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Captulo 1Biologia celular e ultraestruturaBiologia celular e ultraestruturaBiologia celular e ultraestruturaBiologia celular e ultraestruturaBiologia celular e ultraestrutura

Helene Santos BarbosaSuzana Crte-Real

1. H1. H1. H1. H1. Histricoistricoistricoistricoistrico

Citologia, ou biologia celular, a cincia que estuda os vrios sistemascelulares, a maneira como as clulas so reguladas e a compreenso do funcio-namento de suas estruturas. A construo dos microscpios pticos foi umpasso decisivo para a descoberta das clulas, e acredita-se que o primeirotenha sido inventado em 1592, por Jeiniere da Cruz e seu pai, ZachariasJansen, dois holandeses fabricantes de culos. Tudo indica, porm, que oprimeiro a fazer observaes microscpicas de materiais biolgicos foi o holan-ds Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723). O microscpio simples comapenas uma lente, construdo por Leeuwenhoek, foi aprimorado por RobertHooke em 1665, ganhando mais uma lente.

A partir dos estudos de Hooke em biologia, publicados em um livrointitulado Micrographia (1665), que analisou cortes finos de cortia obtidosda casca do sobreiro, verificou que estes eram constitudos por pequenascavidades polidricas (no latim, cella), as quais foram denominadas clulas.Estes compartimentos representavam as paredes das clulas vegetais mortas. Em

20 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

1838, o botnico alemo Matthias Schleiden descreveu que a clula era aunidade bsica de todas as plantas e, mais tarde, em 1839, o zologo alemoTheodor Schwann chegou mesma concluso para os animais. Com basenestes conhecimentos, elaborou-se a teoria celular que foi proposta por Schleidene Schwann. Posteriormente, a associao de tcnicas de colorao e decitoqumica foi capaz de revelar as estruturas e a fisiologia das clulas.

O grande avano no conhecimento da biologia celular, sem dvida, foia inveno dos microscpios eletrnicos em 1931, por dois engenheirosalemes Ernst Ruska e Max Knoll , o que possibilitou a visualizao dasorganelas celulares em grande detalhe.

A clula uma unidade funcional que estabelece interao entre seuscomponentes, sob o aspecto fisiolgico, biossinttico e reprodutivo. A din-mica celular para a manuteno da vida regida por um processo deautomanuteno, que compreende a modificao de estruturas, a substituiode componentes, de tal forma articulada que garanta a sua organizao estrutu-ral e funcional.

2. Clulas procariticas e eucariticas2. Clulas procariticas e eucariticas2. Clulas procariticas e eucariticas2. Clulas procariticas e eucariticas2. Clulas procariticas e eucariticas

A divergncia entre procariontes e eucariontes deve ter ocorrido apsserem estabelecidos os mecanismos de replicao e transcrio do cidodesoxirribonucleico (DNA), a traduo, o sistema de cdons e os metabolis-mos energticos e biossintticos. O principal critrio de distino entre estesgrupos a sua organizao celular. As clulas procariticas (do latim pro-primeiro e cario-ncleo) so relativamente simples e se caracterizam por noapresentarem membrana, segmentando os cidos nucleicos DNA) e ribonucleicos(ARN) do citoplasma. Alm disso, algumas destas clulas apresentam umamembrana plasmtica circundada externamente pela parede celular. As clulaseucariticas (do latim eu-verdadeiro e cario-ncleo) constituem o tipo celularda constituio dos fungos, protozorios, animais e plantas. Estruturalmente,so clulas mais complexas, ricas em membranas que formam compartimentos,

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ou seja, uma diviso de funes metablicas entre as organelas citoplasmticase o ncleo, circundado pelo envoltrio nuclear, onde est contido todo seumaterial gentico. Para os eucariontes, a compartimentalizao de atividadescelulares em organelas circundadas por membranas fosfolipdicas foi decisivapara a homeostase celular.

Os componentes das clulas eucariticas (Figura 1) compreendem: a mem-brana citoplasmtica, o citoplasma, o ncleo, o retculo endoplasmtico, o comple-xo de Golgi, os lisossomos, as mitocrndrias, os peroxissomos, as incluses lipdicas,o glicognio, o citoesqueleto, os centrolos, o centrossomo, os cloroplastos (en-contrados em vegetais) e a parede celular, sendo esta ltima encontrada em fungose vegetais. As caractersticas morfolgicas e fisiolgicas das principais estruturasencontradas nas clulas eucariticas sero apresentadas a seguir.

Figura1. Clula eucaritica mostrando membrana plasmtica, ncleo (N) e organelas.

2.1. Membrana celular

A membrana plasmtica ou celular atua na manuteno de microambientes,formando uma barreira que impede o contedo celular de escapar e se misturarcom o meio circundante. Esta membrana confere individualidade a cada clula,

Biologia Celular e Ultraestrutura


definindo os meios intra e extracelulares. Alm desta funo, a membranaplasmtica o primeiro contato entre esses meios, traduzindo informaes parao interior da clula e permitindo que ela responda a estmulos externos quepodem influenciar nas suas funes biolgicas, participando decisivamente dasinteraes clula clula e clula matriz extracelular.

A membrana plasmtica e a membrana das diferentes organelas celularesmedem cerca de 7 a 10 m de espessura e so visveis somente ao microsc-pio eletrnico. Trata-se de uma estrutura trilaminar constituda de duas camadaseletrondensas (escuras) e uma camada eletronlcida (clara) central. Molecularmenteso formadas por uma bicamada fluda de fosfolipdios (fosfoglicerdeos eesfingolipdios) e colesterol, onde esto inseridas molculas de protenas. Amembrana plasmtica no uma estrutura esttica, os lipdios movem-se pro-porcionando fluidez membrana.

Esquema mostrando a bicamada da membrana plasmtica:

Figura 2. A membrana plasmtica formada por molculas de lipdeos (fosfoglicerdeose esfingolipdeos), colesterol, protenas perifricas (localizadas somente em uma dascamadas dos fosfolipdeos) e as transmembranares (localizadas nas duas camadasdos fosfolipdeos, ligando o meio extracelular ao citoplasma). A cadeia de peque-nas molculas verdes representa os carboidratos localizados somente no lado exter-no da membrana plasmtica.

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Os carboidratos presentes nesta estrutura, como, por exemplo, glicose,manose, fucose e galactose, esto ligados s protenas, formando as glicoprotenas;ou aos lipdios, resultando nos glicolpidios e nos glicoesfingolipdios. Estescarboidratos esto presentes apenas na face externa da membrana e forne-cem identidade clula.

A membrana apresenta uma propriedade imprescindvel para manu-teno da viabilidade celular, que a permeabilidade seletiva, controlandoa entrada e a sada de substncias da clula. A passagem de molculas polaresmaiores e os ons requer canais, formados por protenas transmembranares.

O transporte de molculas para o interior das clulas pode ser:a) transporte passivo por difuso ou por osmose, quando no envol-ve o consumo de energia do sistema, sendo utilizada apenas a energiacintica das molculas. Sendo assim, a movimentao dos ons e mol-culas d-se a favor do gradiente de concentrao (do meio hipertnicopara o meio hipotnico). A difuso pode ser auxiliada por enzimas(difuso facilitada) ou pode no ter participao de nenhuma delas(difuso simples). A difuso simples ocorre quando molculas hidrofbicaspequenas e polares, como O2, CO2, N2 e C6 H6, passam pelamembrana sem serem bloqueadas;b) transporte ativo quando o transporte das molculas envolve autilizao de energia pelo sistema, na forma de adenosina trifosfato(ATP). A movimentao das substncias se d contra o gradiente deconcentrao, ou seja, do meio hipotnico para o hipertnico, como,por exemplo, a bomba de sdio e potssio, que tem funo de mantero potencial eletroqumico das clulas.Entretanto, partculas maiores no conseguem atravessar a membrana,

mas podem ser incorporadas clula pela prpria estrutura da membranacelular, ocorrendo, assim, a formao de vesculas. A este processo, no qual amembrana celular envolve partculas ou fluido do exterior, d-se o nome deendocitose. Ele ocorre por dois mecanismos:



a) fagocitose quando ocorre a captao de molculas maiores, part-culas ou microrganismos. Neste processo, a partcula a ser ingerida tocana membrana celular, formando projees chamadas de filopdios;

b) pinocitose processo utilizado pela clula para englobar poresde fluidos extracelulares e pequenas molculas. Neste caso, a mem-brana sofre um processo de invaginao, ocorrendo a formao depequenas vesculas. Estas so direcionadas para o citoplasma para queocorra a absoro dos nutrientes. Por outro lado, para eliminar subs-tncias residuais, a clula utiliza o processo de exocitose, no qual umavescula, vinda do citoplasma contendo material que deve ser elimina-do, se funde membrana plasmtica, lanando o seu contedo nomeio extracelular.

2.1.1. Especializaes da membrana plasmtica

A comunicao e a coeso entre as clulas so estabelecidas por meiodas membranas, formando trs classes funcionais de junes celulares:

a) juno ancorante ou aderente clula-clula ou clula-matriz, squais a fora de estresse transmitida ao citoesqueleto. Existem vriostipos desta juno; destacamos, dentre eles, os desmossomas, oshemidesmossomas e junes que circundam completamente as clulas,atuando como uma barreira de permeabilidade e tenso;

b) juno apertada ou oclusiva (tight junctions) um tipo de junoque liga duas clulas vizinhas, selando os espaos entre elas e tornandoessa regio impermevel, no permitindo, assim, a passagem de peque-nas molculas ou ons;

c) juno mediada por canais proteicos so as junes comunicantes(gap junctions) que permitem a passagem de molculas e de ons entreduas clulas adjacentes.

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2.2. Citoplasma

O citoplasma, ou citossol das clulas eucariotas, formado por umasoluo coloidal, viscosa e de aspecto relativamente uniforme, que contmgua (80%), ons diversos, aminocidos e protenas. No citoplasma estolocalizados o ncleo e as organelas celulares, o retculo endoplasmtico, ocomplexo de Golgi, os lisossomos, as mitocndrias, os peroxissomos e, ainda,as incluses lipdicas, os grnulos de glicognio e os ribossomos. Estas estrutu-ras so responsveis pelas funes celulares, como digesto, respirao, secre-o, sntese e transporte de protenas. No citoplasma esto tambm os ele-mentos do citoesqueleto, responsveis por vrias atividades dinmicas das clu-las, e os centrolos, estruturas geradoras dos microtbulos.

2.3. Ncleo

Estrutura extremamente importante para as clulas eucariticas, poisnele esto contidos os cidos nucleicos (cdigo gentico), protegidos peloenvoltrio nuclear. no seu interior que ocorre a duplicao do DNA e atranscrio dos ARNs.

O ncleo tem sua localizao geralmente no centro da clula e a suaforma pode estar relacionada ao tipo celular. O envoltrio nuclear compostopor duas membranas, uma externa e outra interna, com composies proteicasdistintas, que delimitam um espao varivel que oscila entre 40 e 70 mm. Amembrana interna deste envoltrio se encontra associada lmina nuclear, que,por sua vez, est ligada fortemente cromatina. A membrana externa do envoltriocircunda a membrana interna e contnua com a membrana do retculoendoplasmtico (RE). Este fato faz com que o espao existente entre as membra-nas do envoltrio seja tambm contnuo luz do RE. Assim como a membranado RE, a membrana externa do envoltrio face citoplasmtica apresentaribossomos aderidos que esto envolvidos ativamente na sntese proteica. Oenvoltrio nuclear interrompido regularmente, formando os poros nucleares.



Eles tm nmero e densidade bastante variveis, dependendo do tipo celular eestado metablico da clula. Pelos poros, ocorre o transporte bidirecional seleti-vo de protenas e ARNs entre o citossol e o ncleo.

No ncleo (Figura 3) de clulas em intrfase encontra-se a cromatina compactada (heterocromatina) ou frouxa (eucromatina) composta de molcu-las de DNA, protenas histnicas e no histnicas. As histonas, protenas bsicasencontradas nos eucariotos, so importantes componentes da estrutura da cromatina,participando no somente como repressoras, mas tambm como ativadoras natranscrio do DNA. Por outro lado, as protenas no histnicas desempenhampapel estrutural e enzimtico, participando da atividade gnica.

No ncleo interfsico tambm esto os nuclolos, cuja funo sintetizarARNs e envi-los para o citoplasma. Os nuclolos podem ter estrutura reticularou compacta e o tamanho e a forma dependem do estado funcional da clula,variando conforme o tipo celular. Durante o ciclo celular, geralmente os nuclolosdesaparecem a partir do final da prfase, reaparecendo no final da telfase.

A lmina nuclear est presente no ncleo, tendo papel importante nareorganizao nuclear aps o trmino da diviso celular. Ela est ancorada sprotenas integrais da membrana interna do envoltrio nuclear e ligada forte-mente cromatina. constituda por protenas filamentosas intermedirias dotipos A e B que se polimerizam em uma rede bidimensional.

Da estrutura do ncleo faz parte a matriz nuclear, que forma uma redeproteica fibrogranular alicerando o ncleo. Ela est associada ao DNA duran-te os processos de duplicao e regula a transcrio nos eucariotos, juntamentecom as histonas.

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Figura 3. (A) Moncitos mostrando o ncleo ocupando grande extenso docitoplasma da clula; (B) clula eucaritica, apresentando ncleo com poros(setas) e mitocndrias (M).

2.4. Retculo endoplasmtico

O retculo endoplasmtico (RE) encontrado na maioria das clulas,ocupando cerca de 10% do volume celular. formado por uma rede demembranas interconectadas na forma de tubos ou cisternas. Dois tipos deretculo endoplasmtico so observados: liso (ou agranular) e rugoso (ougranular), os quais apresentam caractersticas morfolgicas e funcionais distintas.

O retculo endoplasmtico liso, ou agranular, caracterizado pela au-sncia de ribossomos aderidos sua membrana e apresenta-se como uma redede delgados tbulos que se anastomosam entre si. As funes desse retculoso muito variadas, dentre elas a sntese de hormnios e de lipdios, adesintoxicao celular com a converso de substncias nocivas lipossolveisou insolveis em compostos hidrossolveis e o armazenamento de clcio.

O retculo endoplasmtico rugoso (Figura 4), ou granular, caracteriza-do pela presena de polirribossomos (ribossomos e ARNm) aderidos ao ladoexterno da membrana. Esta organela apresenta formas variadas, frequentementeem forma de tbulos achatados e longos ou bem dilatados, podendo estar


(A) (B)


localizada em vrios pontos da clula ou concentrada em determinadas reasdo citoplasma. O RE rugoso, em parceria com os polirribossomos, tem umimportante papel na sntese e exportao de protenas. As protenas so captu-radas pelo RE, por receptores presentes na sua membrana, assim que comeam aser sintetizadas pelo complexo de ribossomos e ARNm. As protenas sintetiza-das podem ter dois destinos: como protenas transmembranares ou protenashidrossolveis. As protenas transmembranares podem permanecer na membra-na do retculo ou serem destinadas membrana plasmtica e membrana deoutras organelas. Por outro lado, protenas hidrosolveis, quando sintetizadas,podem ser direcionadas para o complexo de Golgi ou encaminhadas ao lmende alguma organela e secretadas no meio extracelular.

Figura 4. Retculo endoplasmtico rugoso (RE) dilatado de fibroblasto, apre-sentando ribossomos aderidos membrana.

2.5. Complexo de Golgi

O complexo de Golgi, aparelho de Golgi ou simplesmente Golgi(Figura 5) foi descrito em 1898 pelo bilogo italiano Camilo Golgi e formado por vesculas e tbulos achatados empilhados e organizados, chama-

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dos de cisternas (cerca de 4 a 8 cisternas). As cisternas voltadas para oretculo endoplasmtico so convexas (cisternas cis). As centrais so denomi-nadas cisternas medianas, e as mais prximas ao stio de secreo so cncavas(cisternas trans). O complexo de Golgi apresenta como principais funes oprocessamento de lipdeos e protenas (denominados de glicosilao, sulfataoe fosforilao) e a separao e o endereamento de molculas sintetizadasfazendo parte da via biossinttica secretora (RE sntese; Golgi processamentoe seleo; vesculas transporte). As vias secretoras compreendem o transpor-te de lipdeos, protenas e polissacardeos aos destinos finais e o empacotamentodas macromolculas em diferentes vesculas de transporte. Essas vesculas trans-portadoras direcionam protenas/lipdeos/hormnios do retculo endoplasmticopara o complexo de Golgi (face cis); o transporte de protenas/lipdeos (mo-dificados) do complexo de Golgi para o retculo endoplasmtico (face cis) epara a superfcie celular (face trans) e, ainda, o transporte das molculas queoriginam os lisossomos (face trans).

Figura 5. Citoplasma de clula eucaritica apresentando complexo de Golgi(G) com suas cisternas empilhadas, vesculas e mitocndrias.



2.6. Lisossomos

Os lisossomos so estruturas geralmente esfricas, delimitados por umamembrana, que apresentam uma grande variao no seu tamanho. Eles soformados no complexo de Golgi, e em seu interior se encontram acumuladascerca de quarenta enzimas hidrolticas com propriedade de digerir uma grandegama de substratos, incluindo nucleases, proteases, glicosidases, lipases,fosfolipases e sulfatases. Estas hidrolases tm um pH timo entre 3 e 6, e,assim, o interior dos lisossomos cido. A acidificao realizada por bombasde H+, que usam ATP. As suas enzimas so glicoprotenas provenientes doGolgi, que saem da sua face trans em vesculas especficas. A compartimentalizaodestas enzimas impede a lise indiscriminada dos contedos celulares. A princi-pal funo do lisossomo a digesto intracelular, permitindo, assim, que aclula seja capaz de degradar partculas, macromolculas, microrganismos ououtras clulas provenientes da endocitose. Alm disso, os lisossomos agem naeliminao de organelas ou partes danificadas da prpria clula, por um pro-cesso denominado autofagia. A formao dos autolisossomos se inicia quan-do uma poro de RE envolve uma organela que deve ser destruda, formandouma vescula em seu redor. Esta vescula posteriormente acidificada e funde-se com um lisossomo primrio, que inicia a degradao. Na heterofagia, oslisossomos fundem-se com endossomos (provenientes da endocitose) oufagossomos (provenientes da fagocitose).

2.7. Mitocndrias

As mitocndrias (Figura 6) esto presentes no citoplasma das clulaseucariticas, sendo caracterizadas por uma srie de propriedades morfolgicas,bioqumicas e funcionais. Geralmente, so estruturas cilndricas, podendo seresfricas, ovoides e alongadas, com aproximadamente 0,5 mm de dimetro evrios micrmetros de comprimento. Possuem grande mobilidade, localizando-se em stios intracelulares onde h maior necessidade de energia, pois suafuno principal a produo de ATP. Uma clula heptica normal pode

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conter de 1.000 a 1.600 mitocndrias, enquanto alguns ovcitos podemconter at 300 mil. Possuem organizao estrutural e composio lipoproteicacaractersticas, e contm um grande nmero de enzimas e coenzimas queparticipam das reaes de transformao da energia celular. Esta organela caracterizada pela presena de um envoltrio formado por duas membranasestrutural e funcionalmente distintas, as quais delimitam dois espaos. Existe umespao intermembranar separando as membranas interna e externa, e um segun-do gerado pela membrana interna, delimitando a matriz mitocondrial. A mem-brana interna apresenta uma srie de invaginaes para o interior da mitocndria,gerando as cristas mitocondriais, onde esto presentes os componentes dacadeia respiratria responsveis pela sntese de ATP. As mitocndrias apresen-tam uma molcula de DNA circular, semelhante quelas encontradas nas bact-rias. Alm disso, contm todo mecanismo necessrio para replicao e transcri-o do DNA e traduo de protenas. Entretanto, apenas uma pequenaquantidade de protenas codificada pelo DNA mitocondrial. Com basenessas evidncias, surge a teoria endossimbitica.

A mitocndria considerada a usina da clula, uma vez que esta capaz de processar oxignio e glicose e convert-los em energia na forma deATP, por meio do ciclo de Krebs e da cadeia respiratria.

Figura 6. Fibroblasto: mitocndrias apresentando a matriz mitocondrial eletrodensa,cristas mitocondriais e a dupla membrana.



2.8. Peroxissomos

Os peroxissomos (Figura 7) so organelas envolvidas por apenasuma membrana e no contm DNA e nem ribossomos; todas as suasprotenas devem ser importadas do citosol. Apresentam em seu interior umcontedo granuloso fino e so geralmente arredondadas, medindo cercade 0,5mm de dimetro. No seu interior, comum se observar a presenade uma poro fortemente eletrodensa, o nucleoide. Dentre as enzimasencontradas nos peroxissomos destacam-se a catalase, a urato oxidase, a D-aminocido oxidase e as enzimas responsveis pela beta oxidao dos cidosgraxos. Os peroxissomos assemelham-se ao retculo endoplasmtico porquese autorreplicam sem possuir genomas prprios. Nas clulas animais, osperoxissomos participam da biossntese de precursores de glicerolipdeos, docolesterol e do dolicol. O nmero relativo de peroxissomos na clula podevariar rapidamente em resposta s mudanas ambientais e s condies fisiol-gicas. Os processos de sequestro e degradao dos peroxissomos so deno-minados macroautofagia e microautofagia.

2.9. Incluses lipdicas

Incluses lipdicas (tambm chamadas de corpos lipdicos, gotas lipidcasou adipossomas) so organelas ricas em lipdios presentes em todos os organis-mos, incluindo fungos, procariotos e eucariontes. Elas variam de tamanho, tmaspecto circular e esto distribudas por todo o citoplasma das clulas.

Os corpos lipdicos so circundados no pela clssica bicamada demembrana, mas por uma monocamada de fosfolipdios, a qual, no mnimo emalgumas clulas, deve ter uma nica composio de cidos graxos. O ncleointerno dos corpos lipdicos rico em lipdios neutros, mas estudos comleuccitos tm demonstrado que os corpos lipdicos no so simples sacos delipdios neutros. Considera-se atualmente que sejam organelas funcionalmenteativas, altamente reguladas e dinmicas. Pelo uso de tcnicas para identificao

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subcelular de fraes enriquecidas de corpos lipdicos, combinado comimunodeteco de protenas por microscopia eletrnica e de luz, tem sidodemonstrado que corpos lipdicos compartimentalizam enzimas envolvidas nabiossntese, transporte e catabolismo de lipdios, caveolina e de protenasenvolvidas no transporte vesicular. A formao regulada de corpos lipdicos,seus contedos proteico e lipdico, e sua associao com outras organelasintracelulares, em algumas clulas especializadas, atuam na sinalizao e ativaocelulares, regulao do metabolismo de lipdios, trfego de membrana e con-trole da sntese e secreo de mediadores inflamatrios.

Figura 7. Incluses lipdicas.

2.10. Glicognio

O glicognio (Figura 8) um polissacardeo constitudo por subunidadesde glicose com uma ramificao a cada oito ou dez unidades. Ocorre interna-mente, na forma de grandes agregados ou grnulos no citoplasma. o meiode armazenamento mais importante nas clulas animais, servindo de reservatriode glicose. Os hepatcitos so responsveis pela manuteno da glicemia, ao



mesmo tempo em que fornecem glicognio para outras clulas do organismo.Principal fonte de energia no crebro, os glicognios produzidos pelos astrcitosso mobilizados para atividade neuronal.

Figura 8. Glicognio distribudo no citoplasma de clula eucaritica.

2.11. Citoesqueleto

O citoesqueleto confere s clulas eucariticas a manuteno da diversi-dade de formas, a realizao de movimentos coordenados e direcionados esua estruturao interna. Esse citoesqueleto depende de uma complexa redede filamentos de protenas que se estende por todo o citoplasma, sendoconstitudo por trs principais tipos de estruturas: os microtbulos, os filamentosintermedirios e os filamentos de actina.

Os microtbulos so formados por subunidades: b-tubulina e a-tubulina,as quais se associam uma s outras, conferindo-lhe assim uma forma cilndrica,com o dimetro de 25 mm. Os microtbulos direcionam o deslocamento devesculas, participam da diviso celular com a formao do fuso mittico para odeslocamento dos cromossomos e esto presentes na manuteno da estruturacelular e na morfologia dos clios e flagelos.

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Os filamentos intermedirios recebem esta denominao por apresenta-rem um dimetro intermedirio entre filamentos de actina e microtbulos (10mm de dimetro). Sua composio proteica, formando uma rede estruturalpor toda a clula.

Os filamentos de actina (Figura 9) esto distribudos por todo o citoplasmadas clulas eucariticas e apresentam dimetro de 5 mm. Eles so formados poruma protena globular, a actina, que apresenta as isoformas: a, b e g. Estesfilamentos, nas clulas epiteliais, esto concentrados nos prolongamentoscitoplasmticos, participando, juntamente com os desmossomos, do contatocom outras clulas e com a membrana basal, mantendo, assim, a integridadeorganizacional do epitlio. Nos miofibroblastos, importantes clulas do tecidomuscular, os filamentos de actina esto organizados paralelamente membranaplasmtica, mantendo estas clulas tensionadas ao substrato e so, ento,denominados fibras de estresse.

Figura 9. Fibra estresse (asterisco) localizada abaixo da membrana, formada pormicrofilamentos de actina.



2.12. Centrossomo

O centrossomo, principal centro organizador de microtbulos, est lo-calizado prximo ao ncleo da clula em intrfase e contm um par de forma-es cilndricas e curtas dispostas perpendicularmente entre si e envolvidas pormaterial pericentriolar, denominadas centrolos. Estas estruturas so formadaspor nove triplex de microtbulos, semelhantes aos corpos basais de flagelos eclios. Esto presentes na maioria das clulas animais, porm ausentes nasclulas vegetais.

3. Tcnicas para visualizao das organelas celulares3. Tcnicas para visualizao das organelas celulares3. Tcnicas para visualizao das organelas celulares3. Tcnicas para visualizao das organelas celulares3. Tcnicas para visualizao das organelas celulares

3.1. Protocolos para revelao do ncleo

O ncleo pode ser visualizado tanto por microscopia de campo claro,com a utilizao do corante Giemsa, quanto por microscopia de fluorescncia,utilizando o corante fluorescente DAPI (4,6-diamidino-2-phenilindole). PorME, ele pode ser visualizado quando se utiliza acetato de uranila, que torna acromatina eletrodensa.

3.1.1. Marcao nuclear com DAPI

1- Fixar com 4% de PFA por 20 minutos a 4C;2- Lavar duas vezes com PBS;3- Lavar duas vezes com soluo de BSA 1% diluda em PBSpor 10 minutos cada;4- Incubar com DAPI 1:10.000 em 0,85% NaCl por 5 minutosem temperatura ambiente;5- Lavar trs vezes com soluo de BSA 1% diluda em PBSpor 10 minutos cada;6- Montar com DABCO;7- Selar com esmalte.

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3.1.2. Colorao com Giemsa

1- Fixar com Bouin por 5 minutos em temperatura ambiente;2- Lavar trs vezes com lcool etlico a 70%;3- Lavar uma vez com gua destilada;4- Corar com Giemsa (6 gotas de corante para cada 1mL de tampofosfato 0,2M soluo de uso filtrado), por 15 minutos em tempe-ratura ambiente;5- Lavar duas vezes em gua destilada. Para clarificao, passar emsrie de acetona / xilol (acetona 100% duas vezes, acetona 70% /xilol 30%, acetona 50% / xilol 50%, acetona 30% / xilol 70%,xilol 100% duas vezes);6- Montar com Permount.

Preparao do tampo fosfato 0,2M:

Soluo A:

NaH2PO4 . 1 H2O (fosfato de sdio monobsico) ................. 27,6 g

gua tridestilada.......................................................................... 1 L

Soluo B:

Na2HPO4 (fosfato de sdio bibsico)...................................... 39,4 g

gua tridestilada.............................................................................1L

Soluo estoque do tampo:

Soluo A................................................................................28 mL

Soluo B.................................................................................72 mL

Soluo de uso:

Diluir 1:10 (soluo estoque: gua tridestilada).



3.2. Protocolo de marcao do retculo endoplasmtico

O RE pode ser observado por microscopia de fluorescncia pela utiliza-o de marcador fluorescente especfico, o ER-Tracker. E, por microscopiaeletrnica de transmisso, utilizando-se citoqumica ultraestrutural, revelando aenzima glicose-6-fosfato.

3.2.1. ER-Tracker

Preparao de reagentes

O ER-Tracker Green fornecido liofilizado em 100 mg. Preparar umasoluo estoque de 1mM. Para isso, deve-se diluir todo o contedo do frascoliofilizado em 128 mL de DMSO. recomendado que esta soluo sejaseparada em alquotas e estocada em freezer com dessecante.

Preparo da soluo de marcao

Diluir a soluo estoque de ER-Tracker a 1 mm para a concentraorecomendada de 500 mm em meio simples;

Para clulas aderidas, remover o meio da cultura, lavar trs vezes commeio simples e adicionar a soluo de marcao pr-aquecida. Incubaras clulas por 30 minutos a 37 C. Substituir a soluo de marcaopor meio de cultura e visualizar as clulas, utilizando microscpio defluorescncia. Se as clulas a serem marcadas precisarem ser fixadas,consultar as etapas de marcao a seguir.

Fixao das clulas ER-Tracker Green

Lavar as clulas em meio simples por trs vezes. Fixar com PFA 4% por20 minutos em temperatura ambiente. Lavar trs vezes com PBS, mon-tar entre lmina e lamnula com DABCO.

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3.3. Protocolo para marcadores seletivos de mitocndria

Mitocndrias podem ser reveladas com marcadores fluorescentes espe-cficos, como MitoTracker e Rhodamine 123, os quais so visualizados pormicroscopia de fluorescncia. Graas sua morfologia tpica, so facilmenteidentificadas durante as anlises por microscopia eletrnica.

3.3.1. Mito-Tracker

Preparando a soluo estoque

Dissolver o produto liofilizado em DMSO de alta qualidade para umaconcentrao final de 1 m; o peso molecular indicado no rtulo doproduto. Solues em que se utilizam derivados di-hidro devem serpreparadas no dia do uso. A soluo estoque pode ser armazenada emfreezer a -20 C, protegida da luz.

Preparando soluo de marcao

A concentrao para uma boa marcao varia de acordo com a suaaplicao. As condies sugeridas aqui podem necessitar de modifica-es baseadas nos tipos celulares utilizados ou em outros fatores, taiscomo permeabilidade das clulas ou dos tecidos a serem marcados.Diluir a soluo estoque de MitoTracker a 1 mm para uma soluo deuso com meio de crescimento Dulbeccos modified Eagle medium(D-MEM), sem soro, ou de acordo com o meio em que as clulasesto crescendo. Para marcao em clulas vivas, usar uma concentraode 100 mm.

Marcando clulas aderidas

Crescer as clulas em lamnulas dentro de uma placa de Petri cobertapelo meio de cultura apropriado. Quando as clulas alcanarem a con-fluncia desejada, remover o meio da placa, lavar trs vezes em meiosimples e adicionar o meio pr-aquecido (37 C) contendo MitoTracker.Incubar as clulas por 30 minutos sob condies de crescimento apro-



priadas para cada tipo celular. Substituir o meio com marcador por meiopr-aquecido e observar as clulas em microscpio de fluorescncia,utilizando o filtro adequado. Para fixar as clulas, deve-se retirar o meiocom marcador e lav-las com meio simples. Fixar com PFA 4% por 20minutos em temperatura ambiente, lavar trs vezes com PBS e montarentre lmina e lamnula com DBCO.

3.4. Protocolo de marcao de grnulos de glicognio

Para caracterizar a expresso de polissacardeos grnulos de glicognio ,utilizamos mtodos citoqumicos ultraestruturais, empregando a tcnica de Thiry.O material deve ser processado de acordo com o protocolo de microscopiaeletrnica de transmisso, sendo as amostras includas em resina Epon. Oscortes ultrafinos so obtidos e recolhidos em grades de ouro e submetidos aoseguinte protocolo:

3.4.1. Thiry

1- As clulas so oxidadas por 20 minutos com 1% de cido peridico;

2- Lavadas rapidamente por duas vezes em gua destilada;

3- Incubadas por 30 minutos, 24, 48 ou 72 horas, em cmara mida,com 2% de tiocarbohidrazida diluda em 20% (v/v) de cido actico;

4- Lavadas sucessivamente em concentraes decrescentes de cidoactico (10%, 5%, 3% e 1%) por 1 minuto cada;

5- Reveladas com 1% de proteinato de prata diludo em soluo aquosapor 30 minutos. OBS: metodologia alternativa, aps as etapas descritasanteriormente, a revelao ser realizada pelo vapor de tetrxido desmio por 1 minuto;

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6- Lavadas com gua (uma vez rapidamente), seguidas de uma lavagempor 10 minutos, trocando a gua sucessivas vezes;

7- Ao final, os cortes sero examinados diretamente ao microscpioeletrnico EM10C da Zeiss, sem prvia contrastao.

Os controles da reao sero feitos por:a) Omisso de tiocarbohidrazida;b) Omisso da oxidao com cido peridico;

c) Omisso dos agentes reveladores.

3.5. Protocolo para marcao de compartimentosintracelulares cidos

A marcao de compartimentos intracelulares cidos lisossomos pode ser feita utilizando os marcadores laranja de acridina e Lysotraker:

1- Diluir a soluo estoque a 1 mM para uma soluo de uso a umaconcentrao de 75 nM. A diluio deve ser feita em meio de culturasimples;

2- Remover o meio da placa, lav-la com meio simples trs vezes eadicionar o meio pr-aquecido (37 C) contendo o marcador;

3- Incubar as clulas com laranja de acridina ou Lysotraker diluda emmeio utilizado para o cultivo celular na concentrao de 10mg/ml e75 nM, respectivamente, por 30 minutos a 37 C, sob condiesapropriadas para crescimento de cada tipo celular;

4- Aps incubao, lavar duas vezes em salina tamponada com fosfato(PBS) e observar as clulas em microscpio de fluorescncia com ofiltro adequado;

5- Fixar com 2% paraformaldeido durante 20 minutos a 4 C e, emseguida, lavar trs vezes com PBS;



6- Em seguida, incubar com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)para visualizao do ncleo por cinco minutos temperatura ambiente;

7- Lavar com PBS;

8- Montar a lmina com antifading 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane(DABCO).

Referncias bibliogrficasReferncias bibliogrficasReferncias bibliogrficasReferncias bibliogrficasReferncias bibliogrficas

ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da clula. 4. ed. Porto Alegre: Artes Mdicas,2004.

CARVALHO, H. F.; RECCO-PIMENTEL, S. M. A Clula. So Paulo: Manole, 2001.

GIEMSA, G. Eine Vereinfachung und Vervollkommung meiner Methylenblau-Eosin-Frbemethode zur Erzielung der Romanowsky-Nochtschen Chromatinfrbung. Centralblattfr Bakteriologie, I, Abteilung Originale, v. 32, p. 307-313, 1904.

THIRY, J. P.; RAMBOURG, A. Cytochimie des polysaccharides. J. Microscopie, v.21, p. 279-282, 1974.

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