capitui,o vi
TRANSCRIPT
CAPITUI,O VI
M$TODOS PARA EI, ^STUDIO CUANTITATIVO
DE I,OS MICROORGArTISMOS D^I, SUEI,O
a) To^ D^ xuES2^s D^, su^^.o. - Cualquiera que sea el mé-
todo que haya de emplearse para el estudio microbiano de un suelo,
el prisner problema que se presenta es el de la toma de muestras del
mismo, que ha de ser ejecutada con aneglo a ciertas normas, ya que
una muestra mal tomada puede conducir a conclusíones erróneas.
El suelo presenta una gran variación, tauto en sus característi-cas físicoquímicas como en las biológicas, aun en superficies peque-ñas. Waksman (ioo), en 5i muestras de suelo, tomadas a distanciasde z metros en una superficie de 2,5 áreas, encontró que el ntímero debacterias por gramo de tierra oscilaba entre 8 millones y 25 millones.Esta gran variabilidad aconseja que para los análisis microbiológicosse utilicen las denominadas muestras medias, procedentes de la mezclade varias muestras tomadas a igual profundidad en distintos puntosdel terreno a estudiar, no pudiéndose otorgar valor eficaz a las deter-minaciones basadas en una sola muestra del terreno.
Para el estudio de los suelos forestales aconseja Pehér (33) reali-zar las investigaciones en parcelas de experiencias grandes y biendelimitadas, las cuales, para eliminar las influencias perturbadoras delas zonas colindantes, deben elegirse, dentro de la masa de arbolado,de tal manera que la naturaleza de 1a parcela corresponda al caráctermedio del conjunto forestal.
Cada parcela de egperiencias consta de una parte exterior y de otrainterior. I,a magnitud de la parte interior oscila entre zoo y 50o me-tros cuadrados. 1~n esta «parte principal^ ► de la parcela de experien-cias, Pehér numera los árboles, para poder también investigar su cre-cimiento y obtener una imagen exacta de la realidad. I,a parte exteriorsirve de zona o cortina de protección. I,a superficie total de la parcelade experiencias oscila, según las condiciones ]ocales, entre o,5 y unaheciáxea.
Para tomar las muestras se quita con una espátula la capa de hoja-
-99-
rasca sin descomponer que cubra el suelo, sacando la muestra hastacle una profundidad de unos i5 cm., mediante un tubo metálirn de3 a 5 cm. de diámetro provisto de bordes cortantes. Cuando quieraestudiarse la variación del número y clase de microorganismos con laprofundidad, debe abrirse una zanja de un metro de larga por o,5o me-tros de ancha y la profundidad deseada, tomando las muestras de unade las caras laterales, cuya superficie se limpíará con la espátula en lospuntos destinados a la toma de muestras.
Para preparar la muestra media, Fehér recomienda reunir paracada parcela las muestras de quince o veinte sitios, y después de bienmezcladas, tomar una muestra en un frasco de vidrío esterilizado, quese envfa inmediatamente al laboratorio para su análisis.
Wasksman aconseja tomar cinco muestras medias, procedentescada nna de ellas de la mezcla de tres o cuatro muestras tomadas endistinto^s lugares del terreno.
Tanto los instrumentos como el material de vidrio, etc., utiliza,dosen la toma de muestras debe estar cuidadosamente limpio, y a serposible, esterilizado, para evitar contaminaciones, aun cuando enesta fase del análisis, las posibles contaminaciones por eaposicpbn alaire y otras causas serían muy pequeñas con relacióu al elevado náme-ro de microorganismos contenidos en el suelo.
1^s de gran importancia que las muestras de suelo se utilictn lomás rápidamente posible después de su extracción, ya que un largoperfodo de almacenamiento puede ocasionar variaciones considera-bles, tanto en lo que se refiere al número y relación cuantitativa debacterias como a otras condiciones de las muestras, tales como pH,nitrificación, etc.
Fehér ha realizado estudios comparativos para apreciar la inflnen-cia del almacenamiento y transporte, sobre todo en los meses de in-vierno, en que egiste gran diferencia de temperatura entre el suelo yel recipiente en que se transportan las muestras. )^1 resultado de estasinvestigaciones se refleja en la figura 4, que demuestra claramente quela elevación de temperatura y el almacenamiento, tanto en recipien-tes abiertos como en cerrados, influye grandemeute en el estado bioló-gico de las muestras de suelo.
I,os valores del pH sufren grandes variaciones, que también seobservan en el número de bacterias. Si los recipientes se mantienenabiertas, aumenta el número de bacterias aerobias, descendiendo, aun-que menos rápidamente, el de las anaerobias; por el contrario, si losrecipientes se conservan cerrados, el número de las bacterias anaero-
- I00 ---
5.000.000
4.000.000
3.000.000
2.000.000
I.000.000
0
6,5
6,0
5,5
5.0
i.
'- _ __
^^ .^
..-- ,-'
_`>>
.^-_ _ - .. ^.
^^__ - ,,
``^` --^^ - -
.'--- .. ._^ ^^
. ^i
â 20, ID.4. IIf.6.
^••^^ Cerrodo .----- ^bicrto.
m.13. BL19.
BOCICrqS
jO^C1)
Acrobias
Anaerobins
uP-
Fze. q.-Variación del número de bacterias y del valor del pH durante el transportede las muestras de suelo en recipientes abiertos y cerrados. (5egún Fehér.)
biaa aumenta considerablemente (de16o al ^o por ioo en nueve días),mientras disminuye el de las aerobias.
Como el valor del pH está infYuído en gran medida por la activi-dad de las bacterias, reacciona inmediatamente, y en los recipientesabiertos, después de elevarse permanece casi constante; en los reci-pientes cerrados, en un principio aumenta también, a consecuenciadel gran trabajo de demolición, y posteriormente desciende a vatoresmás ácidos, como resultado de los procesos de anaerobiosis.
^stas e$perienCias demuestran que en bacteriologfa del suelo, lasinvestigacionea egactas sólo son posibles, especialmente en invierno,cuando se analizan las muestras de veinticuatro a cuarenta y ochohoras después de tomadas y se conservan en locales frescos.
Una vez en el laboratorio, y antes de proceder a su análisís, semezcla cuidadosamente la tierra de cada una de las muestras mediascon ayuda de una espátula, para hacerla lo más homogénea posible,y caso de contener piedrecillas, se pasa a través de un tazniz limpio,esterilizado a ser posible, de 2 nam. de malla.
Para el estudio analítico del suelo pueden emplearse métodasculturales, basados en el desarrollo de los microorganismos del sueloen medios de cultivo adecuados, y métodos llamados directos, consis-tentes en la observación microscópica de una porción del suelo encuestión.
b) Mk^TODOS CUI,TURAI.ES. - I,os métodos culturales para el es-
tudio de los microorganismos del suelo, derivados en un principio de
los métodos usados en medicina, adquirieron gran desarrollo des-
de i881, en que Koch introdujo la técnica de los medios gelatinizados
en placa de Petri para el cultivo de las bacterias, aunque pronto se
vió que los medios más usados en bacteriologta patógena no eran los
más adecuados para el estudio de los microorganismos del suelo, por
no ser medios de composición constante y definida y porque permiten
un desarrollo ezuberante de unos cuantos organismos que invaden
toda ia placa, dificultando con ello el desarrollo de los restantes.
I,os medios de cultivo usados en estos métodos han de permitirel desarrollo del mayor número posible de organismos, y deben serde una composición tal que puedan repetirse idénticos en cualquiermomento o laboratorio; de aquí que hayan de estar constituídos prin-cipalmente a base de sales inorgánicas, y que aquellas substanciasorgánicas indispensables para suministrar carbono y nitrógeno debenser puras y de composición definida y estable. Con el fin de reducir el
- IOI -
desanollo de los organismos de crecimiento esuberante, que impedi-rían el desanollo de numerosas bacterias de crecimiento lento, la can-tidad de materia orgánica del medio debe ser lo más pequeña posible.
Entre el gran número de medios de cultivo propuestos para lacieterminación cuantitativa de microorganismos mediante el méEodode la ^laca, nosatros entresacamos los siguientes:
I. - Agar-extracto de suela, de Fiseher (34) ^
k^tracto de snelo ........ . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . Iooo c. c.
Agar ........................................ Iz gramos.
g,^iPO^ .................................... z •
1~1 estracto de suelo se prepara calentando en un autoclave du-rante media hora, a una atmósfera de presión, una determinada can-tidad de suelo con un peso igual de una solución al o,i por Ioo deNa,CO,.
z. - Agar-eztracto de suelo, de Fehér (33)^
k^tracto de suelo ............................. Iooo c. c.
Agar ........................................ Ig gramos.
El extracto de suelo puede prepararse:a) Hirviendo a fuego directo durante dos horas un kilogramo de
tierra con dos litros de agua corriente; ob) Calentando en el autoclave durante una hora, a una presión
de una o i,5 atmósferas, un kilogramo de tierra con i.ooo c. c. deagua corriente.
l^n los dos casos, se filtra, se completa el volumen con agua hasta2.00o c. c., se le añade un gramo de K,HPO,, se hierve y se filtra de
nuevo.3. - Agar-albuminato de sosa, de Waksman (toI):
Agua destilada ............................ Iooo c. c.
Agar ..................................... Ig,oo gramos.
Giucoea ................................... I,oo •
Fosfato bipotásico (S,IiPO^) .. .. .... . . . . . . . . o,go ^Sulfato magnésico (MgsO^ • qH,O) ...... . . . . . o,zo ^ ,
Sulfato férrlco (Fe:(SO^), • 9Ii,0) .... . . . . . . . . Indicios.Albúmina de huevo en polvo .. . . . . ... . . . . . . . o,xg gramos.
Se hace una suspensibn de la albúmina en g a io c. c. de agua, se
agrega z c. c. de una solución o,iN de NaOH, para formar el albumi-
nato de sosa, que se añade al medio ya filtrado. I,a reacción del medio
es, aproximadamente, pH : 7,2.
- I02 -
q. - Agar-ye¢tona, de I,ipman y Brown (6 ► ):
Agua ..................................... iooo c. c.
Agar ..................................... i5,oo gramos.
Peptona .................................. 0,05 r
^. - Agar-caseína sódica, de Waksman (ioi):
Agar ........................................ iz.5 Sramos.
Casefna sódica (nxtrosa) . ..................... 2,0 •
Glucosa ...................................... i,o .
Foefato bipotAsico (BsHPO*) .. .. .. .. . . . . . . . . . . . 0,2 •
Sulfato magaéaíoo (Mg30^ ' 7Fis0) . . . . . . . . . . . . . . 0,2 •
Sulfato fertoeo (FeSO• • 7I^0) . . . . . . . . . . . . . . . . . Indidos.
Agua corriente ................................ iooo c. c.
No es necesario ajustar la reacción del medio, que tiene, aproxi-madamente, un pH = 6,8.
0. - Gelatina-extracto de suelo, de Fehér (33) ^
^ztracto de suelo.....' ........................ tooo c. c.
Geiatina ..................................... ioo gramos.
F,1 extracto de suelo preparado según Fehér (fórmula 2) se calienta
durante una hora u hora y media al baño de vapor. Se deja enfriar
hasta una temperatura de 45^, y se añade albúmina de huevo para
clarificarlo, calentándolo nuevamente de media hora a tres cuartosde hora. Cuando se ha coagulado la albúrnina, se filtra, en caliente,
sobre papel.En la preparación de los medios de cultivo deben disolverse los
componentes, incluso el agar o la gelatina, en agua hirviendo. Des-
pués de filtrar en caliente, a través de algodón o lana de ^ridrio - el
filtrado de medios con agar, a través de papel, es lento, y sólo puede
hacerse con embudos especiales provistos de calefacción -, se agre-
gan aquellos componentes que puedan alterarse por un calentamiento
excesivo (sales amoniacales, albuminato sódico, glucosa, etc.). Se re-
parte en tubos de ensayo, en cada uno de los cuales se ponen unos
io c. c.; se tapan con algodón, y se esterilizan de dos a tres veces,
con intervalos de veinticuatro horas, procurando que la temperaturade esterilización no exceda mucho de los roo^, sobre todo en medios
que contengan glucosa.
Todo el material de vidrio (pipetas, matraces, placas de Petri, etcé-
tera) que haya de utilizarse para la obtención de cultivos deberá
- Io3 ,
esterilizarse previamente, en seco, a una temperatura de i2o^ a z4o^,durante varias horas. Fs conveniente regar las paredes y el suelodel laboratorio rnn una disolución acuosa de bicloruro mercúrico ali por Ioo, inmediatamente antes de empezar a trabajar.
I,a muestra media del suelo que queremos analizar se remueveperfectamente sobre una placa de vidrio con ayuda de una espátulaesterilizada, y se pesan 5o gramos, que se mezclan con 5vo c. c. deagtta esterilizada, agitando para provocar la dispersión del suelo. F^perfodo de agitación varta según los operadores. Waksman recomiendatma duración de cinco minutos: rPexíodos más cortos no permitenla separación de las bacterias unidas a las parttculas del suelo; y pe-ríodos más largos - dice - pueden disminuir el námero de bacte-rias er. forma vegetativa a causa de fenómenos de plasmólisis.r Fehérrecomienda la agitación durante una hora en un aparato de agita-ción horizontal alternativa. Nosotros, en las experiencias realizadas,tio hemos encontrado aumento apreciable en el número de micro-organismos para períodos de agitación comprendidos entre los cincoy los sesenta minutos, por lo que habitualmente agitamos la mezclade agua y suelo durante cinco o seis minutos.
Cada centímetro ctíbico de esta mezcla encierra o,i granios de suelo.De esta primera dilución de suelo, sin dejarla reposar, tomamos io cen-tímetros cúbicos con una pipeta esterilizada, y en matraz estkril, losmezclamos con go c. c. de agua destilada, agitando cuidadosamente,con lo que obtenemos la segunda dilución, que tendrá o,oi gramasde suelo por centímetro cúbico.
Y así sucesivamente, como se indica en el siguiente cuadro, en el
que el número de orden de la dilucíón nos indica el número de cerosen el denominador de la fracción de suelo que contieue:
NÚ1^R0
D$
DII,UCIóN
M^TODO D$ O$T$NCIÓN i cros CORRI;SPOND^ A
go gramos de suelo en 50o cme de agua ^
esterIlizada .....................1 IJIO
I O em' dC I I JI00
x o cros de z I JI .000.000
Io cme de 3 en go cma de agua .. . I Jla.ooo
I o cm' de q I J I 00.000
Io cma de 5 I Jl.ooo.ooo
gramos de suelo.
- Io4 -
Para cada dilución debe emplearse una pipeta esterilizada dis-tinta, y agitar bien antes y cuando se procede a una nueva di-lndbn.
El número de diluciones a practicar depende de la clase de suelo,sobre todo de su contenido en materia orgánica: en suelos pobres yarenosos suele bastar con cuatro diluciones; los suelos ricos en materiaorgánica requieren cinco o seis diluciones.
A1 trabajar con un suelo desconocido deben practicarse seis dilu-dones, haciendo siembras rnn las números 4, g y 6. La dilución másconveniente es aquella que da en el cultivo sobre placa de Petri unnániero de colonias comprendido entre 4o y 200. Un número de colo-nias por placa muy bajo expone a errores de consideración, y superiora 20o es pesado de contar.
A1 mismo tiempo que se toma la tierra para hacer las diluciones,
se pesan io gramos de tierra, que se tíenen en estufa a ioo^ hasta su
peso constante, con el fin de determinar el contenido de humedad del
suelo, expresado en tanto por ciento.
l^l cultivo se hará colocando i c. c. de dilución en una placa dePetri esterili2ada (teniendo la precaución habitual de no destapar porcompleto la placa, sino levantar la tapa por e] borde justamentelo indíspensable para introducir la pipeta), al que se agregan unosio c. c. del medio del cultivo elegido, fundido previamente y enfriadohasta unos 42^ (*). Después se imprime a la placa un suave movi-miento de ratación para la mejor distribución de los gérmenes, y secoloca sobre una superficie horizontal hasta que el medio se solidifica.
FI número de cultivos en placa para cada muestra media de suelono debe ser menor de cuatro, con el fin de aminorar posibles errores.Fn trabajos delicados debe aumeirtarse este número.
I,as placas sembradas se incuban en la estufa de cultivos a tem-peratura constante: de 25^ a 27^ para medios con agar, y de i8^ si setrata de medios gelatinizados. Para la determinación de los hongosse cuentan las colonias a las cuarenta y ocho y setenta y dos horas deincubación. I,as placas para determinaciones bacterianas deben in-cubarse de siete a doce días. A menor temperatura, el período de in-cubación ha de ser mayor, no siendo conveniente el empleo de tem-peraturas superiores a 30^, porque pueden ejercer acción perjudicialsobre algunos organismos del suelo.
(*) Los medios a base de agar se funden a temperatura prósittta a los ioo°; pero
permanecen líquidos hasta una temperatura alrededor de los qo°.
- Io5 -
A1 final del período de incubación se cuentan todas las coloniasexistentes en la placa, ayudándose, si es preciso, de una lupa o micros-copio binocular. Para evitar errores en el conteo, se puede ir colocandoun punto de tinta en el fondo de la placa por su cara exterior, en co-rrespondencia con cada colonia contada.
1^1 níunero de colonias por placa nos dará el número de micro-
organismos contenido en un centímetro cúbico de dilución, en la hipó-
tesís de que cada uno de ellos se haya desarrollado en colonia. Fse nú-
mero, multipiicado por el grado de la dilución, nos dará el número de
microorganismos por gramo de suelo húmedo de la placa en cuestión.
Después se tomará la media aritmética de los números conespon-
dientes a cada muestra media; y si designamos este media por a,por h e] tanto por ciento de humedad de la tierra determinada ante-
riormente y por d el grado de la dilución empleada, el número N demicroorganismos por gramo de tierra seca vendrá dado por la fórmula
a X d x iooN=
ioo - k.
C) Mí:TODOS MICROSCÓPICOS DIRI+rCTOS. - ESte métod0 ftlé Silge-rido gor Cohn, y desarrollado posteriormente por Winogradski, Cho-lodny y otros investigadores. Busca la determinación de la totalidad
cie los organismos existentes en el suelo para complementar los mé-
todos culturales, que son selectivos. Tiene la ventaja de permitir obser•
var la abundancia relativa de los diversos grupos morfológicos de
organismos del suelo, independientemente de sus peculiaridades de
nutrición, así como las relaciones ftsicas entre el suelo y su poblaciónmicrobiana.
i) El método de Cohn (ig) consiste en preparar una suspensiónde suelo en una solución fijadora diluída; extender una o dos gotas dela suspensión sobre un portaobjetos, y después de seca, teñirla conun colorante ácido.
I,a solución fijadora se prepara disolviendo a calor suave, en unlitro de agua destilada, o,i5 gramos de gelatina. I,a solución se dis-tribuye en tubos de ensayo (5 c. c. en cada uno), que se tapan con algo-dón y se esterilizan.
I,a solución co]orante se prepara disolviendo un gramo de eri-trosina o de rosa de bengala en ioo c. c. de una solución acuosa deácido fénico al g por ioo que contenga del o,ooi al o,i por ioo deC1ECa, hasta ligera precipitación de la sal cálcica del colorante.
La técnica a seguir es la siguiente: Medio gramo de suelo se coloca.
- i o6 -
en uno de los tubos de ensayo que contienen la solución fijadora, conla qne se mezcla cuidadosamente, colocando una gota de la suspen-sión sobre un portaobjetos muy limpio, extendiéndola con una agujahasta que cubra una superficie de un centímetro cuadrado. )^ste frotisse deja secar, de preferencia sobre un baño de María; luego, siempresobre el baño de Marfa caliente, se coloca una gota del colorante,que se deja actuar durante un minuto. Pinalmente se lava en se-guida con agua y se observa al microscopio. Conociendo el volumende la suspensibn de suelo utilizado en la preparación, mediante unsencillo cálculo se obtiene el número aproximado de microorganismospor gramo de suelo.
2) Modáficación de Winogradsky (zi2). - I,a presencia de gran-des corpúsculos amarillentos, de materia mineral del suelo, perturba1a observación de los microorganismos, y para evitarla, Winogradskyideó la signiente modificación del método directo.
I,as muestras de suelo se mezclan bien y pulverizan. Un gramo de
este suelo, desecado al aire, se añade a 4 c. c. de agua destilada y se
agita vigorosamente durante cinco minutos; después se deja reposar
durante treinta segundos, y la suspensión que cubre las grandes par-
tículas inorgánicas se decanta en un tubo pequeño de centri#ugadora
de mano. Por dos veces se añade al residuo 3 c. c. de agna destilada,
agitando cada vez durante un minuto, dejando reposar treinta se-
gundos y decantando en el mismo tubo de centrifugadora que la pri-
mera vez. Se han usado, por tanto, io unidades de agua por unidad
de suelo. Después de estos tres lavados, el primer sedimento suspen-
dido en agua destilada debe depositarse inmediatamente. Durante
estas manipulaciones, que requieren unos diez minutos, se ha formado
un segundo sedimento en el tubo de la centrifugadora. I,a mitad de
la suspensión que lo cubre se decanta en un segundo tubo de cen-
trifugadora , e n e 1 que , centrifugando , se forma un tercer sedi-
mento.Se hacen entonces preparaciones de los tres sedimentos y de las
suspensiones no centrifugada y centrifugada, para lo cual, una gotade cada una de las preparaciones se coloca sobre su correspondienteporta, extendiéndola.s, para que cubran z cm^, poniéndolas a secaren una estufa y cubriéndolas rápidamente con una solución fijadorade agar muy diluído. Para los dos primeros sedimentos conviene usaruna solución de agar al Z por ioo en caliente, y para el tercero, aIo,i por ioo en frío. I,as suspensiones no es necesario fijarlas.
Cuando se ha secado el agar se echan varias gotas de alcohol abso-
- I07 -
luto, y la preparación se tiñe por medio de un colorante ácido (eritro-sina) disuelto en una solución acuosa de fenol al 5 por zoo. I,as célu-las de las bacterias se colorean, no haciéndolo las cápsulas ni el mucas.Fsto se verifica sobre todo para las colonias compartas, como las denitrosomonas y otras formas del suelo, las cuales se supercoloreanfácilmente con los colorantes básicos. I.os coloides se tiñen muy lige-ramente y el agar se decolora rápidamente durante los lavados rnnagua fría. El colorante se deja actuar de cinco a quince minutos enfrfo o con calor ligero, y luego se lava unos segundos en agua.
I,as preparaciones del primer sedimento están, ordinariamente,libres de bacterias, escepto en suelos extraordinariamente ricos enmateria orgánica, en los que algunas de las partículas no son arras-tradas por los tres lavados.
I.a segunda preparación muestra, cualitativa y cuantitativamente,los mismos microbios que el tercer sedimento, que es el que mejorse presta para la observación.
I,a cuarta preparación procedente de la suspensión es, por lo ge-
neral, la más instructiva. Se rnlorean únicamente las células vivas; lasesporas no se colorean, o lo hacen ligeramente, por lo que sólo se ven
cuando son muy numerosas. I,os quistes de protozoos se distin-
guen claramente por su fuerte coloración y pueden contarse fácil-
mente.
3) Cholodny (i^) objetó a la técnica empleada por Cohn y Wino-gradsky el que, a consecuencia de la agitación de las partfculas delsuelo en el agua, no daba una completa imagen de la población delsuelo en su habitat natural, cosa especialmente cierta en el caso de losactinomicetos, que son muy frágiles. Para obviar este inconvenientepropuso la siguiente técnica:
>^n el suelo a examinar se hace con un cuchillo una hendidura
horizontal, en la que se introduce un portaobjetos, que quedará con
su superficie paralela a la del terreno. El suelo se comprime suave-
mente para que quede en contacto con el porta, indicando mediante
señales la situación de éste, que se deja en el terreno de una a tres se-
manas.^1 porta es cubierto por la solución del suelo y las partículas or-
gánicas, sobre las que empiezan a desarrollarse los microorganismos.Después de una a tres semanas se extrae cuidadosamente el porta delterreno, y limpiando con un paño una de las caras, se deja secar alaire y se guarda en un recipiente adecuado. l^n el laboratorio, se fijaprimero la preparación, pasándola sobre una llama; se lava suavemente
- IO$-
en agua, para arrastrar las partículas gruesas de tierra, y luego selava con agua destilada; se tiñe durante treinta minutos, a la tem-peratura ambiente, con eritrosina fenolada, según la técnica de Wino-gradsky; se lava cuidadosamente y se seca.
Fste método de Cholodny, a causa de la desigual distribució^t demicroorganismos en el suelo; de la dificultad de distinguir en ^unoscasos las bacterias de las partículas de suelo, especialmente en ^ casode suelos arcillosos, y de separaz las bacterias muertas de Ias'^a,s,no se presta a estudios cuantitativos, siendo sólo adecuado a fines,^^-'litativos, mostrando los tipos de microorganismos que existen ensuelo en forma activa, por lo que constituye un eficaz complemento delos métodos culturales.
4) Fehér (33) uti]i2a la siguiente modificación del método deCohn: Con un agitador eléctrico se agita enérgicamente un gramo desuelo con 8 gramos de agua destilada. Después de ese tratamientose añade a la suspensión i,5 c. c. de alcahol absoluto, y se agita nue-vamente, con lo cual las bacterias que contenga quedan fijadar, evi-tándose con ello cualquiera variación en su proporción cuantitativa.De este modo las muestras de suelo pueden conservarse largotiempo.
Para el teñido de las bacterias se añaden o,5 c. c. de una soluciónde eosina-eritrosina al i por ioo en agua fenicada al 5 por ioo. I,asuspensión se agita con la mano durante corto tiempo, y rápidamente,para evitar la sedimentación, se lleva al portaobjetos. Se utilizanportaobjetos en los cuales se ha grabado un cuadrado de 2 cm. delado. 5obre este cuadrado se echan, eaactamente, o,og c. c. de la sus-pensión. I,a altura de Ia capa de suspensión así preparada asciende a0,05 : 4- o,oi25 cm. I,a preparación hecha de este modo se desecasobre el baño de María, y finalmente se fija. Si la fijación se hace conesmero, no es necesario el empleo del agar o de la gelatina.
[I^ D^T$RMINACIÓN NUMÉRICA D^ I,AS BACT^RIAS ANARROBIAS. -
Para la determinación del número de bacterias anaerobias susceptiblesde desarrollarse en los medios de cultivo habituales, pueden utilizarse lostubos de Burry, que son tubos de cultivo abiertos por las dos eztre-midades, a las que pueden adaptarse tapones de goma. Para prepararel cultivo se sigue la siguiente marcha: ^1 tubo, esterilizado, se tapapor una de sus eztremidades con un tapón de gorna esterilizado; enel interior se vierte rápidamente, a la llama, la mitad del medio decultivo al agar, refrigerado a unos 42^; se añade con rapidez i c. c. de
- I«^ -
la dilución de suelo elegida, y también, rápidamente, la otra mitaddel medio de cultivo, que debe estar en cantidad tal que el agar frfosblo llene de un tercio a la mítad del tubo. Entonces se coloca en lamitad libre del tubo de Burry un tapón de algodón flameado, que seroda con ácido pirogálico, que se neutraliza con lejía de so^a o depotasa. tapando en seguida con otro tapón de goma esterilizado. Elpirogalato de sosa o potasa absorbe el osígeno, creándose de este modola atmósfera adecuada a la anaerobiosis.
I,os tubos se ponen a incubar a 3^^ porque hay muchas bacteriasanaerobias terxnófilas que sólo se desarrollan a esta temperatura. Du-ra.nte la incubación se debe cuidar que los tapones de goma de lostubos de Burry no sean lanzados hacia fuera por el desarrollo de gasesde la fermentación.
El recuento en los tubos de Burry se hace del modo siguiente: Sesaca la masa sólida fuera del tubo, se divide en trozos pequeños y secuenta el número de colonias. Como sabemos el grado de dilucíóndel suelo, podemos calcular fácilmente el número de gérmenes porgramo de tierra, en la hipótesis de que cada bacteria anaerobia sehaya desarrollado en una colonia.
Además del método de Burry, que hemos recomendado por lasencillez de su técnica, factor digno de tenerse en cuenta cuando hayque realizar determinaciones en serie, puede emplearse cualquiera delos métodos para cultivo de organismos anaerobios que se encuentranen los tratados de Bacteriologfa, y de los que Waksman hace un resu-men en su Microbiología del suelo, tantas veces citada.
C^ DETEBMINACIÓN D^ I,OS GItiTPOS I+I$IOIÁGICOS D^ BACTF;RIAS.-
Con los métodos descritos se determina únicamente el número totalde bacterias, lo que es una solución incompleta del problema, todavez que con ello no podernos formarnos idea de la diferente partici-pación que tienen en e1 suelo los distintos grupos que integran la florabacteriana del mismo.
I,a determinación de los grupos fisiológicos de baeterias se con-sigue con el método llamado ^ie las diluciones, que, en combina-ción con e1 procedirniento selectivo, fué empleado por primeravez por Hiltner y Stármer (49j, y más tarde por Diiggeli (2qj y
otros.En esencia, e1 procedimiento es e] siguiente: Se hacen diluciones
de suelo en agua esterilizada en la forma descrita anteriormente,llevando z c. c. de cada una de Ias diluciones elegidas a una serie de
- iio -
medios de cultivo selectívos, de los que cada uno es adecuado sola-inente para el desarrollo de un grupo particular de microorganismos.I,as bacterias de la suspensión originan en los medios de cultivoadecuados a cada una alteraciones químicas, las cuales se puedenobservar frecuentemente a simple vista o mejor por medio delanálisis.
El princípio de los cultivos selectivos consiste en crear las condi-
ciones de vida más favorables para una determina.da e^pecie de bac-
terias, tanto por la composición esp^ecial del medio de cultivo como
por una determinada temperatura. A consecuencia de ello, esta espe-cie bacteriana obtíene el predflminio, y las bacterias acompañantes,
o desaparecen a consecuencia de la falta de nutrición, o quedan muyen segundo término, sobre todo después de algunos trasplantes suce-
sivos.Estos medios de cultívo diferenciales se colocan de ordinario en
matraces de ^rlenmeyer de 25o a 30o c. c., o en tubos de cultivo. I,osmatraces de Erlenmeyer tienen un fondo relativamente ancho,^ locual permite un acceso suficiente de aire. Taa siembra se hace, a partirde las diluciones oríginales, desde z/io hasta z/z.ooo.ooo. Sin embargo,en determinadas especies de bacterias se pueden emplear escalonesintermedios de dilución z/5.oo0, z/5o.o00, Z/Soo.ooo, z/2.5o0.000,z/5.oo0.000. Con cada dilución se siembran dos matraces de ^rlen-meyer. Los cultivos aerobios se llevan a la estufa de cultivo y s^e in-cuban entre 2go y goo,
I,os cultivos anaerobios se ejecutan en recipientes grandes de vi-drio que cierren herméticamente, de los que se extrae el aire con unabuena bomba de vacío hasta o,ooz atmósferas de presión, y se absorbeel resto de oxígeno que pudiera quedar presente, con la mezcla de lejíade sosa y ácido pirogálico. I,os cultivos anaerobios se llevan general-mente a la estufa a 3^^. Después de un cierto tiempo, que es muy dife-rente según las distintas especies de bacterias, determinamos, con elmétodo correspondiente, la dilución en la cual ha aparecido ya laesperada reacción química, o bien la presencia de una determinadaespecie de bacterias. De este hecho deducimos que en esa especialdilución hay, por lo menos, un germen de aquellas bacterias, el cualestá en condiciones de realizar la reacción.
Por medio de un ejemplo aclararemos lo anterior. Cuando, porejemplo, se dice que el número de bacterias nitrificantes es de z.ooo porgramo de tierra, esto significa que las bacterias fueron halladas toda-vía en la dilución z/z.ooo, pero que ya no aparecieron en la dilución
- III -
inmediata i^io.ooo. Más correcto serfa escribir que en un gramo detierra, el número de bacterias nitrificantes es mayor que i.ooo, perornenor que io.ooo. Sin embargo, en general, se fija el dato del valor1{mite inferior. Después de ello se pueden obtener números más exac-tos por la interpolación entre las diluciones; pero esto exige mnchotrabajo, que es incompatible con el trabajo en serie.
Aun cuando en los capítulos que anteceden hemos indicado mediosde cultivo adecaadas para los distintos grupos fisiológicos de bacte-rias, para completar este trabajo queremos indicar los medios de cal-tivo que, para algunos de ellos, recomienda Fehér en su obra sobreMicsoLiologsa de los suelos f orestaks, no sólo por el hecho de habersido seleccionados por quien lleva muchos años dedicado a esta clasede investigaciones, sino porque para que los resultados que se obten-gan puedan ser comparables a los muy numerosos e interesantes quefiguran en dicha obra, deben haberse logrado mediante el empleode técnicas iguales.
a) Czdtivo de las bacterias aerobias que f ijan al nitrógeno
librc del aire.
Se emplean las diluciones r, 2, 3^ 4• 5 Y 6•(En todos los medios de cultivo se debe fijar el pH entre 6 y 7.)
Iooo cma de agua destilada.15,0o gramoe de manita.
I,oo + SaHPO^.
0,20 + MgCla.
Medio de cultivo...... .... 0,90 + CaCOa.
0,20 + NaCI.o,io + Fe80^.o,IO + Ah(SO^)a•
^ o,ol + MnCI^.
El líquido nutritivo así obtenido se reparte en matraces de ^rlen-meyer de 30o c. c. de capacidad y se esteriliza en corriente de vapor.>^1 cultivo se incuba durante dos o tres semanas en estufa de 20^ a 25^.Después se hace la determinación microscópica de las especies deAzotobacter, de las cuales existen principalmente, en los suelos ana-lizados, el Azotobacter chroococcum y el agilis.
- II2 -
b) Cultivo de las bacterias anaerobias que f i^an el nitrógeno
del aire.
I,a preparación se hace a partir de las diluciones I-6:
^ r oo cm• de agua destilada.z,oo gramoa de glncosa.
o,ro • S•HPO•.
o,oz s o,og gramon de MgSO^.
Medio de cultivo.. ........ o,oi gramos de NaCl.o,or w FeSO^.o,oi w MnSO^.o,go • CaCO•.
^ Indidos de 2nS0^.
1~1 medio nutritivo líquido así obtenido se reparte en matracesErlenmeyer de ^o c. c. de capacidad, El cultivo se incuba, en atmós-fera de nitrógeno, a 37^ durante dos o tres semanas. Para la determi-nación del número se estudia microscópicamente la presencia deiClostridium ^astorianum.
Puesto que ambos grupos de bacterias dan, aprolcimadamente, lamagnitud de Ios organismos que fijan el nitrógeno, y su ntímero estásometido, relativamente, a grandes oscilaciones, debemos emplearen ambas investigaciones todas las diluciones desde i hasta 6.
Para las restantes determinaciones, si ya se tiene la deseada impre-sión de conjunto, se deben emplear únicamente aquellas dilucionesqne correspondan, al parecer, con la presencia de la bacteria corres-pondiente.
c) Cultivo de las bacterias nitri f icantes.
5e emplean las diluciones 3 a 6. Se recomienda, además, estable-cer escalones intermedios entre las diluciones 4 y g, por una parte, ylas 5 y 6, por otra, si se quieren hacer investigaciones precisas y seguirdetalladamente la dinámica de la nitrificación.
goo cros de agua destilada.r,o gramos de, K^HPO^.o,g w MgSO^.
Medio de cultivo... .. ..... o,z w NaCI.
0,4 • FeSO^.
S,o w MgC09.
Iadicios de ZnSO^.
I,a disolución se reparte en matraces de 1^rlenmeyer de ioo c. c. decapacidad y se esteriliza por tres veces. Por separado se prepara una
- r13 -
disolución que contenga 2 gramos de sulfato amónico en Ioo c. c. de
agua destilada, se esteriliza, y después se lleva a los matraces de Erlen-
meyer, con una pipeta estéril, la cantidad precisa para que el contenido
de sulfato amónico llegue al 2 por Ioo.
El cultivo tiene lugar durante dos o seis semanas entre 20° y 25°.Después de transcurrido este tiempo, se toman muestras del cultivo,y se analizan en ellas los nitritos o los nitratos según la técnica indi-cada (págs. 2^ Y 31)•
d) Cziltivo de las bacterias desnitrificantes.
5e emplean las diluciones 3-6.
culti o: IM di d1OOO ^amos de agua deatIlada.
. ^e o e vz ► KNOs dísuelto en zso cm$ de agua.
i,oo gramos de asparagina. . . . .
S,oo + ácido cítrico. . .
2,00 > K1HP0^......Medio de cultívo: II. z,oo A MgSO^, ...,.._
Disuelto en 50o cn►' de aguay neutrallzado con 6idró-
o,zo ^ CaG....... ... aido potásíco.Indicios de FeCI^ . . . . . . . . . . . . .Indicios de T.nSO^. .. ... . . . . . .
I,as dos diluciones se juntan y se completan con agua hasta for_
mar 2.00o c. c. I,a distribución se hace en tubos de cultivo, los cuales
se llenan hasta su mitad. I,os cultivos se mantienen de dos a tres se=
manas en la estufa de 20° a 25°. Después de transcumdo este tiempo,
se investigan nitritos y amonfaco. (Pág. 27.)
e) Bacterias anaerobias que destruyen la celulosa.
Se emplean las diluciones 3^ 4 Y 5•
rooo gramos de agua destilada.
r,ooi,oo
r►
(NH^)rS0*•K^HPO^.
Medio de cultivo. . . . . . . . . . o,go a MgSO4.o,oz ► NaCI.
zg,oo ► CaC01.
Indicios de ZnSO4.
El medio de cultivo líquido así obtenido se reparte, o bien en pro-betas, o bien en matraces de Ioo c. c. P;n los recipientes se echa papel
_ I14 ^
de filtro corriente, en tiras o en pedazos mayores, y el conjunto se
esteriliza una o dos veces a una presión de una y media a dos atmós-
feras. El desanollo del cultivo tiene lugar en recipientes anaerobiosdurante tres o cuatro semanas a 37^. Se observa, en general, la des-
trucción de la celulosa.
f) Bactcrias aeyobe'as que destruyen la celulosa,
Se emplean las diluciones 3^ 4 Y 5•El medio de cultivo es el mismo que para las bacterias anaerobias
destructoras de la celulosa. Sin embargo, la repartición es algo dife-rente. En matraces de 1~rlenmeyer de 20o a 30o c. c. echamos perlas
de vidrio. Sobre estas perlas se coloca un trozo redondo de papel de
filtro, el cual se rocía con solución nutritiva. Podemos también ejecu-
tar toda la investigación en placas de Petri, con cuyo objeto, entre
dos trocitos redondos de papel filtro, esparcimos algo de fosfatoamónico-magnésico Mg(NH,)PO^. Después de esta manipulación se
esterilizan las placas de Petri a i2o^. Aproximadamente, una hora
antes de la siembra se rocía el papel de filtro con disolución esterilizada
al o,og por ioo de fosfato bipotásico. ^1 cultivo tiene lugar durante
tres o cuatro semanas entre 20^ y 25^. El empleo de perlas de vidrio
es decididamente el mejor, pues con ello los cultivos se mantienen
bien y fácilmente aerobios.
T^a observación consiste en apreciar, análogamente al caso de ladestrucción anaerobia de la celulosa, el comienzo de destrucción delpapel de filtro.
