CAPITULO 6. Preservación de cultivos para el proceso de fermentación

6.1 Introducción: Las células son los bloques de construcción de la fermentación y por tanto es indispensable su conservación con el fin de obtener procesos exitosos. Los cultivos celulares son la materia prima más crítica usada en la fermentación y como tal deben ser caracterizados y controlados estrictamente.

Las células deben conservarse de tal manera que se garanticen sus propiedades genéticas en tiempos y espacios definidos. Es importante que en los cultivos se induzca un estado metabólico llamado “ANIMACIÓN SUSPENDIDA” en el cual no existen cambios conformaciones o de cualquier otro tipo en el tiempo; la manera las fácil y común de lograrlo es mediante el CONGELAMIENTO a temperaturas muy bajas. Se menciona el uso de temperaturas CRIOGÉNICAS (-196°C A -135°C) que son alcanzadas utilizando típicamente el nitrógeno líquido (LN2) el cual sólo se puede utilizar en cultivos conservados en ampollas de vidrio termoselladas o pajas de plástico termoselladas.

A continuación se tratan temas y métodos de conservación y almacenamiento de cultivos utilizados para bioprocesos industriales enfatizando en la CRIOPRESERVACIÓN (mantenimiento de la viabilidad celular y las propiedades biológicas a través de metodologías de congelación).

6.2 Agua, hielo y preservación de la vida6.2.1 Células congeladas

El agua es el disolvente universal y es esencial para la vida ya que se ve comprometida en muchas reacciones químicas y bioquímicas necesarias para vivir. Sin embargo, la presencia de moléculas de agua puede ser mortal para las células cuando se transforma en una red cristalina de enlaces de hidrógeno conocido como HIELO.

La criopreservación induce estasis metabólica celular, lo que impide o suprime variaciones genéticas durante el almacenamiento, en parte porque al reducir la temperatura se induce una fuerte inhibición en las velocidades de reacciones quimicas catalizadas por enzimas. La crioconservación se puede realizar de 2 formas: a) Con células depositadas en ampollas de vidrio termoselladas que se almacenan o sumergen directamente en LN2 y b) Almacenamiento de ampollas de vidrio en un ambiente donde están en contacto con la fase de vapor de LN2 (más utilizadas actualmente).

Bancos de células: son colecciones de células criopreservadas las cuales se cultivan en condiciones definidas en medios líquidos nutritivos que se dividen en recipientes estériles y se congelan. Los recipientes que mayormente se utilizan son las ampollas de vidrio, viales de plástico o tubos de plástico delgado o “pajas”; todos los recipientes criogénicos son conocidos como CRIOVIALES los cuales deben ser lo suficientemente robustos, soportar la esterilización por vapor, irradiación de luz y almacenamiento de gas (el más utilizado en el criovial de polipropileno que se usa en almacenamiento en fase de vapor de LN2). Todos los bancos de células se preparan y llenan en condiciones estériles o asépticas en cabinas de seguridad biológica y bajo flujo laminar.

6.2.2 Unidad biológica

Se habla acerca de la importancia de la evolución de las células ya que en principio el congelamiento-descongelamiento es un proceso que induce la muerte celular, sin embargo, la

integralidad de las células, su estado evolutivo y las condiciones óptimas en que se realizan los procesos criogénicos disminuyen el impacto de esta técnica. Además, gracias a la gran similitud entre los diversos sistemas biológicos (animal, vegetal y microbiano) es posible utilizar y realizar ensayos de criopreservacion en cada sistema encontrando una viabilidad casi idéntica.

6.2.3 Madre naturaleza

La CRIOBIOLOGÍA es el estudio delos efectos de las bajas temperaturas sobre los organismos vivos, tejidos y células individuales. El principal mecanismo de defensa que se desarrolla en la naturaleza es la producción de AGENTES ANTICONGELANTES. Se mencionan dos ejemplos: a) Glucosa: La rana de la madera (sylvatica) que sobrevive al invierno en ciclos de congelación-descongelación gracias a que descomponen el glucógeno y distribuye la glucosa a todos sus tejidos con el fin de deshidratar las células por difusión osmótica y por tanto no hay agua que se congele en las mismas; y b) Glicerol: Las larvas de la avispa Bracon cephi acumulan 25% de glicerol en su hemolinfa (sangre) lo cual le permite tolerar temperaturas de hasta -50°C entrando en un estado de animación suspendida. La circulación de glicerol en la sangre logra una deshidratación intracelular que impide el congelamiento del agua presente en las células.

6.2.4 Agentes protectores

Los AGENTES CIOPROTECTORES (CPAs) son aquellos que se utilizan para mantener la viabilidad de las células en procesos de congelamiento-descongelamiento. Estos CPAs se deben utilizar a concentraciones adecuadas para preservar la integralidad y funcionalidad de las células. Por lo general, para que sean eficaces, deben ser sustancias químicas de bajo peso molecular como el glicerol, tener alta solubilidad en agua y alta permeabilidad a través de membranas celulares, además de presentar baja toxicidad. Los CPAs son capaces de reducir o disminuir el punto de congelamiento del agua y los solutos biológicos asociados a ella. Los CPAs generan enlaces de hidrogeno con el agua y cambian sus propiedades a bajas temperaturas impidiendo la formación de cristales de hielo.

La principal alternativa al glicerol como CPA es el dimetilsulfoxido (DMSO) de alta pureza el cual se utiliza en la criopreservacion de virus, bacterias, espermatozoides, hongos, levaduras y protozoos. El DMSO presenta ciertas características que lo hacen un CPA excelente: penetra membranas y paredes celulares, es de bajo peso molecular, elimina radicales libres de oxígeno, mantiene la fluidez de las membranas plasmáticas y mitocondrial a temperaturas menos a -5°C y se usa en bajas cantidades (típicamente entre 5-10% v/v de las células criopreservadas).

La otra categoría de crioprotectores son conocidos como NONPERMEATING (o de peso molecular superior) tales como sacarosa, lactosa, trehalosa, manitol, sorbitol, almidón de hidroxietileno y PVP los cuales no penetran membranas. Se utilizan como adyuvantes con el DMSO para aumentar la recuperación de células viables. Estos compuestos actúan inhibiendo la formación de cristales de hielo fuera de la célula y proporcionan estabilidad mecánica a la célula. Las proporciones adecuadas de uso generalmente se dan de forma empírica. También se pueden usar combinaciones entre DMSO + NONPERMEATING + peptonas o proteínas como albuminas de suero o hidriolisato de caseína. Por último es necesario mencionar que no se asegura un 100% de supervivencia de las células después del congelamiento-descongelamiento ya que la utilidad de las CPAs está limitada a sus concentraciones toxicas.

6.2.5 Congelamiento y descongelamiento

Después de elegir un solo CPA o una combinación, es necesario encontrar la VELOCIDAD DE ENFRIAMIENTO Y CALENTAMIENTO óptimos para cada tipo de célula. La optimización del proceso se da en función de disminuir los factores de estrés físicos y químicos durante la congelación: La formación de hielo intracelular y la hipertonicidad inducida por altas concentraciones de solutos extracelulares. Si se congelan muy lento, las células quedan expuestas al medio extracelular hipertónico y se forza la salida del agua hacia el exterior y si se congelan muy rápido se forma hielo intracelular induciendo ruptura de las membranas. Ya que no todas las células son iguales, no existe un protocolo universal para garantizar la supervivencia celular. Dichas velocidades de congelamiento y descongelamiento se deben evidenciar en ensayos previos que garanticen la viabilidad de las células después del proceso de criopreservacion medidas a partir de tasas de calentamiento. También se debe tener especial cuidado con el AGUA RESIDUAL O AGUA UNIDA (la cual no se congela ya que se encuentra entrelaza a varios organelos de la célula), ya que de acuerdo a porcentaje intracelular de esta agua, se pueden presentar variaciones osmóticas al pasar de un estado al otro.

6.2.6 Agua, hielo y calor?

Por extraño que parezca, durante la congelación se genera calor. La liberación de calor durante la congelación se llama CALOR LATENTE DE FUSIÓN O CALOR LATENTE DE CRISTALIZACIÓN el cual es la liberación de energía que forma los cristales de hielo a partir del agua cuando se alcanzan temperaturas menores a 0°C. Al formarse la red cristalina de hielo, se generan enlaces de hidrogeno que liberan energía y, por consiguiente, calor. Si no se controla la velocidad de enfriamiento, la liberación de calor puede generar un aumento de la temperatura generando que no se alcance el punto de congelación óptimo de la célula y se afecte la viabilidad de la misma.

6.2.7 Temperatura de almacenamiento

Una vez se congelan y depositan las células en su recipiente, es indispensable controlar la temperatura en que se almacenan. A temperaturas iguales o inferiores a la temperatura de transición vítrea de agua pura (-139°C) no hay recristalización del hielo y las reacciones químicas y procesos biofísicos son muy lentos que no afectan la supervivencia celular. En teoría, si se mantiene dicha temperatura (por ejemplo con el LN2 se alcanza -196°C y cesan las reacciones) la viabilidad de la célula se mantiene en el tiempo. Sin embargo, cabe resaltar que a esa temperatura el ADN todavía es susceptible de daño fotoquímico por radiaciones ionizantes o rayos cósmicos y ya que no hay reacciones bioquímicas de reparación por el congelamiento, después de descongelar, la célula ya no es viable. En casos donde la temperatura de almacenamiento es superior (-70°C a -60°C) porque no se cuenta con los equipos necesarios, es necesario realizar seguimiento a la viabilidad de las células constantemente.

6.3 Bancos de células especializadas para la industria

Los cultivos celulares empleados a nivel industrial deben contar con los estándares mínimos de conservación y almacenamiento, pero además, se debe confirmar la identidad y auseancia de cualquier otro microorganismo asegurando la pureza, seguridad y eficacia de los productos. Generalmente se toman como referencia los bancos de células de primera línea. En dichos bancos se investigan células generadas por tecnologías genéticas como la transfeccion, transformación o

mutagenesis. Los bancos de segundo nivel son aquellos que utilizan células genéticamente modificadas para confirmar la pureza, fenotipo, genotipo y expresión de alguna proteína en particular. Es importante evaluar la procedencia de la materia prima en las operaciones de fabricación y los instrumentos utilizados en los procesos con el fin de controlar rigurosamente los estándares de calidad requeridos.

6.4 Guía de laboratorio para una criopreservacion exitosa6.4.1 Recipientes criogénicos (crioviales)

Seleccionar el recipiente criogénico adecuado que soporte los rigores de congelamiento a las temperaturas producidas por el vapor de nitrógeno líquido (-110°C a -190°C)

Pueden ser pre-esterilizados por el fabricante o se pueden esterilizar por vapor, irradiación gama, gas de óxido de etileno.

Se deben identificar mediante rótulos indelebles que soporten rigores de congelamiento-descongelamiento

Se debe utilizar un tapón tipo rosca para evitar riesgos de exposición o fugas tras el descongelamiento por expansión rápida del LN2

Verificar que no hayan fugas en las ampollas a utilizar antes del congelamiento por inmersión en azul de metileno durante 30 min. Si la ampolla contiene rastros se debe descartar.

Si se utiliza inmersión en LN2, NO utilizar crioviales de plástico Las células provenientes de Bancos se deben almacenar en crioviales de polipropileno con

cierre de polietileno de alta densidad para que no se alteren sus características.

6.4.2 Crioprotectores y medio de congelación

Los CPA deben ser esterilizados por filtración de membrana antes de su uso por una membrana de tamaño de poro de 0,2mm

Si se usa DMSO la membrana de filtro debe ser resistente a solventes orgánicos Los medios de congelación y crioprotectores se deben almacenar a temperaturas de

refrigeración El tiempo de exposición de las células a los CPAs antes de la congelación debe ser limitado

con el fin de no generar alguna toxicidad

6.4.3 Cultivos celulares y crioviales de llenado

La recolección y transferencia a los crioviales debe hacerse en una cabina de seguridad biológica bajo flujo laminar

Por lo general, la recolección de las células se realiza en la fase exponencial de crecimiento donde la viabilidad es máxima

El llenado de los crioviales se debe realizar en frío (4-8°C) Se debe mezclar o agitar la suspensión de las células durante el llenado para asegurar la

distribución uniforme en los crioviales La transferencia y llenado de crioviales se realiza manual (con pipeta estéril) o

semiautomático (con bomba peristáltica)

6.4.4 Congelamiento de crioviales

Asegurar el intervalo de velocidades de congelamiento del cultivo Se usan programas computarizados que lleven el control en la velocidad y aseguren la

reproducibilidad del proceso de un lote a otro Si no se cuenta con un congelador computarizado, se debe utilizar un recipiente mecánico

ultrafrio (-70°C) en el que se almacenan los crioviales después de varias horas durante las cuales se desprende vapor de LN2

6.4.5 Almacenamiento y envío de crioviales

Una vez congelado, los crioviales deben permanecer a una temperatura inferior a -135°C (temperatura de transición vítrea del agua) preferiblemente en vapor de LN2

Se debe contar con un congelador el cual es monitoreado por alarmas que detectan variaciones por encima a -135°C

La apertura de los congeladores debe reducirse al mínimo para evitar fluctuaciones de temperatura que puede reducir la viabilidad de las células

Los congeladores deben permanecer bajo llave y con acceso limitado al personal de laboratorio autorizado

El envió y transporte de crioviales se debe dar en cargadores de nitrógeno que mantienen temperaturas inferiores a -135°C preferiblemente que usen vapor de LN2