estácodificada
por los genesdmpKLMYOP(Nordlundy cols., 1990), y la tolueno 4-monooxigenasade
P. mendocinaKR1 codificadapor los genesImoABCDEF Los componentesde estas
dos monooxigenasasestánrelacionadosentre sí y con otros sistemasenzimáticoscon
cadenade transponeelectrónicocomola metanomonooxigenasay algunasdioxigenasas
hidroxilantesdecompuestosaromáticos(Yeny cols., 1991).
Unamonooxigenasade interésparala discusiónposteriorde estetrabajoesla 4-
HPA-hidroxilasade P. putida (Arunachalamy cols., 1992). Es un sistemaenzimático
que consta de dos componentesproteicos; una flavoproteina dimérica con dos
subunidadesidénticasde 30,7 kDay una proteínacooperadorade 38,5 kDa Los genes
quecodificanparaestesistematodavíano han sido donados,pero la purificaciónde los
dos componentesenzimáticosha permitido estudiarparcialmentesu mecanismo de
reacción(Arunachalamy cols., 1994; Arunachalamy Massey, 1994). La tiavoproteina
puede, por sí sola, catalizar la oxidación de NADH en presencia de 4-HPA
independientementede la incorporacióndel grupohidroxilo en la moléculade sustrato,
siendonecesariala presenciade la proteinacooperadoraparaacoplarlas reaccionesde
oxidación e hidroxilación (figura 3). La oxidación de NADH mediada por la
flavoproteinatambién se produceen presenciade otros compuestosestructuralmente
relacionadoscon el 4-HPA, como son el p-clorofenilacetatoy el p-fluorofenilacetato,
aunquesólo el 4-HIPAy en menormedidael p-hidroxifenilpropionato,sonsusceptiblesa
la hidroxilación mediadapor la proteína cooperadora.La proteínacooperadorano
presentaningún centro redox, lo que descartala posibilidad de que actúe como un
28
INTRODUCCION
receptorde electronesequivalenteal componenteoxigenasaterminal de la cadenade
transporteelectrónicocaracterísticode los sistemasmulticomponentes.
OXIDACION HDROXILACION
FLAVOPROTEINA(Efector 1 Sustrato)
++ NADHM-H j-Oa
FLAVOPROTEINA+
PROTEíNA COOPERADORA
GH2000H
1%~3 +NADt +H202
OH
CH2COOH
-a--
4-NaD~+H2OOH
OH
Figura 3. Reacción catalizada por el componente flavoproteico de la 4-tIPA-hidroxilasa de P. puti<la en presenciay ausenciade la proteína cooperadora.
29
INTRODUCCION
Las dioxigenasashidroxilantesson sistemasenzimáticosmulticomponentes.Los
componentesproteicosde estetipo de dioxigenasassedividen, desdeel punto de vista
funcional, en dos clases: oxígenasa terminal (o hidroxilasa) y componentes
transportadoresde electrones. Generalmente, los genes que codifican para las
dioxigenasashidroxilantesestánagrupadoscon un genquecodificaparaunadihidrodiol
deshidrogenasaque pertenecea la familia de las alcohol deshidrogenasas(Mansony
Camniack,1992).
Las oxigenasasterminalesson proteínasoligoméricasformadaspor una o dos
subunidadesdiferentesque presentanunaconfiguraciónctn ó (a13)n. Contienenal menos
un núcleoredox de tipo “Rieske” y un átomode hierro no hematinicoresponsablede la
activaciónde oxígeno.El núcleoredoxde tipo “Rieske” estáformadopordosátomosde
azufrey dos de hierro en el que, a diferenciade los centrosredox de las ferredoxinasde
las plantasdondeel hierro y el azufreestáncoordinadosa cuatrocisteinas,un átomo de
hierro estácoordinadoados císteinasy el otro a doshistidinas.Estosaminoácidosestán
conservadosen el N-terminal de la subunidadcx lo que ha permitido idear la siguiente
secuenciaconsensodondeX indica cualquieraminoácido(Mansony Cammack,1992):
C-X-H- 15 a 17 aminoácidos-C-X-X-H
En el sitio de unión del átomo de hierro no hematínicoestánimplicadasdos
histidinas y dos tirosinas conservadasen la parte central de la subunidadci. Otras
oxigenasasdependientesde hierro como las monooxigenasasde alcanosy xileno (Suzuki
y cois., 1991)contienenregionesricas en histidinay tirosinaque estánimplicadasen la
unión del átomo de hierro, pero su disposición es diferente a la de las oxigenasas
terminales.
Además de la oxigenasaterminal, en la cadena de transporte electrónico
intervienenuna reductasaflavínica que reduceel NADH y otros componentescon
núcleosredox de tipo ferredoxinao “Rieske”. Atendiendoal númerode componentes
queformen el sistemay al grupoprostéticoqueutilicen, las dioxigenasasseclasificanen
(tabla3):
30
INTRODUCCIÓN
-Clase1: Dioxigenasasde dos componentesen los que el núcleoredox azufre-
hierro y el llavín nucícótidoestáncombinadosen unasolaproteína.Dependiendode si
el cofactorrequeridoesEMIN ó FA.D, sesubdividenen ClaselA y liB respectivamente.
-Clase II: Dioxigenasasde tres componentesen las que en el transporte
electrónicoestánimplicadosuna flavoproteinay una proteínacon un núcleoredox de
tipo ferredoxina( ClasehA) o de tipo “Rieske” (ClaseliB).
-ClaseIII: Dioxigenasasde trescomponentesque constande una flavoproteina
con un núcleoredox azufre-hierroy unaferredoxina.
A pesarde la gran diversidadque caracterizaa estetipo de enzimas,sepiensa
que algunasprovienende un mismo gen ancestraldebido a la relación estructuraly
funcionalquepresentan.Comoejemplopodemoscitar la benzoato1,2-dioxigenasade A.
calcoacezicus(Neidley cols., 1991)y la toluato 1,2-dioxigenasadeP.putida. Estasdos
enzimaspertenecena la ClaseIB de las dioxigenasashidroxilantes. La benzoato1,2-
dioxigenasaestá codificadapor los genesbenABC,que pertenecena la ruta orto de
degradaciónde benzoato de A. calcoaceticus. Esta enzima está codificada en el
cromosomaal igual que la benzoato1,2-dioxigenasa de P. arvilla C-1, que es una
enzímaequivalentepertenecientea la ruta orto del benzoatoen estemicroorganismo
(Yamaguchiy cols., 1982).La toluato 1,2-dioxigenasa,codificadapor los genesxylXYZ
de la rutaTOL, esdecirde la rutame/a de degradaciónde benzoato,estálocalizadaen el
plásmidopWWO a diferenciade las dosanteriores.La comparaciónde la secuenciade
aminoácidosentreestasenzimasdemuestraque existengrandeszonasde homologíaen
todos sus componentesenzimáticos,fUndamentalmenteen los sitios de unión de los
centrosredox. Estasenzimaspresentanla mismaftrnciónperodifieren en la especificidad
de sustratoya que, aunquelas tres son capacesde oxidar el benzoato,la toluato 1,2-
dioxigenasaademásde toluato, hidroxila otros alquilbenzoatos sustituidos en las
posiciones 3 y 4 del anillo aromático. Este es un claro ejemplo de cómo los
microorganismosamplían su capacidadmetabólicamediantevariacionesen sus rutas
periféricas.
31
INTRODUCCIÓN
3.2.1.2. Compuestosaromáticoshalogenados
Los hidrocarburosaromáticoshalogenadosconstituyenuno de los gruposmás
amplios de compuestosxenobióticos.El uso de herbicidas, insecticidas,fungicidas y
material dieléctricoen diversasindustrias,que contienenmezclasde hastaio~ isómeros
diferentesde compuestospolihalogenadoscomo en el caso de los policlorobifenilos
(PCBs)(Furukawa, 1994), contribuyea incrementarla resistenciaa la biodegradación
quenormalmentepresentanlos compuestosaromáticos.
Los microorganismoscapacesde metabolizarcompuestoshalogenadosrequieren
la intervención de enzimas, denominadas comúnmente deshalogenasas,que
específicamentecatabolizanla escisióndel enlacecarbono-halógeno.Las reaccionesde
deshalogenaciónpuedenformar partede las rutasperiféricascuandose producenen un
pasoprevio a la rupturadel anillo aromático,mientrasque si seproducenen un paso
posteriora la aperturadel anillo dan lugara las rutascatabólicasmodificadas.
Se handescritosietemecanismosde deshalogenaciónque permitenclasificarlas
deshalogenasasen sietegrupos(tabla4):
a) Deshalogenasasreductasas.La deshalogenaciónreductivaestácatalizadapor
reductasasdependientesdeNADH quecatalizanla sustitucióndel halógenoporun
átomo de hidrógenomedianteunareacciónde oxidoreducción.Generalmente,este
tipo de deshalogenaciónse lleva a cabo en un pasoposteriora la orto-fisión del
anillo aromático. Las enzimas mejor caracterizadasde este grupo son las
cloromaleilacetatoreductasasde las rutasde degradaciónde derivadosaromáticos
doradosdeA. eutrophusJMP134(Ohosaly You, 1988)y Pseudo¡nonasPSi (van
der Meer y cols., 1991b)codificadaspor los genes(fdF y tcbF respectivamente.
Ambosgenesestánlocalizadosen plásmidos.
b) Deshalogenasasoxigenasas.La deshalogenaciónoxigenolíticaestámediadapor
monooxigenasascomo la pentaclorofenol monooxigenasade Flavobacterium
32
INTRODUCCIÓN
ATCC 33790, o por dioxigenasascomo la 4-clorofenilacetatodioxigenasade
Pseudomonassp. CBS3.A diferenciade las reductasas,las oxigenasasintervienen
antesde ¡a rupturadel anillo aromáticodandolugar a un derivado dihidroxilado
que seguirámetabolizándosepor la rutadel catecol.
e) Halurohidrolasas.La deshalogenaciónhidrolítica conlíeva la incorporaciónde
un grupo hidroxilo procedentedel aguamedianteuna sustitución nucleofihica
catalizadapor las halurohidrolasas.Estas enzimasutilizan el agua como único
cosustrato.Las halurohidrolasassehanclasificadoen fUnciónde la especificidadde
sustratoy de su estructuraprimaria(Jansseny cols., 1994).
d) Glutation-S-transferasas. La deshalogenacióntiolitica consiste en el
desplazamientonucleofilico de un átomo de halógenopor una molécula de
glutation, queposteriormenteseráa su vez desplazadapor una reacciónmediada
porel mismo sistemaenzimático.En algunasrutasde degradaciónde compuestos
haloaromáticos intervienen conjuntamente dos sistemas enzimáticos de
deshalogenacióncomo en el casode la ruta de degradaciónde pentaclorofenolde
FlavobacternunATCC 33790 (Orsery cols. 1993ay 1993b). En primer lugar, el
pentaclorofenol sufre una deshalogenaciónoxigenolítica catalizada por una
monooxigenasacodificadapor el gen pcpB. Duranteesteprocesose elimina un
átomo de cloro. Posteriormente,el derivado dihidroxilado es deshalogenado
medianteunaglutation-S-transferasacodificadapor el genpcpC. Lasglutation-S-
transferasasestánimplicadasno sólo en las rutas degradativasmicrobianassino
que también intervienen en mecanismos de detoxificación de compuestos
aromáticosde organismossuperiores.
e) Deshalogenasasisomerasas.Uno de los mecanismosdesarrolladospor los
microorganismosparadegradarcompuestoshaloaromáticosesla deshalogenación
por sustitución intramolecular. El clorocatecol se produce como metabolito
intermediariode muchasrutas degradativasde compuestoscloroaromáticos.Este
intermediariosemetabolizaen ?seudomonasB13 y en A. eutrophusJMPI34 por
unarutade tipo orto denominadaruta orto modificada(ver apartado3.2.2.2.).El
33
INTRODUCCIÓN
3-clorocatecolse transformaen el ácido 3-cloromucónicoque, mediantela 3-
cloromuconatocicloisomerasa,da lugar a un intermediario inestable que se
descomponeespontáneamenteprovocandola liberacióndel cloruroy la formación
del ácido oxomucónico.Este compuestose metabolizadirectamentepor la ruta
orto de degradaciónde benzoato.
O Deshidrodeshalogenasas.La deshidrohalogenaciónconlíevala formaciónde un
doble enlace y la liberación de una molécula de haluro de hidrógeno. La y-
pentaclorociclohexanodeshidrohalogenasade 1’, paucimobilisU126, codificada
porel gen linA, transformaesteproductoen tetraclorociclohexadienoque a su vez
puedesertransformadoen triclorobenceno.Esteúltimo pasono esmuy frecuente
iii vivo ya que el intermediariotetracloradoesmetabolizadopor un mecanismo
hidrolitico.
g) Deshalogenasashidratasas. Dentro de este grupo, la enzima mejor
caracterizadaes la 4-clorobenzoatodeshalogenasade PsezdomonasCBS3
(Babbitt y cols., 1992).Estemicroorganismoestáespecialmentecapacitadoparala
mineralizaciónde compuestoshaloaromáticosya que producedos4-clorobenzoato
halurohidrolasas,una 4-clorofenilacetato oxigenasa, y una 4-clorobenzoato
hidratasaque catalizala conversiónde 4-clorobenzoatoen 4-hidroxibenzoato.La
4-clorobenzoato hidratasa es un sistema enzimático que consta de tres
componentesproteicos:una CoA-ligasaque activa el anillo aromáticomediantela
incorporación de una molécula de CoA, una hidratasa que lleva a cabo la
deshalogenacióndel anillo aromáticoactivadoincorporandoun grupohidroxilo, y
una tioesterasaque moviliza el CoA dando lugar a 4-hidroxíbenzoato.Este
mecanismode deshalogenaciónse ha detectadoen otros microorganismoscomo
Arthrobactersp.US (Crooksy Copley,1993).
34
INTRODUCCIÓN
Tabla 4. Deshalogenasas
Enzimas Ruta Microorganismo Gen Referencia
Cloromaleilacetatoreductasas
Monooxh~enasas
Hidrolasas
2,4-diclorofenoxiacetato1,2,4.trielorobenceno
pentaclorofenol
4-clorobenzoato4-clorobenzoato
A.eutrophusJMP134(pJP4)PseudontonasPSI (pPSl)
Flavobecletiun,ATCC 33790
Eseudomonas CBS3Eseudomonas CBS3
OcdE
tcbF
pcpfl
deliCideliCi
(Ohosal y You, 1988)(y. d. Meer y cols., t991b)
(Orserycols., 1993b)
(Schneidery cols., 1991)
Glutation-S-transferasaspenlaclorofenol FlavobacteriumATCC 39723
Cloroniuconatocicloisornerasa3-clorobenzoato2A-diclorofenoxiacetato1,2,4-triclorobenceno
E. putida AC867 (pAC27)Aea/ropkusJMPI34 (pIPA)Eseudonzonas PSI (pI’S 1)
pcpC (Orser y coís., 1993.)
clcB (Gliosal y You, 1988)
0CdD <?erkinsycols.,1990)icOD (y. d, Meer y cols. 199 Ib)
Desl,idrodesl,alogeu,asasy-hexaclorociclohexano
4-clorobenzoato4-clorobenzoato
E. paucimobilis UT26
Fseudo,nonasCB53Arthrobacter SU
linA (Irnai y cols., 1991)
ORE1 (Babbittycols., 1992>ORFI (Crooksy Copley, 1993>
3.2.1.3.Compuestosnitroaromáticos
Los compuestosnitroaromáticosse producena gran escalaen los procesosde
fabricaciónde colorantes,plásticosy explosivos.Soncompuestosaltamentetóxicosy su
liberaciónprovocagrandesdañosno sólo al medio ambiente,sino que tambiénpuede
afectardirectamenteal hombreya que, incluso a muy bajasdosis, producencianosis,
hepatotoxicidad,anemiae ictericia.
Se han descritoalgunosmicroorganismoscapacesde mineralizarnitrobenceno,
nitrofenoles, cloronitrofenoles,nitroanilinas, nitrobenzoatos,dinitrobenzoatose incluso
2,4,6-trinitrotolueno(TNT) (Higson, 1992). El TNT esun compuestoderivadode la
fabricación de explosivosque secaracterizapor su notableestabilidadquímicaque le
confiere una gran resistencia al ataque microbiano. Los microorganismoshan
Hidralasas
35
INTRODUCCIÓN
desarrolladodos mecanismosgeneralesparamineralizarestetipo de compuestos.Por
una parte,una reducciónprogresivadel grupo nitro generalmentellevadaa cabo por
nitroreductasaspertenecientesa rutascentrales,que conducea la formaciónde aminasy
amoniaco.La otra alternativaconlíevala liberación de nitrito medianteunareacciónde
oxidación.Estosdosmecanismoscoexistenen una estirpede1’. pu/idaaisladaporZeyer
y Kearney(1984) ya queescapazde mineralizar2-nitrofenol,mediantela formaciónde
nitrito y catecol, y por otra parte es capaz de metabolizar3-nitrofenol liberándose
amonioen el proceso.
Actualmenteel conocimientoa nivel molecularde estetipo de rutascatabólicas
esmuy escaso,aunqueel aislamientode microorganismosdegradadoresde compuestos
nitroaromáticospermitiráel desarrollode estetipo de estudios.
3.2.1.4.Compuestosaromáticosazufrados
El azufreestápresenteen combustiblesfósilesen forma de azufrepirítico. tioles,
sulfUros, tiofenos, dibenzotiofenosy ácidos sulfónicos. La combustión de carbón y
petróleoda lugar, ademásde dióxido de carbonoy agua,a óxidos de azufrey nitrógeno
queson muy perjudicialesya que generan lluvias ácidasque ocasionangrandesdaños
en los ecosistemasvegetales.La reduccióndel contenidoen azufrey nitrógenoen este
tipo de combustibles por métodosquímicos y biológicos contribuiría a paliar este
problema. Existen varios procedimientosquimicos y microbiológicos para eliminar el
azufre inorgánico del carbón y petróleo (Monticello y Finnerty, 1985), pero el
verdaderoproblemalo planteael azufrequeformapartede los hidrocarburosaromáticos
que componenestos combustibles. Se han descritomicroorganismosy comunidades
microbianascapacesde oxidar selectivamenteel enlaceC-S facilitando la liberacióndel
azufreen formade sulfato,pero hastaahora,las rutascatabólicasimplicadas sólo sehan
estudiadoconcompuestosmodelo como el díbenzotiofenoy el ácido nafialen-sulfónico
(de Lorenzoy Rojo, 1994).
36
INTRODUCCIÓN
3.2.2. Ruta del catecol
Mediante las rutasperiféricasmuchosderivadosaromáticossetransformanen
catecolcomo metabolitointermediario,lo quejustifica que comúnmentese le denomine
“embudo catabólico” o “cuello de botella” de las rutas catabólicasde compuestos
aromáticos.Como ya seha mencionado,dependiendode la posiciónen la que se efectúe
la ruptura del anillo, el catecolserámineralizadopor la ruta ¡neta o la ruta orto (figura
1).
3.2.2.1.Ruta ¡neta
Un compuestoaromáticosigueuna ruta de degradaciónde tipo me/acuandola
rupturadel anillo se lleva a cabopor una extradiol dioxigenasa(tabla 5). En la figura 2
estánindicadasalgunasrutascatabólicasde tipo me/a.
Tabla5. Dioxigenasasimplicadasen la rupturadel anillo aromático
Familia Enzima Microorganismo Referencia
EXTRADIOL DIOXIGENASAS
Catecol 2.3.dioxigenasa 1
Protocatecuato 4.5-dioxisenasa
Catecol 2,3-dioxigenasa 1
2,3-Dihidroxibifenil dioxigenasa
1 .2-Dihidroxinaflaleno dio~cigenasa
Protocatecuato 4,5-dioxigenasa
Catecol 2,3-dioxigenasa fl
E. putida (TOL)
E. paucimobilis
JA putida
E.paucimobilis
.4. eutrophus
(Nakai y cols., 1983)
(Taira y cols., 1988)
(Harayama y Rekik, 1989)
(Neberty González, 1987)
(Kabischy Fortnagel,1990)
Homoorotocatecuato dioxipenasa
INTRADIOL DIOXIGENASAS
Catecol 1.2-dioxicenasa 1
Homoprotocatecuato dioxigenasa
Catecol 1 .2-dioxigenasa1
Catecol 1 ,2-dioxigenasa 11
(Clorocatecol 1 ,2-dioxigenasa)Protocatecuato 3,4-d¡oxigenasa
Esclierichia cali C
E. aeruginosa
Eseudomonas sp. PS 1
.4. calcoaceticus
(Roper y Cooper, 1 990a)
(Kukor y cola., 1988)
(vandaMeery cola., 199Ib)
(Hartnetty cols. 1990)
GENTISATO 1.2-DIOXIGENASA
Gentisato 1,2 dioxigenasa E. testosteroníE. acidovoran,
(Harpel y Lipseomb, t990a y b)
37
INTRODUCCIÓN
La extradiol dioxigenasamejor caracterizadaes la catecol 2,3-dioxigenasa1
(C2301) que estácodificadaporel genxylEy formapartede la ruta TOL de P. putid.a.
La C230 1 estáformadapor cuatro subunidadesidénticasde 32 kDa y contieneun
catión ferrosoen cadasubunidad.El productode la reacciónesel 2-hidroximucónico
semialdehidoo su alquilderivado, dependiendode si el sustratoinicial es catecol o
alquilcatecol, que esfácilmentedetectableporserde color amarillo. El rangode sustrato
de estaenzimaesbastanteamplio, oxida 3-metil-, 3-etil-, 4-metil- y 4-cloro-catecol.La
comparaciónde la secuencia de aminoácidosde la C230 1 de P. putida con la catecol
2,3-dioxigenasaIi de A. eutrophus sugiereque estasenzimasno derivan del mismo
origenpor lo queambasproteínasdebenpertenecera dossuperfamiliasdiferentes.
Los pasossiguientesa la nieta-escisiónen la ruta TOL puedenseguirdosramas
diferentesque convergenen el intermediario 2-oxopent-4-enoato(figura 4). La via
utilizada dependeráde si el semialdehido,productode la dioxigenasa,provienedel ni-
toluato o si proviene del benzoato o del p-metilbenzoato.En el primer caso, el
semialdehidocorrespondientees metabolizadomedianteuna hidrolasacodificada por
xy/Fmientrasque, en el segundocaso,la rutasiguela ramadel oxalocrotonatoen laque
intervienentres enzimas:la hidroximucónicosemialdehidodeshidrogenasa(XylG), la 4-
oxalocrotonatotautomerasa(XyIH) y la 4-oxalocrotonatodescarboxilasa(XylI). El 2-
oxopent-4-enoatoes posteriormentehidratadopor XyIJ y mediantela acción de una
aldolasa(XyIK) da lugar a acetaldehidoy piruvato que entran directamenteen el
metabolismointermediariode la célula(Marquésy Ramos,1993).
Otrasrutascatabólicasde tipo nieta como, por ejemplo,la ruta de degradación
de fenol de Pseudomonassp CF600 (Powlowski y Shingler, 1994) y la ruta de
degradaciónde naftalenode P. puada (Assindery Williams, 1988), siguenun esquema
similar al de la ruta TOL y seha demostrado,mediantetécnicasde hibridación de DNA
y comparaciónde secuenciasde aminoácidos,que algunasde las enzimascon función
equivalentepertenecientesa diferentes rutas procedende un gen ancestral común
(Williams y Sayers,1994).
38
INTRODUCCION
CH2OH
o xy/B
CHO
oCCC H
xy/G
xy/XYZ
o OH
COOH — COOH‘N~~ COOH
xy/H
COa~7~ xyl/
OHaCH300COOH COOH ~ COOH
+ —.4—.
R2CH2CHO HO xyIt/xy/K Ra
.tCYIG\
HOOC OHOH
¡ H
xyIL
OH
COOH0
N R xyIE
R1 COOH
Figura 4. Pasosenzimáticos de la ruta TOL. Los sustituyentesdel anillo aromáticopuedenser: R1 R2 = -H; R1 -CH3, R2 -H; R1 = H, R2= -CH3; R1 -C2H5, R2= -1-1. Los genes xy¡ del operón upper (xylCMABAI) y del operón me/a(xyIXYZLEGFJKJh’) codifican para las siguientes enzimas: XyIMA, xileno oxidasa;XyIB, bencil alcohol deshidrogenasa;XyIC, benzaldehidodeshidrogenasa;XyIXYZ,toluato 1 ,2-dioxigenasa;XyIL, dihidroxiciclohexadienodescarboxilasadeshidrogenasa;XyIE, catecol 2,3-dioxigenasa;XyIF, hidroximuconícosemialdehidohidrolasa; XyIG,hidroximucónico semialdehidodeshidrogenasa;XyIH, 4-oxalocrotonatotautomerasa;XylI, 4-oxalocrotonatodescarboxilasa;XyIJ, 2-oxopent-4-3-encatohidratasa;XyIK, 2-oxo-4-hidropentonatoaldolasa(Marquésy Ramos,1993).
CH3
Rí xy/MA
39
INTRODUCCIÓN
3.2.2.2.Rutaorto
Un compuestoaromáticosigueunaruta de degradaciónde tipo orto o ruta del
f3-cetoadipato cuando la ruptura del anillo es llevada a cabo por una intradiol
dioxigenasa.En la figura2 estánindicadasalgunasrutascatabólicasde tipo orto.
La familia de las intradiol dioxigenasasincluye tres tipos diferentesde enzimas
(tabla5): catecol1,2-dioxigenasa1 (C120 1), protocatecuato3,4-dioxigenasa(P340)y
catecol 1,2-dioxigenasaII (C120 11). Las dos primerassehan identificado en muchos
microorganismosque contienenla ruta or/o propiamentedicha como P. putí¿kz, P.
aeruginosa,P. cepaciay A. calcoaceticus(Aldrich y cols., 1987; Doten y cols., 1987;
Hartnett y cols., 1990; Neidle y cols., 1988). Estasenzimasestáncodificadasen el
cromosomaa diferenciade la C120 II pertenecientea la ruta orto modificadaque está
codificadaen un plásmido.
Las intradiol dioxigenasasutilizan Fe(III) como cofactor y se ha demostrado,
mediantela determinaciónde laestructuratridimensionalde la P340de 1-’. putida, queel
Fe(III) seune a la proteinapor dos residuosde tirosina y dos residuosde histidina
conservadosen todas las intradiol dioxigenasas.Los genesquecodificanparala C1201
(ca/A) y las dos subunidadesdiferentesde la P340 (pcaH y pcaG) se transcriben
separadamentedel restode los genesde la rutaorto. En la figura 5 se muestranlos pasos
enzimáticosqueconducenala formaciónde acetil-CoAy succinil-CoA.
El aislamientoy caracterizaciónde algunasbacteriascapacesde mineralizar
compuestosaromáticosdoradosderivados de benceno,benzoato y el ácido 2,4-
diclorofenoxiacéticodemostróla existenciade un grupo nuevode enzimasresponsables
de la metabolizaciónde estoscompuestosmedianteunavía orto que sedenominaruta
orto mod¿ficada(Ohosaly You 1988; Don y Pemberton,1981). La mayoría de ellas
conviertenlos derivadosaromáticosdoradosen clorocatecolesqueson susceptiblesa la
acción de las dioxigenasaspertenecientesal grupo de la de la C120 II. Las enzimas
implicadasen la mineralizaciónde clorocatecolespresentanunaespecificidadde sustrato
más amplia que las enzimasequivalentespertenecientesa la ruta orto no modificaday
40
NTROOUCCION
estáncodificadasen plásmidos(van der Meer y cols., 1992). Algunas rutas han sido
estudiadasen profundidad como la ruta de degradaciónde 3-clorobenzoatode
Pseudon,cn tas sp. 813 (Dom y cois. 1974) y la ruta de degradacióndel ácido
diclorofenoxiacéticocodificada por los genes <IdCDEJY en el plásmido pJP4 de A.
eu/¡-ophnsJMPI34(Kaphammery Olsen, 1990)(figura 2).
REGULACORES NOUOTORES GENES GENES NOUCYORES V1?fIDORES
4- Htdrozbonzooro
cao—
OH
poM
aLt4 Hidr&xibcn=ootó
006 ~. JOtA
—9 Ch.’
I tanA SC
OH beOiOoI(,
—¾ OH
000- ~ OH
Prolocotecuoto
000
000~~
8-celoodipoto
0
COY
pco6/Y
Croas
000
000~cao—
coiS
000COY
o—. -> Oto
pccC
~pcaD000~~
COY
L pocid
i~—ceroodipoto
o
Coo- [pocE
foo II
000~
4¡A- ceteodipoto Succ~n,I-Coh
tcetd -CoA
Figura 5. Ruta del »-cetoadipatopropuestoporParalesy I-Iarwood(1993).
deA. calcoacelicusy P pulido.. Esquemade la ruta
000~
Bon,ooto
000~~
co/A
~— COY
cao—
PeoR
C0CY
COY
~eonoToC~5,C’S- Mv
CotR
Y coi~C
41
INTRODUCCIÓN
3.2.3. Ruta dcl gentisato
El gentisatoes un metabolito dihidroxilado intermediario de algunasrutas de
degradaciónmicrobianade compuestosaromáticoscomoel antranilato(Ladd , 1962),g-naftol (Walker y Lippert, 1965)> 3- y 4-hidroxibenzoato(Crawford, 1975), salicilato
(Crawfordy cols., 1975), flavonas(Tomaseky Crawford, 1986), nafialenodisulfonato
(Whittich y cols., 1988),m-cresol,2,5- y 3,5-xilenol (Hoppery Chapman,1970).En el
primerpasodeestaruta catabólica(figura 1) intervienela gentisato1,2-dioxigenasaque
provoca la aperturadel anillo aromático dando lugar a maleilpiruvato que puede
degradarsedirectamentepor el metabolismointermediariomicrobiano o transformarse
previamenteen flimarilpiruvato medianteuna reacciónde isomerización.La gentisato
1,2-dioxigenasase ha purificado de P. acidovorans y 1>. testosteroni (Harpel y
Lipscomb,1990a)y sehademostradoquecontienecuatrosubunidadesidénticasy utiliza
Fe <II) como cofactor igual que las extradiol dioxigenasas,aunqueel mecanismode
acciónde ambosgruposde enzimasesdiferente(Harpely Lípscomb, 1990b).
3.2.4.Regulacióndelas rutascatabólicasdecompuestosaromáticos
La expresiónde los genesquecomponenlas rutascatabólicasestácontroladapor
proteínasreguladorasespecificas.Deestaforma, los microorganismosproducenenzimas
para utilizar diferentes Ihentes de carbono, nitrógeno y fósforo degradándolas,
solamente,cuandono existeen el medio otro compuestomás fácilmentemetabolizable.
Estemecanismosuponeun ahorrode energíaen el metabolismomicrobiano.
La mayoríade las rutascatabólicasde compuestosaromáticos estánreguladas
positivamente.Generalmentelas proteínasreguladorasseunena un efectoro coinductor
e interaccionancon la regiónpromotorade los operonescatabólicosa los que regulan
favoreciendo su transcripción. Actualmentese ha caracterizadoun gran número de
proteínasreguladorasde estetipo de rutas. El sistemamásestudiadoesel formado por
las proteinasXyIS/XylR que regulan coordinadamentela expresión de los operones
upper y nieta de la ruta TOL de P. putida (Marquésy Ramos, 1993). La figura 6
muestra el modelo de la regulación de esta ruta. Los dos genes reguladoresestán
42
INTRODUCCIÓN
situadosen una posiciónadyacenteuno del otro en el extremo3~ del operónme/ay se
transcribendivergentementemediantelos promotoresPr en el caso de xy/R y LS en el
casode xy/S.XylR esuna proteínade 566 aa (67 kDa) que pertenecea la familia de
reguladoresNtrC (Inouye y cols., 1988). El gen xylR se expresaconstitutivamentey
respondea la presenciade xileno activandola transcripcióndel operón uppery xylS, en
presenciadel factor&~ (RpoN)de la RNA polimerasa y, parael casodel operónupper,
la proteinareguladora ll-IF (Kóhler y cols., 1989, HolteL y cols., 1990, de Lorenzo y
cols., 1991).
toluoto
_______ stPu xyl CMABN Pm xyl XYZLTEGFXJQKIH
+
£
y
~sPrzyIR
t —
ea¿aaRpoN
u
x ¡ lera
Figura 6. Regulación de la ruta TOL de P putida. Símbolos: O, forma inactiva deXyIR incapazde estimulareficientementela transcripcióna partir de Pu y Ps; U, formaactiva de XyIR que i) autorreprimesu propia síntesis,u) en presenciadel factor detranscripcióna 54ó proteínaRpoN (@) estimula la transcripcióndel gen xyIS, y iii) enpresenciade RpoN y de la proteína II-IP (•) estimula la transcripcióndel operónupper; A, forma inactivade XyIS que a baja concentraciónno es capazde activar alpromotorPm; A, forma activa de XyIS que estimulala transcripcióna partir de Pm +
estimulaciónde la transcripción; - , inhibición de la transcripción(Marquésy Ramos,1993).
RpoN
u
43
NTRODUCCIÓN
La familia de reguladoresNtrC se caracterizapor estarestructuradaen cuatro
dominios (A, B, C y D), tres de los cualesestánaltamenteconservadosentre los
miembrosde estafamilia. El dominio D estásituadoen el extremoC-terminal de estas
proteínasy presentaun motivo de hélice-giro-héliceresponsablede la unión de la
proteínareguladoraal DNA. El dominio C es la región másconservaday secreeque es
la responsablede la interacciónde estasproteínascon la RNA polimerasapermitiendola
formacióndeun complejo abiertode transcripción(Kustu y cols., 1991). El dominio 13
comprendeuna región hidrofilica muy cortaque actuaríacomo sistemade unión entre
los dominiosC y A. Porúltimo, el dominio A pareceestarimplicado en la recepciónde
la señalactivadora,bien sea una señal mediadapor una proteina como en el sistema
NtrC/NtrB (Ninfa y cols., 1988) o bien una señal mediadapor un compuestoquimico
como en el casode XyIR. El dominio A constituyeel N-terniinal de estasproteínasy es
el menosconservadoen estafamilia.
Además de XyliR, existen otros miembros de esta familia implicados en la
regulaciónde las rutas catabólicasde derivadosaromáticoscomo, por ejemplo, las
proteínas DmpR y PhhR pertenecientesa la rutas de degradaciónde fenol de
PseudomonasCF600 (Shingler y cols., 1993) y de P. putida P35X, respectivamente
(Ching y cols., 1995). El porcentajede identidad que presentanestastres proteínases
superioral 60%(Chingy cols., 1995).
La activaciónde la transcripcióndel operónmeta estámediadapor la proteína
XyIS que sehiperproducecomo consecuenciade la activaciónprovocadaporXyIR o se
activa independientementede XyIR en presencia de benzoato o determinados
alquilbenzoatosque actúan como efectores(Inouye y cols., 1987; Mermod y cols.,
1987;Ramosy cols., 1986). XyIS esunaproteínade 321 aa(36kDa) quepertenecea la
familia de reguladoresAraC (Gallegosy cols., 1993). Algunos de estosreguladores
(RhaR,RhaS,MeIR, MaC y XyIS) estánimplicadosen el catabolismode ciertasfUentes
de carbonocomo la ramnosa,la melobiosa,la arabinosay los alquilbenzoatos(Tobin y
Schleit 1987 y 1990; Webster y cols., 1989; Miyada y cols., 1990; Stoner y Schleit
1982; Lei y cols., 1985). Otros regulan la expresión de factores de virulencia en E. coli
(Rns) (Caron y cols., 1989) y Yersiniaeníerocolitica(VirF) (Comelis y cols., 1989). La
44
INTRODUCCIóN
mayoria de ellos son reguladores positivos excepto CeID que actúa como represor del
operón ceIABCFde E. cdi (Parker y Hall, 1990). Estas proteinas reguladoras están
estructuradas en dos dominios el C-terminal y el N-terminal. En el C- terminal existe un
motivo característico de hélice-giro-hélice responsable de la unión de la proteína al DNA.
Este dominio está muy conservado en toda la familia lo que ha permitido diseñar una
secuencia consenso que caracteriza a la familia (Gallegos y cols., 1993). El dominio N-
terminal no está conservado y se cree que, en el caso de los reguladores implicados en el
metabolismo de fluentes de carbono, es el responsable de la unión al efector (Ramos y
cols., 1990).
Otra familia de reguladores muy frecuentes en este tipo de rutas catabólicas son
los pertenecientes a la familia de reguladores LysR (Henikoff y cols., 1988; Schell,
1993). Normalmente codifican para proteínas activadoras de la transcripción excepto
catM (Neidle y cols., 1989) que actúa como represor. La mayoría de estos genes tienen
un tamaño aproximado de 1 kb y se transcriben en sentido contrario al gen u operón al
que regulan (Schell, 1993). En la región N-terminal de los miembros de esta familia
existe un motivo de hélice-giro-hélice, característico de proteínas que se unen a DNA,
que está conservado en la mayoría de los miembros de esta familia. Estas proteínas
necesitan un coinductor para activar la transcripción pero se unen al DNA diana
independientemente de la presencia del coinductor. La tabla 6 muestra algunos ejemplos
de proteínas reguladoras implicadas en el catabolismo de derivados aromáticos
pertenecientes a esta familia.
Tabla 6. Familia de reguladoresLysR.
Froleinas Origen Ruta catsbólles Colnduetor Refeniwia
NahR plásn,ido NAH7 deP. putida nattaleno/salieilato salicilato (Schell, 1985)
CatR P. putida benzoato cis-cis-nxuccuato (Rothmel y cols., 1990)
CatM .4. calcoacé ricos benzoato cis-cis-muconato (Neidie y cols., 1989)
Tfds
TcbR
plásmido pJP4 deA. eurrophus
Pseudo,nonas sp. estirpe PSI
diclorofetioxiacetatoclorodienlactonaclorobenzoato
cloromaleilacetato
3-elorobonzoato
(Kaphanunery Olsea, t990)
(vander Meery cois., 199ta)
CIcR plásmidopAC2SdeP. vuuda clorocatecol clorocatecol (Cocoy cols., 1993)
45
INTRODUCCIÓN
4. AMPLIACIÓN DIRIGIDA DE LA CAPACIDAD BIODEGRADATIVA
BACTERIANA
Como se comentó en el apanado 2., la caracterizaciónexhaustivade las rutas
metabólicasmicrobianaspara la mineralización de compuestosaromáticos,permite la
utilización de técnicas de ingeniería genéticapara la ampliación de la capacidad
biodegradativa de los microorganismos. Esta aproximación experimental puede
abordarsepor distintasvías; poruna parte,desdeel punto de vista cuantitativo,puede
mejorarse la actividad catalitica de cienos sistemas enzimáticos incrementandola
transcripcióna partirde los promotoresnativosmedianteel uso de proteínasreguladoras
mutadas,aumentandoel nivel de traduccióno actuandoglobalmentesobrelos circuitos
reguladoresde la ruta (Ramosy cols., 1988; Timmis y cols., 1994). Desdeel punto de
vistacualitativo, las rutasmetabólicaspuedenmejorarsemediantela variacióncontrolada
de la estabilidad y la actividadcatalítica de las enzimasque componenla ruta, la
construcciónde enzimashibridas con amplio rango de sustratoo el aislamiento de
mutantescon enzimas reguladorasmodificadasque permitan aumentarel rango de
efectoresqueactivenla ruta(Timmisy cols., 1994).
Otra forma de ampliarla capacidadmetabólicade unabacteriaesla construcción
de nuevas rutas mediante el ensamblajede genes provenientes de diversas rutas
catabólicasde otrasbacteriasde forma que, en conjunto, se componencomouna ruta
coordinada (de Lorenzo y Rojo, 1994). Generalmente,las rutas metabólicas de
hidrocarburosaromáticosconvergen,medianterutas periféricas, en un intermediario
metabólicocomo el catecolo el gentisato(ver apanado3.2.).Esta estructuramodular
permite la combinación de diferentes módulos bioquimicamente compatibles que
posibiliten la canalización de nuevos sustratoshacia rutas metabólicascentrales.
Dependiendode si los nuevos compuestos metabolizablesson o no análogos
estructuralesdel sustratoque originalmente el microorganismopodía metabolizar,la
expansiónde la capacidadbiodegradativade una ruta metabólicapuedeser lateral o
vertical (Timmis y cols., 1994). Un ejemplo clásico de estetipo de estrategiases la
expansiónde la ruta de degradaciónde 3-clorobenzoatode Pseudomonassp.B13. Este
microorganismocontieneuna ruta de tipo orto parala degradacióndebenzoatoy una
46
INTRODUCCIÓN
ruta orto modificada para la degradación de 3-clorobenzoato, pero no es capaz de
mineralizar 4-clorobenzoato o mezclas de alquil- y halobenzoatos (Dom y cols., 1974).
Sin embargo, Pseudomonassp. FRI (pFRC2OP), una cepaderivadade Pseudomonas
sp.B13 que fUe construida mediante el ensamblaje de genes de diferentes
microorganismos, es capaz de mineralizar estos compuestos (Rojo y cols., 1987).
La liberación al medio ambiente de microorganismos modificados genéticamente
(MlvIGs) para su utilización en la descontaminación de suelo, aguas subterráneas, o en
plantas de tratamiento de aguas residuales, plantea el problema de la predictibilidad del
impacto ecológico que tendrán las bacterias recombinantes en el medio en que se
introducen así como los posibles riesgos para la salud humana y animal (de Lorenzoy
Rojo, 1994). La evaluación de riesgos requiere el estudio de sistemas modelo o
microcosmos, que simulen el nicho ecológico en el que las cepas recombinantes están
destinadas a actuar. El microcosmos debe ser diseñado de forma que se puedan controlar
diferentes parámetros como la capacidad de los MMGspara sobrevivir y multiplicarse, la
estabilidad del material genético introducido, la capacidad de los MMGspara llevar a
cabo la fUnción para la cual habían sido construidos o la transferencia genética del
material introducido en los MMGsa otros microorganismos que comparten el
microcosmos (Ramos y cols., 1994). Por tanto, los MMGsdestinados a aplicaciones
medioambientales deben presentar ciertas propiedades que complican significativamente
su manipulación genética en comparación con los MN’IGs de uso exclusivo de
laboratorio, La mayoría de las bacterias recombinantes contienen marcadores de
resistencia a antibióticos, por lo que la liberación de este tipo de bacterias está prohibida
por la mayoría de las normativas vigentes en los países de nuestro entorno (de Lorenzo y
Rojo, 1994). Por ello se han desarrollado nuevos sistemas de selección inocuos desde el
punto de vista medioambiental como, por ejemplo, resistencias a herbicidas y metales
pesados (Herrero y cols., 1990; de Lorenzo y cols., 1990). Estos marcadores están
incluidos en vectores-transposones, siendo los más utilizados los mini-transposones
derivados de TnS (Herrero y cols., 1990). Otra alternativa consiste en utilizar
anticuerpos monoclonales como marcadores de selección que reconozcan epitopos de la
superficie celular de la bacteria recombinante en estudio, Este sistema es muy sensible y
permite la identificación de los MMGsin si/u (Ramos y cols., 1994).
47
INTRODUCCIÓN
Por último, es importante resaltar los trabajos que actualmente se están
desarrollando en sistemas de contención biológica, consistentes en el diseño de circuitos
genéticos que permiten la expresión de un gen tóxico cuando el MMGno se encuentra
bajo las condiciones de crecimiento preestablecidas (Molin y cols., 1987; Knudsen y
Karlstróm, 1991; Ramos y cols., 1994). Con estos sistemas se pretende evitar la
proliferación incontrolada de los MMGsfUera del nicho ecológico para los que fUeron
diseñados o cuando el compuesto tóxico ya ha sido eliminado. Asimismo, también han
sido diseñados recientemente sistemas de contención genética que reducen la posible
transferencia genética horizontal del material recombinante a la población nativa de
microorganismos (Diaz y cols., 1994).
5. LAS ENTEROBACTERIASY LA BLODEGRADACIÓN DE COMPUESTOS
AROMÁTICOS
Las Enterobacteriasconstituyenuno de los gruposmayoresy mejor definidos
entre las Eubacterias Gram-negativas no fotosintéticas. Son bacterias de forma bacilar
recta o curva cuyas dimensiones oscilan entre 0,3-1,0 x 1,0-6,0 ¡-im (Brenner, 1984). Las
especies pertenecientes a ciertos géneros son inmóviles mientras que otras se mueven
mediante flagelos perítricos. Se distinguen del resto de las Bubacterias Gram-negativas
de estructura similar por ser anaerobios facultativos. En condiciones anaeróbicas
obtienen energía por fermentación de carbohidratos mientras que, en condiciones
aeróbicas, pueden utilizar una amplia gama de compuestos orgánicos como, por ejemplo,
ácidos orgánicos, aminoácidos y carbohidratos (Stanier y cols., 1986). La consideración
de la inserción flagelar como un carácter taxonómico ha impedido la inclusión en el
grupo entérico de algunas bacterias acuáticas muy relacionadas con las enterobacterias,
como las pertenecientes a los géneros Vibrio, Aeromonas,Beneckeay Photobacterium.
Estas bacterias presentan flagelos polares o inserción flagelar mixta y son oxidasa-
positivos a diferencia de los miembros del grupo entérico (Stanier y cols, 1986). En la
figura 7 se muestra un esquema simplificado del porcentaje de similitud entre el DNAde
los géneros de la familia Enrerobacter¡aceae(Brenner, 1984).
48
INTRODUCCIÓN
~5oijj 70-100 J~efIa
40-50
[jjrotocíer 30 60 ]Zie(1a~~~3O~4O [jotacter 40 50 IEitc ¡¡a
LEEd Li] 1141110 20 20
15 10 15
Edila 1540113 111
Figura 7. Porcentaje de similitud a nivel de nucleátidos entre los miembros de lafamilia Enterobacteriaceae.
Eseherichia coil es el representante clásico de las enterobacterias (Brenner,
1984). Este microorganismo forma parte de la flora intestinal habitual de los mamíferos,
aunque algunas estirpes patógenas causan infecciones intestinales y del tracto urinario.
Además, esta bacteria está presente en el suelo y en ciertos ambientes acuáticos como
consecuencia del tratamiento del suelo con estiércol y del vertido de aguas residuales
urbanas (Cies!ak y cols., 1993; Tsai y Olson, 1992; Manja y cols., 1992). Los géneros
Sah-nonella y Shigella están constituidos por bacterias patógenas responsables de
infecciones intestinales como la disentería bacilar, la fiebre tifoidea y la intoxicación
alimentaria bacteriana (Schaechter y Neidhardt, 1987). Dada la importanciaclinica de
estos géneros se han hecho subdivisiones intraespecificas muy minuciosas en base al
49
INTRODUCCIÓN
estudio inmunológico de las superficies celulares (Brenner, 1984). Los géneros
Enterobacter,Serratia, Erwinia, y Proteusestán muy relacionados con los anteriores
pero su hábitat es diferente, ya que principalmente están presentes en el suelo y en
algunos ambientes acuáticos. Las especies pertenecientes al género Erwinia son
patógenos de plantas. Algunas bacterias patógenas de animales clasificadas
antiguamente dentro del género Pasteurellase incluyen actualmente dentro del género
Yersinia. Entre las especies que componen este género la más conocida es Y pestis el
agente causal de la peste bubónica que se caracteriza por ser una infección muy diferente
a las infecciones entéricas desde el punto de vista de la sintomatología que provoca y del
mecanismo de transmisión (Stanier y cols., 1986).
No cabe duda de que E. coli es un microorganismo paradigmático que ha servido
como herramienta para el estudio y desarrollo de la Biología Molecular. Ya desde
principios de siglo fUe elegido por los fisiólogos para sus investigaciones, debido a su
capacidad de crecer rápidamente en medios simples. A finales de 1930, las
investigaciones realizadas por Wollmans y Bronfenbrenner sobre los bacteriófagos de E.
coli, determinaron el establecimiento definitivo de esta bacteria como modelo de estudio.
Actualmente el conocimiento de esta bacteria a nivel molecular es mayor que el de
cualquier otro organismo unicelular. De hecho, en el año 1987 aproximadamente un
tercio de los productos génicos de estabacteriahabíansido estudiadosen detalledesde
el punto de vista bioquímico y sus genes habian sido identificados (Schaechter y
Neidhardt, 1987; Bachmann, 1990).
5.1. La capacidadbiodeeradativa de E. coil
E. coli presenta un alto grado de adaptabilidad al medio ambiente, propio de las
bacterias que compiten por los nutrientes con otros microorganismos en un mismo nicho
ecológico. Por ejemplo, ante ciertos estímulos como e! aumentoen la concentraciónde
nutrientes en el medio de cultivo, estemicroorganismopuedevariar en segundosla fase
de crecimientodesdefaseestacionariahastafaseexponencial(Schaechtery Neidhardt,
1987). Por otra parte, E. cok puede degradar una amplia gama de compuestos orgánicos
como diferentes azúcares, polioles y ácidos orgánicos utilizándolos como frente de
50
INTRODUCCIÓN
carbono, lo que favorece la adaptación de este microorganismo a nichos ecológicos con
diferente composición química (Lin, 1987). Sin embargo, resulta sorprendente que
siendo E. coli la bacteria mejor estudiada bioquimica y genéticamente no se haya
analizado, hasta hace relativamente poco tiempo, su capacidad para degradar
compuestos aromáticos. Aunque el número de trabajos en este sentido es aún escaso, se
sabe que algunas cepas de E. coli poseen rutas tan complejas como las descritas en otros
microorganismos para mineralizar distintos derivados bencénicos como los ácidos
fenilacético (PA), 3- y 4-hidroxifenilacético (3- y 4-HIPA), homoprotocatéquico (HPC),
3-fenilpropiónico (HCA), 3-(3-hidroxifenil)propiónico(MHP), 3-hidroxicinámicoy 2-
feniletilamina (Coopery Skinner, 1980; Burlingamey Chapman,1983; Cooper y cois.,
1985). Otras enterobacteriasque poseen rutas catabólicasde este tipo son K.
pneumomae,quepuedemineralizar3- y 4-hidroxibenzoatoasícomo 3-y 4-UPA (Suárez
y cols., 1991; Martin y cols., 1991), y algunasespeciesdel géneroSerrada quepueden
utilizar como única fUente de carbono benzoato, benzilformato, 3- y 4-hidroxibenzoato y
PA (Brenner, 1984).
No todas las estirpes de E cokpueden catabolizar los mismos sustratos (tabla 7).
Por ejemplo, la estirpe K-12 puede metabolizar el PApero no el 3- y 4-HIPA, a diferencia
de la estirpes B y C que sólo pueden mineralizar los hidroxiderivadosdel PA. La estirpe
Wpuede degradartanto el PA como el 3- y 4-1-IFA así como todos los derivados
aromáticos que han sido estudiados hasta ahora, por lo que parece estar especialmente
capacitadaparala mineralizaciónde estetipo de compuestos(Burlingamey Chapman
1983). Esta estirpe posee una enzima denominada penicilina G acilasa (PGA) capaz de
hidrolizar el resto PA de la molécula de penicilina O, liberando ácido 6-amino
penicilánico que es la base de las penicilinas senaisintéticas (Cole, 1964). La PGAha sido
muy estudiada en la industria para la producción de antibióticos ¡3-lactámicos siendo una
de las pocas enzimas que actualmente se emplean en procesosindustriales de
biotransformación (Valle y cols., 1991). Además de la penicilina O estaenzimapuede
hidrolizar otras amidas y ésteres del PA, 4-HiPA y de otros compuestos aromáticos
(Margolin y cols., 1980; Roa y cols., 1994; Duggleby y cols., 1995)por lo que se ha
especulado que su fUnción debe estar relacionada con la posibilidad de hidrolizar
compuestos que puedan ser posteriormente utilizados como fUente de carbono (Valle y
5’
INTRODUCCIÓN
cols. 1991). El mecanismo de regulación de la acilasa apoya esta hipótesis ya que su
producción está sujeta a represión catabólica y se induce por PA y otros derivados
aromáticos relacionados con éste (Merino y cols., 1992; Vandame, 1985). Existen otras
enterobacterias que poseen PGAcomo Kluyvera citrophila ATCC21285 y Proteus
reageri ATCC 31052 (Barbero y cols., 1986; Daumy y cols., 1985) pero, sin duda
alguna, la acilasa mejor caracterizada es la de la estirpe Wde E. coli ATCC 11105.
Tabla 7. Estirpes de E. coil que metabolizan compuestos aromáticos
EstirpeB C Ml K-12 NTCTCS928 A¡slados clínicos
Númeroexaminado 2 9~28 1 2~ 27
Fenilacetato + +
3-Hidroxifenilacetato + + +
4-Hidroxifenilacetato
3-Fenilpropionato +
3-(3-Hidroxifeniflpropionato + * + + 4 +
3-Hidroxifenilcinamato + + + * + * + +
5.1.1.Rutas catabólicasde compuestosaromáticos de E .coIi
Los primeros trabajos sobre rutas catabólicas de aromáticos de E. coli frieron
realizados en 1980 por Cooper y Skinner. Mediante la identificación de intermediarios
catabólicos en extractos crudos de células de la estirpe C de E. cok incubadas en
presencia de los ácidos 3- y/ó 4-HPA y la caracterización bioquímica de las enzimas
implicadas, propusieron una ruta metabólica de ruptura meta para la degradación de 3- y
4-NIPA. El primer paso de la ruta consistiría en una hídroxilación del sustrato para dar
52
INTRODUCCIÓN
lugar en, ambos casos, al HPC, por lo que demostraron que ambas rutas están
conectadas en esta estirpe. Durante los últimos quince años se ha caracterizado
bioquimicamente y donado ~osgenes (Jipe) de la ruta de degradación nieta del HPCde
E. cokC, aunque el mapa de restricción así como el orden de transcripción de los genes
de la ruta no han sido determinados hasta 1993 por Roper y cois., (figura 8) (Cooper y
Skinner, 1980; Garrido-Pertierra y Cooper, 1981; Skinner y Cooper 1982; Jenkins y
Cooper 1988; Ferrer y Cooper, 1988; Fawcett y cols., 1989; Roper y Cooper, 1990a, b;
Roper y Cooper, 1993; Roper y cols., 1995)
hpcR hpcE hpcC hpcB ApeO hpeG
CEnAS HPCdeshidrogenasadioxigenasa
hpcH
CI-IM-isomerasa
w1 kb
Figura 8. Orden de transcripción de los genes de la ruta catabólica delhonioprotocatecuatodc E. cotí C. Esta ruta está compuesta por el gen regulador Jipe]?y el operón me/a(hpcECBDGA9.Las flechas indican la dirección de transcripción de losgenes. Los genes hpc codifican para las enzimas que aparecen en la parte inferior de lafigura. Abreviaturas: HPC, homoprotocatecuato; CI-IMS, 5-carboximetif-2-hidroxi-mucónico semialdehido; CHM, 5-carboximetil-2-hidroxi-muconato; OPET, 5-oxo-pent-3-en- 1 ,2,5-tricarboxilato; OHED, 2-oxo-hept-3-en-1 ,7-dioato; HHED, 2,4-dihidrox,-hept-2-en-l,7-dioato (Ropery col., 1993).
Represor OPETdescarboxilasa
OREO Fil-LEOhidratasa aldolasa
53
INTRODUCCIÓN
La ruta catabólica del PA no ha sido prácticamente estudiada. En 1985> Cooper y
cols. aislaron una serie de mutantes de E. col) K-12 incapaces de metabolizar e] PA y
localizaron los genes implicados en esta ruta metabólica en el minuto 30,4 del
cromosoma de E. col) K-12. Se ha demostrado bioquimicanaente que la ruta de
degradación de 2-feniletilamina está relacionada con la ruta del PA, ya que esta amina se
transforma en fenilacetaldehido mediante una amina oxidasa dependiente de cobre y
posteriormente en PA mediante una deshidrogenasa, por lo que aparentemente las rutas
de degradación de la 2-feniletilamina y del PA podrian estar relacionadas (Parrot y cols.,
1987; Cooper y cols., 1992). Por otra parte, se ha demostrado la existencia de una
fenilacetil-CoA ligasa en E. col) Winducible por PA que podria estar involucrada en la
ruta catabólica de este compuesto, activando el anillo aromático mediante
tioesteriflcación, de igual forma que otras acetil-CoA ligasas implicadas en las rutas
catabólicas de derivados aromáticos de microorganismos, generalmente, anaerobios
(Vitovski, 1993).
La ruta catabólica del UCA fije caracterizada bioquimicamente en 1983 por
Burlingame y Chapman. Posteriormente, mediante el aislamiento de mutantes incapaces
de metabolizar el HCA, estos autores determinaron los pasos enzimáticos de la ruta de
degradación del HCAy del MHIP de E. coli K-12 (figura 9) (Burlingame y cols., 1986).
Esta ruta sigue un mecanismo similar al de las rutas de ruptura me/a descritas en otros
microorganismos para la degradación de otros hidrocarburos aromáticos (ver apartado
3.2.2.1.). Actualmente se han localizado en el minuto 8 del cromosoma de E. coiz K-12
los genes que codifican para las tres primeras enzimas de la ruta de degradación del
MIHIP, la MHP-hidroxilasa (mhpA), la 3-(2,3-dihidroxifenil)propionato1,2-dioxigenasa
(mhpB) y la 2-hidroxi 6-cetononadienedionatohidrolasa (mhpC) (figura 9) y se han
donadoe hiperexpresadolos genesmhpB y mhpC(Bugg, 1993). La comparación de la
secuenciadel extremoN-terminal de la 1 >2-dioxigenasaMhpB indica que estaenzima
puedeestar relacionadacon la catecol2,3-dioxigenasaII de A. eutrophus(Kabisch y
Fortnagel,1990).
54
INTRODUCCIÓN
HcoA
000 H
OH~ -41~ OH
H
HcaB
COOH
MhpA OH
‘~‘- OH2,3-DHP
lv
MhpR
000H
O00019
—> OH
Mh~C¡~
00019
VII0195
O 19
00019
CH~ ~
Ix x
MhpE CO OH
HO O
VIII
Figura 9. Ruta de degradación del ácido 3-fenlipropiónico y del ácido 3-(3-hidroxifenil)propiónicodc E. coIi K12. Los metabolitosson los siguientes: ácido 3-fenlípropiónico (HCA) (1), cis-3-(3-carboxietil)-3,5-ciclohexadieno-l,2-diol (II), ácido 3-(3 -hidroxifenil)propiónico (MA-IP) (III), ácido 3-(2,3-dihidroxifenil)propiónico (2,3-DHP) (IV), ácido 2-hidroxi-6-cetononadienodióico (y), ácido 2-ceto-4-pentenoico(enol) (VI), ácido succinico (VII), ácido 4-hidroxi-2-cetovalérico (VIII), acetaldehido(IX), ácido pirtivico (X). Denominación de las enzimas implicadas en la ruta: dioxigenasaHcaA, deshidrogenasa HcaB, hidroxilasa MhpA, dioxigenasa MhpB, hidrolasa MhpC,hidratasa MhpD, aldolasa MhpFi (Bugg, 1993).
LeCH
H CA
00019
OHMHP
III
000192
MhpD 00019
OH
VI
55
INTRODUCCION
5.2. Fuentesnaturales de los comnuestosaromáticos metabolizablespor E. cotí
Para poder establecer una hipótesis sobre el posible papel fisiológico de estas
rutas en un organismo como E. cok,es necesario conocer las &entes naturales de las que
provienen tos compuestos aromáticos que este microorganismo puede nietabolizar.
Comose mencionó anteriormente, E. cok forma parte de la flora intestinal del hombre y
otros mamíferos y, por tanto, no sería extraño que estos compuestos estuvieran
presentes en el hábitat intestino/fecal. Se ha planteado la hipótesis de que E. col) utiliza
estos compuestos cuando están presentes en el medio y no hay un sustrato más
fácilmente metabolizable, lo que justifica que las rutas sean inducibles y que algunas de
ellas estén sujetas a represión catabólica (Valle y cols., 1991).
Los derivados aromáticos metabolizables por E. col) no pueden ser considerados
como agentes xenobióticos, ya que están presentes en la Biosfera como compuestos
naturales y de hecho existen otros microorganismos que contienen rutas metabólicas para
su completa mineralización (tabla 8). E! ácido cinámico e hidroxícinámico son
metabolitos centrales implicados en la síntesis de compuestos fenólicos en plantas, y se
encuentran en la mayoria de los vegetales como ácidos conjugados en forma de ésteres o
como ácidos libres, La reducción del doble enlace del sustituyente alifático del ácido
cinámico da lugar al HCA, por lo que este compuesto también puede aislarse en
extractos vegetales (Martinez y cols., 1992; Elder y Kelly 1994). Por tanto, este tipo de
compuestos aparece de forma natural en los alimentos de origen vegetal como, por
ejemplo, frutas y hortalizas (Li y cols., 1993). También se ha detectado la presencia de
PA y MHP en champiñones, ciruelas, calabacines, pimientos verdes, tomates y
berenjenas (Chen y Wu, 1984, Heimhuber y Herrmann, 1990). En muchas ocasiones,
este tipo de compuestos son los responsables del sabor y el aroma de ciertos alimentos
como por ejemplo el de la miel. De hecho, la presencia o ausencia del PA y del HCAen
este alimento se ha utilizado como parámetro para la identificación de diferentes tipos de
miel (Steeg y Montag, 1988).
56
INTRODUCCIÓN
Tabla 8. Bacteriasque metabolizan4-HPA
Bacteria
Acinetobactersp.
Bacillus brevis
B. stearotherrnoplzllus
E. coli (30aisladosclínicos)
E. coli B
E. cali C
E. cali W (ATCC 9637, ATCC 11105)
Fla,’obacteriurn sp.
K. pneumoniae M5a1
P. acidovorans
E. olalis
P. pulida
E. purida T
R puadaU (NC~ 10015)
Pseudornonassp.
Bacteriade suelo
(Spaminsy cols., 1974)
(Quey cols.,1981)
(Janialuddin,1977)
(Burlingamey Chapinan,1983)
(Coopery Skinner,1950)
(Coopery Skinner,1980>
(Coopery Skinner>1980>
(van denTwecl y cols., 1988)
(Grant, 1967)
(Harelaudy coN., 1975)
(Adachl y coN., 1964)
(Rajuy cols., 1988)
(Spaminsy coN., 1974)
(Spaminsy cols., 1974)
(Blakleyy cols.,1967)
(Blakley1972)
Se ha demostrado que el PA, HCA, MI-IP, HPC, 3- y 4-NIPA y algunos derivados
de éstos, son productos intermediarios del metabolismo de aminoácidos aromáticos en
organismos superiores y en bacterias (Samid y cols., 1994; Spoelstra, 1978; Sparnins y
Chapman, 1976>. Por otra parte, el 4-HPA y HPCse producen como consecuencia del
metabolismo bacteriano de aminas simpaticomiméticas como la sinefrina que está
presente en ciertas plantas en grandes cantidades (Devi y cols., 1975). El hecho de que
estos productos se acumulen durante procesos metabólicos microbianos, justifica su
presencia en alimentos cuya elaboración conlíeva procesos fermentativos. Por ejemplo,
se ha detectado la acumulación de PA durante la maduración de licores y vinos, siendo
uno de los componentes responsables del sabor y aroma de estas bebidas (Kepner y cols.,
Referencia
57
INTRODUCCIÓN
1968; Gianotti y Stefano, 1991; Yayas y Rapp, 1992). También se ha identificado el PA
entre los componentes volátiles responsables del sabor del vinagre (Kubota y cols., 1989)
y como producto de la descomposición de la fenilalanina en la elaboración del queso
(Lee y Richard, 1984).
La presencia de este tipo de compuestos en el hábitat intestino/fecal no procede
sólo del apode alimenticio, sino también del metabolismo de la flora intestinal. En este
sentido, se ha demostrado la presencia de PA, HCA, MI-IP y 4-NIPA en estiércol
procedente de granjas dedicadas a la cría del ganado porcino. Estos compuestos se
producen como metabolitos del catabolismo de la tirosina de microorganismos que
forman parte de la flora intestinal (Spoelstra, 1978).
El PA y sus derivados hidroxilados están presentes habitualmente en cerebro,
tejidos periféricos y fluidos corporales de mamiferos como consecuencia del
metabolismo de las aminas simpaticomiméticas tiramina y 2-feniletilamina, las cuales se
originan a partir de la L-fenilalanina y la L-tirosina (Saavedra, 1989). La toxicidad del
PA y sus derivados en humanos es dosis-dependiente. En condiciones normales, la
concentración de estos compuestos en tejidos humanos es muy baja, sin embargo, en
procesos patológicos como la fenilcetonuria provocada por una deficiencia en la enzima
L-fenilalanina hidroxilasa, los niveles de estos compuestos se elevan considerablemente
provocando daños en el sistema nervioso central y retraso mental en niños (Thibault,
1994). No obstante, desde el punto de vista farmacológico, a la dosis adecuada el PA,
HCA y algunos derivados de éstos se comportan como agentes anticancerígenos y
analgésicos (Samid y cols., 1994; Adanas, 1992).
Ya se ha mencionado que, desde el punto de vista medioambiental, los sustratos
aromáticos metabolizables por E col) no pueden ser considerados como compuestos
xenobióticos. Sin embargo, su acumulación puede ser la causa del mal olor del estiércol
que se genera en explotaciones de ganado porcino ya que, como se ha demostrado, el 4-
NIPA y otros derivados de éste se transforman mediante reacciones metabólicas de las
bacterias presentes en las heces, en los compuestos fenólicos responsables de dicho mal
olor (Spoelstra, 1978).
58
INTRODUCCIÓN
Durante el proceso de molturación de la aceituna para la extracción del aceite de
oliva se originan una serie de subproductos entre los cuales cabe destacar el alpechino
agua residual originada durante dicho proceso (Martínez y cols., 1992). Este residuo es
muy recalcitrante debido a su elevado contenido en compuestos fenólicos de alto poder
contaminante. Entre los componentes principales de carácter aromático de los alpechines
se encuentra el ácido hidroxicinámico y algunos derivados del HCAy del PA como el 4-
NIPA, que junto con el ácido siríngico puede constituir hasta el 50% del total de los
compuestos fenólicos en ciertos alpechines (Balice y Cera, 1984; Martínez y cols.,, 1992).
Tan solo en la cuenca del río Guadalquivir se puede estimar una producción media de
1.800.000 m3 de alpechin al año, de los cuales el 25% se vierte de una forma
incontrolada, lo que implica un importante deterioro de las aguas. El 75% restante, en la
actualidad, se trata en balsas de evaporación que tan solo palían parcialmente el
problema medioambiental (Martínez y cols., 1992). Actualmente se han puesto en
práctica diversos procesos que van desde la simple evaporación, hasta procesos fisico-
químicos como la ósmosis inversa y la ultrafiltración. Pero estos procesos requieren altas
inversiones de dificil amortización dado el carácter temporal de la industria almazarera.
Distintos organismos de la Administración y empresas privadas están desarrollando
planes de actuación con el fin de paliar el problema causado por el vertido de estos
residuos aprovechando, además, su alto contenido en materia orgánica e inorgánica
mediante procesos de reciclado que permitan su uso en la producción de combustibles
sólidos, compost y biogas (de Andrés y García, 1982). Uno de los proyectos más
interesantes es el diseño de biorreactores para la depuración biológica de los alpechines,
que permita la biotransformación de los compuestos aromáticos con el fin de disminuir el
carácter tóxico de estos residuos (Janer, 1980, Fiestas y cols., 1982; Martinez y cols,
1986; Martínez, y cols. 1992). Dado que los principales componentes del alpechin son
metabolizables por algunas estirpes de E. cok, este microorganismo podria ser
considerado como un candidato en el diseño de biorreactores para la depuración
biológica del alpechin, a lo que también contribuiría su gran capacidad de adaptación a
distintos ecosistemas. El estudio y caracterización a nivel molecular de las rutas
catabólicas de este tipo de compuestos, nos aportarla nueva información que seria de
gran utilidad a la hora de diseñar proyectos biotecnológicos como los descritos
anteriormente.
59
INTRODUCCIÓN
6. OBJETIVOS
Durante el periodo de tiempo en el que el Dr. José Luis García formaba parte del
equipo de investigación de Antibióticos S.A., desarrolló un procedimiento para donar
genes ¡mc, que codifican para la penicilina G acilasa (PGA), de diferentes
microorganismos. Este método está basado en la complementaciónauxotróficadeE. col)
1-IB 101 (leuB) incubando las células en medio mínimo en presencia de fenilacetil-L-
leucina como única fUente de L-leucina (García y Buesa, 1986). En el proceso de
aislamiento del gen pac de E. col) ATCC11105, se detectó un clon productor de PGA
que al incubarlo en medio Luna Bertani (LB) presentaba un extraño fenotipo negro. Este
clon contenía el plásmido pAEC19, el cual es un derivado de pBR322 que contiene un
fragmento H¡ndIII de aproximadamente 8,5 kb del DNAcromosómico de E. col! ATCC
11105. El hecho de que los derivados catecólicos se oxiden espontáneamentedando
lugar a productos de coloración marrón o negra y la posible implicación de la PGAen el
metabolismo de derivados del PA nos indujo a pensar que, además del gen ¡mc, el
plásmido pAEC19 podía contener un gen que codificara para una hidroxilasa de
compuestos aromáticos.
Ya se ha comentado que E. col), un microorganismo que se caracteriza por
crecer rápidamente en medios simples, es la bacteria más estudiada a nivel molecular. Por
tanto, la caracterización y el estudio de la expresión de una ruta de derivados aromáticos
de E. col) resulta interesante desde el punto de vista biotecnológico, ya que facilitaría el
uso de esta ruta con fines medioambientales.Además,aportaríanuevosdatossobrela
posibilidad de utilizar este microorganismo como vehículo de expresión de rutas
catabólicas de compuestos recalcitrantes.
Por todo ello, los objetivos de esta Tesis son los siguientes:
1. Caracterización de la hidroxilasa de compuestos aromáticos de E. cotí ATCC
11105
i) Localización del gen que codifica para la hidroxilasa.
u) Construcción de un sistema que posibilite la alta producción de la enzima.
60
INTRODUCCIÓN
iii) Purificación de la enzima.
iv) Estudio de los requerimientos bioquímicos de la hidroxilasa.
y) Determinación de la especificidad de sustrato de la enzima.
vi) Secuenciación del gen que codifca para la 4-HiPA-hidroxilasa.
vii) Comparación de la secuencia de aminoácidos de la 4-HPA-hidroxilasa con otras
oxigenasas ya secuenciadas.
viii) Clasificación de la hidroxilasa en función de la similitud que presente con otras
oxigenasas.
II. Caracterización molecular del resto de la ruta metabólica del 4-HPA de E. cotí
ATCC11105
i) donación de todos los genes implicados en la mineralización del 4-NIPA.
u) Construcción del mapa fisico de la ruta del 4-NIPA de E. col) W.
u) Secuenciación de la ruta completa del 4-NIPA
III. Estudio del mecanismo de regulación de la 4-HPA bidroxilasa
i) Búsqueda de regiones promotoras.
u) Construcción de fusiones de las regiones promotoras a genes trazadores.
iii) Identificación de las proteínas implicadas en la regulación de la expresión de la 4-
NIPA-hidroxilasa.
IV. Expresión de los genes de la ruta del 4-HPA en organismos heterólogos
i) Obtención mediante Ingeniería Genéticade módulos transponiblesque permitan
transferirlos genesde la rutadel 4-NIPA aotrosmicroorganismos.
u) Expresiónde los genesde la ruta catabólicadel 4-NIPA en organismosheterólogos
con el fin de ampliar su capacidad biodegradativa.
6]
II. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
1. ESTIRPES BACTERIANAS Y PLASMIDOS
Para el desarrollode estetrabajo se utilizaron las estirpesde E. col) que se
detallana continuación:E. col) ATCC 11105 (derivadade E. col) W ATCC 9637
auxótrofapara vitamina B12, productorade PGA); B/rK (E .coli B resistentea Uy,
cedida por el Dr. M. Vicente); C (estirpe salvaje cedidapor el Dr. M. Vicente); W
(estirpesalvaje cedidapor el Dr. A. Garrido-Pertierra);MCi 116 (A(ara-leu)); HB1O1
<proA 2, leuB, /hi, red); TG1 (supE,hsdDs, th), A~ac-proAB),F’ (traD3ó, proABj
laciA’, lacZDMJS));MC4100 (araD139, A(JacIPOZYA);SBS688 (MC4100, Acrp39),
W3110 (CECT 416, ATCC 27325),DH1 (supE44,hsdRI7, recAí, endAl, gyrA9ó,
diii, relAi)(Sambrook y cols., 1989), SF5000 (MC4100, recAS6) (Silhavy y cols.,
1984) ET8000(Nair, rbs lacZ::ISJ, gyrA, hutC) (MacNeil, 1981); CC118-Xpir (ALcira-
leu], araD, /xlacX74,galE, galK, phoA2O,1h14, rpsE, rpoB, argE (Am), recAí, Xpir);
S17-V)r (Tpt, Smr, recA, th), pro, hsdlt, Kl RP4:2-Tc:Mu:KmTn7, Xp)r) <Herrero y
cols., 1990).
Otras especiesutilizadas: K. c)trophila ATCC 21285 (productorade PGA)
(García y Buesa, 1986) and K. pneumon)aeM5aí (cedida por el Dr. A. Garrido-
Pertierra)(Martin y cols., 1991),P. put)daKT2442(hsdR,Rif’) (Herreroy cols., 1990).
Los plásmidosutilizados sonlos siguientes:pBR322 (Apr, Tet); pBR325 (Apr,
Cmr, Tc» (Bolívar, 1978); pACYC184 (Cmt, Tcr) (Rose, 1988); pUC18 (Ap’) (Yanisch-
Perrony cols., 1985); pRS551(Apt, Kmr; plásmido parala búsquedade promotores)
(Simons y cols., 1987); pUTmini-Tn5Km2 (Apr, Kmr) (de Lorenzo y coís., 1990);
pUCl8Not (Ap’) (Herreroy cols., 1990);pCNB5(Apt, Km’) (de Lorenzoy cols., 1993);
pAW3 1 (Ap’) (derivadode pEMBL9 con un fragmentoSail de 1,7 kb que contieneel
gen xylE) (cedidopor el Dr. V. de Lorenzo);pAG464 (Ap’) (derivadode pUC18 que
contieneel gen de la HPC-dioxigenasade K. pneumoniaeM5al) (cedidoporel Dr. A.
Garrido-Pertierra).
63
MATERIALES Y MÉTODOS
2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
Las cepasbacteríanas se conservaron congeladasa -700C en medio de cultivo al
que se añadió glicerol al 10% (y/y). En el momento de inocularías se descongelaron,
incubándose en los medios correspondientes a 37’C, a menos que se indique lo contrario,
con agitación.Los principalesmediosde cultivo utilizados han sido: LB, MQ y M63
suplementadosadecuadamenteen cadaensayoy añadiendoagar al 1% (p/v) para los
cultivos en mediosólido (Miller, 1972; Sambrooky cols., 1989).Cuandoserequiereuna
fuentedecarbonoespecificasepreparansolucionesestérilesde éstasparasuplementarel
medio mínimo hastauna concentraciónfinal de 5 mM, en el caso de los derivados
aromáticos,20 mM si setrata de glicerol y 10 mM si la fuentede carbonoutilizada es
glucosa.
La concentraciónde antibiótico añadidoal medio de cultivo de cepasresistentes
flie de 100 ng/ml para la ampicilina, 10 vg/ml parala tetraciclina, 50 ~tg/mlpara la
kanamicina,30-60 ~tg/mlparael cloranfenicol, 50 ~tg/mlparala rifampicina y 25 ¡igmí
parael ácidonalidixico.
El crecimiento de las cepas se siguió por turbidimetría a 600 nm con un
espectrofotómetroShimadzuUV-260.
3. PROCEDIMIENTOS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA
La transferencia de DNAentre las diferentes estirpes se ha llevado a cabo por
transformación y conjugacion.
3.1. Transformación
Las cepas de E. col) se transformaron con el método del RbCI (Kushner, 1978) y
porelectroporación(Wirth y cols, 1989)utilizandoun equipoGenePulserde Bio-Rad.
64
MATERIALES Y MÉTODOS
3.2. Coniu2ac¡ón
Los plásmidosque contienentransposonesderivadosde mini-TnS setransfieren
porconjugaciónsegúnel métododescritoporde Lorenzoy Timmis (1994).Paraello se
utilizaronE colí S17-1Apir como cepadonadoray E col)ET8000y P. pulida KT2442
comobacteriasreceptoras
4. MANIPULACIÓN DEL DNA CON ENZIMAS DE USO COMÚN EN
BIOLOGíA MOLECULAR
Las endonucleasasde restricción se obtuvieron de Boehringer Mannheim,
Amersham,Pharmaciao New EnglandBiolabs. La fosfatasaalcalina de intestino de
ternera se obtuvo de BoehringerMannheim. Amershamsuministró la DNA ligasa, el
fragmentoKlenow de la DNA polimerasa1 de E. col) y la polinucleótido quinasadel
fago T4. Todaslas enzimasy sustamponescorrespondientesseutilizaron siguiendolas
indicacionesrecomendadaspor lascasassuministradoras.
5. PREPARACIÓNDE PLÁSMmOSY DNA CROMOSÓMICO
La preparaciónde plásmidosa partir de cepasde E. col) serealizó utilizando el
métodorápidode lisis alcalinay el métodode purificaciónde DNA por centrifugaciónen
gradientede CsCl (Sambrooky cols., 1989). La extraccióndel DNA cromosómicoa
partir de las bacteriasutilizadasen estetrabajo serealizó segúnel métododescritopara
E. col) porSambrookycols.,(1989).
6. ELECTROFORESIS DEL DNA EN GELES DE AGAROSA
Se utilizaron gelesde agarosaal 0,7 ó 1% en tampónTAE (Tris-NICI 40 mM,
ácido acético 20 mM, EDTA 2 mM, pH 8,1), utilizando el mismo tampón como
electrolito. A las muestrasse les añadió 1/5-1/10 de su volumen de una solución
compuestaporFico!! 400 al 30% (p/v), azul de bromofenolal 0,2% (p/v), xilencianol al
0,2%y EDTA 40 mM pH 8,0. La electroforesisserealizó a 100-150V durante60-90
65
MATERIALES Y MÉTODOS
minutos.Unavezfinalizada la electroforesis,los gelessetiñeroncon bromurode etidio
(5 jg/ml) parasuvisualizacióncon radiaciónultravioleta.Como marcadorde tamañose
utilizó el DNA del fago X digeridocon la enzimade restricciónBsIEII (Amersham).
7. AISLAMIENTO Y PURIflCACION DE LOS FRAGMENTOS DE DNA
Los fragmentosresultantesde la digestión del DNA con las enzimas de
restricciónse aislarony purificaronporcuatroprocedimientosdistintos.
7.1. Gelesdenoliacrilamida
Se utilizaron geles de poliacrilamida no desnaturalizantespreparadosen TBE
(Tris-borato89 mlvi, ácidobórico 89 mM y EDTA 2 mM, pH 8,0) a una concentración
variabledependiendodel tamañode fragmentoa aislar. Seempleócomoelectrolito para
la electroforesisel tampónTRE. A las muestrasseles añadió1/10 de su volumende una
solución compuestapor Ficolí 400 al 30% (p/v), azul de bromofenol al 0,2% (p/v),
xilencianol al 0,2% y EDIA 40 mlvi pH 8,0. Una vez terminadala electroforesis,los
gelessetiñeron con azul de metilenoy se recortó la bandade DNA deseadaen cada
caso.El DNA seeluyó de la bandade acrilamidatal como describenSambrooky cols.,
(1989).
7.2. Técnicade Geneclean
Los fragmentosque sedeseanaislarseseparanmedianteelectroforesisen geles
de agarosa.Posteriormente,serecodanlas bandasde interésy el DNA sepurifica de la
agarosamediantesu adsorciónapanículasde vidrio siguiendola técnicadel Geneclean,
tal comorecomiendanlos fabricantes(Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA).
66
MATERIALES Y MÉTODOS
7.3. Gelesde agarosade bajo punto de fusión
Paraalgunosaislamientosde fragmentosde DNA se utilizaron gelesde agarosa
de bajo punto de fusión (Bio-Rad) al 1-1,4% en tampón TAE. Una vez realizadala
electroforesis,se recortó del gel la banda deseadaen cadacaso y seresuspendióen
tampónTE (Tris-HCI 10 mM, pH 8,0; EDTA lmM) conNací 0,25 M. La agarosase
fundió manteniéndolaa 65 oc durante5 minutos.A continuación,lamuestrasetrató con
fenol y posteriormentecon éter (y/y), incubándoladespuésa 650C durante 10-15
minutosconel fin de eliminarlos posiblesrestosde fenol. El DNA seprecipitócondos
volúmenesy medio de etanol absoluto durante 45 minutos a -700C. Tras una
centrifugación a 10.000x g durante10 minutos,el precipitadose lavó con etanol70%y
finalmentesedisolvióen un volumenadecuadode tampónTE.
7.4. Técnicade la B-a2arasa
El empleodeestatécnicatambiénrequierela separaciónpreviade los fragmentos
medianteelectroforesisen geles de agarosade bajo punto de fusión y posterior
tratamientode la bandaextraídacon la 13-agarasa.Esta enzimahidroliza la agarosa
liberando el DNA. Para ello es necesariofundir previamentela banda de agarosa
recortadaen el tampónde la enzima(10 mM Bis Tris-RU pH 6,5; 10 mM EDTA) y
posterior tratamientocon la ~3-agarasaduranteunahora a 40-420c. Despuésde tratar
con fenol y precipitarel DNA se resuspendióen el volumen de TE adecuado.Tanto la
enzimacomoel tampónseobtuvierondela casacomercialBiolabs.
8. SELECCIÓNDE LOS CLONESPRODUCTORESDE PGA
La selecciónde los clonesconactividadPGA se realizó segúnel métododescrito
por Garciay Buesa(1986). La fenilacetil-L-leucinafUe cedida por Antibióticos SA.
(León). Lascélulasde E. colí NIB 101 transformadascon una genotecaH¡ndl[I de E. col)
ATCC 11105 construidaen pBR322 sesembraronen medio mínimo M9 suplementado
conglucosa10 n,M, lmg/l de tiamina-Hcl, 10 mg/l de L-prolina, 100 mg/l defenilacetil-
L-leucinay ampicilina a 75 vg/ml. Despuésde 72 horasde incubación a 30 0C, las
67
MATERIALES Y MÉTODOS
colonias que crecieron fueron aisladas y su fenotipo se estudió resembrándolas en M9
con y sin fenilacetil-L-leucina.Se consideróqueun clon era positivo cuandola colonia
crecíaexclusivamenteen presenciade L-leucinao su fenilacetilderivado.
9. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE DNA
Los fragmentosde DNA marcadosradiactivamente(sondas) se obtuvieron
mediantela técnica del random-primer utilizando [a-32P]dcTP (400 Cilmmol, 10
pCi/yd) (Aniersham),el fragmentoKlenow, la soluciónde iniciadores(Pharmacia)y los
dNTPs, segúnseindica en Sambrooky cols., (1989). Todaslas hibridacionesy lavados
se hicieron a 65 0C.
9.1. Técnicade Soutbern-blot
La hibridación del DNA mediantela técnicadescritapor Southem(1975), se
realizó siguiendo el protocolo de Sambrook y cols., (1989). Las membranas de nylon
para la transferencia del DNA se obtuvieron de Schleicher and Shuell. Las bandas
radiactivasse detectarona -700C utilizando peliculasHyperfilm~«-1vW (Aimersham)y
pantallasamplificadorasCronexLightning Plus(Dupont).
9.2. Hibridacióndel DNA sobrefiltros decoloniascelulares
Las coloniasde E. col) setransfirierona los filtros de nitrocelulosa(Millipore
HATF, tamañode poro 0,45 gm) como se indica en Sambrooky cols., (1989). Las
células se Usaron sobre el filtro mediante tratamientossucesivos,de 5 minutos de
duracióncadauno, con las solucionesque se indican: i) NaCí 1,5 M y NaOH 0,5 M (2
veces);u) Tris-HCI 1 M, pH 7,0; iii) Tris-HCI 0,5 M, pH 7,0 y NaCí 1,5 M; iv) 2 x
(NaCí 0,3 M, citrato sódico0,003 M). La fijación del DNA al filtro serealizó mediante
incubacióna 80 oc durante2 horas. Para eliminar los restoscelulares,los filtros se
hirvieronen aguadestiladadurante10 minutos.La hibridacióncon la sondaradiactivase
realizócomosedescribeen Sambrooky cols., (1989).
68
MATERIALES Y MÉTODOS
10. SECUENCIACIÓNDEL DNA
La secuenciacióndel DNA serealizó segúnel métodode Sangery cols., (1977)
pordosprocedimientos:
10.1.Secuenciaciónmanual
Para la reacción de secuenciaciónse utilizó el T7 DNA polymeraseKit
(Pharmacia)y como desoxinucleósidotrifosfato marcadoradiactivamente,[a-35S]dATP
(Amersham),siguiendolas recomendacionesde los fabricantes.
10.2. Secuenciaciónautomática
Partede la secuenciacióndel DNA sellevó a cabo en el CentroNacional de
Biotecnología (G.B.F.) (Braunschweig, Alemania) utilizando un secuenciador
automáticomodelo 373A (Applied Biosystems).Parala reacciónde secuenciaciónse
utilizó el Prisrn ready react)ondyedeoxyterminatorcyclesequenc)ng1</e de Applied
Biosystems que conlíeva el uso de didesoxinucleótidos coloreados y la DNApolimerasa
AmpliTaq siguiendo las recomendacionesde los fabricantes. Las reacciones de
polimerizaciónsellevaron cabomediantela técnicade PCR (reacciónen cadenade la
polimerasa)paralo queseutilizó un termocicladorPerkin-ElmerCetus480.
10.3.Análisisde la secuenciadeDNA
Parael análisis de la secuenciade DNA seutilizó el grupo de programaspara
Biología Molecular de la Universidadde Wisconsin (WINP) presenteen el VAX del
CentroNacionalde Biotecnologíade Madrid. La secuenciade aminoácidosdeducidaa
partir de la secuenciade nucleótidosse comparócon las proteínasde las siguientesbases
dedatos:GenBank/EMBLy Swissprot.
69
MATERIALES Y MÉTODOS
11. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE CULTIVOS CELULARES
Paraobtenerextractosde las cepasde E. col) se cultivaron éstasen 100 ml del
medio indicadoen cadacasoa37 oc durante16 horas(faseestacionariade crecimiento).
A continuación,los cultivos se enfriarona 4 0C y se centrifugarona 6.000 x g durante
10 minutos, resuspendiéndoselas célulasen 10 ml de tampónfosfastosódico20 mM ó
100 mM pH 8, dependiendodel ensayoque se fuera arealizar.Unavez homogeneizada
la suspensión,las células se rompieronen un sonicadorMSE modelo MK2 mediante
cuatro pulsos de 15 segundoscada uno, manteniendosiempre la muestraa 4 oc.
Finalmentela suspensiónsonicadasecentrifugó a4 0C y 30.000x g durante20 minutos
para eliminar los restos celulares. El sobrenadantede esta centrifugación (extracto
crudo) se conservóa -200C. Cuandose cultivaron volúmenesmayores,las células se
rompieronusandounaFrench-Press(American InstrumentsCompany)operandoa una
presiónde 7,6 atmósferas.
12. ENSAYOSDE ACTIVIDAD ENZIMATICA
En todos los casos las medidas de absorbancia se realizaron en un
espectrofotómetroShimadzuUV-160.
12.1.PenicilinaG acilasa
La amplia especificidadque presentala PGA parael restoácidoo amino de los
enlacesque hidroliza, permite el empleo de sustratosderivadosdel PA cuya hidrólisis
suponela apariciónde cromóforos.Duranteestetrabajo, la actividadpenicilinaG acilasa
sedeterminóde acuerdoal métodocolorimétricodescritoporSzewczuky cols., (1979).
Los cultivos se incubarona 30 oc con agitaciónen presenciade fenilacéticoal 0,15%
durantetodala noche.La mezclade reaccióncontenia0,2 ml de una soluciónde 5 mlvi
fenilacetil-p-aminobenzoicoy unaalicuotade 0,05 ml de medio de cultivo con célulasen
estadoestacionario.Estamezclase incuba20 minutosa 37 0C deteniéndoseal añadir
0,250 ml de unasoluciónque contiene10 mM de nitrito sódicoen ácidoacético0,25 M.
Posteriormentese añadieron 0,750 ml de la solución reactiva (ácido 1-amino 8-
70
MATERIALES Y MÉTODOS
hidroxinafialeno 3,6-disulfónico al 0,01% (pfv) en carbonato sódico 0,66 M). Por
centrifugaciónen microfugaseeliminan los restoscelularesy semide la reacciónen el
espectrofotómetroa 535 nm utilizandoun coeficientede extinciónmolar (E) de 36.000
M-’ cm~.
12.2. 4-HPA-bidroxilasa
Paradeterminarla actividad de la 4-NIPA hidroxilasasobrediferentessustratos
seutilizaron dosmétodosque sedetallana continuación.
12.2.1.Cuantificaciónde la oxidacióndel NADH
La actividadhidroxilasase midió añadiendo0,01 ml de sustrato0,1 M a 0,5 ml
de una solución que contiene, NADH 0,2 mlvi y 0,06 ml de extractopreparadoen
tampónfosfato sódico 100 mM pH 8. La oxidación del NADH se determinaa 30 0C
midiendola disminuciónde absorbanciaa 340 nm usandoun s=6.220M’ cm~’ parael
NADH. Losvaloresse corrigieronporla oxidacióndel NADH en ausenciade sustrato.
Unaunidadde actividadhidroxilasasedefinecomo la cantidadde enzimanecesariapara
la oxidaciónde 1 ytmol de NADH porminuto.
12.2.2.Reacciónacopladacon la catecol2,3-dioxigenasa1 (C2301) deP pulida
Este ensayo se llevó a cabo utilizando fenol como sustrato de la 4-HPA
hidroxilasa. En presenciade concentracionessaturantesde C230 1 el catecol se
transformainstantáneamenteen 2-hidroximucónicosemialdehído(HMS) que presenta
un máximo de absorcióna 375 nm lo que permitesu cuantificación(s=46.000Nt1 cm1
a pH 8). La reacciónse inicia añadiendo0,050 ml de extracto de E. col) JM1OI
(pAW31) en el instanteen quetodo el NADH seha oxidado.Unaunidadde actividadse
definecomo la cantidadde enzimanecesariaparala transformaciónde 1 ¡tmol de HiMS
porminuto.
71
MATERIALES Y MÉTODOS
12.3. IIPC-dioxi2enasa
El ensayode actividad de la HiPC-dioxigenasase llevó a cabo de acuerdo al
procedimientoespectofotométricodescritoporCoopery Skinner (1980).La mezclade
reaccióncontenía0,005 ml de HPC 20 mM, 0,05 ml de extractocrudo y 0,445 ml de
tampón fosfato 50 mM PH 8. La formación de 5-carboximetil-2-hidroximucónico
semialdehido(CHMS) sedetectóa380 nmutilizandoun s= 35.000M4 cnt.
12.4. 8-lactaniasa
La actividadB-lactamasasedeterminómedianteel método espectrofotométrico
de Rossy O’Callaghan(1975).Seutilizaron0,05 ml deextractoenzimáticoen 0,5 ml de
tampónfosfato 100 mlvi pH 7 iniciándosela reacciónpor la adición de cefaloridina0,1
mM. La reacciónse desarrollóa 25 oc. La hidrólisis del anillo j3-lactámicosesiguió a
una longitud de onda de 255 nm, registrandola disminuciónde absorbanciadurante5
mm. Secalcularonlos imoles de cefaloridinahidrolizadosempleandoun e= 14000 M’—I
cm
12.5. B-2alactosidasa
Los nivelesde 13-galactosidasasedeterminaronde acuerdoal protocolode Miller
(1972).Las célulassecultivarona 30 0C y los efectoresensayadosseañadieronal medio
de cultivo a unaconcentraciónde 1 mM. Seanalizarondiferentesalícuotasde medio de
cultivo en función de los nivelesde 13-galactosidasaproducidosporcadaclon, entre0,02
y 0,1 mi, completandoaun volumenfinal de 0,5 ml con tampónZ, (fosfato disódico0,06
M, fosfatomonosódico0,04 M, KCl 0,01 M, SO4Mg 0,001 M y 13-mercaptoetanol0,05
M). Las célulasse permeabilizaronañadiendodosgotasde cloroformo(Merck) y una
gotade dodecilsulfatosódico (SDS) al 0,01 %. La reacciónse inicia añadiendo0,1 ml
del sustrato,2-nitrofenil-13-D-galactopiranósido(ONPG) (4 mg/mí). Tras un periodo
variablede 5 a 15 minutosa28 oc separala reaccióncon 0,25 ml de carbonatosódico 1
M. Los restoscelularesseeliminaroncentrifugandolasmuestrasa 12.000x g durante10
minutosy posteriormentese midió la reacciónen un espectrofotómetroShimadzuUV-
72
MATERIALES Y MÉTODOS
160 a 420 nm. La medida es estable durante 20 mm a 4 0C. Las unidades de 13-
galactosidasa se calcularon en base a la siguiente ecuación:
Unidades 13-gal [DO 420 / t (mm) x vol (ni]) x DO600 del medio de cultivo] x 1000
13. IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LA REACCIÓN DE LA 4-
HPA-IIIIPROXILASA
Los productos obtenidos por incubación de las células en medio M9
suplementado con glucosa 10 mMy el sustrato a analizar a una concentración final de 1
mM, se analizaron por cromatografia líquida de alta resolución (HPLC). Después de
centrifugar los cultivos se analizaron los sobrenadantes en un equipo Gilson utilizando
una columna Nucleosil 300-508 (250 x 4 mm)precedida de una precolumna Nucleosil
300-SC 18 (11 x 4 mm). Para detectar la formación de catecol se utilizó una solución
(1:1) de fosfato potásico 50 mMy metanol pH 5 como fase móvil. Para detectar L-
Dopa, se utilizó como fasemóvil una soluciónde fosfato potásico50 mM, EDTA 0,1
niIvI, trifluoroacético 100 mMy acetonitrilo 8 %y/y a PH 4,8. El flujo se mantuvo a 0,5
mí/mm y la detección se llevó a cabo espectrofotométricamentea 280 nm. Los
metabolitos se identificaron por comparación con los tiempos de retención de las
sustancias puras.
14. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS CODIFICADAS POR FRAGMENTOS
CLONADOS DE DNA
Las proteínas codificadas por los genes hpaB, hpaC y la ORF 14, presentes en
diferentes plásmidos, donados en E. coil SESOOOse detectaron mediante la técnica de
maxicélulas descrita por Silhavy y cok., (1984) utilizando [a-35S]metionina(1.500
CiImoI) (Amershan).La electroforesisen gel de poliacrilamidasellevó a cabosegúnse
describeen el apartado18.
73
MATERIALES Y MÉTODOS
15. PURIFICACIÓN DE LA 4-HPA-HIDROXILASA
Las célulasdeE.coli DHI (pAJ221)fueron incubadas a 37 0C en 50 ml de medio
LB conteniendo 34 gg/ml de cloranfenicol. Después de centritbgar, el sedimento se
resuspendió en 5 ml de tampón fosfato 20 mM, pH 8. Las células se rompieron mediante
sonicación y el extracto resultante se centrifugó a 30.000 x g durante 20 minutos. Los 5
ml de extracto se cargaron en una columna (3 x 1,5 cm) de Cibacrón Blue 3GAAgarosa-
3000-cL (Sigma)equilibradaen tampónfosfato 20 mlvi, pH 8. La columnaselavó con
el mismo tampóny la enzimaseeluyó con tampónfosfato 20 mM conteniendo30 mlvi
NADH. Las fracciones que presentaban actividad hidroxilasa se mezclaron y
concentraron con polietilenglicol 20.000. Para la croniatografia de filtración se utilizó
una columna Superosa 12 HR 10/30 (Pharmacia) equilibrada en tampón fosfato 50 mlvi,
pH 8 utilizando un equipo de HPLC Gilson. Los patrones utilizados para las
determinaciones del masa molecular fueron: ovoalbúmina (45.000 Da), seroalbúmina
bovina (67.000 Da) y aldolasa (160.000 Da).
16. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
La concentración de la proteína existente en preparaciones puras de HpaB y en
extractos crudos celulares ha sido determinada mediante el método descrito por
Bradford(1976).
17. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRIAMIDA-
SDS
Las electroforesisanalíticasde proteínasse realizaronen todos los casos en
condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS. La técnicaempleadafue descritapor
Laemmli (1970) utilizando geles de poliacrilamida en placa (160 x 100 x 2 mm)
preparadosa concentracionesque, segúnlos casos,oscilaronentreel 8 y el 15 %. Las
muestrassehirvieron durante5 minutosen presenciadel tampónde ruptura(Tris-UCI
62,5 mM, pH 6,8; SDS al 2%, ¡3-mercaptoetanolal 5%, glicerol al 10% y azul de
bromofenol al 0,005%). Las electroforesisse realizarona temperaturaambiente y
74
MATERIALES Y MÉTODOS
corrienteconstante(50 mA), utilizando un electrolito que conteniaTris-I{CI 0,025 M,
glicina 0,192 M y SDS al 0,1%. Las proteínas de los geles se visualizaron con azul
brillante de Coomassie R-250, según se describe en Swank y Munkress (1971). Las
proteínas empleadas como marcadores de tamaño molecular se adquirieron de Bio-Rad.
18. DETERMINACION DE LA SECIIJENCIA N-TERMINAL DE HpaB
La secuencia de aminoácidos N-terminal de la proteína HpaB se determinó
medianteel método de degradaciónde Edmanutilizando un secuenciadorde fase
gaseosaconectadoaun equipodeHIPLC (Applied Biosystems).
19. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI4IpaB
Parala obtenciónde anticuerpospoliclonalesanti-HpalB seinmunizaronconejos
con la enzima HpaB purificada. Se utilizaron dos dosis de 100 ~.tgde proteína en solución
salina; la primera en adjuvante completo de Freund (1:1 y/y) y la segunda en adjuvante
incompleto de Freund (1:1 y/y) dejando transcurrir un mes entre ambas. La
administración del antígeno se realizó por vía subcutánea. Una semana después de la
administración de la segunda dosis se extrajo la sangre a los conejos para la obtención
del antisuero. La sangre se incubó a 37 0C durante 5 horas y después se mantuvo a 4 0C
12 horas para permitir la formación del coágulo. El sobrenadante se centrifugó a 10.000
x g a 4 0C durante 5 minutos para eliminar los restos celulares y, por último, se
inactivaron las proteínas del complemento durante 15 minutos a 56 0C. Se ensayó la
especificidad del antisuero obtenido, así como la posible reacción inespecífica del suero
pre-inmune,mediante análisis por Westernblot utilizando diferentesdiluciones del
mismo. Para evitar la detección de bandas inespecíficas en el Western blot formadas por
la posiblereaccióncruzadadel antisuerocon otrasproteínascelularesdiferentesa HpaB
sepreincubóel antisueroa37 0C con un extractocelularde la cepaqueposteriormente
se iba a emplear para producir la proteína HpaB.
75
MATERIALES Y MÉTODOS
20. TÉCNICADE WESTERNBLOT
Una vez separadas las proteínas mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida-SDS, se transfirieron a membranasde nitrocelulosa (Schleicher and
Shuell) segúndescribenSambrooky cols., (1989). La membranasesaturócon lecheen
polvo desnatada al 5% (p/v) en tampón PBS (fosfato sódico 10 mlvi, pH 7,4; NaCí 140
mM) mediante incubación a 40C durante 12 horas. Posteriormente, se incubó a
temperaturaambientecon agitaciónsuavedurante4 horasen presenciadel sueroanti-
HpaB. Despuésde tres lavadoscon PBS que conteníaTween-20al 0,1% (y/y), de 10
minutos de duración cada uno, la membranase hizo reaccionardurante 1 hora a
temperaturaambientey agitaciónsuavecon anticuerposde cabraanti-IgGs de conejo
conjugados con peroxidasa (Jackson Immunoresearch). Finalmente se lavó con tampón
PBS y las bandas de reacción con los anticuerpos se visualizaron con peróxido de
hidrógeno y 4-cloro-1-naftol (Sigma).
21. AISLAMIENTO DE RNA
Paraobtenerel RNA total de un cultivo deE. col), las células se cultivaron en 20
ml de medio de cultivo hastauna DO600 de 0,5 (fase exponencialde crecimiento).El
sedimento celular se resuspendió en 1 mide TE 10:10(Tri-HCI 10 mM, pH 8; EDTA 10
mlvi) lavándolo a continuación con el mismo tampón. Posteriormente se resuspendió en
0,4 ml de tampón de lisis (TE 10:10 con 2 mg/ml de lisozima (Sigma)) y se provocó la
lisis celularcon tresciclossucesivosde congelación-descongelaciónutilizando nitrógeno
líquido. Se añadióa la mezclaSDS al 0,8%, acetatosódico 166 mM, pH 4 y 0,5 ml de
fenol equilibradocon agua a 600C. Se calentarona 60 oc durante5 minutos y se
centrifugarona 30.000 x g 10 minutos a 4 0C. El sobrenadanterecibió un nuevo
tratamientocon fenol ácido caliente. El RNA total se precipitó con etanol absoluto
disolviéndosefinalmente en un volumen adecuadode TE 10:10. La concentraciónde
RNA seestimó a partir de la DO de la preparacióna260 nm. Unaunidadde DO a 260
nmequivale a una concentración de 40 ¡.tg/ml. La cantidad de RNAobtenida a partir de
los 20 ml de cultivo de E. col) osciló entre0,3 y 0,8 mg. Paracomprobarla calidaddel
RNA, las muestras se visualizaron en un gel de agarosa del 1 %, tras eliminar las
76
MATERIALES Y MÉTODOS
RNAsas de la cubeta y tampones. Una extracción correcta permite observar bandas de
1,1, 0,8 y 0,2 kb. Los RNAs se conservaron a -70 0C. Se eliminaron los posibles restos
de DNAde la muestra, que pudieran interferir en el análisis posterior del RNA, mediante
un tratamientocon DNAsa libre de RNAsa (DNAsa 1 de Pharmacia)en presenciade
RNAsina (inhibidor de RNAsa) (Boebringer)durante1 hora a 37 0C. Posteriormentese
repitió el proceso de fenolización ácida y precipitación con etanol del RNA en
condiciones similares a las descritas anteriormente.
22. DETERMINACIÓN DE LOS SITIOS DE INICIACIÓN DE LA
TRANSCRIPCIÓN MEDIANTE EL EMPLEO DE LA TÉCNICA DE
EXTENSIÓN CON UN INICIADOR.
Para localizar e] sitio de ¡niciacion de la transcripción de los genes hpaA
y hpaB de E. col) ATCC 11105 se han seguido dos procedimientosdiferentes,
ambos basados en la técnica de extensión del cDNA a partir de un iniciador o
primer extension. Los oligonucleótidos utilizados para determinarlos sitios de
iniciación de la transcripción de los genes hpaA y hpaB son 038A (figura 23) y
OLACZSO 5’-GCGGAACTGGCGGCTGTGGG-3’,respectivamente.
22.1.Marcaje del oli2onucleótido con Fy-32P1 ATP
.
Este método se llevó a cabo según el protocolo descrito por Sambrook y cols.,
(1989). Para el marcajede oligonucleótidosse empleó la T4 polinucleótido quinasa
utilizando como isótopo[y-32P]dATP (SOOOCiImml, 10 ~Ci/pd).Paraello seutilizaron7
pmolesdel oligonucleótidoy 50 gCi de [y-32P] dAfl. Posteriormentesemezclaron1
pmol de oligonucleótidoy 15 ¡.tg RNA precipitandola mezclasegúnel procedimiento
descritoporSambrooky cok., (1989).El precipitadoseresuspendióen 30 pU de tampón
de hibridación(40 mM PII>ES pH 6.4, 1 mM EDTA pH 8, 0,4 M NaCí y formamidaal
50 %), desnaturalizandoa 85 0C durante10 minutose incubandola mezcla12 horasa 30
0C para permitir la hibridación. El híbrido RNA-oligonucleótido se precipitó con 2,5
volúmenesde etanol absolutoresuspendiéndoloposteriormenteen la mezclade reacción
de la transcriptasareversa(lx tampónAIvW (Promega),0,9 mlvi dNTPs,pH 7, 0,4 U de
77
MATERIALES Y MÉTODOS
RNAsina,y 3 U de transcriptasareversaAMV (avianmyeloblastosisvirus) de Promega.
La reacciónde extensióntranscurrióduranteunahoraa 42 oc y sedetuvocon NaOH a
unaconcentraciónfinal de 0,4 M, manteniéndose12 horasa temperaturaambientepara
desnaturalizarlos ácidosnucleicos.El siguientepasoconsistióen la neutralizaciónde la
mezclacon ácidoacético0,4 M y posteriorprecipitacióncon etanol,resuspendiendoel
precipitadoen una solución1:1 (y/y) de aguay solucióncolorante(azuldebroniofenolal
0,3 %, xilencianolal 0,3 %, 10 mMEDTA~pH 7,5 y formamida desionizada al 97,5 %).
Paraanalizar la longitud de los productosde la extensión,y por tanto el punto de
iniciación de la transcripción, se realizó una electroforesís cargando las muestras en un
gel de poliacrilamida al 6 %-urea 8 M, detectándose el resultado por autorradiografia. La
secuenciación de los plásmidos que contenían las zonas promotoras subclonadas, con el
mismo oligonucleótido,sirvió paralocalizararel punto de iniciación de la transcripción
en e] genonia.
22.2. Incorporación de lct-32PldCTP
.
Este método se realizó según el ensayo descrito por Chandry y cols., (1994). Para
ello, se calentaron a 90 0C durante un minuto 3 ~l de la mezcla que contenía 40 pmoles
de oligonucleótidoy 15 pg de RNA y posteriormentese mantuvola mezclaa 42 0C
durante 5 minutos para realizar el anillamiento RNA-oligonucleótido. El cDNA es
sintetizadoen un volumen de reacciónde 10 pU que contiene 24 U de la enzima
transcriptasareversa(AMV), 15 ~Ci de [ct-32P]dCTP,dCTP 10 ItM, dATP 100 gM,
dGTP 100 vM, dTTP 100 ~.tM,Tris-HCI 50 mM pH 8,5, KCI 50 mM, MgCI2 20 mMy
ditiotreitol 10 mM. La reacciónseincubaa 420C durante30 minutosy sedetienecon 5
ud de formamida al 0,5 %, EDTA 20 mM, azulde bromofenol0,05 % y xilencianol0,05
%. El resultado se visualiza y analiza como en el método anterior.
Este procedimientoes mucho más rápido que el anterior y tiene la ventajade
conseguiruna mejor desnaturalizacióncuando se trabaja con material genético de
elevado contenido en estructura secundaria.
78
III. RESULTADOS
RESULTADOS
1. CLONACIÓN DEL GIENpaeDE E. cdiATCC 11105
Como se ha comentado en la Introducción (apartado 6.) el clon HElOI
(pAEC19), productorde PGA, presentabaun fenotiponegroal incubarlo en medio LB
que había sido relacionado con la presencia de una hidroxilasa de compuestos aromáticos
en esta cepa. Además, la producción del pigmento negro también se observaba al incubar
las célulasen medio mínimo suplementadocon diferentescompuestosaromáticoscomo
L-tirosina, N-acetil-L-tirosina,L-tirosina-metil éster, 4-HIPA, 3 -HIPA y fenol, lo cual
apoyaba la hipótesis de la existencia de una hidroxilasa de aromáticos en este clon (figura
10). Sin embargo,cuandolas célulasseincubaronen presenciade PA, L-fenilalaninao 2-
HPA no se detectó la producción de ningún pigmento. Dado que por una parte, el clon
1-118101 (pAECl9) era propiedad de Antibióticos S.A y que, además, era necesario
comprobar que este fenotipo era realmente consecuencia de la expresión de un gen de E.
col) ATCC 11105, se construyó nuevamente la genoteca HindIII de esta estirpe en
pBR322 y, utilizando el método desarrollado por García y Buesa (1986) para seleccionar
clones productores de PGA, se seleccionó el clon HB1OI (pAJl9) que presentaba un
fenotipo idéntico al de las células transformadas con el plásmido pAEC19. Para
confirmar que el plásmido pAJl9 contenía el gen responsable del fenotipo negro se
transformaron diferentes estirpes de E. col) (DH1, JIMiO], TG1 y SESOOO)obteniéndose
siempre el mismo resultado.
1.1. Localización del 2Cfl resuonsabledel fenotino negro
El plásmido pAJl9 contiene un fragmento HindIII de 8,5 kb del DNA
cromosómico de E. col) ATCC 11105. El gen pac fue localizado en uno de los extremos
de este fragmento mediante secuenciación,utilizando oligonucleótidos sintéticos
diseñadosa partir de la secuenciade nucleótidosdel vectorpBR322. Paralocalizar el
gen responsable del fenotipo negro, al que se denominó hpaB, se hicieron distintas
construcciones algunas de las cuales se muestran en la figura 11. Un paso decisivo en la
localizacióndelgenhpaBconsistió en la construcción del plásmido pAJ2l mediante una
deleción Safl del plásmido pAJ2O. Las células transformadas con el plásmido pAJ2 1 no
producían el pigmento negro al incubarías en LB, lo que indicaba que el gen hpaB estaba
80
RESULTADOS
EH
H Fo
Figura II. Subclonac¡ón del gen hpaB. Símbolos: ~, gen pat., U gen /rpaB; E, genque codifica para la proteína C; E, gen que codifica para la proteina D. Las flechasindican la dirección de transcripción de los genes. Abreviaturas: Apr, resistencia aampicilina; Cmt, resistencia a cloranfenícol; Tcr, resistencia a tetraciclina; B, Ba,nHI; lE.EcoPJ;Ec, EcoRV; Hc, HindII; H, K/ndIII; P, Psfl; Pv, PvulL; 5, Sa/l; Ss, SspI.
E
HoH
pU~I92.Zkb
H
82
RESULTADOS
1.2. Detecciónde las Droteinas donadasen el plásmido pAJl9
Una vez localizado el gen hpaBen el plásmido pAJ27 se analizaron los productos
de los genes donados en el plásmido pAJI9 mediante la técnica de maxicélulas (figura
12). En el carril correspondiente al clon SESOOO (pAJI9), además de la fB-lactamasa
(30.000Da), seobservantres bandas59.000,40.000y 19.000Da que seindican como
proteínas18, 13 y C, respectivamente.No sedetectaronlas bandascorrespondientesa las
dos subunidadesde la PGAde 60.000y 26.000Da, ya quela produccióndeestaenzima
sólo tiene lugar a 30 0C y en presencia de PA. Los plásmidos pAJ19, pAJ22 y pAJ27
contenían el gen hpczB a diferencia del plásmido pAJ2S, dado que en las células
transformadascon esteúltimo no seobservóel fenotiponegro. Teniendoen cuentaque
en las células que contenian el plásmido pAJ22 se producía la cloranfenicol acetil
transferasa(27.000Da) y las proteínas18 y C, y en el clon SE5000 (pAJ27) sólo se
observaban la ¡3-lactamasa y la proteína B, se dedujo que el producto del gen hpaB
podria ser la proteína 18 que se denominó HpaB.
83
RESULTADOS
2. CARACTERIZACIÓN DE LA HIDROXILASA
2.1. Identificación de los productos de la reacción de bidroxilación
Como se ha mencionado,los clones que expresan la hidroxilasa producen
pigmentos de coloración marrón o negra al incubarlos en medio mínimo en presencia de
compuestosaromáticosmonohidroxiladoscomo L-tirosina, fenol, y 3- ó 4-HIPA. Para
comprobarque los productoscoloreadosprocedíande la oxidación espontáneade
derivadosdihidroxiladosobtenidosmediantela acciónde unahidroxilasa,seidentificaron
los metabolitos de la reacción mediante cromatografia líquida de alta resolución (HPLC).
Para ello, la cepa E. col) DH1 (pA.122) se incubó durante toda la noche a 37 0c en medio
M9 con glucosa suplementado con L-tirosina o fenol 1 mM. Para comprobar que los
sustratos no se transformaban por otro sistema diferente a la reacción mediada por la
hidroxilasa, se incubaronen las mismascondicionescélulas de E. col) DH1 (pBR32S).
Posteriormentelos cultivos se centrifugarona 6.000 x g durante 10 minutos y el
sobrenadante se utilizó para el análisis en HPLC empleando como patrones sustancias
puras para determinar el tiempo de retención de cada compuesto. Los resultados de este
experimentoindicaronque la cepaE col) DH1 (pAJ22) producíaL-dopay catecola
partir deL-tirosina y fenol respectivamente,demostrándoseque la enzimacodificadaen
el plásmido pAJ22 transformabaestossustratosaromáticosmonohidroxiladosen los
correspondientesdiolesmedianteunareacciónde hidroxilación(figura 13). Estesistema
se utilizó para comprobar la transformación de otros posibles sustratos como N-acetil-L-
tirosina y L-tirosina-metil éster, detectándose en ambos casos la aparición de un
metabolito más polar que no pudo ser identificado por carecer de las sustancias puras
correspondientes.Medianteestemétodotambiénfue analizadala transformacióndel PA
y de sus derivados hidroxilados, observándose que los picos correspondientes al PA y al
2-HIPA permanecían invariables en el cromatograma del sobrenadante del medio de
cultivo de E. col, DH1 (pM22). Sin embargo, el 3-tIPA y el 4-HPA se transformaban
en un metabolito que, dada su inestabilidad, no era identificable mediante este método.
85
RESULTADOS
A
HRC F~
L±wur~ llfflmi
0 5
B
lo 0 5 lO
C
(1~i
1 1 t -<
O
t (mm)
Figura 13. Identificación por HPLC del producto de la oxidación de fenol mediadapor la 4-HPA-bidroxilasa. Panel A, solución estándar de hidroquinona (H), resorcinol(R), catecol (C) y fenol (P). Panel B, sobrenadantedel cultivo de E. col) DHI (pBR325)cultivada en medio M9 suplementado con fenol lmM. Panel C, sobrenadante del cultivode E. col) DHI (pA.J22)cultivada en las mismas condiciones.
86
RESULTADOS
La transformaciónde 3- y 4-tIPA en HPC por la acción de la hidroxilasa fue
comprobada por otro procedimiento consistente en el acoplamiento in vivo de la
reacciónde hidroxilacióny la reacciónde oxigenaciónmediadapor la HPC-dioxigenasa
de K. pneunzoniaeM5al (Gibello y cols., 1994). Esta dioxigenasa lleva a cabo la ruptura
en posición nieta del anillo aromático del HPC dando lugar al 5-carboximetil-2-
hidroximucónicosemialdehido(CHMS), que es de color amarilloy presentaun máximo
de absorbancia a 380 nm. Para expresar los genes de la hidroxilasa y de la dioxigenasa en
una misma cepa se construyó el plásmido pAJ221 (figura 11), compatible con el
plásmido pAG464, el cual es un derivadode pUCiS que contieneel gen de la HPC-
dioxigenasa(Gibello y cols., 1994).El vectorpACYC184 se digirió con las nucleasas
HindIII y BamHI ligándoseposteriormenteal fragmentode 2,7 kb HindIII-Bamm de
pAJ22, que previamentehabia sido purificado mediantela técnicade la ¡3-agarasa.La
mezclade ligaciónseutilizó paratransformarlas célulascompetentesde E. cotí DH1 y
los clones recombinantes frieron seleccionados en base a su resistencia a cloranfenicol y
al fenotipo negro que, en este caso, era más evidente que en cualquier otra construcción
analizadaanteriormenteya que, como seobservóposteriormente,la cepaE. cok DH1
(pAJ221) hiperproduce la hidroxilasa. Una vez obtenido el plásmido pAJ221 se
transformaron las células competentes de E. col) DH1 (pAG464).
Al incubar la células de E. cok DH1 (pAJ22I, pAG4Ó4) en medio M9
suplementado con glucosa y con 4-HIPA ó 3-tIPA, se producía un compuesto de color
amarillo cuyo espectro de absorción coincidía con el del CHlvIS lo que confirmaba la
presencia de este compuesto en el medio de cultivo. Al suplementar el medio con 2-HIPA
como sustrato aromático de la hidroxilasa no se detectaba CHMSen el medio de cultivo,
ya queel 2-tIPA no eraun sustratode la hidroxilasa.
Un experimentosimilar al anteriorpero utilizando la catecol2,3-dioxigenasade
P. puada codificada en el plásmido pAW31, confirmó la transformaciónde fenol en
catecolporacciónde la hidroxilasa.LacepaE. cotí JM 101 (pAW31, pAJ221), incubada
en condicionessimilares a las anteriormentedescritaspero suplementandoel medio
mínimo con fenol, producía 2-hidroximucónico semialdehido (Ii-IMS) que también es
amarilloy presentaun máximode absorbanciaa375 nm (datosno mostrados).
87
RESULTADOS
2.2. Estudio de los cofactoresrequeridosnoria J¡idroxiiasa
Las oxigenasashidroxilantesrequierendonadoresde electronesexternoscomo el
NADH ó NADPH y un centro redox, como mínimo, normalmente compuesto por
metales de transición o una molécula de fiavina (apartado 3.2.1.1. de la Introducción).
Parallevar a caboel estudiode los cofactoresrequeridospor la hidroxilasaseutilizó el
fenol como sustratoya que, a concentracionessaturantesde la catecol2,3-dioxigenasa
de P. putida (C230),todo el catecolse convierteinstantáneamenteen WvIS que puede
serdetectadoa simple vista en un análisis cualitativo. El análisis coloriniétricopermite
cuantificarla cantidadde sustratotransformado.El acoplamientode estasdosreacciones
in viti-o no sólo permitió determinarlos requerimientosbioquímicosde la hidroxilasasino
que tambiénfacilitó la detecciónde la enzimaduranteel procesode purificaciónque se
detallaen el apartado2.6.
La formaciónde I-IIMS en el extractocrudo de la cepaE. cok JM101 (pAW31,
pAJ221) semidió espectrofotométricamentellevándosea cabola reacciónen presencia
de FAD o FMN 1pM añadiendoen ambos casosNADH ó NADPH 0,2 mM como
cosustrato.Medianteestosexperimentosse llegó a la conclusiónde que la hidroxilasa
erauna enzimadependientede NADH. Aunquelos nivelesde HMS no aumentabanen
presenciade FAD o FMiN, estono indicabaque no fueranrequeridosen la reacciónde
hidroxilación ya que estos cofactores estaban presentesen el extracto crudo,
probablemente,en concentracionessaturantes.
2.3. Especificidaddesustrato
La especificidadde sustratode la hidroxilasasedeterminóutilizando el extracto
crudo de la cepaDH1 (pA.1221) preparadoen tampón fosfato sódico 100 mM, PH 8,
midiendoespectrofotométricamentela oxidaciónde NADH (tabla 9). Los resultadosde
esteexperimentopermitieronclasificar la enzimacomo una 4-HPA-hidroxilasa,a pesar
de quepresentabaun rangode sustratomuy amplio actuandosobreunagranvariedadde
derivados aromáticoscomo la L-tirosina, el HPC, el p-cresol, el fenol y algunos
derivadosdoradosde éste.La oxidaciónde NADH no aumentabaen presenciade PA ni
88
RESULTADOS
de 2-NIPA, lo que confirmaba los resultados obtenidos en la identificación mediante
HPLC de los productosde la reacción de hidroxilación.
Tabla9. Sustratos de la bidroxilasa
Compuesto Actividad (%)
4-Hidroxifenilacetato 100’
3 -Hidroxifenilacetato 82
2-Hidroxifenilacetato
Homoprotocatecuato 65
2,5-Difidroxifenilacetato 155
3-CI-4-Hidroxifenilacetato 16
Fenilacetato N.D.
4-Clorofenilacetato 5
o-Creso! N.D.
m-Cresol N.D.
p-Cresol 51
Fenol 28
2-Clorofenol N.D.
3-Clorofenol 5
4-Clorofenol 41
Catecol 2
Resorcinol 28
Hidroquinona 32
L-Tirosina 5
L-Fenilalanina N.D.
L-Dopa 7
D-4-Hidroxifenilglicina N.D.
‘100 % de actividadequivalea 0.2 U/mg de proteína.
bND No detectado
89
RESULTADOS
2.4. Secuenciacióndel oDerón de la 4-HPA-bidroxilasa
El análisisde la expresiónde los genescontenidosen el plásmidopAJ22 mediante
la técnicade maxicélulasindicó que el fragmentoHindIII-PvuII de 2,5 kb conteníael gen
que codifica para la 4-NIPA-hidroxilasa.Este plásmido fue utilizado como punto de
partida para la construcción de una serie de subclones (plásmidos pM24-28) (tabla 10 y
figura 22). Los fragmentosdonadosen estosplásmidosfueron secuenciadospor ambas
cadenasrevelandola existenciade dosmarcosde lecturaabiertos(ORFs) que parecían
estarformandopartede la mismaunidadde transcripción.La región de DNA analizada
esla comprendidaentrelos nucleótidos9.185 y 11.695 de la figura 23, dondeseindican
los oligonucleótidossintéticosutilizados en la secuenciación.En la figura 23 sepuede
observarque la primeraORF comienzaen el nucleótido9.258 y su codonde iniciación
estáprecedidopor la secuenciaAGAGG correspondientea un posible sitio de unión al
ribosoma(RBS). La masamoleculardeducidade estaORE era de 58.781 Da que se
correspondíacon el valor de la masa molecular de la proteína HpaB determinada
mediantela técnicade maxicélulas(figura 12). El codonde iniciación de la segundaORE
estálocalizadoen la posición 10.838de la figura 23 y, como en el casoanterior, está
precedidopor un posibleRBS que se correspondecon la secuenciaAGGAGG. Esta
ORE codificabaparaun polipéptido cuya masamolecular(18.679Da) se correspondia
con la observadaparala proteínaC (figura 12) a la que se denominóHpaC por estar
codificada en el mismo operón que HpaB. En la región inmediatamenteposterioral
extremo3’ del genhpaC, entrelos nucleótidos11.357-11383,se encontróun posible
terminadorde la transcripciónRho-independientecon un energíalibre de -22.6 kcallmol,
lo queparecíaindicar quehpaCerael último gendel operón.
Paradeterminarla presenciade otros genesque formaranpartedel operónde la
hidroxilasaen la regiónanterioral extremo5’ del genhpaB, seconstruyóunagenoteca
EcoRVcon el DNA deE. coli ATCC 11105 en pUCiS. Asi se aisló el plásmidopAJ33
(figura 14) que contenía un fragmento EcoRV de 2,6 kb situado entre los nucleótidos
8147-10.788 de la figura 23. El análisis de la secuencia de este fragmento reveló la
existenciade otro genal que sedenominóhpaA, que terminaba en el nucleótido 9.005 de
la figura 23. Aunque el gen hpaA no estaba aún completo en su extremo 5’ terminal,
90
RESULTADOS
Tabla 10. Plásmidosconstruidos para la secuenciaciónde la ruta del 4-HPA
Plásmido (kh) Vector Diana
del Vector
Inserto
Diana (pb) Procedencia
HindllI
Hin dIll-EcoRI
Sal!-EcoPJ
H¡ndlll~EcoRV*
EcaPJ
PstI-Ba,niI1
PstI
Pstl
Hindlfl-Hind.ll
Pstl-HindJr
Srnal
Srnai*
Ban,l{1-Sn¡aP
Dan,Hl
ffindtfl
Hitidr-EcoPJ
Ban¡HI
BamHl
Ban,W-EcoRl
EcoRI
BamHI~SmaI*
Sn¡alY
S,naI*~BarnHt
EcoRI
EcoRI
Hindfll-EcoRI
HindJiIl
HindIll-EcoRl
SalI-EcoRI
Hindffi~Pvull*
EcoRI-Hindffl
PsII-Pvufl’
PstI
PMI
H¡ndffi.SspP
PstI-EcoRv
PvuhI*
EcaRV
Ban:HI-EcoRv
EcoRvtBarnill
HindIfl~EcoRv*
PvulltEcaRI
DaniEl!
Ban,HI
BamHl-EcoRI
EcoRI
Ban¡HI~EcoRV*
EcoRV*
EcoR’P-BamHI
EcoRI
EcoPJ
Hin dIU-EcaRI
8.593
4.890
4.822
2.506
3.510
163
800
1.341
1.717
739
1.319
2.641
1.868
733
1.038
1.065
2.521
6.017
2.631
11.061
4.566
288
1.163
5.900’
5.900’
s.ooo’
pUC 18 HindIl-EcoRI HindiI-EcoPI-EcoRi 16.000’
GenotecaHindm deE. col! ATCC 11105
DeleciónEcoPJdepAJI 9
DeleciónSal! depAJ2O
FragmentoHindffl-Pvull depAJ2O
FragmentoEcoPJdepAd19
FragmentoPstI-BamHldepAJ22
FragmentoPM! depAJ22
FragmentoPsi! depAJ22
FragmentoIlindffi-SspIdepAJ22
FragmentoPsti-EcoRvdepAJ22
FragmentoEvul! dePAJ2O
GenotecaEcoRVdeE. cali ATCC 11105
DeleciónBarnHl depAi33
FragmentoBamI{l depAJ33
FragmentoHindllI depA.J33
FragmentoPvull-EcoRldepAJ2O
GenotecaBornE?!deE. cali ATCC 11105
GenotecaBornE??! deE. col! ATCC 11105
DeleciónEcoR!depHCB1
GenotecaBeoRídeE. cali ATCC 11105
DeleciónEcaav-SrnaIde pivlCB 1
FragmentoEcoRvde pHCB1
FragmentoEcoRV-BamnidlldepECE1
GenotecaEcoRIdeE. cali ATCC 11105
FragmentoEcoRIdepiziCRí
DeleciónHindffi depHCR.1
DigestiónEco]?) pI-ICR3 ligado a fragmento
EcoR!depHCB3
* Dianaderestricciónperdidaduranteelprocesodedonación.
a Tamañoaproximado.
+: PromotorE,,. orientadoenel sentidode la transcripcióndelos operonescatabólicos.
- PromotorEiac orientadoenel sentidocontrarioal de la transcripcióndelos operonescatabólicos.
pAlI 9
pAJ2O
pAJ2I
pAJ22
pAJ23
pAJ24
pAJ25
pAi26
pALJ27
pAJ28
pAJ32
pAJ33
pAJ34
pAJ35
pAJ36
pAJ37
pAJ3S
pECE1
pECE2
pHCI33
pHCE4
pECES
pHCE6
pHCRi
pHCR2
pECR3
pAJ4O
13
9,2
8,5
7,8
7,8
3
3,5
4
4,4
3,4
4
5,3
4,5
3,4
3,7
3,7
5,2
8,7
5,3
13,7
7,2
2,9
3,8
8,5
10
7,6
19
pBR322
pBR322
pBR322
pBR325
pACYCI84
pUC 19
pUC19 ±
pUC19 _pUC 19
p1IJC 18
pUC18 _
pUC 18 —pUC18
pUC18 -
pUC18 +
pUC18
pUC¡8
pUCi8 -pUC 18
pUC ¡8 -
pUC18
pUC18 —pUC 18
pUC 18 -
pACYCI84
pUC18
91
RESULTADOS
parecía no formar parte del mismo operón que los genes hpaB y hpaC ya que en la
región dc 254 pb comprendida entre los genes hpaA y hpaB existía una secuencia de
nucícótidos capaz de originar una posible estructura de bucle con una energia libre de -
19.8 kcalimol, que podría actuar como un terminador de la transcripción (nucleátidos
9.044-9.084 de la figura 23). Por otra parte, el promotor del operón de la 4-NIPA-
hidroxilasa fue localizado en la región situada entre el gen hpaA y el operón hpaBC,
como se demuestrará en el apartado 4,1.
La proteínatruncadaHpaA se parecía(21,4%de identidad) a la proteínaMeIR
de E. coli (figura 31), un miembro de la familia de reguladoresde transcripción
XyIS/AraC (Gallegosy cols., 1993), lo que indicabaque HpaA podria seruna.proteína
reguladora.La secuenciade HpaiB no mostró una similitud significativa con ninguna
proteínasecuenciadahastael momento,a diferenciade la proteínaHpaCque separecía
(24,7% de identidad)a la ORF6 del clusterde genesde la síntesisde actinorrodinade
Streptomycescoelicolor (Fernández-Morenoy cols., 1992)(figura 15).
pAd2S
>4e/Ec OsP Ss HelEe
EcSs/HcB Ss H
Ss/NcPE
1B~P Ss S~ >4Y
Pv/OcPEcO, Pj ?(~ 7 7 Ss Ss H
Pv’OcPOcOs P SS SS SsH
Vr’ ~ 1 Y
P Oc/SmSsN,~$m/Fc
pAJ2THSP
PAJ271 EpAJ22
dSP
pAJ22I ESm/Oc SsE3 HSP
1 MWpAJ33
Oc SsBHSP PEcO, PPv
—~ — —
¡pcA ~cB hgcc
1
’
1W
Figura 14. Mapa de restricción de los plásmidos pAJ28, pAJ27, pAJ271, pAJ22,pAJ22I y pAJ33. Símbolos: U, pUCI8 y pUCI9; ~9 pBR32S; ~, pACYC1S4; Uregión donada. Las flechas indican la dirección de transcripción de los genes.Abreviaturas:B, BamNIl; Ec, EcoRV;Hc, HindII; H, HindIII; P,PstI;Pv, PvuII; S, Saft;Sm, SrnaI; Ss,SspI.
92
RESULTADOS
HpaC NQLDEQRLRFRDAMASISAAVNTITTESDADNA-GLRQRPSCSVTDTPPSLMVCINANSA59
:1 :1:::: II: :11 :11::ORES MAADQSML--RDAMARVPAGVATNTAHDRGGVPHGF’TASSFVSVSMEPPLALVCLARTAN 58
HpaC MNPVFQGNGKLCVNViNHEQEVMARHFASMTSMP~4EERFSLSCWQKGPLAQPVLKSSLA5 119
ORES SFPVFDSCGEFAVSVLREDHTDLAMRFA----BKSADKFAGSEFVRTARGATVLDGAVAV 114
HpaC LESEIROVQAIGTHLVYLVEIKNITLSAEGHGLTYFKRRFHPVI4LEMEAAI 170
:1:::: :1:1:: 1:::: :1 :jIl :1OREE VECTVHERIPACDHIILLGEVQSVHVEERGVPAVYVDRRFAAICSAAGACPSATGRGVPH175
OREE AS 177
Figura 15. Alineamiento de la proteína HpaC y la ORF6 del cluster de genesde lasíntesisde actinorrodina de S. coelicolor. y : indican, respectivamente,aminoácidosidénticosy conservados.
2.5. Implicación de la proteína HpaC en la actividad hidroxilasa
Como se comentó en el apartado 3.2.1.1. de la Introducción, la 4-HPA-
hidroxilasa de P. putida es un sistema enzimático formado por dos componentes
proteicos; una flavoproteina homodimérica, que cataliza la oxidación de NADH
dependientede 4-1-IPA, y unaproteínacooperadora,que acoplala reacciónde oxidación
de NADH a la incorporacióndel grupohidroxilo en el anillo aromático(Arunachalamy
cols., 1992). En este sistema, la transformaciónde 4-HPA en HIPC dependede la
presencia de ambos componentes.
93
RESULTADOS
Durantela subclonacióndel gen hpaB se había observado que, en las mismas
condiciones de incubación, E. cok DH1 (pAJ27) presentabaun fenotiponegro menos
acusado que las cepas que producían conjuntamente las proteínas HpaB y HpaC. Este
hecho podría ser atribuido a una diferencia cuantitativa en la expresión del gen hpaB en
estos clones pero, teniendo en cuenta el mecanismo de reacción descrito para la 4-NIPA-
hidroxilasade P. pulida, y que los genes hpaBy hpaC forman partedel mismo operón,
cabía la posibilidad de que la proteína HpaC actuara como proteína cooperadora
incrementandola actividadhidroxilasade HpaB.
El plásmidopAJ271 seconstruyóligando el fragmentoHindIII-BamHI de 1,7 kb
al vector pACYC184 digerido con las mismas enzimasde restricción(figura 14). La
mezclade ligación se utilizó paratransformarcélulascompetentesde E. colí DHI y los
clones recombinantes se seleccionaron en base a su resistencia a cloranfenicol y a la
producción del fenotipo negro al incubarlos en medio LB. Comoen el caso del clon Dii
(pAJ27), el fenotipo negro que presentaba la cepa DH1 (pAJ271) no era tan acusado
como el de Dii (pAJ221) a pesar de que, la proteína HpaB se producia en la cepa DRí
(pAJ27l) a unos niveles similares a los de el clon DH1 (pM221) (datos no mostrados).
El plásmido pAJ27l se utilizó para transformar las células competentes de E. cok DH1
(pAJ28). En la figura 16 se puede observar el fenotipo negro que presenta la cepa Dii
(pAJ271, pAJ28) al incubaría en medio LB comparado con las cepas DH1 (pM271) y
Dl-II (pAJ28) incubadasen las mismascondiciones.El plásmidopAJ28 sólo contieneel
gen hpaC por lo que el incrementode laproduccióndel pigmentonegro, y por tanto, el
incremento de la actividad hidroxilasa observado en la cepa DH1 (pAJ271, pAJ28)
respecto a la cepa DH1 (pAJ27 1), sólo puede atribuirse a la presencia de la proteína
HpaC.Los resultadosque se muestranen la tabla 11 indican que las célulasportadoras
del plásmido pAJ271 presentan una actividad hidroxilasa muy baja que aumenta
considerablementeal añadirel extractocrudo de la cepaDH1 (pAJ2S) a la mezclade
reacción.Cuandolos geneshpaB y hpaC se expresan en la misma célula en cis (DH1
(pAJ221) ó en tratis (DH1 (pAJ271, pAJ28)), los extractosson capacesde transformar
eficientemente el fenol en catecol. Por otro lado, se observó que la oxidación de NADH
dependientede fenol aumentaconsiderablementecuandoambasproteínasestánpresentes
en la mezclade reacción(tabla 11). Estos experimentospermitierondemostrarque la
94
RESULTADOS
Tabla II. Actividad h¡drox¡lasa dc los extractos de E. ccli
Actividad (mU>’
Oxidación de NADH
-FAD d-FAD
Formación de RMS
-FAD ±FAD
DHI(pAJ22I) 34 47 46 58
DHI(pAJ27I> 1 2 1 4
DIII (pAJ2S) NDS ND ND ND
DHI(pAJ27I,pAJ2S) 18 50 23 63
DHI(pAJ27I) + DHl(pM28) 10 42 10 51
a
Actividad (mU): La actividad hidroxilasa se ensayó utilizando fenol 2 mMcomosustrato. El FAD se añadió a la mezcla de reacción a una concentración final de 0,6 uM.
300-
50 -
~0
¡o
1—ox
o0 2 3
íog [r~o] (nM)4
Figura 17. Dependenciade la actividad 4-HPA-hidroxilasa por el FAD. Los nivelesde oxidación de NADHdependiente de 4-HPA se determinaron utilizando una mezcla1:1 de los extractos celulares de E. cokDHI (pAJ27I) y E. cali DIII (pM2S).
Cepa
no detectado
4Cosc-J>0~
o’.—r‘cl4zo-
rD
oclo
1~-cicl
96
RESULTADOS
2.6. Purificación de la bidroxilasa HoaR
Las enzimas dependientes de coenzimas derivados de la adenina interaccionan
específicamente con la molécula de Cibacrón blue que presenta analogía estructural con
esta base púrica (Stellwagen y Baker, 1976). Dado que la 4-ILPA-hidroxilasa es una
enzima dependiente de NADHy FAD cabía la posibilidad de que el Cibacrón blue
pudiera actuar como ligando de adsorción de esta proteína. De este modo se podría
conseguir la purificación de la enzima en un número reducido de pasos mediante
cromatografia de afinidad. Para purificar la hidroxilasa HpaB se utilizó el extracto crudo
de la cepa E. cok DHI (pAJ221)ya que estacepahiperproducía la 4-}WA-hidroxilasa
(figura ISA). El proceso de purificación de la enzima se llevó a cabo mediante una
cromatografia de afinidad en una columna de Cibacrón blue 3GA-agarosa 3000-CL
equilibrada en tampón fosfato sódico 20 mM, pH 8 y eluida con el mismo tampón
conteniendo NADH 30 mM. Las fracciones que presentaban actividad hidroxilasa se
concentraron con polietilenglicol 20.000y se cargaron en una columna de filtración en
gel de Superosa 12 HIR. Durante todo el procesode purificación la medida de la
actividad hidroxilasa se llevó a cabo por el método acoplado con la C230 de P. pulido
dada la alta sensibilidad y reproducibilidad de este sistema.
En el análisis en geles de poliacrilamida-SDS que se muestra en la figura 1SB
puede observarse que la proteína HpaB queda retenida en la resma y eluye
específicamente al afiadir NADH al tampón de lavado. Lo mismo sucede con la
cloranfenicol acetil transferasa (CAT) codificada en el plásmido pAJ22 1, ya que la CAT
esuna enzimadependientede acetil-CoA y por tanto, susceptiblede ser purificadapor
estetipo de resinas(Stellwageny Baker, 1976).La proteínaHpaCeluye de la columna
duranteel procesode ¡avadolo queindica que la interacciónentrelos dos componentes
de la 4-UPA-hidroxilasa es muy débil.
El extractocrudo presentabauna actividadespecíficade la hidroxilasade 50 mU
sobre el fenol. Al contrario de lo que cabria esperar,estaactividaddisminuyóa lo largo
del proceso de purificación obteniéndose al final un valor de actividadespecíficaparala
proteínaHpaB purificadade tan soloiS mU en presenciade FAD 0.6 lilVí, pero que
97
RESULTADOS
En la figura 19 se muestra e! cromatograma correspondiente a la elución de la
enzima HpaB purificada de la columna de Superosa 12 1-IR con un tiempo de retención
equivalente a una proteina de 120.000 Da, lo que sugiere que la proteina HpaB nativa es
una enzima homodimérica.
La purificación de la hidroxilasa HpaB permitió determinar la secuencia de
aminoácidos MK.PEDFRASTQRPFTGEEYL, correspondientea los primeros 19
residuos del extremo N-terminal. Esta secuencia coincide exactamente con la del N-
terminal de la proteína HpaiB deducida a partir de la secuencia de nucleótidos.
B
1
L 1 1
0 20 40
t (m¡n)
1 1
60 80
1~ .Th~ffi _ ffi
0 20 40 60 80
t ( ini n
Figura 19. Determinación de la masa molecular de la proteína HpaB mediantefiltración en LIPLC. Panel A: 1, aldolasa (160 kDa); 2, seroalbúmina (67 kDa); 3,ovoalbúmina (45 k.Da). Panel B: proteína HpaB (120kDa).
A
2
3
99
RESULTADOS
2.7. Presenciade 2eneshomólo2osa hpaBen otros microor2anismos
Teniendo en cuenta que el 4-HPA y 3-NIPA eran buenos sustratos de la
hidroxilasa (tabla 9) y que había sido descrita la presencia de una hidroxilasa de 3-NIPA y
4-NIPA en E. cok C (Cooper y Skinner, 1980), cabíapensarque el operón hpaBC
formara parte de la ruta de degradación de estos compuestos en E. cokATCC 11105 y,
por tanto, otras estirpes capaces de mineralizar estos compuestos podrían tener genes
homólogos a hpaB. Utilizando como sonda el fragmento HindIII-EcoRV de 1,6 kb del
plásmido pAJ27 se investigó medianteanálisispor Southemblot la presencia del gen
hpaB en otras estirpes (figura 20). Estos análisis indicaron que las estirpesB, C y W de
E. co/¿ así como otros microorganismos capaces de degradar el 4-NIPA como K
pneumon¡aey K dftrophila, contienen genes similares a hpaB. Los genomasde dos
estirpes diferentes de E. cotí K12, DHI y W3 110, no contienen ningún fragmento de
DNAhomólogo. Esta sonda flie utilizada para donar la 4-NIPA-hidroxilasa de E. cok C
mediante la construcción de una genoteca Hindilí en pBR322. De esta forma se aisló el
clon DH1 (pHd) que contenía un fragmento Hindilí de 6 kb y presentaba un fenotipo
negro similar al de los clones que expresan la 4-NIPA-hidroxilasa de E. cok W(ATCC
11105). La secuenciación de los extremos de este fragmento nos permitió deducir la
secuencia de los primeros 45 aminoácidos de la hidroxilasa de la estirpe C, que era
idéntica a la secuencia N-terminal de la 4-HIPA-hidroxilasa de la estirpe W, E. coil
ATCC11105.
100
RESULTADOS
3. CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL OPERÓN metaDE LA RUTA DEL
4-HPA
3.1. Clonación del operón metay construcción del mapa fisico de la ruta del 4-RFA
K pneumoniaeM5al esun microorganismocapazde utilizar 3-y 4-HPA como
única fUente de carbono. En el apartado 2.7, se comprobó que existen secuencias
homólogasal gen hpaB en el DNA de estabacteria y por otra parte, sehabia descrito
queotrosgenesde la rutade degradacióndel 4-HPA de K pneumoniaesonhomólogos
a los genesequivalentesen E. cali W (Fawcetty cols., 1989).Portodo ello, se analizó
medianteSouthernblot la posibilidad de utilizar como sonda el gen de La HPC-
dioxigenasade K. pnewnoniaeMSal para donar el operón meta de la ruta de
degradacióndel 4-HPAdeE. cali ATCC 11105. En la figura 21 se muestrala presencia
de genessimilaresal de la HIPC-dioxigenasade K. pneu¡noniaeen las bacteriascapaces
de mineralizarel 4-HIPA como K. citrophila y las estirpesB, C y W de E. cok.
Posteriormentese construyerondiferentesgenotecasde E. cali ATCC 11105 en pUC18
utilizando la mismasondaparala selecciónde célulasrecombinantesportadorasde genes
homólogos a la HIPC-dioxigenasa. Mediante este procedimiento se aislaron dos
plásmidossolapantes,pHCB1 y pHCB3, queconteníanun fragmentoBamHI de 6 kb y
un fragmentoEcaPJde 11 kb, respectivamente(figura 22). Al incubarlas célulasque
conteníanel plásmido pHCB3 en medio LB se observóque producíanun pigmento
negrosimilar al observadoen las cepasque conteníanel plásmidopA.J19, lo queindicaba
que el fragmento EcaRI donado en el plásmido pHCB3 podía contenerel operón
hpal3C. Esto se confírmóposteriormentemedianteSouthernblot y análisisbioquímico.
El fragmentoBarnHI-EcaRI de 2.7 kb del plásmido pHCB1 seutilizó como sondapara
seleccionarel plásmidopHCRI a partir de unagenotecaEcoPJ(tabla 10, figura 22). El
análisisde restricciónde estosplásmidospermitió determinarel mapafisico de la ruta
completadel 4-HIPA (figura 22).
102
RESULTADOS
3.2. Secuenciacióndel clusterde senesquecomponenla rutadel 4-HPAdeE. colí
ATCC 11105
La secuenciacióndel grupode genesquecomponenla ruta de degradacióndel 4-
HIPA y de partede las regionesflanqueantes,Ibe llevadaacabomediantesecuenciación
manualy automática.Paraello seconstruyeronlos plásmidosdetalladosen la figura 22 y
en la tabla 10, y se utilizaronlos oligonucleátidossintéticosmarcadosen la figura 23. El
análisis de los marcosde lectura abiertos(figuras 22 y 23) y de la comparaciónde
secuencias(figuras 15, 25-35), sugirió que estaruta estabacompuestapor oncegenes,
ocho de los cualesestabanorganizadosen dos operones;el operón de la 4-NIPA-
hidroxilasau operónhpaBC,y el operónhpaGEDFHJu operónme/cc Ademásexisten
dosgenesreguladoreshpaRy hpaA, y el genhpc¿X~ de fUnción desconocida,que parece
formarpartede la misma unidadde transcripciónque hpaA. Paralelamenteal desarrollo
de estatesis, el grupo del Dr. Cooperha secuenciadoy caracterizadobioquimicamente
las enzimaspertenecientesal operónhpcECBDGHu operón me/ade la estirpeC de E.
coli (apanado5.1.1 de la Introducción). Dada la homología entre las proteínasque
componenlos operonesme/ade ambasestirpes,la fUnción de las enzimascodificadas
por el operónhpaGEDFHIfUe atribuidade acuerdoa lo establecidopor estosautores
parala estirpeC de E. cali. En la figura 24 se detallanlos pasosenzimáticospropuestos
parala conversiónde 4-NIPA en piruvatoy succinatosemialdehído.
El primer gen del operónme/a es el gen hpaG (nucleótidos 85 1-2.138 de la
figura 23)quecodificapara unaproteínade46.927Da y eshomólogoal genhpcEdeE.
cali C (Ropery Cooper, 1993)que codificaparaunaenzimabitbncional que catalizala
descarboxilación del ácido 5-oxo-pent-3-en-1,2,5-tricarboxílico (OPET) y la
isomerizacióndel productode la reacciónde descarboxilación,el ácido2-hidroxi-hept-
2,4-dien-1,7-dioico(HHDD) (figura 24). La diferenciamás notable entre la proteína
HpaGy la proteínaequivalenteHpcE esque la primeratiene 24 aminoácidosmásen su
extremo C-terminal debido a una terminaciónprematurade la transcripción del gen
hpcE,provocadaporuna deleciónde 7 pb en su extremo3’. SehapropuestoqueHpcE
podríaprocederde unaduplicacióngénicaya que el N-terminal de estaproteínaesmuy
similar a suC-terminal(Ropery Cooper, 1993).En estesentido,el alineamientoentreel
104
RESULTADOS
N- y C-terminalde HpaGesmásprecisodebidoala contribuciónde los 24 aminoácidos
adicionales(figura 25). También se había descrito que HpcE se parecíaa la 4-
oxalocrotonatodescarboxilasacodificadaporel gendmpHde la ruta de degradaciónde
fenol de PseudomonasCF600 (Shingler y cols., 1992) y a una proteína de fUnción
desconocidaque parecía formar parte de la ruta de degradaciónde catecol de
Alcaligeneseutrophus(Kabischy Fortnagel,1990). Porotra parte,el productodel gen
hpaH (nucleótidos4.957-5.758de la figura 23) también se parecea la descarboxilasa
DmpH de PseudomonasCF600 (figura 25.). Estegen codifica para una proteínade
29.714 Da homóloga a la hidratasadel ácido 2-oxo-hept-3-en-1,7-dioico(OHED) o
proteína HpcG (Roper y cols., 1995) (figura 24). En la figura 25 se muestra la
comparaciónde la secuenciade aminoácidosde las proteínasHpaG y HpaI-1 con otras
descarboxitasase hidratasasde diferentesmicroorganismose incluso de organismos
eucariontes.Por último, hay que destacarque no se ha encontradoninguna isomerasa
quepresentesimilitud con HpaG.
El gen hpaE (nucleótidos2.137-3.601)codificaparaunaproteínade 53.011 Da
pertenecientea la superfamiliade las aldehidodesbidrogenasas(Horn y cols., 1991).La
deshidrogenasaHpaE es homólogaa la CHMS-deshidrogenasacodificadapor el gen
hpcC de E. coil C (Ropery cols., 1995). En la figura 26 semuestrael alineamientode
estasproteínascon la deshidrogenasaDmpC de la ruta de degradaciónde fenol de
PseudomonasCF600 (Shingler y cols., 1992). Como en el caso del gen hpcE, una
deleciónen el extremo3’de hpcC provocala terminaciónprematurade la transcripción
dandolugara unaproteínacon 18 aminoácidosmenosquela enzimaHpaE.
El genJipaD (nucleótidos3.605-4.454dela figura23) codificaparauna proteína
de 32.018Da homólogaa la HPC 2,3-dioxigenasade E. cok C codificada por el gen
hpcB(figura 27) (Ropery Cooper, 1990a).La diferenciamás importanteentreestasdos
proteínasfUe observadaen el C-terminal dondeuna inserciónde 2 pb en el gen hpcB
provocaun cambio en la fase de lecturaprovocandouna pérdidade similitud en los
últimos 23 residuosde UpaD. Estasproteínasno presentanningunasimilitud con otras
dioxigenasassecuenciadaslo que sugiereque puedanformar partede una nueva familia
de dioxigenasas.
105
RESULTADOS
La proteínacodificadaporel genhpaF (nucleótidos4.466-4.844)esidénticaa la
5-carboximetil-2-hidroximuconato-isomerasa(CHM-isomerasa)de E. cali C (figura 28)
(Ropery Cooper, 1990b). Como en el caso de la HPC-dioxigenasa,estaenzimano se
pareceaningunaproteínasecuenciadahastael momento.
Segúnel trabajode Ropery cols. (1993),la última enzimadel operónme/aes la
2,4-dihidroxi-hept-2-en-l,7-dioato-aldolasa(HHED-aldolasa) codificada por el gen
hpcH(GeniBank/EMBL ac. Z47799).El genequivalentehpal (nucleótidos5771-6.557)
codifica paraunaproteínade 28.072Da idénticaaHpcH. Además,HpaI essimilar auna
ORE incompletacodificadaporun gende fUnción desconocidalocalizadoen la región5’
de dos ORFs relacionadascon el metabolismodel gluconato en E. cok (Komine e
Inokuchi, 1991).El gradode identidadentreHpal y estaproteínaesdel 44%(figura 29).
El gen hpaR (nucleótidos577-133 de la figura 23) se transcribe en sentido
opuestoa los operoneshpaBCy hpaGEDFHJ(figura 24).Codifica paraunaproteínade
17.235Da idénticaa la proteínareguladoraHpcR (figura 30) que actúacomorepresor
del operónme/ade E. cali C (Ropery cols., 1993). Estasproteínasno separecena
ningunaproteínareguladoradescritahastael momento,El gen hpaA (nuclcótidos8.120-
9.005) codifica para una proteínade 34.129Da que conservala secuenciaconsenso
presenteen los miembros de la familia de reguladoresXyIS/AraC (Gallegosy cols.,
1993) (figura 31).Estegen pareceformarpartede la mismaunidadde transcripciónque
el genhpaX(nucleótidos6.734-8.108)ya queentreel codonde terminaciónde éstey el
codonde iniciación del genhpaA sólo hay 9 nucleótidos.La proteínaHpaX tiene una
masamolecularde 50.568 Day presentasimilitud con la proteínacodificadapor el gen
phtJ (34 % de identidad)de la ruta de degradacióndel fialato en P. pu/ida (INomura y
cols., 1992)(figura 32).La fUnción de la proteínaPhdno estáaúndeterminada,pero se
ha sugeridoquepodríaactuarcomo un reguladorpositivo de la expresiónde los genes
ph/ ó como un transportadorde fialato (Nomuray cols., 1992)ya que separecea la
proteínatransportadorade glicerol-3-fosfato(GIpT) de E. cali (Eiglmeiery cols., 1987)
pertenecienteal grupo4 de la superfamiliade transportadorestransmembranales(MES)
(Margery Saier, 1993).La comparaciónde la secuenciade aminoácidosde HpaX con la
106
RESU LTADOS
de los miembrosde estegrupocomo GIpT (49 % de similitud y 17 % de identidad),la
proteínatransportadorade fosfogliceratode S. typhimurium (52 % de similitud y 21 %
de identidad),la proteínatransportadorade hexosa-fosfatoUhpT de E. cali (46 % de
similitud y 20 % de identidad)y su proteínareguladoraUhpC (50% de similitud y 22 %
de identidad), sugirió que HpaX podía ser tambiénun miembro de estasuperfamilia.
Todos los miembrosde la MES tienenaproximadamente400 aay presentanun motivo
estructuralcomúnde 12 a-hélicestransmembranales.El perfil hidrofóbicode la proteína
HpaX (figura 33) essimilar al que presentanlos miembrosde la MES (Marger y Saier,
1993).
107
RESULTADOS
E
E
-~ PHCR3E
a ~ PHCRI
5 r pHCBIIIA Ec
Ec B
a Sc
pHCBS ~ A a
Lo 5LW p4435
Ec HpAJ36 L..ffi
A EcL........ffi pAJ34
E ,-~ ECSSIPVD RoSs SE Sc 5~b
OROS hpcR tocO 40oS 40o0 40cY hpofl 40o~
—A
SS SS SP Py30 j~ 4p4Pv Yi¡sox lpoA Ocas apeo ORE1=
p pw
Sc Ec
H SeII
pAJ26
pAJ3S
E’LW phJ2bEc E’L~ pAd2B
p Pv
H U p~J34PvpAJ22 L~......J
Pv Pi
p4~J32 ~
ESaEcE’, Ss 5CM.0L4’ ......L..J.J
OREO ORFI4
Pv E~ ph337
3 E¡ pAJRl
Fi E¼pA120 Fi
pA323Fi Fi
pAJl9
Figura 22. Organización f¡sica y mapa de restricción del cluster de genes de la rutacatabólica del 4-UPA y de las regiones flanqueantes.En la partecentralde la figuraestánindicadoslos geneslocalizadosen la región secuenciaday los sitios de restricciónmásrelevantes.En la partesuperiore inferior seindicanlos fragmentoscontenidosen losplásmidosutilizados para la secuenciaciónde estaregión indicando, únicamente,lossitios de restricciónutilizadospara la construcciónde los mismos(tabla 10). Las flechasen líneacontinuaindican el sentidode la transcripciónde los genesy las flechasen líneadiscontinuaindicanlas regionessecuenciadasparcialmenteen estetrabajo.Abreviaturas:B, BamHI; E, EcoRI;Ec, EcoRV; H, HindIII; P, PstI; Pv, PvuII; S, Safl,; Ss, SspI.
108
H
Fiu—
E
pHCB2
pHCB4
E
pM4OpHCB3
RESULTADOS
ACGT5TTAAQAT&2TTTCTCTTTCCTOTCOACCCATOC~2~OATTTTCGCCCT0OPALOCA
TGCAAAATTOTACCWO4~AAAOOACACCTOOC0AC0TTC~AAOAGCC0CACCTTTCOT
R Fc L >4 4-- 03115
?MACTTTATOAAAACCTOTAACCCOCCATcCATOOAI,AMCCACOCQCTGCT¶A:cAGA61
flTTCAMTAC~¶TTCCACATTOOOCCOTAO0TACCTTTTTCGTCCOC5ACC~ATAOICT
¶ACTM~AMOTTA0TCATTATCOCCCGOcATOTCTTC5TOTCOCGAATTACCCAOAOCAA121
ATGATTTTTCAATPAOTAATAOCOOGCCCCACASAAOAACAGCCCTTVJGOOICTCGTTE UDC PIDE O RS 14 OLA
ACC,OAOMOATOCCOCAGAOTACATC$CCGIOATAT$CGCTOGCTAACGATGTCAGCCT1061 oc~., 05200 1140
TOCACTTCTTÓTACGCCOTCTCATGTAZOCCCCTATACOCOACCGATTOCTACAOTCGOARE E DAAE Y 1 A GY AL AU DV SL
60
120
180
TM~ATTCCTCTAACAGA0GC0TT?ACOTTOCMTTTCTCGGCA0TMACICA63CTTCM’181 240
ATTTAAGOAGATTGTCTACCCAATTCAC>,CGTAPAAOAGCCGTCATITCACTCOM,GTT15511 11* líQ 014~ SAIS QAS
TOTOCCOAT6flc0OTTCTTCAOTCTGSOTCTGAGCGCCCTTATACACCOCCTOCCCCTCTT241 300
AGACO0CTATCC0A8SAAOTtAOACACAGACTCOCGCCM~TATOTCOCCGACGCCCAOAAI O A YAET lOT QA 386 Y LA 005
TCCTCAOCCACATATACAOCTTCCGOTOATCATTCATCCOCTI¶AATCGCMCACTMAC301 360
ACCAOTCGCTCTATATCTCCAAGOCGACTAOTAACSAOCCO?AATTACCOTTOTGATTTGsrí Sí YL KA 00 FOl PR IR 1 VI
COTCGCC¶¶CCATCCGCOTAAGOAIOOCOO3TCAO’SCTTOOOCOCAA,MTOCASOCOOGAT361 420
OCAOCOCAAIJCTAEOCOCAISCCTAGOOCCAOTCCGAACCCOCOTTTIACCTCCOCGCTAO O RISA 1 LI OT LS PR II CAR
ACOCCAGATCOTOPAAAT0CM 1041 0042111 CCOCOAGAPIACOCACGAIOCOCCAO?
421 480TOCGOTC1AOCACTTTTACCT?ACTACCTOXMOOCOC1CTTATGCOTOCTACOCCGTOAYA L 01450145? SEA LI iv’ iw
GTTGC?CAOIO2AATTAIOCCGTTTM,COATTGOOCOAAAXTAACTCAICOCCOC11CTC401 540
CAACOACTCAGTTTALJACGGCAAATTOCTAACCCOCTTTTATOGAOTAOCOOCGMCAOQQ E It 5863KV 1 PR PY SMAAE
OCOCCT004024400 244? 00 1 1401 0401201 OCA?SAI 011 ICCCC1OAAAMT1 044
541 05203 600COCCOACC1201TCCOT7400441 CACTCAOC400T44T4OAA40100400 111144011
R A O 1 1 A I T 1 8 0 >4 84 4-- AspaR
40724 AATAIAOAAACAOIT44TCAI2ACOI I400000ACIOCOCOOICCCTOCAATI
601 6601140144
1TA141CT1701C44114014010044100000T0400204C4000400110A
CCIO4SITI4ICM.AATtIAOCAT0TITTAIIAACTCACTOATAII1AAIATATICTTAI061 720
00401> VsA? AOTTTtA42TCOTACAAMI44TTOAOIOACTAI44ATT4I4IM,OMTA
C?IIAMTOIAA45A0?TIOITAATTACMCACATITACATCACTIACTIIIOCCAOACT721 CAP —35 780
045A1174047?1AICAMCMSIAAICTA0TGIAAAZ0TAOI0AAIOAAAACOOTIICA
420 2441 COCOA4TAkV,01A41241T4424147 1441241144041 041 2244102040
781 —10 84010201140 2 00 líA? 1 112A114014A1101A14411 42 744110 142 1400 11400 0 12
O4OTCOIACCAIOAAAOOC4CIAICIICOCCOTAOOOIIO442241202402244CIIOA841 800
C1CACCAIOOTAC1T7020IOAIAOAAOCOOOATCOCM2IICOIAOCOICOOIIO442IhpaG-~>4 RO TI Y AVAL U MR SQL O
T00A1000A004400011224024412000214244401CCC20221»AAC10200ICIO901 960
AC0IACCOICCIIC0 24N2s012011AO0000A1O111020000200A11110A20224040AVO E A E QQ SP Y RAP 2 Kl AVW
0TT1411444011020C44742001041T00170200104ACc0411222111cC4C4000961 1020
CA4A14471T002020114100042T44204A2022421100214000A4400101022FI K PRN TV 10 CG E? IP Y 200
10444400140104000010004270110002 10A1101000044440400040044011021 1080
42íí1120A10ACí2022420210424420204214424202011110120010211T24E 14V LS O A IVA LIVOR T Al KV
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2000211 2101004444100220020011401110011114240042742 0144042000PEES E Y R PAT RAI< CROO SC?
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2000201221020041242100440420020047114C440014J&02202424021021
1261 1220000002400A20021A010A221101000000140A101102A1100000010120420A
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4040020202010040A1A2422240000A120201000101121000404A00777222
1181 14401010c020002402IT1ATO1C00IC202140200A20242440A020121I00AAA000
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1441 1500C00204221111A000241CA22102170240112427001020201121204A000110PL EN PVVO E RE V 1 Ti Fc 5 F?I
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204200101000001022A1020424442000A02000A0110410000C1001020010LP 14 PRO T L SALOL 18 Y 40 MAS
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010420001411001210040024200000211011A1440114101A201041001120
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1681 1240
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441404020220041010024040A110010410 200144000 21041404201111041
Y VA OX IV C NO Y AIRO Y LEN Y
0142202CC144201020001444440200004000421040022041001112442241
1801 1860
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00102204 A0020A1C2200420202414A121042221120040011201244000
1861 :1920
00A000011121200014000201000201411404210004400010044024011020VP REA TPO? MU LI L R TE V>4 O
204011420224004400240242000 0041010410112400010020112010410001921 1980
0C1044100 0120112201 01000002140421404401200A20004400401A020
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214011440004411141040C21046122000204041041202242C00040A00444
1981 20400410441100211A841421000421140020200101A21402001002 0010100111
Y LS E SMI tU? 00>4TA 101? R
40001141C1042010010001002041044O100100120A401404400201000020
2041 soir coso 2100
10004414040102400420040000140112400402402110412112200AC22002
CL 50V VP 00EV VV EV E OVO R
0210010440004411010401040044404020444104440.44014441241100A122101 2160
00422401 100011 440421 24012211101 20211 142 11 11 1 1041 1 14014402140
L VN R IV 5551 ARhpaE—>X 1< R y U II 14 1
109
RESU LTADOS
44000744440TOT702ACO74400ACIAO77024OACCACC?A72000044C0001044
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020TT0200ACT1
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070070000041070022107002~S07044020040472A4104040001A020024020
221 2200
OA0C4220CCT4CACOOCAO420000ACTICOOO72I40II40TCCOCOAICOCCOI20OVL AOVAS CG EAE 1840 AVAAA
AA40ACCCC772200PAATOOOOOAAICIOCCOAIOAAAO40007000002COA70000
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REAS? XWA U LP MKE RARL MR
0072700020A1070410040040A4007022A0404720000004100A9JC22020042
341 coCc 24000040ACCC0074042140070010770040007072140200000140011100000010
RIO OLIO QN VP El AAO6E TAO
400002270000A10047040400Mc444707071041000A000007700C4C440111
401 24601G0C000A0000140C7401Cl0O77117A0424401A00C70C0C0A40O0707704~4A
IGL PI 14 Ql RU VII? RAS 14 NS
OAJ,
777770020044072100040040470440000440422141220017012040AA0
461 252007744444020007724040001007074C110000772100414000044040010170
ES SAE V C QQ >4840 Kl Y PVVO Fc
47001C44C74042027007004000001000007110100001007470000010044C521 2580
140040110470 700040242070002240000044404C00040047400000400110MI U XI L VO PV GVCA LV 5 ?WN
0142201174704220004041 0044007COCOC00707 0700C0070000447400000501 2640
2470024447 42 700000 701400 7 10040 000000404042 20 0042 2 007 74700000VP SMI A 1W KVAP CL AL CNT A
OTACTO44AATOTCOO44CIO72220007OAOOOO
7OAOOOOOIOCOIOAOCICOCOO7O
641 coz. 2700
C4704C77774C40021104040003030042100004270020042024010040200040
V LX MS E LS? LI A O RL CELA 1
04400020T417000004002010070442070074240000740000004400004000701 2760
077000004744000007020240042110042041070000470000007700001000E Aol? A GV L U VV OCX GATA O
047000070077COl04704704007400 7000070700772422002007420000400
:761 2820274200042244004074014070047004000C40400440100CCCCC4IOC CGO700OA L VR14 MO VRAV SF1001 Al
00000244041047044440000000270444A4474C1C0410044C10000001444021 2880
0C000077014074211777020000204C777771410400740C11040000004111
GR 841>4 KUAG 1 KR Y 5 >4E LOOR
720220010C70477177044047002047477044000000070040000000010110
081 2940
4000000400407444440710742000T474401T00000004CC70000000040440
PV LIS E O A 01 E RALO AA LS
42241211070041044000004420210042202000770020047 27 77477040044
041 3000
1001404404021A0770220077020400700000024A0202014044474407207711551840 E R CIA OS Allí QQ
4024707400000447 10077444000771000044000000440001C10000010000
¡001 3060
700740410000071440044117000444000C770000007700040400000A0000ST Y PS SV KA SAE RAU RL RVC
04100044004700t4474000A007 100002001141140004004004070004444,A
3061 312001400077 00740007 741000702440000000441 4470007007007040007777 7
OP 140 PUTO VG ALT 500 14WE K
07070000C 14147000101000 C4110440440000044CCC700100 CCOO0000000
¡121 3180
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111
RESULTADOS
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rOl —10 *1 0240
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Aspafl —>14 Fc P E O W A A 8 1 0 A 2 5 1
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10201 10261
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10441 10500
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10561 00620
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113
RESULTADOS
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777
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12721 12780
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114
RESULTADOS
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-7461 17520051377554<344ACC<3IICOS’149,002<3C1<31240014421247<3400CIGCACCCSAAA13
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17640P4<37442213747fl4742022<3TACG<327,TX’337A02027701774044A74C4<3r<30A27
DNA Y 114? MC Y E O AV 10<1 E SS
C<34250272402C9<3T0C483031440212241,74A74097C41303037,4<3241314427,24130S
17641 17700CCSO4C<34<3TC<3031C42072C4772134007141145135401CCC77007247707C5249,
SO E ALA PL SM Y Y MIS A IV C U
CAC04T241420411125477755247705472C1C5<3<3240051374144554132C445717460 17701 17760
031CC1407450C7Ak4045 49,449,07 41,247 7,00407,2207 224247 47 7 447 COCí144
V 1 14 A U A FI 0< 8< 4-- p.c
07,17,CI40C44CCA1,025i
17761 1.7779277,5047C1375<3C112044
Figura 23. Sentencia de nucleátidos y aminoácidos de los genes y enzimas que componen laruta catabólica del 4-RFA. En la figuraestá indicadala secuenciade nucleótidos de los genesdela ruta del 4-NiPA así como la secuenciade aminoácidosde sus productos: hpaR (represordel operonme/a); hpaG (5-oxo-pent-3-en-1,2,5-tricarboxilato(OPET)/2-hidroxi-hept-2,4-dien-1 ,7-dioato (HHIDD) descarboxilasa/isomerasa);hpaE, (5-carboximetil-2-hidroxi-mucónicosemialdehido(CHMS) deshidrogenasa);hpaD (homoprotocatecuato(HPC) dioxigenasa);hpaF (5-carboximetil-2-hidroximuconato(CHM) isomerasa);hpaH (2-oxo-hept-3-en-1 ,7-dioato (OHED)hidratasa);hpal (2,4-dihidroxí-hept-2-en-1,7-dioato(NIHED) aldolasa); hpaX (codifica para unaproteinapertenecientea la superfamíliade transportadorestransmembranales);hpaA (reguladordeloperónhpaBC);hpaB (componentede la 4-UPA-hidroxilasa);hpaC (proteínacooperadorade la 4-HPA-hidroxilasa).Tambiénestáindicada la secuenciade nucleótidosde los genessituados en lasregionesflanqueantesal ciusler: tsr (codificaparala proteínaquimiorreceptorade serma);ORFs 12,13 y 14 (codificanparaproteínasde función desconocida);pac(codificaparala penicilina O acilasa).En la figura aparecesubrayadala secuenciacorrespondientea los primers utilizados en lasecuenciación:3232A, 32RA, 333A, IiIIDROPRO, 038B-S,OBIA-J,OB2A-H, 0B2B3-9, 0B2K3 y5, 0B41-7, 0B61-5, 0D61-3, ORIA-F, PACEN, PAJ19A-B, PAJ19AC, PAJ2SR,PAJ26D,PAJ32B,PAJ32T,PM33B, PAJ36R,PM37A-C,PAJ38A. También está subrayadala secuenciacorrespondientea los posibles sitios de unión de la CAP y los posibles terminadoresde latranscripción.Las secuenciasREP seindicancon una líneadiscontinua.Los sitios de la iniciación dela transcripciónestánseñalados(+1), así como las secuenciaspromotoras-10 y -35. La secuenciapresentadaapareceen la basede datosGeneBankIEMlBLcon el númerode accesoZ37980.
117
RESULTADOS
SSOHO CH
8 -CH8—C<3OH
4-HPA -¡PC CHMS OHM
CH20300H CH8000H CH0000H CH2COOH
02’NOOH HAO
¡ ‘— —L~~ -< CHa 4’ < COOH
OH N COOH ¾ COOH
NAO NAOHOH ~- OH OH OH
¡$0
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OPEY FiFiDO OHED
CH2000H CH2000H
¡ COOH ‘
coo~?\ ¾ COOH
CO~O OH
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CH0000H CH>C<3OH
HO
CCOH ¾ COOH
O OHPy
O O H 1 CH,—C—-COOH
O
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¡ J* i’.Lkb OREI5hpaP
E Ec 8.fr
hpoC hpct ~cO hpaf hpcH ~oo1
En 81-1
AspaN hpaA
Ene-.Aspas AspaC ORn? 0flE13 0RF14
Figura24. Pasosenzimáticospropuestosde la ruta catabólicadel 4-RFA. Los pasosenzimáticosRieronpropuestosporRopery cola,(1993).Las flechasindican la direcciónde transcripciónde los genes.Las flechasen linea discontinuaindican los genesque hansido parcialmentesecuenciadosen estetrabajo. Los sitios de restricción son comosiguen:E, BamHI; E, EcoPJ;Ec, EcoRV;H, Hindilí; Los metabolitosintermediariosdela ruta del 4-NiPA estánindicadosen la partesuperiorde la figura. Abreviaturas:HPC,homoprotocatecuato;CHMS, 5-carboximeíil-2-hidroxi-mucónicosemialdehido;CHM,5-carboximetil-2-hidroxi-muconato; OPET, 5-oxo-pent-3-en-1 ,2,5-tricarboxilato;HHDD, 2-hidroxi-hept-2,4-dien-1,7-dioato; OHED, 2-oxo-hept-3-en-1 ,7-dioato;1-lEED, 2,4-dihidroxi-hept-2-en-1,7-dioato;Py, piruvato; SS Succinatosemialdehido.B,C, D, E, F, G, H e 1 representanlas enzimascodificadasporlos respectivosgenes.
H¡$0
EC Hti
502
118
RESULTADOS
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PodO HOOLDT7,RTC7,VRKAADLLYZA7RSOVAVVPVRRI4IGRTOLE44YAVQKVNTQPALVAGRRLVGRKIOLTSV7,VQKQLGVHQPDY
~phJ< MSPELIG7LGIIELYS7,LCSRSVVEPLTSPJWEITVEOAYHIQQFO4ISRRLQAGERVVGKKIGV7SMVMNMLOVYQPDFXylJ NDKTLIHELGDEIYQA=4VQREiVSPL7SRGFOISVEDAYHISLHOII4ERRLAAGERVIGRKIGVSSKAVQNMLGVHQPDF
»0386JII~BLG~¿$YQ7,MW0,REAVSPLTER0LDISVID7,YRbSLY~4LERRIAA0EKVYGKKI0V1SK4VQNML1JVHQPDF
¡<ptO IIPQDIAt4FDKHiHiLI4QRLDQAEKQREQIPAISLOY?EIIIEDAY4VQREWVRLKIAEGR7LKCHKTGLSSKPSNQASSQISEPDY8<paJl HPQOI7,NFDISHSI:AQRLQAEKQRCCIPAIS0.DYFEISIEDAYAVQREWVR0.KIAKGRTLKGHKIGLISI<P3’OQASSQISEPOY
Xy1I ~4R7INREQVL7,LAEHZEN4ELQ7,BDIHKVíMDYPEN5FAOAYíIQWEIF[BRKEER0NKIV01zfl4GL13WAM4AQMGVEíPIYDripH MNR7LSROQVI7,IACHIEHAELUVHDIPFINSWOYPOHIFADAYDVQWEIE’BRKBARGNKVV13LIQ4OL7SWAK=44QMGVESPIY
II: 77 77
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TMpcZ-N >4KGSIEAV4INHRSQLOAWQEAE’QQS-PYKAPRpoI—C RKSFP7LPHPHOTLP7,LOLNYADHASELEFKPCe. NS$LA<3EPNL7,SKIVCV<3RNYKIIHALELON7,I
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1: <:7 :7:7:1<1: 1:11 : :1<71 7 ¡ liii..Np•0C PEEPLVFI>KAPNILTOD¡OQ7SVRPNHIZYMHYE7,ZLVWIGKQA 1038V537,DAMDYVAOYiVCNDYAIRDYL—Et0—YYR—Upas—E E’KTAVWFIKP~47VIGC0DPT PFPQC-EPNLSG4TVALIVGICtA SKVREED7,AEYIAOY7,LAIODVS—---LPEESFYR—¡<poE-FI ?KTAVWFII*PFPSVIGCGEPIPEPQG-ENtLSCASVAOJVGIC?4 TKVREEDMEYIAGY4LANDVS--—-LPEESFYR-XpcE-C E’E13PLVFLK4PN1Lí<3ONQ1SVRPNF01.2YM04YE4EI~VVVIGKQA ¡9=AVSEADP4DYV7,OY7VCNDY4IRDYL-EN—YYR-CO. PKKPHLFVKTVNSFIVEOEPIV4PPOCQNLHQEVELGVVISKICA SRISKSDAVDyI<313YiV7,LD84TARDFQDEAKKAO7,
* * * 4 4* 0 *
BphZ I4IiDíI7,DN7,550LYVLGSiPKRLCIIFD7,RQAOMV7.OERQGVPVSSGVOSACLGS?LNA7OJWLAK’33’IAR7,ORPLPAGDTVLSGAIOPlodO RISDTIADN7,SSGLYVLOS7?KBLCOFDSRQAGHVI4ERQGIPVOSGVGXACLGAPLNAV0.WLARV14APAGRPLRSGOI7VLSGALGPBphR KIQDSVADNASCGHFVLCSSOADPRRIDLM7CGMVLEKNGEII7,TGAGA44L13SP’mSVAWtA»ILGRI
4GIGLKAGRVILSOALAAXy1J KIQDTV7,DNASCGLFVLGDCAVSPRQVCLViCONLVEKNGQItSTG7,G7,P,AL13SPVNCV7,WL7,NiLGHFGIGIKA<3EVILSGSLVPDopE KIQPIVADPO7,SCGI4EVLGLoQ7,VSPRQVDZViCGMVVEKHGHIISiO7,GA?ALGSE’VNCV7,WLAN7LGRE13IALKAOZVUS<3SIVPNpoO WFOTTSDH7,ANSGVILGGRPIKPDELDLRWISALNYF206VIEKiOVMGVLNHP4NGV7,WLANKLAPYDVQLEAGQIII4GOSFTRl8paJ< KVFDTISDNMNA<3VILGGCPIKPDELOLP&6ISALNYmIGVICETOVAAGVLNIIPPS4GVASOLANKLAPYOVQLE4GQIIL<3GSETRXylT tLISWADN7,SS1RYI5<30P34ANLEDVDLR1LGV’~4EK14GEVVELGAG7,4VI,0HPLSSVAJ40.ANLL7,ERGEHIP7,07EIM7G02T7,
DopM SLISVVADN7,SS5REIiG0QM414VAbLDLRiLGW74C¡Q4GKVVELGA0~VLGHP4SSMAJ4I~ANLL4ERGEHIPAG13FIM7G0I7A:7<77:7:77 7777:7<: II <II:: <:717 <¡77<7 ¡:1 771771
MpaC-C 2NLRVKSRl.<3L7PMLS7IVPKEAI?DpHNL7LR-—iFV7I13ELRQ~<3i1AD—LIF---SV?FL74YLSEF-M7LNP0DHIA70iPK<3
NpaO-N PAIF1.AKCRDGECPIGETV---—ALSNVDHLTIY—-7EINGRPAOHWN7AD-LQR--—NKAQLLS7,LSEF-AILNPGOAIOIG7PQ4NpcE—N E’AIKAKCRI<OFCPIGEIV—-—-ALSNVDNLSIY--7867N0RP7,OHWN7SD-LQR-——NMQtLSALSEF-7,TLNPODAILLG7PQA>tpa-C ?NLRVYSRIOGLiPHISTJVPYEAIPDPPIIL7LR--12V732.ELPQQG7iAD-LIF——-SVPPLIAYLBEF-H7LO4PGDMAIGiPPZGC.c. PWFLAKSFl.OSCPIGGFL-PVSDIPNPFIDVELF-—CKINGKDQQRCRS-DVMIE----DIItSLLEYT7QF—ESLEVGDWL7G7PAC
BphE MVPVAGGDVFOVRI7,GLGSVI7,VEAKElodO HVPV7,GGDVFOVRI7,<3L0SV7AAF7,8~SphM >-4FPAQAGDHFRVI7GGIG<3CSVRFHXy1J LEPVKAGDEI¶RVEIOGIGS7,SVREIDopE LEPVKAGDV1-RVOIOCIGS7,SVRE7NpoG PVP4RKGDTFHVDYGHNGSISCRVVNpaM PVP7,RKODIFHVDYGHHGSISCRFVXylI AV7,VAPCDFOI7VRYQCLGSVSARFV
DopN 4VPVAPGDNI7VRYQ<3LCSVSARE171117:71 :1:77:1::
NpaS—C LODVVP<3DEVVVEVEGVORI,VNRZVSEE7AKUpaS—U RVEIQPODRVRVLAEGFPPLZHPVVDEREVI7¡<poE-FI RVEIOPGDRVRVLAEGFPPLEH?VVDEREVTTNpOE-C LSDVX.IKe... V7ECNSOD---VTEEGL7DKLNSKFNVQ
Figura 25. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la hidratasa HpaH y ladescarboxilasalisomerasa HpaG con otras proteínas.BphE hidratasade Pseudomonas.sp.KKSLO2 (Kikuchi y col., 1994),TodOhidratasadeP.puada (Zylstray Gibson, 1989), BphHhidratasade Pseudomonassp. LB400 (Hofer y cols., 1994),XyIJ hidratasa de la ruta TOL(Hom y cols., 1991),DmpEhidratasadePseudomonassp. CF600(Shinglery cols., 1992),XylIdescarboxilasade la ruta TOL (Harayama y Rekik, 1993), DmpH descarboxilasadePseudomonassp. CF600 (Shingler y cols., 1992), C. e. proteina de Caenorhabdttiselegans(GeneBank/EMBLac.101366,100450)HpcG y HpcE, hidratasay descarboxilasade E. coil C(Roper y cola, 1995; Roper y Cooper, 1993). Los asteriscos indican los aminoácidosconservadosentre las hidratasasy las descarboxilasasDmpH y XylI. 1 y : indican,respectivamente,aminoácidosidénticosy conservados.
119
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120
RESULTADOS
HpaD MGKLALAAKITHvPsMYLSELPCKNHGcRQGAIDGHKEISKRCRENGVDTIIv 53
HpcB MGKLALAAKITHVPSMYLSELFGKNHGCRQGATDGHKETSKRCREMGVDTITV53
Hpafl FDTHWLVNSAYHINCADHFEGVYTSNETJPHFIRDMTYNYEGNPELGQLIAOEALKIGVRA113
liii 11111111111111111111111 111111111 ¡[liii 1111111111111111HpcB FDTHWLVNSAYHINCADHFEGVYTSNELFHFIRDMTYNYEGNPELGQLIADFALKLGVPA113
UpaD KABNTPSLKLEYGTLvPMRYMNEDKHFKVVSISAFCTvHDFADSRKLGFAILKAIEQYDG173
111111111[¡II:: 111111111 1:11111111111111111111111 1:11111111EpeE KAHNIPSLKLEYGSVVEt4RYMNEDKRFKVVSTSAFC’rVHDFADSRKLGERTVKAIEQYDG 173
Epan TVAVIASGSLSHRFTDDQRAEEGNNSYTREEDRQNDERvVKLWREGQFKEFCNNLPEYAD 233
111111111111111111111111111 III ¡ 111111111111111 Iii 11111111UpeE TVAVLASCSLSHRFIDDQRAEEGMNSYTREFDRQMDERVVKLWREGQFKEFCNMLPEYAD 233
Epa» YCYGEGNI4HDTVMLLGMLGWDKYDGKVEFITELFPSSGTGQVNAVFPLPA 283
HpcB YCYGEGNMHDTVMLLGMLGWDKYDGKVWSLSPSYSQASWHRSG 276
Figura 27. Alineamientode la secuenciade aminoácidosde las dioxigenasasilpaDy HpcB. HpcB es la HPC-dioxigenasade E cok C (Ropery Cooper, 1 990a). 1 yindican, respectivamente,aminoácidosidénticosy conservados.
121
RESULTADOS
flpaF MPHFIVECSDNIREEADLPGTJFAKVNPTLAATGTEPLAGIRSRvH 45III irrírírí II iii ííííí¡¡ííí í1 liii II
UpaD NPHEIVECSDNIREEADTJPGLEAKVNFTLAATGIEPLAGIRSRVH 45
HpaF WVDTWQMADGQRDYAFVHMTLKIGAGRSLESRQQAGEI4IFELTKTHFAALP4ESRLLALSF 105
:111 111111111 111111111 1111111111111111111111111UpaD WVDTWQNADSQHDYASVHMTLKTGASRSLESRQQAGEMLFELTKTHFAALNESRLLALSF105
HpaF El EELHETLNFKQNNVHALFK 126
[11111111 111111111 IIIUpan ETEELHPTLNFKQNNVHALFK 126
Figura 28. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las isomerasas HpaF yHpcD.HpcD esla CHIvI-isomerasade E. cali C (Ropery Cooper, 1990b). y: indican,respectivamente,aminoácidosidénticosy conservados.
122
RESULTADOS
Epal MENSFKAALKAGRPQIGLWLGLSSSYSAELLAGAGFDWLIJIDGEHAENNVQTV53
HpaI LTQLQAIAPYPSQPWRPSWNDPVQIKQLLDvGTQTLLVEt4VQNADEAREAVRATRYPPA113
¡:1 ::I:I:I:::II II :11111:Rnpbl DIGFYNFLTPFVETKEEAELAVASTRYPPE 30
HpaI GIRGVGSALAPASRWNRIPDYIQKANDQMCVLVQIETRE.AI4KNLPQILDVESvDGVFIGP17311111::
Rnpbl GIRGVSVS—HRANMFGTVADYFAQSNKNITILVQIESQQGVDNVDATAATEGVDGIINGP89
Epal AOLSADNGYAGNPQHPEVQAAIEQATVQTRESGKAPGILTANEQLAKRYLELGALFVAVG233
Rnpbl SDLAAALGHLGNASHPDVQKáIQHTFNPASAHGKFSGILAPVEADARRYLEWGATFVAVG149
HpaI VDTTLLAPAAEALAARFGAQATAVKPGVY 262¡ : :1:: II:
Pnpbl SDLSVFRSATQKLADTFKK 168
Figura 29. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la aldolasa ilpal conuna proteína de función desconocida de E. colí. La proteínaRnpbl truncadaestácodificadapor un gen de función desconocidalocalizadocercadel gen rnpB (Komine eInokuchi, 1991). 1 y: indican,respectivamente,aminoácidosidénticosy conservados.
123
RESULTADOS
EpaR MINCFYINDFEFFRGKINHDSITIALLQAR 30
IIIHpcR MINCFYINDFEFFRGKIMHDSLTIALLQAR 30
UpaR EAAI4SYFRPTvKRHNITEQQWRIvRILAESPSMDFHDLAYEACILRPSTJTGILTPMERDG90
Él ¡¡liii LIEpeR EAAI4SYFRPIVKRHNLTEQQWRIVRTLAESPSMDFHDLAYRACTLRPSLTGILTPMERDG90
EpaR LVLRLKPINDQRKLYISLTKEGQAIJYNPAQTQIEEAYRQTEAQFTAEKMQQLTHTJLEEFI150
111111UpaR LVLRLK?TNDQRKLYISLTKEGQALYNRAQTQIEEAYRQIEAQFTAEKMQQLTHLLEEFI150
UpaR AIGNSRQEUIPGDNE 165
HpcR ALGNSRQEDTPGDNE 165
Figura30. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las proteínas ilpaR yHpcR. HpcR es la proteínarepresorade la transcripcióndel operónme/a de la rutacatabólicadel HPC deE. cokC (Ropery cols., 1993). 1 indica aminoácidosidénticos.
124
RESULTADOS
HpaA MCDRQIANIDIS}~YDESLGTDDVHYQSFARMAPFLASMIPHRHEQYFQM 50
MeiR frfCSSDEKQTRSPLSLYSEYQRMEIEF----RAPHIMPT--SHWHGQ-VEV 49
HpaA HFLNSGQIELQI>DDHRYSVEAPIFVITPPSVPHAFITESDADGHV—--IT 97
MeiR NVPEDGOVEYLINNEKVNINQGHITLE’WACTPHQLTDTCTCQSNAIENL? 99
HpaA - VREDLIWPLLEVIJYPGTRETEGLPGICLSLADKPDELAALEHYWQLIERE 14?
MeiR NHLELSWPLDKDLI--NHVT}{CM--VIKSLA--TQQLSpFEVRRWQQEIN 143
HpaA 3--- -VEQLPGREHTLTL--LAQAVFTLLLRNAflDDHAASGMRGSLKIE 191:11: 1:11 :7:::: :11: :1:1:1:
MeiR SPNEQIRQLAIDEIGLKRE5ISEPILVNKTSRTH}~SVSRHAQFYV 193
Epa QRFNMLIESHFHQHWTVPDYMJELHITESRLTDICRRFANRPPKRLIFDr~241:1:1:::
MeiR SQMIGFIAENYDQAITTNDVAEHVflNANYAMGT FQRVMQLTMKQYI TAM 243
Epa QLREAKRIJLLFSDNAVNNIAWQIGEKDPAYFARFFNRLVCCSPSAYPAKK 286
MeiR RINHVRALLSDTDKSILDIAIJTAGFRSSSRFYSTFGKYVGMSPQQYRKLS 290** ** ** * * ** *
Epa vPvT T-DIA---GF-S--YF---F----G-TPS--R
CONSENSO
MellE QQ
Figura 31. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las proteínas HpaA yMeIR de E coiL MeIR esun miembro de la familia de reguladoresXyIS/AracC. Lasecuenciaconsensodel motivo conservadoen la región C-terminalde estafamilia estáindicadaen la parteinferior de la figura. La posibleregiónimplicadaen launión al DNAestá subrayada(Gallegosy cols., 1993). y : indican, respectivamente,aminoácidosidénticosy conservados.Los asteriscosindicanlos aminoácidosidénticos a la secuenciaconsenso.
125
RESULTADOS
HpaX MSDTSPAIPESIDPANQHKATJTAGQQAVIKKIFRRLIVFIFVTjFIFSFLDRINIG 55.1:1:
Phtl I4TTTAATDAVPHLLQRSHERIEKVYRKVTLRU4TFIFVALqVLNYLDRvNTS 51
RpaX FAGLTMGRDLGISATMFGLATTLFYAAWI FGI PSNTNLSIVGARRWTATTNVLWGIAST 115:1: :1: 1:111 1:111111:1:
Thtl FAQvYLKHDZJGMSDADLRTRRKLvFHRLHRIGNTQYAYLQKIGARLTITPIHVLWGLISA 111
HpaX ATMFATGPTSLWTJRILVGITEAGFLPGILLYLTFWFPAYFPARANALFMVAMPVTTALG175
Phtl SMAFMTTPTEFYTAPALLGAAEAGFWPGIILYLTYWYPGARPARITSRFLIJATAAAGIIG 171
EpaX SIVZGYI 1S-LDGVMALKGWQWLFLLEGFPSVLLGV1~5VWFWZDD5PDKAKWLTKEDKKCL 234
Phtl GPLSGWILTHPVDVMGI4KNWQWMFILEGLPAAVMGVb4AYFYLVDKPEQAKWLDUEEKSIT 231
flpaX QE~4I4DNDRLTLVQEEGAISHHAMQQRSt4WRETFTPVVNP4YTLAYFCTJTNTTJSAISTWTPQ294
Phtl LDALAADPAG-KKPVTDKRHAVLAALKDPR-VYVLAACWATVP--ICGT----ILNYWTPT 284
HpaX T LQSFNQGSSNTTIGLLAAVPQTCTILGMVY~SRHSDRRQERRHHTALPYLFAAAGW-LL 3531:11 II
Phtl IIRN-TGSIQDVLHVGLLSTvPYTVGAIAI4ILIARSSDTRLERRKHFFFSTAFGALGACLL 343
BpaX ASATDHNNIQMLGIIMASTGSFSAMAIFWTTPDQSISIRARAIGIAVTNATGNTGSALSP413
Phtl PHVVDSATTSITCLAJ4TAVSYFGAAATIWSIPPAYLNDESAAGGISAISSLGQTGAFCAP403
EpaX FNIGWLKDLTGSFNSGLWFVAALLVIGA-GIIwAIPMQSSREPATP 458
Whtl IGLGWTNTVTGSIAAIGLTTIGALvIAGGMAVLTAVPANALSEKPLTDE 451
Figura 32. Alineamientode la secuencia de aminoácidos de la proteína HpaX conla proteína Pthl. Phtl esunaproteinade la rutade degradacióndel fla]ato deP.pu/idapertenecientea la superfamiliade transportadorestransmembranales(Nomura y cols.,1992). y: indican, respectivamente,aminoácidosidénticosy conservados.
126
RESULTADOS
48 -
—28 —
-A8 —
1
Figura 33. Perfil hidrofóbicode la proteínallpaX. Se llevó a cabopor el método deKyte y Doolittle (1982).
¡ II 1 III 1 ¡ ¡ ¡ ¡ 1 [1 ¡ ¡ II ¡ ¡ 1 1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
98 188 278 368 458
127
RESULTADOS
3.3. Análisis de las re2iones flanqueantes a la ruta del 4-HPA y su localización en el
cromosoma de E. cdi
El análisis de las regionesflanqueantesmostró la presenciade cinco OREs
(figuras 23 y 24). La ORFíS estaba incompleta y era similar a la proteína
quimiorreceptorade sermacodificadaporel gen /sr de E. cok K12 (Amesy Parkinson,
1994).EstaORF tambiénfije localizadaa 119 pb del codonde terminacióndel genhpcl-?
de E. cali C (Ropery cola, 1993). La ORFI2 erasimilar a la proteínaCstA de E. cali
MC4100, la cual se expresadurantela faseestacionariade crecimientoy en estados
carenciales de fuente de carbono (Schultz y Matín, 1991), y a los primeros 567
aminoácidosde la ORFf721 de E. cokMG1655 (Genflank¡EMBLac. U14003)(figura
34). La ORE13 era similara una proteínade funcióndesconocida(Cst2) queformaparte
del mismo operón que la proteínaCstA (Schultzy Matín, 1991) y al C-terminalde la
OREf721 de E. cali MG1655 (GenBank/EMBLac. U14003) (figura 34). Por tanto, la
0RFf721 de la estirpeM01655 seríaequivalenteal productode la fusión de las OREs
12 y 13 de E. cali W. Esta fusión podría estarprovocadapor una mutaciónen la
ORFf721, que originaraun cambio de fasemediantela inserciónde un nucleótidoen la
posición equivalenteal nucleótido 13.421 de la figura 23. En este sentido, Schultz y
Matín (1991)demostraron,mediantela técnicade maxicélulas,la producciónde las dos
proteínasdel operóndela CstA equivalentesa lasORFs 12 y 13 deE. cali W.
La ORF14 era muy similar al producto del gen yjiA de función desconocida,
localizadoen la región5’ del genmrr en diferentesestirpesdeE. coli K12 (Waite-Reesy
cols., 1991; GenlBankJEMBLac.U 14003),y a la proteínaP47KdeP.chlararaphis B23
implicadaen el metabolismodel nitrilo (Nishiyamay cols., 1991) (figura 35). Las OREs
12,13 y 14 se transcribenen la misma dirección que los genesque componenlos
operoneshpaBCy meta. Por el contrario, el genpac, localizado a 82 pb del codonde
terminaciónde la ORE14, setranscribeen el sentidoopuesto(figura 22).El genpacno
fue secuenciadoen su totalidad ya que su secuencia había sido determinada
anteriormenteporotrosautores(Ohy cols., 1987).
128
RESULTADOS
El hechode que el gen cstA haya sido localizado en el minuto 14 del mapa
genéticodel cromosomade E. cali W31 10, mientrasquelos genestsr y mrr semapean
en los minutos99 y 98,5 respectivamente(Bachmann,1990), indicaríaquela adquisición
de los genes de la ruta del 4-NiPA se había producido simultáneamentea un
reordenamientode estosgenesen el cromosomade E. cali W, o que el cromosomade
esta estirpe es muy diferente al de E. cak K12 W3 110. Sin embargo,en la estirpe
MG1655 de E. cali K12, los genestsr, OREfl2l, yjiA y mrr estánsituadosen una
posiciónadyacenteen el cromosomaentrelos minutos92,8 y 0,1 (GenBank/EMBLac.
U14003)(figura 36).Deacuerdocon estedato,se podria sugerirque el clusterdegenes
de la rutadel 4-NiPA sehabríainsertadoen el cromosomaentreel gentsr y la ORFf721,
en las posicionescorrespondientesa los nucleátidos73 y 11.450 de la figura 23 (figura
36).Estosnucleótidosestánlocalizadosen regionesno codificantes,a 57 y 101 pb de los
codones de terminación de los genes JipaR y hpac, respectivamente.Además la
comparaciónde las secuenciasde las estirpesMG1655 y W reveló la existenciade una
inserción entre los nucleótidos 11.602-11.727 de la figura 23, en la región
inmediatamenteanterioral codonde iniciación de la ORFf721 (figura 36).
Por otra parte, en el apartado2.7 se comentó que se había localizado la
hidroxilasa de E. colí C en uno de los extremosdel fragmentoHindIII del plásmido
pHC1. La secuenciacióndel otro extremoreveló la presenciade una ORE similar a la
ORF14.La secuenciade nucleótidosde estaregión eraprácticamenteidénticaala de E.
cali ATCC 11105 hastael codonde terminaciónde la ORE14. A partir de estepunto, se
pierdecompletamentela similitud entrelas secuenciasde lasestirpesMG1655, W (figura
36) y C (datosno mostrados).Asimismo,se midió la actividadPGA en las estirpesB y C
de E. cali utilizando las mismascondicionesen el ensayoque parala PGA de E. cok
ATCC 11105 y seanalizó, medianteSouthernblot, la presenciade geneshomólogosal
genpacen estasestirpes(datosno mostrados).Estosexperimentosindicaronqueel gen
pac no estápresenteen las estirpesB y C. Estos resultadossugeriríanque el genpac
podríahaberseinsertadoen el cromosomadeE. cali W en la región adyacenteal codon
de terminacióndelgen yjiA.
129
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RESULTADOS
YjiA EFGEVS 6
111111ORF14 VVNGESMNPIAVTLLTGFLGAGKTTLLRHILNEQHGYKIAVI ENEFGEVS 72
p47K MIEGAQAGPLPVTVLSCFLGAGKTTLLNAILRNRQGLRVAVIVNDNSEVN 50
YflA VDDQLIGDPAT QI}CrLTNGCICCSRSNEIEDALIJDLLDNLDKGN 66II 111111111
ORF14 VDDQLIGDRAT QIKTLTNGCICCSRSNELEDALLDLLDNLDKGN 116
147K LDESVQROVSLHRGRDELIEMSNGCICCT----LRADLLEQISDLARQQ 96
YjiA TQFDRLVIECTGMADPGPTIQT--FFSHEVLCQRYI--LDGVIAI<VDAVH 96
III 11111111111 11111:111III 111111111III0RF14 IQFDRI.vIECTGMADPGPTIQT-—FFSHETT.JCQRYL-—LDGVIAIJVDAvH 162
3::P47K -RFDYLLIE5TGISEPMPVAETFAFLDTEGFSLSELARLDTLVTVVUGSQ 145
YjIA ADEQYINQF-TIAQS QVGYADRILLTKTDVAGEA 128
II:0RF14 ADEQWJRF-TIAQS QVATPDRILLTKTOVAGEA 194
:1 II :: II~ ¡ 1: :1:P47K FQALLES1’DTVARADT~AJ{TSTRHLAflLLrEQvEYANvILVNKRDLXnEP 195
YjiA --EKLRQRLARINAPAPvYTVTHGDIDLGLLFNTNGFMLQ~NVV5TKPRF 176
11110PF14 - -EKLRQRLARINARAPVYTvTHGDIDLGLIFNTNGEMLQENVVSTKPRF 242
11:1:1:147K GYQAVHMLAGLNPSARIMpNAEGNVALSSLLDTHLFDLP-SLAASPGWM 244
YjiA HFIADKQNDIS5I----WELDYPVDISEVSRVMENLLLES---ADKLLRY 220
1111111111111 111111111111111111111 II 11111k 10BF14 HFIADKQNOISSI----VVELDYPVDISEVSRVMENLLLES--ADKLLRY 286
1 : 1 : 7:3
P47K RIct¶EATDTPASESDTYGVTSWVYRERAPFHPQPLLEFLQKPWHNGRLLRS294
Yj±A KGNLWIDG EPNRLLFQGVQRLYS--ADWDRPWGD 2521 111:11 111111111111111 111111111
0flF14 KGMLWVDG EPNPLLFQGVQRLYS--AflWDRPWGD 318
P47K KGYF~~IASRHLEIGLLAQSGKQFQWrYVGRWWNFIEPSQWPRDEYRLQGI344
Yj±A EKPHSTMVFI RIQLPEEEIRA—--AFAG 277
0BP14 ETPHSTMvFI RIQLPEDEIRA-—-AFAG 343
:111 1 :11 1147K MARWnSWGDCRQELVFIGQGLDTRvLQRELDHCLLSAQEIAAGPIAWQA 394
YjiA RK 279
0RF14 1K 345
147K LT 396
Figura 35. Alineamiento de la 0RF14con las proteínasYjiA de E. cdi y P47K deE chlororaphis 1323. y indican, respectivamente, aminoácidos idénticos y
conservados.
131
RESULTADOS
MG1SSB --tsr--CAT--53n--TTTATGAATATCCC—-140n--AAACTGACC--124n--TCGGCCAACTAT— III = IllIlIlIl 311111 = 1111111 II
W -CRF15-CAT--53n--TTTATGAAAAGGTG-11369n-TTCCTGACC---124n--TCGGCCTATGAT
<— In.CLUSTER 4-HPA
MGiGS5 TAATCAATAC---A----ATG----ORFf72 1-----yjiA---TAAGCGGTT--39n--TCA--mrrIII III III = = III 1 1 1
W TAACAAATTA--124n--ATG-ORF12-ORF1S--ORF14 --TAACCAGCC--71n--TTA--pa aIn. —* —* —* Ter. Ter. <—
Figura 36. Comparación de las secuencias flanqueantes al cluster de genes de laruta del 4-HPAcon la región correspondiente del cromosoma de la estirpe MG1655de E. coli K12. Las flechasindican la dirección de transcripciónde los genes; yindican, respectivamente,aminoácidosidénticosy conservados;A, significa delecióndesecuencia;= indica regionesmuy conservadas;In., indica codon de iniciación; Ter.,indicacondonterminador.
132
RESULTADOS
3.4. Lasregionesintergénicas
El análisis de las regionesintergénicasreveló la presenciade cinco secuencias
palindrómicassimilares a la secuenciaconsensode las REP (secuenciaextragénica,
palindrómicay repetida(figuras37 y 38A). Estetipo de palindromesse ha encontradoa
lo largo del cromosomade algunasenterobacteriaspero su fUnción es aún un tema
controvertido,aunquese ha demostradoque puedenestar implicados en la expresión
génicae influir en la estabilidaddel mRNA (Stemy cols., 1984). En la figura 37 se
puedeobservarque dos RiEP estánlocalizadasentrelos geneshpaF y hpaH, la región
intercistrónicamás larga del operónhpaGEDFHJ, mientras que las otras tres están
localizadasen la región 3’ del gen hpal, el último gen del operónme/a. Las REP 1 y
REP 2 estáninvertidasy, comosemuestraen la figura 38B, formanunaestructurade
bucle con una energía libre de -65.9 kcallmol. La posibilidad de que este bucle se
comportecomo un terminadorde la transcripcióndividiendo al operónme/a en dos
policistronesaúnno hasido comprobada.En el apanado2.4 se comentóquehabíansido
localizadoslos posiblesterminadoresde la transcripciónde los operones hpaBC y
hpaX4,en cambio,entrelos genesJipal y hpax los únicospalindromeslocalizadosson
las REPs3, 4 y 5 por lo queno se descartaque estassecuenciasseanlas responsablesde
la terminaciónde la transcripcióndel operónme/a. Por otra parte, se ha detectadola
presenciade estructurassemejantesa las REP en la ruta arta de degradaciónde catecol
(ca/) de P.pu/ida, aunquecomo en el casode lasREP de las enterobacterias,su función
no ha sido determinada(Houghtony cols., 1995).
El sitio de iniciación de la transcripcióndel operónme/ase localizó comparando
la secuenciade nucleótidosde estaregióncon la equivalentedel operónhpcECBDGHde
E. colí C (Ropery cols., 1993) (figura 37). Estacomparacióntambiénpermitió localizar
las secuenciaspromotoras-35 y -10 y un sitio de unión a la CAP (proteínareceptorade
cAMP).
133
RESULTADOS
R KL E COREiS100
* E N O G 2 - 138aa - L S O U E C J>paRACCAGGCGCTGCTTATCACATACTAAAAAGTTATTCATTATCGCCCGC--4 1421---TAGTGAGTCGTGCATTATCT97TCCCCTGAAI’JXATTCAAAATCA 605
705
CAP —35 —10
805
hpaE4 E E KV U U
+1 MaC 4 E K O T 1— 419aa —E E T A E
TTpACATATTAATGATTAAGATGATCGAATCCCAGGAGTGGTAC0APO~AGGCACTATC--S19n---GAOCAAACAGCOAPATGPAAAAAGVAAATCA2153
hpafl4 MO KL A-273aa-P PL PA +
E E U O - 473aa -1- E E O V hpaF4 M 8 U4473
E Y ‘1 E — ll4aa - H A L E E * REP 1 4CTTTATCGTTOAA--34 2n---CACGCATTGTT’PAAGTAGCGCOCAGATTGCCCOGTGGCGCEOCGCTTACCGGGCCTACAAAACCCCAPACCOTACACC4906
CREPí hpaH4 E E O K-259¿oa-C R E V + hpaif4 E
GTAOOCCGGAfAACGCGCAOCCGCATCCOOCAATGCCACAOGATATCOCTATGTTCOATAAA--777n---TGCCOCTTTGTTTAAGGAOAOAACGATO3O5774
E N E E E — 251aa — E E O V Y * REE 3 4A~ACAGTTTTAAA--7 53m---AWGCCCOOCGTGTA’PTAATOCCGGAPOCOCTGCGCTTATCCGGCCTACACTCGOACCPAACCCTAGGCCCGA’PAAOO6618
C RER 4 C REP 5____________________ __________________________________ 6718
hpax 4 E 6 0 7 5 — 448aa — 9 R A 7 9 * hpaA 4 M C O R 0— 285aa - K y pATTAOAOOAáGAAAAATOAGCGACACCTCA--1344m--CCGCGAGCOACCCCGTAAGOATkCGACGAPOTOTGACCOTCAG--855n---AAAOTACCTG8999
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hpaC4 E QL O E-l6Oaa-Pf E A AlCOCAGCAGGAGOTTAAGATGCAATTAOATGAA—-4S0n—->-ATOOAAGCTGCOATTTAAGCTCCAOCCCCTTCACGCATTCGTCGPAGGGGCATTTTTAT11391
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Figura 37. Regionesintergénicas del clusterde genes de la ruta del 4-HPA. Sólo semuestranlos extremos5 ‘y 3’ de las regionescodificantes.Lasflechasindicanla direcciónde transcripciónde los genes.Las secuenciasREPestánsubrayadascon doblelínea. Losposiblesterminadoresde la transcripcióny el presuntositio de unión a la proteínaCAPdel operónme/a estánsubrayados.También estáindicado el sitio de iniciación de latranscripción(±1)del operónme/ay las secuenciaspromotoras-10 y -35. Los asteriscosseñalanel codonde terminaciónde las proteínas.
134
RESULTADOS
A
1 GCCCGGTGGCGC TGCGCTTACCGGGCCTAC2 GCCGGATG-CG--GCT----GCGCCTTATCCGGCCTAC3 GCCGGATG—CGC TGCGCTTATCCGGCCTAC4 GCCGGAAG-CGGCGTAA---ACGCCTTATCCGGCCTAC
5 GGCGGATG-CGGCGTA----ACGCCTTATCCGGTCCGC
CONSENSO GCCGGATG~CGCCGC GCGCCTTATCCGGCCTACT A T A T A
B
REPl -4
C - O - - - GGCC SG TG CG CTGCGC TTA CCGG CCTACCGG CC AC SC GACGCGAAT GGCC GGATG
-1- C 5 A -
AAAACCCCAAA
CCACATGCC
REP2
Figura38. Alineamientode las secuenciasREP. PanelA, alineamientode las REPslocalizadasen las regionesintercistrónicasdel clus/erde genesde la rutadel 4-NiPA conla secuenciaconsenso(Sterny cols., 1984).PanelB, estructurade bucleformadapor lasREP 1 y 2.
RE 2RE 2
RE 2RE 2RE 2
135
RESULTADOS
4. REGULACIÓN DEL OPERÓNhpaBC
4.1. Localizacióndel promotor PRc
Paraestudiarla regulaciónde la transcripcióndel operónhpaBCera necesario
disponerde un sistemaquedetectaraclaray específicamentela producciónde la 4-HPA-
hidroxilasa tanto en medio sólido como en medio liquido. Inicialmente se pensóen
utilizar el fenotiponegroprovocadopor la producciónde estaenzima,peroéstesólo era
evidenteen los cloneshiperproductores.Por ello, paradeterminarla presenciade un
posiblepromotor en la región de 254 pb comprendidaentre el gen hpaA y el operón
hpaBC,se fusionódicharegiónal gentrazadorlacZ. Estesistematiene laventajade que
la expresióndel genfusionadosepuededetectarPi vivo, con el sustratocromogénicoX-
Gal, o iii vi/ra determinandola actividadp-galactosidasa.En la figura 39 se detallala
construcciónde esta fusión en el plásmido pROHí. Este plásmido se utilizó para
transformarcélulas competentesde la cepa E. cali MCi 116 seleccionandolos
transformantesa 30 oc en placasde medio LB suplementadocon kanamicinay X-Gal. A
las 12 horasde incubación,las coloniaspresentabanun fenotipo azul a diferenciade la
cepacontrol MCi 116 (pRS551) cuyas colonias eran blancas.En la figura 40A se
muestrala expresiónde la ¡3-galactosidasaen la cepaMCi 116 (pROHí) durantela fase
exponencialde crecimiento,comparadacon la cepacontrol. Una vez comprobadoque
en estaregiónhabíaun promotor, al que se denominó P~0, sedeterminóla actividad 13-galactosidasade las células cultivadas en un medio con 4-NiPA. Estos resultados
demostraronque, en la cepaMCi 116 (pROHí), la expresiónde la fusión PBC-lacZno se
inducíaen presenciade 4-NiPA (figura 40A). Paracomprobarsi estepromotor estaba
reguladopor una proteínaexistenteen la estirpesalvaje, se transformaronlas células
competentesdeE. cali ATCC 11105 con el plásmidopROHí. Al cultivar la cepaE. cali
ATCC 11105 (pROHí) en medio M9 con glicerol en presenciao ausenciade 4-NiPA se
comprobóque los nivelesde J3-galactosidasaaumentaban10 vecesen presenciade 4-
NiPA, lo que demostrabaque la expresión de la fusión >PBC-lacZ estabaregulada
positivamenteen estaestirpe(figura 40B).
136
RESULTADOS
Ec/Sm
8
1 Salí2. 8am Hl3. ,S—Agarasa14. Klenow
Ec/Sm8
EcoRíBern Hl
2~ Fosfatase alcalino
Eco Rl8am Hl
T4 Lig
EB
Figura 39. Construcción del plásmido pROHí. Las flechasfinas indican la direcciónde la transcripciónde los genes y las gruesasel promotor PBC. Abreviaturas: Apr,
resistenciaa ampicilina, Kmr, resistencia a kanamicicna; TI4, terminadorestranscripción;B, BamNiI; E, EcoPJ;Ec,EcoRV; S, Salí,; Sm, SmaI.
1. SmaI
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137
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A
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’C
INA
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138
RESULTADOS
4.2. Determinación de los inductores del operón hpaBC
.
La purificación de la proteína HpaB permitió obtener un suero anti-HpaB
(apanado19. de Materialesy Métodos)y por tanto, detectarla producciónde esta
enzimamediantela técnicade Westernblot. Estatécnicase empleóparadeterminarqué
compuestosinducian la producciónde la 4-HPA-hidroxilasaen la estirpesalvaje. Para
ello, secultivó E. cali ATCC 11105 a 30 0C en medio M9 conteniendoglicerol y uno
de los siguientes compuestos: 4-NiPA, 3-NiPA, PA, L-tirosina, L-fenilalanina, L-
metioninay L-alanina. Se tomaronalícuotasde los cultivos durantela faseexponencial
de crecimientoy seanalizaronporWesternblot (figura 41).De estamanerasedemostró
que de los compuestosensayadossólo el 4-NiPA, 3-NiPA y PA inducenlaproducciónde
la hidroxilasa.
Los inductoresde la producciónde 4-HPA-hidroxilasatambiénfueronanalizados
medianteel estudiode la producciónde 13-galactosidasaen la cepaE. cali ATCC 11105
(pROHI), incubadaen medio M9 suplementadocon glicerol y diferentescompuestos
aromáticos(tabla 12).Los resultadosde estosexperimentospermitenconcluir,en primer
lugar, que los inductoresde la hidroxílasason el 4-HIPA, el 3-NiPA y el PA, y, en
segundo lugar, que algunos sustratos de la enzima como el NiPC, el 2,5-
dihidroxifenilacetato,el 3-cloro-4-NiPA,el 4-cloro-fenilacetato,el p-cresol,el fenol, el 3-
cloro-fenoly el 4-cloro-fenol,no secomportancomoinductores.
4.3. Localización de la re2ión re2uladora del oDerón hpaBC
Los resultadosderivadosde la secuenciaciónde la ruta metabólicadel 4-NiPA
revelaronqueestarutaestáformadapordosoperonescatabólicos,los genesreguladores
JipaRy hpaA, y el gen hpaXque parececotranscribirsecon el gen hpaA (figura 22).
Como ya seha mencionado,el gen JipaReshomólogoal gen hpcR de E. cali C, que
actúacomorepresordel operónme/aen estaestirpe.Segúnlos trabajosde Ropery cols.
(1993),la transcripcióndel operónme/aseinduceen presenciade NiPC y/o 4-NiPA. Para
comprobarsi la transcripcióndel operónhpaBcestabareguladatambiénpor la proteína
HpaR se construyó el plásmido pHCR2 ligando el fragmentoEcaRI de 5,9 kb del
139
RESULTADOS
plásmido pHCR1 al vector pACYC184 digerido con la misma enzima (datos no
mostrados).La mezclade ligación seutilizó paratransformarlas célulascompetentesde
MCi 116 (pROHí)con el fin de expresaren la misma célulala fusiónPBC-lacZ y el gen
JipaR. Los niveles de 13-galactosidasaen la cepa MCi 116 (pROHí, pHCR2) eran
similaresa los de la cepaMCi 116 (pROHí, pACYC1S4) (datosno mostrados)lo que
indicabaque, aparentemente,la proteínaHpaRno estabaimplicadaen la regulacióndel
operónde la hidroxilasa. Paracomprobarla influenciaejercidapor las proteínasHpaA y
HpaX en la regulaciónde la hidroxilasa,seconstruyóel plásmidopREl segúnsedetalla
en la figura 42 y en el esquemade la figura 43. Con esteplásmidose transformóla cepa
MC4100 (pROHí) que presentabael mismo fenotipo que la cepaMCI 116 (pROHí)
perocrecíamásrápidamenteen medio mínimo, facilitando los estudiosde producciónde
f3-galactosidasaen la faseexponencialde crecimiento.La cepaMC4100(pROH1,pREl)
al serincubadaen medio M63 con glucosapresentabaun nivel basalde j3-galactosidasa
de 40.000unidadesque aumentabaal cultivar las célulasen presenciade 4-NiPA (figura
44). Paraconfirmar que el incrementodel nivel basalde 13-galactosidasaobservadoen la
cepaMC4100(pROHI, pREl) respectoa la cepaMC4100(pRS551,pREl) no sedebía
a un aumentoen el númerode copias del plásmido pROHí, se midió la actividad 13-lactamasade dichascepas.En amboscasos,la actividad ¡3-lactamasaa las 4 horasde
incubaciónerade 1-4 x io-~ ,imoles de cefaloridinahidrolizados/minuto,lo que indicaba
que el aumentode la actividad13-galactosidasaen la cepaMC4100(pROHí, pREl) no
era debido a un aumento del número de copias del plásmido pROH1 sino a un
incrementoen la expresiónde la fusión PBC.-JaCZ,aparentementeprovocado por las
proteínasHpaA y/o HpaX.
4.4. Implicación delasproteínasllpaA y HpaX en la regulacióndel onerónhnaBC
Paradeterminarsi la transcripcióndel promotorhpaBc estabareguladapor la
proteínaHpaA, la proteínaHpaX, o ambas,seconstruyeronlos plásmidospRAl y pRXl
(figuras42 y 43). A continuaciónsetransformóla cepaMC4100(pROHí)con cadauno
de ellos, seleccionandolos recombinantesen medio LB con kanamicinay cloranfenicol.
La actividad j3-galactosidasaque presentabanlas cepasMC4100 (pROHí, pRAl) y
140
RESULTADOS
MC4IOO (pROHí, pRIXí) demuestraque la proteínaHpaA regulapositivamentela
expresiónde la fUsiónPBC-lacZen presenciade4-NiPA (tabla 13).
El plásmidopRA2 (figura 43) seconstruyóligando el fragmentoSalí de 1,4 kb
de pRAl, al vector pRS551 digerido con la enzima de restricciónBamNiI, tratando
previamenteambosfragmentoscon el fragmentoKlenow de la DNA polimerasa.La
mezclade ligación se utilizó paratransformarla cepaMC4100 seleccionando,en placas
de LB con kanamicina,X-Gal y 4-NiPA, los clonesque presentabanel inserto orientado
en la direcciónquepermitíaexpresarel gen lacZ medianteel promotorPBC. Lascolonias
positivaspresentabanun fenotipoazul muy intenso.En la cepaMC4100 (pRA2), el gen
hpaA y la fUsión Psc-lacZseexpresanen cis lo quepermitióestudiarla producciónde la
4-UPA-hidroxilasaen un sistema semejante,aunqueen multicopia, al existenteen el
cromosomade la estirpesalvaje. En la figura 45A se muestrala producciónde 13-
galactosidasaen esta cepacultivada en presenciade 4-NiPA, 3-NiPA, PA y 2-NiPA,
comparándolacon la de E. cok ATCC 11105 (pROHí) (figura 45B) cultivada en las
mismascondiciones.La respuestade ambascepasantela presenciade los inductoreses
similar, aunque la actividad j3-galactosidasaen la cepa MC4100 (pRA2) es
aproximadamente6 vecesmayordebido,probablemente,a que en la estirpesalvajesólo
hay unacopia del genhpaA.
Porotraparte,la diferenciaobservadaentrelos nivelesbasalesde ¡3-galactosidasa
de las cepasMC4100 (pROHí, pRAl) y MC4lOO (pROHí, pREl) (tabla 13) podría
justificarsesi la proteinaHpaX activaraa la proteínaHpaA. Sin embargo,la producción
de j3-galactosidasaen las cepasMC4100(pRA2, pACYC1S4)y MC4IOO (pRA2, pRXl)
eramuy similar (datosno mostrados).
4.5. Represiónporcatabolitodela 4-HPA-bidroxilasa
Los trabajosde Ropery cols. (1993)demostraronque el operónme/ade la ruta
de degradacióndel 4-NiPA en la estirpeC deE. cali estabasujetoa represióncatabólica.
Portantoeralógico pensarque,puestoquela hidroxilacióndel 4-HPA esun pasoprevio
a las reaccionesmediadaspor las enzimascodificadasen el operónme/a, la expresiónde
141
RESULTADOS
el operónhpaBCtambiéndependierade la fuentede carbonoutilizada en el medio de
cultivo. Paracomprobarestahipótesis,secultivaron las célulasde E colí ATCC 11105
(pROHí)en medioM9, en presenciay ausenciade 4-NiPA, utilizandoglucosaó glicerol
comofuentedecarbono(figura 46A). La producciónde 13-galactosidasaen estacepaera
10 vecesmenorcuandola glucosaestabapresenteen el medio de cultivo sugiriendoque,
efectivamente,el operónde la hidroxilasatambiénestabasujetoa represióncatabólica.
En la figura 46B se muestrala producciónde 13-galactosidasaen las cepasMC4100
(pRA2) y SBSÓS8(pRA2) utilizando las condicionesde cultivo descritasanteriormente.
En este caso, la presenciade glucosaen el medio sólo afectabaa la cepaMC4100
(pRA2), sugiriendo fuertementeque la represión catabólica estabamediada por la
proteínaCAP (crp) ya quela cepa5BS688eraun mutanteAcrp de MC4100.
4.6. Determinaciónde los sitios de iniciaciónde la transcripción de los promotores
Ya seha comentadoquelos geneshpaAy hpaXestabanprácticamentejuntosen
el cromosoma,lo que parecíaindicar que ambos genesformabanpartede la misma
unidad de transcripción(figura 23); sin embargo,los resultadosobtenidoshastaese
momento en las células que conteníanel plásmido pRAl ó el plásmido pRA2,
demostrabanla existenciade un promotor(PA) situadoen la región de 203 pb anterioral
codonde iniciación del genhpaA. El sitio de iniciación de la transcripcióndel promotor
PA se determinómediantela técnicade “primer extension” (figura 47A) paralo cual, el
oligonucleótido038A (figura 23) se hibridó con el RNA total de la cepaMC4100
(pROHí, pREl). Este RNA se utilizó posteriormentepara determinarel sitio de
iniciación de la transcripcióndel promotorPBC (figura 47B) utilizando en estecaso el
oligonucleátídoOLACZSO, de 20 nucleótidos,situadoen la cadenano codificante del
vector pRS5S1,a 50 pb de la dianaBamNiI del mismo (apartado22 de Materialesy
Métodos). Los resultadosobtenidos en ambos casos se confirmaron repitiendo el
experimentosegúnel métododescritoen el apartado22.2 y en el casodel promotorPBC,
utilizandoel RNA total de la cepaMC4100 (pRA2) cultivadaen presenciade 4-HPA. En
la figura 47C se muestrala secuenciade nucleótidoscorrespondienteal promotorPBC,
así como dos posiblessitios de iniciación de la transcripciónen la región 5’ del gen
142
RESULTADOS
hpaA, estandouno de ellos (.i) precedidopor un posible sitio de unión a la proteína
CAP. Paracomprobarla flincionalidad de ambossitios de iniciación de la transcripción
serianecesariorealizaruna seriede experimentosgenéticosquehastael momentono han
sido desarrollados.
4.7. El promotor Pr
Seha demostradoque la hiperproducciónde algunosreguladorespertenecientes
a la familia XyIS/AraC provocala inducción de la transcripcióndel gen al que regulan
independientementede la presenciadel efector (Marquésy Ramos,1993). Por tanto, la
diferenciaapreciadaentrelos niveles basalesde 13-galactosidasade las cepasMC4100
(pROHí, pRAl) y MC4IOO (pROHI, pREl) (tabla 13) podríanindicar quela proteína
HpaA estabahiperproducidaen estaúltima. La determinacióndel sitio de iniciación de la
transcripcióndel promotorPA demostróque la expresióndel gen hpaA estabacontrolada
porestepromotortanto en la cepaMC4100(pROHí, pREl) como en la cepaMC4IOO
(pRA2) (apartado4.6). Estosresultadossugeríanque la supuestahiperproducciónde
HpaA en las célulasque contienenel plásmidopREI, podríadebersea la formaciónde
otro tránscrito a partir de un promotor más fuerte que PA. Para comprobarlo se
construyóel plásmido pRX2 (figura 43) ligando un fragmentoEco47III de 288 pb del
plásmidopAJ3S (figura 22) al vectorpRS55I digeridocon la enzimaBamHJy tratado
con Klenow. Este fragmento(nucleótidos6.502-6790de la figura 23) abarcatoda la
región intergénicasituadaentreel operónme/ay el gen hpaX,por lo que seconsideró
que debíacontenerel posiblepromotorde esteúltimo (Px). La cepaMC4100 (pRX2)
producía13-galactosidasaconstitutivamentehastaun nivel de 100.000 unidades,igual
que las cepas MC4IOO (pRX2, pRAL) y MC4IOO (pRX2, pHCR2) (datos no
mostrados)-
143
RESULTADOS
Tabla 12. Inductoresdel operónhpaBC
SUSTRATO ACTIVIDAD I3~GALa
4-Hidroxifenilacetato +++
3-Hidroxifenilacetato ++
2-Hidroxifenilacetato N.D Yfenilacetato +
3-Cloro-4-hidroxifenilacetato N.D.
3-Clorofenilacetato N.D.
Homoprotocatecuato N.D.
2,5-Dihidroxifenilacetato N.D.
p- Creso! N.D.
rn-Cresol N.D.
o-Cresol N.U.
Fenol N.D.
4-Clorofenol N.D.
3 -Clorofenol N.U.2-Clorofenol N.D.
a Actividad 13-gal: paraensayarla actividadf3-galactosidasa,E. cok ATCC
11105 (pROH1) se cultivó durante 4 horas a 30 0C en medio M9suplementadocon glicerol 20 mM y los compuestosaromáticosmostradosen la tablaaunaconcentraciónfinal de 1 mM.“N.U.: no detectado
145
RESULTADOS
E-
pACYC1B4
42 kb
5
Ec
PI
Pi
PI
- PI
Ec5
Figura42. Construcciónde los plásniidospREI, pRXI y pRAl. U, genhpaA;~ gen
hpaX; Bfl, genhpal; 1, restode los genescontenidosen el plásmidopHCB3. Las flechasindican la dirección de transcripciónde los genes. Abreviaturas: AV. resistenciaaampicilina; Cmr, resistenciaa cloranfenicol;Tct, resistenciaa tetraciclina;B, BarnHJ; E,EcoRí;Ec,EcoRV; P
1, Pv¡¡I; S, Salí.
5 PIs p1
146
RESULTADOS
Ec 9
hpof ñpaX hpcA
1IlI~FW1 L. \ 1-~ -4 -÷
‘~BO
-4 -~
~BC
~>~N~’ 7>
2t<<YÑ. ‘o «1,
’
hpaB hpaC
pROHI
pIRE 1
pRX1
pRAl
pRA2
pRX2
1 Kb.1
Figura 43. Fragmentosdonadosen los plásmidospROH1, pREI, pRXl, pRAl,pRA2 y pRX2. U, gen hpaA; I~ genhpaA~ I?fl, genJipal; ~, operónhpaBC; !!U restodelos genesdel operón me/a, ~, operón lac; Las flechas indican la dirección detranscripciónde los genes.En la figura se indican la localizaciónde los promotoresPA,PBC y P,<, y los sitios de restricciónutilizadosparala construcciónde los plásmidos.Losasteriscosindican los sitios de restricciónque no son únicosen el fragmentomostrado.Abreviaturas:B, BamHl; Ec, EcoRV;E~, Eco47flI; P1, Pwñ; S,Salt..
~BC
-3 -4~BC
px
147
RESULTADOS
Tabla 13. Estudio de la expresión de la fusión PBc-lacZ en presenciade HpaA y
ILpaX.
Cepa Unidades13-gal x io’~ a
+ 4-NiPA - 4-NiPA
MC4100 (pROHI, pACYC1S4) 0,70 0,62
MC4IOO (pROHí,pREl) 63,5 38,7
MC4IOO (pROH1,pRAl) 41,4 0,5
MC4IOO (pROH1,pRXl) 0,95 0,94
a Actividad j3-gal: para ensayarla actividad 13-galactosidasalas células se cultivaron
durante4 horasa 30 oc en medioM63 suplementadoconglicerol 20 mM en presenciaoausenciade 4-NiPA 1 mM.
148
RESULTADOS
loo
7.5
50
25
t (h)
Figura 44. Producción de 13-galactosidasapor la cepa E. cali MC4100 (pREl,pROHl). Las célulassecultivarona30 0C en medio M63 suplementadocon glucosa10mM (A, A) 6 glicerol 20 mM (O, e), en presencia (@, A) ó ausencia(O, A) de 4-HPA 1mM.
149
o
-Jcl:o
o2D
2 3 4 5
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3.2
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sI
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INA
151
RESULTADOS
5. EXPRESIÓN DE LOS GENES DE LA RUTA DEL 4-RFA EN ORGANISMOS
HETERÓLOGOS
El plásmidopAJ4Ose construyócon el fin de comprobarquela rutacompletadel
4-NIPA estabaformadapor los geneslipa y que no era necesarioningún gen adicional
parala mineralizaciónde estecompuesto.Paraconstruirel plásmido pAJ4O se ligó el
fragmentoEcoRI de 11 kb del plásmido pHCB3 al plásmidoPHCR3 digerido con la
enzimade restricciónEcaPJ (tablalO, figura 22). La mezclade ligación se utilizó para
transformarlas células competentesde E. coli ETSOOO. La selección de los clones
recombinantesse llevó a cabo a 30 0C, en medio M9 sin glucosasuplementadocon
ampicilina y 4-NiPA 5 mM. Sólo los clonesque pudieranutilizar el 4-NiPA comoúnica
fuente de carbono serían capacesde crecer en estemedio. Despuésde dos días de
incubaciónen estascondiciones, seobtuvierondos coloniasque fueronreaisladasen el
mismo medio selectivo en presenciade ácido nalidixico, ya que la cepaETSOOO es
resistentea estecompuesto.Deestaformaseaisló la cepaET8000(pAJ4O)a partir de
la cual se obtuvo el plásmido pAJ4O, que se utilizó posteriormentepara transformar
células competentesde E. cok DH1 y así comprobarque la capacidadde utilizar el 4-
NIPA y, por tanto, deexpresartodos los genesimplicadosen su ruta dedegradación,no
eradependientede cepa.La cepaE. cali DH1 (pAJ4O)tambiénera capazde mineralizar
estecompuestotanto en medio sólido como en medio liquido (tabla 14). Medianteestos
experimentosse demostróque los genesnecesariospara la degradacióndel 4-NiPA
estabancontenidosen el fragmentodonadoen el plásmidopAJ4O.
5.1. Construccióndemódulostransponiblescon los eenesde la rutadel 4-HPA
Los minitransposonesderivados de TnS se han diseñadoen un plásmido
(pGP7O4)cuya replicación (oriRK6) dependeespecíficamentede la proteína it ~pir)
(Herreroy cols., 1990),porlo que sólo puedemantenersede formaestableen cepasque
produzcanestaproteína,y que ademáscontieneel origen de transferenciaconjugativa
(ori7RP4) del plásmidopromiscuoRP4.Por tanto, los vectores-transposonesmini-mS,
son establesen bacteriaslisógenas\pir y puedensermovilizadospor conjugacióna una
bacteriareceptoramediantelas funcionesde transferenciadel plásmidoconjugativoRP4.
153
RESU LTADOS
En el casodequela cepareceptorano produzcala proteínait el plásmidono podráser
mantenidoy, conunaciertafrecuencia,habrátransposicióndel mini-TnS o sus derivados
a un replicón diferente,normalmenteel cromosomade la célula receptora.El gen que
codifica para la transposasa(/np*) no estáincluido dentro de la unidad móvil, por lo
que, si la bacteriareceptorano es capazde mantenerel plásmidotransferidosólo se
integraráuna copia del segmentomóvil en su cromosoma.Los transconjugantesasí
obtenidossonmuy establesdesdeel punto de vista genéticoy fáciles de seleccionaren
baseal marcadorde resistenciaincluido en el segmentomóvil (de Lorenzo y Timmis,
1994).
Uno de los objetivosde estatesiserala expresiónde la ruta catabólicadel 4-NIPA
en otros microorganismosdiferentesa E. cok W para conferirles la capacidadde
metabolizareste compuestoy así ampliar su capacidadbiodegradativa.Con estefin
fueronconstruidoslos plásmidospAJ224y pAJ402como semuestraen la figura 48. El
primero es un derivadode pCNBS que tiene donado,dentro del segmentomóvil, el
operón hpaBC orientado de forma que su expresión pueda ser controlada por el
promotorP/rc, así como el represor~ y el marcadorde resistenciaa kanamicina.El
plásmido pAJ4O2 es un derivado de pUTmii-TnS-Km2 y fue construidopara poder
insertar la ruta completa del 4-NIPA en el cromosomade otros microorganismos
diferentesa E. coli W, seleccionandolos transconjugantesen base a su resistenciaa
kanamicina.
5.2. Inte2raciónde la ruta del 4-tIPA en el cromosomadeE. cdi 1<12
Las célulascompetentesde E. cali S17-lXpir setransformaroncon el plásmido
pAJ402 quele conferiaresistenciaa ampicilinay a kanamicina.Estaestirpecontieneen
su cromosomalos genesque codificanparalas funcionesde transferenciadel plásmido
RP4 y parala proteínait (Herreroy cols., 1990),por lo que podía serempleadacomo
cepadonadoraen los experimentosde transposición.Como organismoreceptorse eligió
lacepaETEOQOdeE. cali K12. Laconjugaciónsellevó a cabosegúnel métododescrito
por de Lorenzo y Timmis (1994) utilizando, parala selecciónde los transconjugantes,
medio M9 sin glucosasuplementadocon kanamicinay 4-NIPA como única frente de
154
RESULTADOS
carbono.La cepadonadoraeraauxotrofaparaL-prolina, por lo que no podíacreceren
el medio de selección.Los transconjugantesasí obtenidosse volvieron a seleccionaren
basea su sensibilidada la ampicilina, descartándoseasílos procesosde cointegración,y a
sucapacidadde mineralizarel 4-NIPA en presenciade kanamicinay ácidonalidixico, un
marcadorespecíficode la cepa ETSOOO. Como resultadode estosexperimentosse
obtuvola cepaET4025capazde utilizar 3- y 4-HPA como únicafuentede carbonopero
no 2-NIPA (figura 49, tabla 14). Al incubar durantetoda la nochea 30 0C la cepa
ET4025 en mediomínimo suplementadocon glicerol y fenol, en presenciay ausenciade
4-NIPA, secomprobóque, en estacepa,la transformaciónin viva de fenol en catecol
dependíade la presenciadel inductor4-NIPA (tabla 15). Estosresultadosdemuestranque
el plásmido pAJ4O2conteníano sólo las enzimascatabólicasde la ruta del 4-NIPA sino
tambiénlos genesreguladores.
5.3. Producciónde la 4-HPA-bidroxilasaenP. pu/ida KT2442
Como seha demostradoen los apartados2.1., 2.2. y 2.3., la 4-HIPA-hidroxilasa
es una enzima que actúa sobre una gran variedad de compuestosaromáticos
monohidroxilados,pero sólo e] 3- y 4-NIPA son metabolizadoscompletamentepor la
estirpe salvaje. La producciónde esta enzima en otros microorganismoscapacesde
mineralizar metabolitos producidospor la 4-NiPA hidroxilasa, permitiría al organismo
receptorutilizar nuevossustratosaromáticoscomo fuentede carbono,lo que supondría
unaexpansiónverticalde su capacidadbiodegradativa.
El organismo receptor elegido para comprobaresta hipótesis fue P. pu/ida
KT2442 ya que era capazde metabolizarel benzoatomediantela ruta arta del catecol
(ver apartado3.2.2.2.de la Introducción)y, por tanto, deberíaser capazde mineralizar
el catecolprocedentede la transformaciónde fenol mediadapor la 4-NIPA-hidroxilasa.
Como organismo donadorse utilizó la cepaE. cali S17-lXpir transformadacon el
plásmidopAJ224(figura 48), llevándosea cabola conjugaciónsegúnel métododescrito
porde Lorenzoy Timmis (1994). Paraseleccionarlos transconjugantesseutilizó medio
LB suplementadocon kanamicina y rifampicina dado que P. pu/ida KT2442 es
resistentearifampicinaadiferenciade la cepadonadora.La nuevacepade F. pulida, a la
155
RESULTADOS
quesedenominóKTH2, presentabaun fenotiponegrosimilaral de los clonesde E. col-]
que expresanel operón de hpaBC (figura 50), lo que demostrabaque la enzima se
producíaconstitutivamenteen estacepa.
A continuaciónse investigóla capacidadde P. pu/idaKTH2 paramineralizar el
fenol. Paraello, seincubaronlas célulasa 30 oc con agitacióndurantetoda la nocheen
medioM9 suplementadocon glicerol20 mM, IPTG 3 mM y fenol 1 mM. Estecultivo se
utilizó para inocular, el medio compuestopor M9, II’TG 3 mM y fenol 3 mM como
frente de carbono,hastauna DO600 de 0,1. Despuésde nuevehorasde incubación,el
cultivo alcanzóla faseestacionariade crecimientocon una 00600de 0,55. Una nueva
adición de fenol 3 mM a los cultivos en faseestacionariaprovocó que la cepaKTH2
iniciaraun nuevoprocesode crecimiento.Sinembargo,si el fenol seañadíainicialmentea
unaconcentraciónsuperiora3 mM no sedetectabacrecimiento,probablementedebidoa
la gran toxicidad de este compuesto. Como control, se repitió paralelamenteel
experimentocon la cepaP. pu/ida KT2442 cuyo cultivo presentabaa las nuevehoras
unadensidadópticasimilar a la inicial (figura 51).
156
RESULTADOS
FUnd 111BomHI
8
FI
E
FUnd IIIBamHI
14 Lig
__________________ T4Liq
FIN
¡opo
pAJ2235Zkb
jopeO
NB
N
Gene olean 1 tRj5rnt~,..142~<Ptt5.Y1 O Gene olean
Not 1 No? 1Fosfotoso Fosfotosoalcalino alcalino
14 LiqT4Ug N
/‘W
pAJ224 R6K’\
ILTkb jopeO NKn#
hpa8¡0041<N
Figura 48. Construcción de los plásmidos pAJ4O2 y pAJ224. U, operónhpaBC;Efragmento de DNA que contiene la ruta completapara la degradaciónde 4-NIPA.Abreviaturas: Apr, resistencia a ampicilina; Kmr, resistencia a kanamicina; Cmr,resistenciaacloranfenicol;B, BamHI;E, EcaRI; H, Hindilí; N, Na/I; P/rc, promotor/rc;
/np* transposasamS desprovistade la dianaNa/I; 1 y O, secuenciasterminales(19 pb)del minitransposon.
N
1~O
E
6pAJ4O
19 kb
jopeO
EcoR 1Gene olean
6
EooRIGene olean
B
157
RESULTADOS
Tabla 14. Capacidaddemineralizarel 4-tIPA
Cepa de E. coIi D06»
ET8000 0,3
ATCC 11105 0,8
ET8000(pAJ4O) 0,85
DH1 (pAJ4O) 1,0
ET4025 0,95
DO600 ,,,,,: los cultivos seinocularona unaDO 600 = 0,3 y seincubarondurantetodala
nocheen medioM9 suplementadocon 4-NiPA 5 mM.
158
RESULTADOS
Tabla 15. Inducción de la 4-HPA-bidroxilasa en diferentesestirpesde E. coli
Cepas Catecol (nmol/mI)’
-4-1-IPA +4-HPA
K12ETSOOO <1 <1
K12ET4025 <1 329
WAICC 11105 <1 695
Catecol(nmol/ml): La inducciónde la actividadhidroxilasafue determinadamediantelamedida iii vivo de la transformaciónde fenol en catecol. Las células fueron cultivadasdurantetoda la nochea 30 0C en medio M9 suplementadocon glicerol 20 mM enpresenciao ausenciade 4-HIPA 1 mM.
160
RESULTADOS
I,0
Ec
oo<00
0,5oá
t(h)
Figura 51. Curva de crecimiento de A pu/ida KTLI2 utilizando fenol como fuentede carbono. Las cepas P. pulida KT2442 (A) y P. pulida KTNI2 (O) fueron cultivadasen medio M9 suplementadocon IPTG 3 mM y fenol, que seañadeauna concentraciónde 3 mM al iniciarseel cultivo y despuésde24 horasde incubación.
lO 20 30 40 50
162
IV. DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
1. CARACTERIZACIÓNDE LA 4-HPA-HIDROXILASA DE E. coli W
La posible implicación del gen pac en el catabolismodecompuestosaromáticos
fue postuladapor Valle y cols., (1991) basándoseen la capacidadde la PGA para
hidrolizar distintos ésteres y amidas del PA y algunos derivados de éste que,
posteriormente, pueden ser utilizados como sustratos por los microorganismos
productores.En estesentido,sesabequela cepadeE. cokATCC 11105,productorade
PGA, es capazde utilizar como única fuente de carbono algunos productos de la
reaccióncatalizadapor la PGA como el PA y el 4-HPA (Coopery Skinner, 1980). Sin
embargo,hastael momentono ha sido presentadaningunaevidenciaque confirme esta
suposición, por lo que el papel fisiológico de estas enzimas todavía no ha sido
determinado.Esta hipótesisy la posibilidad de que el clon NiBlOl (pAECl9), que
contiene el gen pac de E. coli, pudieraproducir derivados catecólicosa partir de
compuestosaromáticosmonohidroxilados,sirvieronde baseparael esquemade trabajo
en estaTesis,consistenteen la caracterizacióndel gen responsablede la transformación
de compuestosaromáticospor esteclon así como el estudio de su implicación en el
metabolismode los derivadosdel PA.
La identificación de los productosde la transformaciónde fenol, L-tirosina, 4-
NIPA y 3-NiPA en los clones que contienen el plásmido pAJ19 mediante distintos
procedimientos,ha permitidoconfirmar quela enzimacodificadaporel gen hpaB esuna
hidroxilasade compuestosaromáticosdependientede FAD y NADH. Esta enzimaha
sido clasificadacomouna4-NIPA-hidroxilasaya que presentala máximaactividadsobre
estecompuesto,aunquesu rango de especificidadde sustratoes muy amplio, siendo
capaz de hidroxilar otros compuestos aromáticos como el 3-NiPA, el fenol, la L-tirosina
y otros derivados de ésta (tabla 9). El hecho de queestaenzimafUera capazdeproducir
HIPC a partir de 3- ó 4-HIPA sugirió que podria sersimilara la hidi-ooxilasadependientede
NADH detectadapor Cooper y Skinner (1980) en el extracto crudo de E. cali C.
También se ha descrito en otros microorganismosla presenciade otras 4-NIPA-
hidroxilasasque utilizan FAD y NADH ó NADPH como cosustratos(Adachi y cols.,
1964; Harelandy cols., 1975; van den Tweel y cols., 1988; Martín y cols., 1991;
Arunachalamy cols., 1992).La especificidaddesustratode cadaunade estasenzimases
164
DISCUSIÓN
diferente;porejemplo, las 4-HPA-hidroxilasasde P. acidavoransy P. pu/idano actúan
sobreel 3-HPA(Harelandy cols., 1975; Arunachalamy cols., 1992)mientrasque en el
casodeK. pneumoniaese handescritodoshidroxilasasdiferentesespecíficasparael 3- y
4-NIPA, respectivamente(Martíny cols., 1991).A diferenciade las anteriores,la 4-HPA-
hidroxilasade Flavobacteriumsp. (van den Tweel y cols., 1988) produce 2,5-DNIPA
(ácido2,5-dihidroxifenilacético)en lugardeNiPC.
Por otra parte, existenotras monooxigenasasmás inespecíficascomo la fenol-
hidroxilasa(finiD) deP.picke//i PKO1 que, ademásdel fenol, utiliza comosustratosel
o-, m- y p-cresol,el catecol,el clorofenol, el bromofenoly el resorcinol(Kukor y Olsen,
1990). El guaiacoly el 3,4-dimetilfenol se comportancomo falsossustratosde esta
enzima,ya queprovocanla oxidacióndel cosustrato(NADPH) independientementede la
incorporacióndel grupo hidroxilo en el anillo aromático(Kukor y Olsen, 1990). Este
desacoplamientoentre las reaccionesde oxidación e hidroxilación también ha sido
observadoen otrasoxidasasde funciónmixta (Beadley Smith, 1982), por lo que no hay
que descartarla posibilidad de que el 3-Cl-4-HIPA, el 4-CI-PA, el p-.cresol, el 3-o. y 4..
clorofenol, la L-dopay los derivadosdihidroxiladosdel fenol y del PA (tabla 9), cuyos
productosde reacciónno han sido determinadosen estetrabajo, puedancomportarse
comofalsossustratosde la 4-NIPA-hidroxilasadeE. coli W.
Inicialmentesepensóquela 4-HPA-hidroxilasaestabacompuestaúnicamentepor
la proteínaHpaB, ya que lacepaDHI (pA.J27)presentabaactividad4-HPA-hidroxilasa.
Además,la mayoríade las monooxigenasasdependientesde FAD y NADH (ó NADPH)
sonproteínasmonocomponentescon una masamolecularsemejantea la calculadapara
la proteínaHpaB (figura 12) (Kukor y Olsen, 1990; Neujahry Oaal, 1973; Beadle y
Smith, 1982; Harayama y cols., 1992). Sin embargo, se han obtenido suficientes pruebas
genéticas y bioquímicas que descartan esta suposición. Por una parte, los resultados
derivados de la expresión de los genes hpaB y hpaC en cis, en trans y en células
diferentes (tabla 11), demuestranque la presenciade la proteínaHpaCen la mezclade
reacción origina un incremento en la actividad 4-HIPA-hidroxilasa de la proteína HpaB.
Además, el análisis de la secuencia de nucleótidos de estos genes sugiere que ambos
forman parte de un mismo operón (hpaBC) (figura 23). En consonancia con estos
165
DISCUSIÓN
resultados,sepuedeafirmar quela 4-HPA-hidroxilasaesun sistemaenzimáticoformado
pordos componentes;la proteínaHpaB de 58.781 Da y la proteínaHpaCde 18.679Da.
Las 4-HPA-hidroxilasasde P. avalis y P. pu/ida son los únicos sistemas
enzimáticos de este tipo descritos hasta el momento, aunque todavía no han sido
estudiadosanivel molecular(Adachi y cols., 1964;Arunachalamy cols., 1992).Como se
ha comentadoen el apartado3.2.1.1 de la Introducción, la 4-UPA-hidroxilasade P.
pu/ida estáformadapor una flavoproteinadiméricacon dos subunidadesidénticasde
30,7 lcDa y una proteína cooperadorade 38,5 kDa. En este sistemaenzimático,el
acoplamientoentrelas reaccionesde oxidacióne liidroxilación es llevado a cabo por la
proteínacooperadoraya que, en ausenciade ésta, la flavoproteinaoxida el NADH en
presenciadel sustratoy de otroscompuestosquesecomportancomo falsossustratos,no
dandolugar en ningún casoal productodihidroxilado. La aparenteausenciade centros
redox en la proteínacooperadoradescartala posibilidad de que actúe como oxidasa
terminalde estesistema,por lo que hastael momentosedesconocela función de esta
proteína.Los dos componentesde las 4-HIPA-hidroxilasasde P. pu/iday P. ovalis no
parecenformar complejosmuy establesya que, en amboscasos,puedenser separados
por una simple precipitaciónfraccionadacon sulfato amónico (Adachi y cols., 1964;
Arunachalamy cols., 1992).
En el casode la 4-NIPA-hidroxilasade E. cali, el componenteHpaB escapazde
producir catecol a partir de fenol independientementede la presenciade la. proteína
HpaC, aunque este proceso es más eficiente cuando ambas proteínas actúan
conjuntamente.Además,la oxidacióndel NADH dependientede sustratoaumentaen
presencia del componente HpaC hasta unos niveles similares a la formación de producto
dihidroxilado (tabla 11), lo que demuestraque la oxidación del cosustratono es un
proceso llevado a cabo únicamentepor la proteína HpaB. Por otra parte, se ha
comprobadoduranteel procesode purificación del componente HpaB que el
Cibacrónblueactúacomoligando de adsorciónde estaproteína,sugiriendosu capacidad
paraunirsea coenzimascomoel FAD y/o el NADH (figura 18B). En cambio, la proteína
HpaC eluyeduranteel procesode lavado de la columnalo que indica que, como en el
caso de las hidroxilasasde P. pu/ida y P. ovalis, el complejo formado entre ambos
166
DISCUSIÓN
componentesno esmuy estable,y además,queestaproteinano debeposeerningún sitio
deunión a NADH o FAD.
Todos estos resultados sugieren que la proteína NipaR es el componente
flavoproteicodel sistemay que la proteínaHpaCactúacomo proteínacooperadoradel
mismo aunque, aparentemente,la formación del complejo FAD-enzima requiere la
presenciade ambas (figura 17). No obstante,la comparaciónde la secuenciade
aminoácidosdel componenteHpaB conla de otrasflavoproteinassecuenciadasno reveló
ningunasimilitud significativa, incluso en las regionesimplicadasen la a FAD y NADH
(Rossmany cols., 1974; Wierengay cols., 1986;Eggink y cols., 1990; Di Marco y cois.,
1993).En estesentido, Howell y cols.(1972)demostraronque algunasflavoproteinas
hidroxilasas,querequierendonadoresde electronesexternoscomo el NADH o NADPH,
presentanun fenómenocomúnde control segúnel cual, la reducciónde la flavina por
NAD(P)H aumentaconsiderablementetras la formación del complejo enzima-sustrato.
Este mecanismopareceestar limitado a aquellashidroxilasasque utilizan compuestos
aromáticoscomo sustratos(Ballou, 1982),sugiriendouna correlaciónentrela presencia
de un sitio atípico de unión de FAD/NAD(P)H y el incrementoen la afinidad de launión
de NAD(P)H provocadapor la presenciadel sustrato.Por otra parte, Arunacha]amy
cols. (1992),han propuestoque la naturalezabicomponentede la 4-HPA-hidroxilasade
P. pu/ida supone un mecanismo de defensa secundario que evita el consumo
improductivodeNADH. Por tanto, y de acuerdocon estasobservaciones,escoherente
suponerque esta nueva familia de hidroxilasasbicomponentespuedantener un sitio
atípico de unión aFAD¡NADH quehastael momentono ha sido caracterizado.
El mecanismoporel cual la proteínaHpaCfavorecela hidroxilacióndel sustrato
mediadapor el componenteHpaB aún no ha sido esclarecido.Estaproteínaseparecea
la ORF6del clus/erde genesde la síntesisde la actinorrodinade S. caelicalor (figura 15)
(Fernández-Morenoy cols., 1992)y cuyafunciónno seha determinadoexactamente.Se
ha propuestoque estaproteínapodríaactuarcomounadimerasauniendodosmoléculas
del último precursorde la actinorrodinaparaproducirla estructurafinal del antibiótico,
aunqueno se descartaquepudieraactuarcomounaproteínareguladora.
167
DISCUSIÓN
2. COMPARACIÓN DE LA RUTA DEL 4-HPA DE E. coil W CON OTRAS
RUTAS CATABÓLICAS
Generalmente, para relacionar dos mtas metabólicas desde el punto de vista
evolutivo se tienen en cuentados criterios;por una parte, la similitud en la estructura
primariade las enzimasequivalentesy porotra, la conservaciónen la organizaciónfisica
de los genes(Williams y Sayers,1994).Sepuedeafirmarque dos enzimasderivande un
mismo gen ancestralcuando cumplen los siguientesrequisitos: i) catalizan la misma
reacción, u) las subunidadesde éstas tienen una masa molecular similar, iii) sus
secuenciasde aminoácidospuedenseralineadassin introducir huecosy iv) el porcentaje
de identidadentre ambasproteínases superior al 30 % (Harayamay Timmis, 1992).
Teniendoen cuentaestoscriterios, en esteapartadoseva estudiarla relación entre la
ruta metabólicadel 4-NiPA de E. coli W y otrasrutasmicrobianasde degradaciónde
compuestosaromáticos.
2.1. Comparación de los seneshna con los genesestructurales dc otras rutas
metabólicasde derivados aromáticos
Los primerostrabajosen el estudiode la capacidadde E. cok parametabolizar
compuestosaromáticosfueron realizadospor Coopery Skinner (1980). Estosautores
establecieronque la estirpeC de E. cok mineraliza el 3- y 4-NiPA por una ruta inducible
de tipo me/a, dondeel NIPC actúacomo intermediariocentraldihidroxilado. A pesarde
que el operón me/a de degradacióndel NIPC (hpcECBDGH)de esta estirpeha sido
donadoy secuenciado(Ropery cols., 1993), el operón de la 4-NiPA-hidroxilasa,así
como los geneslocalizadosentreambosoperones(hpaA y JipaN) (figura 24), no habían
sido donadoshastael desarrollode estaTesis.Dadoque E. cali W tambiénescapazde
metabolizarel 3- y 4-NiPA, existía la posibilidad de que las rutas catabólicasde estos
compuestosen ambasestirpespudieranser homólogas.Los resultadosdecisivos que
permitieronla verificación de estahipótesisfueron: i) la confirmaciónde la existenciade
secuenciashomólogasa hpaB en E. cali C (figura 20), u) la donacióndel operón
hpaBCde E. cali C en el plásmidopHC1 y la secuenciaciónparcial del mismo, iii) la
demostraciónde la presenciade genes homólogos a la NIPC-dioxigenasade K.
168
DISCUSIÓN
pneuman¡aetanto en la estirpeC como en la estirpeW (figura 21) y iv) la donacióny
secuenciacióndel operónme/ade degradacióndel HPC de E. cali W (figuras 22-24).
Los resultadosobtenidosmedianteanálisispor Southernblot (figuras 20 y 21) también
sugierenque otrosmicroorganismoscapacesde utilizar el 4-NIPA comoúnicafuentede
carbono como E. cali B, K. pneumaniaey K ci/rophila podrian tener una ruta
catabólicasimilar a la de las estirpesC y W deE. cali.
La rutacatabólicadel 4-NIPA de E. cokW estácompuestaporoncegenes;ocho
genesestructuralesorganizadosen dos operonescatabólicos,el operónhpaGEDFHJu
operónnieta y el operónhpaBC, dosgenesreguladoresJipaR y hpaA, y el genhpaXde
función desconocida,que está relacionadocon la superfamilia de transportadores
transmembranalesMFS (figura 24). Ya seha mencionadoque las enzimasdel operón
me/asonhomólogasa las de la estirpeC de E. cali, sin embargo,la comparaciónde la
secuenciade aminoácidosde las enzimasque componentanto el operónme/acomo el
operónhpaBC, ha revelado que sólo los geneshpaE, hpaG y hpaH codifican para
proteínasque se parecen a las enzimas equivalentesen otras rutas catabólicasde
compuestosaromáticos(figuras25 y 26).
La deshidrogenasaHpaE pertenece a la superfamilia de las aldehido
deshidrogenasas(ADH) igual que las deshidrogenasasXylG y XylC de la ruta TOL
(figura 4) y la proteínaDmpC de la ruta de degradaciónde fenol de Pseudomonas
CF600 (Dmp) (figura 26) (Horn y cols., 1991; Nordlund y Shingler, 1990). La
comparaciónde l-IpaE con otros miembrosde las ADH indica queen estaenzimaestán
conservadostodoslos motivos característicosde la superfamilia.Por ejemplo, la Cys-
278 de HpaE pareceserun residuoesencialimplicado en la unión del NAD>, además,la
regiónanteriora estacisteina, incluyendo]a Phe-271,estámuy conservadaen estas
proteínas.Otra secuenciacaracterística,LGGK, estásituadaa continuacióndel Glu-244
de HpaE. Esteaminoácidopareceestarimplicado en el reléde cargao bien setratadel
aminoácidoque actúacomo nucleófilo. Por otra parte,en el motivo localizadoentrela
Gly-224 y la Gly-229, la secuenciaFTGGTATG se correspondecon la secuencia
consenso(F/Y)TG(S)(T)XXG presenteen esta familia, que también parece estar
implicada en la unión del NAD4. Asimismo, el motivo GTGREG localizado en la
169
DISCUSIÓN
posición454 de HpaE pareceserel responsabledel reconocimientodel cosustrato.Por
último, el Glu-470de HpaE podríaparticiparen el relédecargaaunqueesteresiduono
estáconservadoen todoslos miembrosde las ADH (Horny cols., 1991).
La proteínaHpaEesequivalentea las deshidrogenasasXyIG y DmpC que sonlas
primerasenzimasde la ramadel 4-oxalocrotonato(ramadeshidrogenasaldescarboxilasa)
de la ruta TOL y de la rutaDmp (figuras 2 y 4). Es interesanteresaltarque, a diferencia
de estas rutas que pueden degradarlos derivados catecólicos por la rama del 4-
oxalocrotonatoo por la ramahidrolitica (Powlowski y Shingler, 1994), la ruta del 4-
NIPA de E. col] es la únicadescritahastael momentoqueúnicamenteconstade la rama
deshidrogenasa/descarboxilasa.
Las descarboxilasase hidratasasde las rutas de tipo me/a se caracterizanpor
poseerun origen comúna pesarde tenerfuncionesdiferentes(Harayamay cols., 1989;
Shingler y cols., 1992). Estasenzimasestáncodificadaspor genesdiferentescuyos
productospresentanun porcentajede identidad superioral 30%,por lo que se supone
que provienende la duplicacióngénica de un gen ancestral.Los genesxyLJ y dmpE
codifican paraJas2-oxopent-4-enoato-hidratasasde las rutasTOL y Dmp. En cambio, la
actividaddescarboxilasasólo es evidenteen los clonesque expresanconjuntamentelos
genesxylI y xyLJ de la ruta TOL, y dmpEy dnzpHde la rutaDmp, no detectándoseen
los clonesque producenúnicamentelas descarboxilasasXylI ó DmpH. Además,todos
los intentosde purificaciónde la 4-oxalocrotonato-descarboxilasaactiva han dado como
resultadouna copurificación de las enzimasXylI/XyIJ ó DmpE/DmpH (Harayamay
cols., 1989; Shinglery cols., 1992).
La descarboxilasaHpaG y la hidratasaHpaH se parecena esta familia de
proteínaspero,a diferenciade las descarboxilasasanteriores, la proteínaHpaG parece
habersufrido dosprocesosevolutivos; unaduplicacióngénicay unafusión posteriorde
ambos genes,ya que sus extremosN- y C- terminal son muy similares (figura 25).
Además, los experimentosrealizadospor Roper y Cooper (1993) con la proteína
homóloga(HpcE) de E. coli C indican que estaproteínaes la únicaresponsablede la
actividaddescarboxilasa.Por otra parte,estosautoresatribuyen a la proteínaHpcE una
170
DISCUSIÓN
doble función OPET-descarboxilasa/HHDD-isomerasa.En este sentido, Harayamay
cols., (1989)demostraronque,en la ruta TOL, la reacciónequivalentea la isomerización
llevada a cabo por estaenzimaentre los compuestosHIHDD (forma enol) y OHED
(forma ceto) (figura 24), es un pasoenzimáticodispensable,teniendo en cuentaque,
debidoa su graninestabilidad,la forma enol se transformaespontáneamenteen la forma
ceto. Parallevar a caboestosexperimentos,estosautoressintetizaronquímicamenteel
2-hidroxipent-2,4-dienoato(forma enol) y demostraronque este compuestoes el
sustratoreal de la hidratasaXylJ. Sin embargo,Ropery Cooper,(1993)demostraronla
actividad isomerasade la enzima HpcE utilizando el HIHDD obtenido mediantela
descarboxilaciónenzimáticadel OPETen un clon queconteníael genhpcEen el que no
se detectéactividadHHDD-isomerasa(Jenkinsy Cooper, 1988). La consideraciónde
los procedimientosde obtenciónde la forma enólica utilizados en amboscasos, hace
necesarioconfirmar los resultadosobtenidosparaHpcE medianteun método similar al
utilizado porHarayamay cols. (1989).
El resto de los genesque componenel operónme/a, incluso su gen regulador
JipaR, no se parecena los genesequivalentesde otras rutas. Hasta el momento se
conocela secuenciacompletade los genesestructuralesde las rutasTOL, Dmp, TOD
(ruta de degradacióndel tolueno de P. pu/ida Fi) y algunasrutas de degradaciónde
policlorobifenilos de distintas estirpesdel géneroPseudomonas(Horn y cols., 1991;
Powlowski y Shingler, 1994; Wang y cols., 1995; Furukawa, 1994) (figura 2). La
comparaciónde las enzimasque componenestasrutas ha demostradoque todos los
genesequivalentestienenun origencomúny que, aparentemente,mutacionesproducidas
a lo largo de la evolución han causado cambios en la especificidad enzimática
provocandodiferenciasen la capacidadbiodegradativade los microorganismos(Williams
y Sayers,1994; Harayamay Rekik, 1993). El origen de los genesJipaD, Jipo!’ y Jipal
pareceno estar relacionadocon el de las correspondientesdioxigenasas,isomerasasy
aldolasasde las rutascitadasanteriormente,lo queimplica un claroejemplode evolución
convergente.
La presenciade permeasasen las rutasde degradaciónde compuestosaromáticos
no ha sido estudiadahasta hace relativamentepoco tiempo. Ultimamente se han
171
DISCUSIÓN
secuenciadoalgunos genes integradosen operonesde rutas catabólicaso situados
inmediatamenteal ladode estos,quecodificanparaproteínasquepresentanunasimilitud
muy altacon proteínastransportadoras.Por ejemplo,el gen ladYforma partedel operón
tod (figura 2) y su productose parecea la proteínaFadL de E. cok implicada en el
transportea travésde la membranacelularde ácidosgrasosde cadenalarga.La función
de estegen no estátodaviamuy clara, pero se ha propuestoque puedeactuarcomo
transportadordel tolueno o como proteína receptorade tolueno, responsablede la
activaciónde las proteínasreguladoras(Wang y cols., 1995). Otros ejemplosde este
tipo de proteínassonla proteínaPhtI de la rutade degradacióndel ifalato de P~ pu/iday
la proteína PcaK de la ruta or/o de degradaciónde 4-hidroxibenzoatode P. pu/ida
PRS2000(Nomura y cols., 1992; Harwood y cols., 1994). Ambas pertenecena la
superfamiliade transportadorestransmembranales(MES) (Margery Saier, 1993)aunque
todavía no se conoceexactamentesu función. En el caso de la proteínaPhtl se ha
sugeridoque podríaactuarcomo transportadorde ftalato o como reguladorpositivo de
los genespía’ (Nomuray cols., 1992).En cambio, la enzimaPcaKpodríaactuar,además
de como transportadorde 4-hidroxibenzoato,como proteína quimiorreceptorade
sustrato,y por tanto, estar implicada en la respuestaquimiotáctica que P. pu/ida
experimentaen presenciade estecompuesto(Harwoody cols., 1994).
La comparaciónde la secuenciade aminoácidosde la proteínaHpaX y el análisis
desu perfil hidrofóbico (figuras 32 y 33) sugierenque estaenzimaesun miembro de la
MFS como los casosanteriormenteexpuestos.La mayoría de los miembros de esta
familia contienenel motivo (R¡K)XXX(R/K) entrelas a-hélices2-3 y 8-9 queda lugar a
unaregiónaltamentehidrofilica (Margery Saier, 1993).Entre las hélices8-9 de HpaX se
hanlocalizadodosmotivosconsecutivossimilaresal consensoentrela Arg-3 18 y laArg-
327 (RHSDRRQERR),encambio,en la región situadaentrelas hélices2 y 3, el carácter
hidrofilico es aportadopor el motivo VGARR situadoentre la Val-96 y la Arg-100
(figura32).
Hastael momentono se ha donadoningún gen que codifique parauna 4-NiPA-
permeasa,aunque se ha detectado la presencia de estas proteínas en algunos
microorganismosque mineralizanel 4-NIPA como K. pneumoniaey E. cok C (Allendey
172
DISCUSIÓN
cols., 1992; Coopery Skinner, 1980). Los resultadosobtenidos del análisis de la
secuenciadeHpaX sugierenque estaenzimapodríaactuarcomo un transportadorde4-
NIPA aunque,hastaque sedispongade las pruebasbioquímicasque lo demuestren,no
sedescartaquepuedaestarimplicadaen procesosde regulacióny/o quimiotaxiscomo se
hapropuestoparalas proteínasTodX, PcaKy Phtl.
2.2. Los senes re2uladoresde la ruta del 4-HPA
Generalmente,las rutas bacterianasde derivadosaromáticosestánreguladas
positivamente por proteinas pertenecientes a las familias LysR, NtrC ó XylS/AraC
(Inouyey cols., 1988; Schell, 1993;Gallegosy cols., 1993).Sin embargo,los trabajosde
Ropery cols. (1993) demuestranque la expresiónde los genesdel operónhpcECBDGH
de E. cok C estáreguladanegativamentepor la proteínaHpcR que, como ya se ha
mencionado, no se parece a ninguna proteína secuenciadahasta el momento. La
represiónmediadapor estaproteínadependede la presenciade HPC y/ó 4-HiPA que
actúan como inductores.Además, estos autoresdeterminaronque la expresión del
operónme/aestásujetaa represióncatabólica,lo quejustifica la presenciade un posible
sitio de unión a la proteínaCAP localizadoen la regiónpromotoradel operón (figura
37). Aunque aún no se han realizado los experimentosbioquímicos y genéticos
necesariosparaextrapolarestosresultadosal operónhpaGEDFIHy su reguladorJipaR,
dadala homologíaque presentanlas enzimas,que en el caso de las proteínasHpaRy
HpcR suponeun 100% de identidad (figura 30), se asume que el mecanismode
regulaciónessimilar en ambasestirpes.
La proteínaHpaA esun miembrode familia de reguladoresXyIS/AraC (Gallegos
y cols., 1993)queregulapositivamentela expresióndel operónhpaBCutilizando como
efectores3-NiPA, 4-NiPA y PA. Los miembrosde estafamilia secaracterizanporestar
estructuradosen dos dominios: el C-terminalque presentaun motivo muy conservado
implicadoenlauniónaDNA(figura3l)(Gallegosycols.,1993;Michánycols., 1995)y
el N-terminal, menosconservadoentrelos miembrosde esta familia, que podría estar
implicado en la unión enzima-efectoraunquetodavíano existenlas pruebassuficientes
paraconfirmarlo.
173
DISCUSIÓN
La comparaciónde la secuenciade aminoácidosde la proteínaHpaA revelóque
MeIR esel miembro de estafamilia quemássele parece(figura 31). Estaproteínaregula
positivamentela transcripción del operón melAB implicado en el catabolismode la
melobiosaen E. cok (Webstery cols., 1989). Las diferencias más notables en la
transcripción de los geneshpaA y níelR son, poruna parte,que meiR setranscribeen
sentidocontrario al operón al que regula,como la mayoríade los miembros de esta
familia (Webstery cols., 1988), sin embargo,el gen hpaA se transcribeen el mismo
sentidoqueel operónhpaBC.Además,los experimentosrealizadoscon la cepaMC4100
(pROR?,pREl) y MC4IOO (pRA2) (figuras 44 y 45) indican que la transcripcióndel
gen hpaA puede estar mediadapor los promotoresPA y/ó Px (figura 43). Estos
resultadossugierenque estegen podría formar partedel operónJipaXA aunqueesta
hipótesis no podrá confirmarse hasta que se analice el número de unidadesde
transcripcióngeneradasen estaregión. Por otra parte, la expresióndel operónhpaBC
estásujetaa represiónpor catabolito(figura 46). Dadoque seha localizadoun posible
sitio de unión ala CAP en el promotorPA (figura 47C), y que esteefectono seobserva
en las cepasMC4100 (pROHí) y MC4100 (pRX2) (datos no mostrados),se podría
asumirque la represióncatabólicaobservadaesdebidaa la intervenciónde la proteína
CAP en la expresióndel genhpaA mediadaporel promotorPA. En estesentido,sesabe
quela expresiónde meiRtambiénestáreguladapor la CAP(Webstery cols., 1988).
Las proteínasHpaA y XylS sonlos únicosmiembrosde estafamilia implicados
en la regulaciónde rutascatabólicasde compuestosaromáticos(Gallegosy cois., 1993).
Comosemencionóen el apartado3.2.4. de la Introducción,XylS regulapositivamente
la expresióndel operónme/ade la ruta TOL y su producciónestácontroladapor el
reguladorXyIR y el factor&‘ de la RNA polimerasa(Marquésy Ramos, 1993). Se ha
propuestoquela formaactivade la proteínaesun dímerocuyaformaciónsefavoreceen
presenciade los efectoresy/o cuando XylS estáhiperproducida(Marquésy Ramos,
1993). Los ensayosrealizadoscon la cepaMC4100(pRX2) demuestranque Px es un
promotormuy fuerte,por lo que los elevadosnivelesde 13-galactosidasaproducidospor
la cepaMC4lOO (pROHí, pREl) en ausenciadel efector (figura 44), podríandebersea
174
DISCUSIÓN
una hiperproducciónde HpaA, la cual, como en el caso de XylS (Marquesy Ramos,
1993),provocaríala dimerizaciónde la proteínay por tantoactivaríael promotorPBC.
Desdeel puntode vistacualitativo, la activacióndel promotorPBC cuandoel gen
hpaA se expresamedianteel promotorPA, es similar a la de la cepaE. cokATCC 11105
(pROHí) (figuras 44 y 45). Todos estosresultadossugierenque la expresiónmediada
porel promotorPxpodríaestarcontroladaporalgúnrepresoren la estirpesalvajeel cual
no estápresenteen la cepaMC4100. En estesentido,los ensayosrealizadoscon la cepa
MC4100 (pRX2, pHCR2), dondeseexpresanconjuntamentela fusión Px-lacZy el gen
JipaR (datosno mostrados),indicanque el reguladorHpaRno pareceestarimplicado en
la expresiónmediadapor P>-o. No obstante,hay queteneren cuentaque, a pesarde que
los experimentosdesarrolladosen estetrabajoaportaninformaciónmuy valiosasobreel
mecanismode regulacióndel promotor F~c, los sistemasmulticopia no son los más
apropiadosparaanalizarpromotoresdesdeel punto de vista cuantitativo,puestoque el
nivel deexpresióndel gen lacZ dependedel númerode copiasdel plásmido.En cambio,
un sistemaen el que, tanto el gen reguladorcomo la fusión PBC-lacZ, hubieransido
insertadosen el cromosoma,reproduciríamásexactamentela situación existenteen la
cepasalvaje (Kesslery cols., 1992). Por ello, hastaque no se dispongade un sistema
monocopiaen el que el genhpaA seexprese,por unapartea partir de PA y, por otra, a
partir de Px, no podremosconfirmar cuál esel promotor implicado en la expresiónde
hpaA.
Los únicossustratosde la 4-HIPA-hidroxilasaque secomportancomo efectores
de la proteínaHpaA son el 3-HPA y el 4-NIPA. En cambio, el PA inducela producción
de la 4-1-ll’A-hidroxilasa pero no es transformadoporestaenzima.Dado que E. coli W
es capazde utilizar el PA como única fuentede carbono, la inducción de la 4-NiPA-
hidroxilasaporestecompuestoen la estirpesalvaje(figura 41, tabla 12) podríasugerir la
existencia de una PA-monooxigenasa mediante la cual el PA sería transformado en 3- ó
4-HIPA, que seríanlos verdaderosresponsablesde la inducción. Estaenzimapermitiría
conectarlas rutas del PA y del 4-NiPA. Sin embargo,el hechode que el PA también
provocarala activación de la proteínaHpaA en la cepaMC4100 (pRA2) (figura 45)
excluyeesa posibilidad ya que, como seha demostradoen estaTesis,E. cali K12 no
175
DISCUSIÓN
contienela ruta del 4-NIPA, y por otraparte,la transformaciónde PA en estaestirpeno
origina la acumulaciónde 4-NiPA (Coopery cols., 1985). Por tanto, esmás coherente
sugerirque, en estecaso,la proteínaHpaA secomportade unaformainespecíficaen el
reconocimientodel efector. Además,esteefectotambiénse ha observadoen la proteína
XyIS, ya quealgunosefectoresson compuestosmetabolizablespor la ruta TOL como el
benzoato y sus derivados 3-metil-, 3-etil, 4-metil y 3,4-metil-benzoato. Sin embargo, el
2-metil-benzoatoy ciertosderivadoshalogenadosdel benzoatosoncapacesde activarla
proteínaperono sonmineralizablesporestaruta (Ramosy cols., 1986).
2.3. La or2anizaciónfisicadelos senes
Como se mencionóal comienzodel apartado2., uno de los criterios utilizados
pararelacionarlas rutascatabólicasdesdeel punto de vistaevolutivo es la conservación
en la organizaciónfisica de los genes.Estapremisapermiteconfirmarel orígencomúnde
los genesque componenla ruta me/a de algunas rutas catabólicas.Por ejemplo, la
secuenciade reaccionesque conllevana la mineralizacióndel catecolde las rutasTOL,
Dmp y de la rutadel naftalenode P. pu/ida PpG7(NAH) (figura 2) es la misma, ya que
las tres contienen las enzimas que codifican para la ramas hidrolasa y
deshidrogenasa/descarboxilasa,y el porcentajede similitud entrelas enzimasequivalentes
esmuy elevado(Harayamay Rekik, 1993). Además,el orden de transcripciónde los
genes xYITEGFJQKIH (ruta me/a) de la ruta TOL, es idéntico al de los genes
equivalentesde la ruta Dmp y prácticamenteigual al de la rutaNAI-I. Sin embargo,esta
similitud disminuyeentrelasenzimasquecodificanparalas rutasperiféricas,cuyosgenes
estánlocalizadosen la región inmediatamenteanterior al primer gen de la ruta me/a
(xylT, dmpQy nahT) formandopartedel mismo operón (figura 2) (Williams y Sayers,
1994). Estosgenessuelenestarrelacionadoscon los equivalentesde otrasrutas, así por
ejemplo, en el caso de la ruta TOL, los genesque codifican parala toluato dioxigenasa
(xylXYZ),sonmuy similaresa los genesquecodificanparalabenzoatodioxigenasade A.
calcoace/icus(benABC) (figura 2) (van der Meer y cols., 1992). En consecuencia,
algunos autoreshan sugerido que la evolución de las rutas metabólicasse produce
medianteel ensamblajede módulosfuncionales,en el que estánimplicadosprocesosde
176
DIScUSIÓN
duplicacióngénica,recombinacióny transposición(van derMeer y cols., 1992; Williams
y Sayers,1994;Wyndhamy cols., 1994).
Los resultadosobtenidos en esta Tesis sugieren que, teniendo en cuenta
solamentela similitud entreproteínasequivalentes,los únicosgenesde la rutadel 4-HPA
que podríantenerun origen ancestralcomúna otros genesequivalentesde la rutas de
tipo nieta, son los genes hpaG, hpaH, hpaE y hpaA. En cambio, el orden de
transcripciónde los genesde estaruta no permiteestablecerningunarelación evolutiva
con ningunarutacatabólicaqueno seala de E. coli C (figuras2 y 24).
Porotraparte,se ha demostradoqueel clus/erde genesde la rutadel 4-HPAha
sido adquirido por la estirpe W como un cassettecatabólico(figuras 36 y 37). Este
procesodeadaptaciónmicrobianapermiterelacionarestaruta con otros sistemas,yaque
la adquisición de rutas metabólicascompletas medianteprocesosde transferencia
genética ha sido ampliamente demostradaen otros microorganismos(Reineke y
Knackmuss,1979; van derMeer y cols., 1992).De hecho,se han descritoalgunoscasos
en los que todos los genesresponsablesde la mineralizaciónde un compuestoestán
incluidos en un transposón,comoporejemplola ruta TOL y la rutaNAH (Wyndhamy
cols., 1994). Hasta el momento,no se ha encontradoningunaevidenciaque permita
especularsobreel mecanismoimplicado en la adquisiciónde la ruta del 4-NIPA por la
estirpeW, aunquela ausenciade un genque codifique parauna típica transposasa,así
como la ausenciade secuenciasinvertidasen los extremosdel clus/er,sugierenqueno se
ha adquiridomedianteun procesotípico de transposición.
Por último, se ha descritola tendenciade algunos genes a insertarseen el
cromosomaen una posiciónmuy cercanaa la de otrosgenesque codifican paraenzimas
relacionadasfisiológicamentecon las proteínasproducidaspor los primeros. Aunque
todavíano seconocenlos factoresque determinanestosprocesos,algunosautoreshan
sugeridoqueno setratade un hechoaleatorio(Houghtony cols., 1995).Por tanto, no
deberíadescartarsela posibilidadde queel procesode insercióndel genpac en la región
del cromosomapróximaa la del clus/erde la ruta del 4-NIPA, hayasido controladopor
algún procesodeadaptaciónmicrobiana,dirigido a ampliar la capacidadbiodegradativa
177
DISCUSIÓN
de E. cotí W. Por otra parte, seria interesanteinvestigar si existe alguna relación
funcional entregenesde la ruta del 4-NIPA y las OREs 12 y 13 ya que, aunquela fUnción
del productodel gencstA no ha sido determinadacon exactitud,hay queteneren cuenta
que estegen se ha localizado en E. cali MC4100 a 600 pb del operónen/CEBA-P15,
que es responsablede la síntesis del compuestoaromáticoenterobactina,y que la
expresiónde algunosgenesde estetipo seinduceen presenciade ciertoscompuestos
aromáticos(Schultzy Matín, 1991; Blom y cols., 1992).
178
DISCUSIÓN
3. PERSPECTIVASDE FUTURO EN LA UTILIZACIÓN DE LOS GENESDE
LA RUTA DEL 4-HPA EN LA DESCONTAMINACIÓN MEBIOAMBIENTAL
Aunque el 3- y 4-NIPA no soncompuestosxenobióticos,la acumulaciónmasiva
de éstos puedeacarrearproblemasde toxicidad ademásde provocar otros efectos
nocivos, desdeel punto de vista medioambiental,derivadosde su mal olor (Spoelstra,
1978). Ya se ha comentadoque, puestoque E. coli W escapazde mineralizarestos
compuestos, estemicroorganismopodríaserutilizado en los procesosde depuración
biológicaderesiduosconalto contenidoen 4-NiPA, como el alpechín(apartado5.2 de la
Introducción).En estesentido,la caracterizaciónde la rutadel 4-NiPA realizadaen este
trabajo, ha permitido determinarcuálesson los genes implicados en esta ruta, y así
disponerde la informaciónnecesariaparadesarrollarun sistemaque permitatransferira
otros microorganismosla capacidadde metabolizarel 3- y 4-NIPA (figuras 48-50). La
viabilidad del uso de mini-transposonesderivadosde ms en procesosde transferencia
genética se ha comprobadoen diferentes especiesde los génerosPseudomonas,
Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Proteus, Vibrio, Borde/ella, Actinobacillus,
Rhizobiuní,Rhodobac/er,Agrobac/eriumy Alcaligenes(de Lorenzoy Timmis, 1994).
Por tanto,la construcciónde un módulotransponiblecon los genesde la rutadel 4-NIPA
en derivadosmini-TaS,haceposibleque los microorganismosantesmencionadospuedan
ser también consideradoscomo candidatosen el diseño de biorreactorespara la
depuraciónbiológicadel alpechín.
En esta Tesis también se ha demostradoque la producción de la 4-NiPA
hidroxilasa de E. cok W en P. pu/ida, permite a estemicroorganismoutilizar el fenol
como única frente de carbono (figura 51), constituyendoun claro ejemplo de la
aplicación de la ingeniería genética en la expansiónde la capacidadmetabólica
microbiana.La baja especificidadde sustratoque presentaestaenzimadeja abiertala
posibilidadde utilizar el vector-transposónpAJ224parainsertarel operónhpaBCen el
genomadeotrosmicroorganismoscapacesde mineralizaralgúnproductode la reacción
mediadaporla 4-NIPA-hidroxilasa,y así ampliarel espectrode sustanciasmetabolizables
pordichosmicroorganismos.
179
DISCUSIÓN
Por otra parte, el catecolse utiliza en la industria farmaceúticay alimentaria
como compuestobase para la síntesis de algunos medicamentosy aromatizantes.
Actualmente,la obtencióndel catecolse llevaa cabo medianteun procesode oxidación
químicadel fenol que da lugaruna mezclade productosaromáticoshidroxi]ados Esta
mezclase someteposteriormentea una seriede procesosde purificación que elevan
considerablementeel costetotal del proceso.En estesentido,seriainteresanteestudiarla
posibilidaddeobtenercatecolenzimáticamentemedianteel usode la 4-NIPA-hidroxilasa
de E. cali e inclusomedianteprocesosde fermentaciónbacteriana.
Por último, la activación efector-dependientede la proteína HpaA permite
considerara estaproteínacomoun candidatoparael desarrollode bionsensores(van der
Lelie y cols., 1994)que permitanla detecciónde la presenciade PA, 3- y 4-NIPA en un
entorno determinado,como por ejemplo en alimentos,puesto que, como ya se ha
comentado,la concentraciónde PA y algunode susderívadosesun parámetroateneren
cuentaen la clasificaciónde ciertosalimentos(Steegy Montag,1988).
180
V. CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
De los resultadospresentadosen esta memoria se derivan las siguientes
conclusiones:
1. La ruta catabólicadel 4-NIPA de E. col] W estácompuestapor once genes;ocho
genesestructuralesorganizadosen los operoneshpaGEDFHJ y hpaBC, los genes
reguladoresJipaRy hpaA,y el genhpaXquepodríaactuarcomouna4-NIPA-permeasa.
2. El operónhpaBCcodificaparala hidroxilasaHpaB y laproteínacooperadoraNipaC,
siendo ambos componentesnecesariospara que se manifieste la máxima actividad
hidroxilasa
3. La 4-HPA-hidroxilasaesun sistemaenzimáticodependientede FAD y NADH que
presentaun rangomuy amplio de especificidadde sustratoya que ademásdel 3- y 4-
NIPA puedehidroxilarotroscompuestosaromáticos.
4. La 4-NIPA-hidroxilasa no presentasimilitud con ninguna de las monooxigenasas
secuenciadashastala fecha,por lo que puedeconsiderarsecomo el primermiembro de
unanuevafamilia.
5. La expresióndel operónhpafiC estáreguladapositivamentepor la proteínaHpaA,
pertenecientea la familia de reguladoresXyIS/AraC. Entre los distintos compuestos
ensayadosen estetrabajo, sólo el 4-NiPA, el 3-NiPA y el PA se comportancomo
efectoresde la proteínaHpaA. La expresiónde la proteínaHpaA estásujetaa represión
catabólica.
6. El operónhpaGEDFHIestásituadoen unaposiciónadyacenteal operón¡¡paRC y es
similar al operónme/ade la rutacatabólicadel HPC deE. col] C.
7. El gen JipaR es similar al gen hpcRde E. coli C que codifica para el represordel
operónme/aen estaestirpe. Los productosde ambosgenesno se parecena ninguna
proteínareguladorasecuenciadahastael momento.
182
CONCLUSIONES
8. La descarboxilasaHpaG, la deshidrogenasaHpaE y la hidratasaHpaHpresentanuna
similitud significativa con las enzimas equivalentes de otras rutas catabólicas de
compuestosaromáticos-oPor el contrario, la dioxigenasaHpaD, la isomerasaHpaF y la
aldolasaHpaIsólo muestransimilitud con las enzimasequivalentesde la rutadel NIPC de
E. cali C.
9. El análisisde las regionesflanqueantesde los genesde la rutacatabólicadel 4-NIPA de
E. cokW ha permitido concluir queesteclus/er sehainsertadoen el cromosomade esta
estirpecomo un módulofuncional. La comparaciónde estaregión con la secuenciade
nucleótidoslocalizadaentrelos minutos92,8 y 0,1 del cromosomadela estirpeMG1655
de E. cali K12, ha permitido determinar que la ruta del 4-NIPA se ha insertado
exactamentea 61 pb del codonde iniciación del gen tsr de E. cok, que codifica parala
proteínaquimiorreceptorade serma.
10. Todos los genes necesariospara que E. cali K12 niineralice el 4-NIPA están
contenidosen este cluster, ya que su expresiónen este microorganismole permite
utilizar4-HPAcomofuentede carbono.
11. La expresión del operón hpaBC en P. pu/ida KT2442 capacita a este
microorganismopara mineralizar fenol, lo que suponeuna expansiónvertical de su
capacidaddegradativa.
183
VI. BIBLIOGRAFÍÁ
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