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Introducción al método de Membrana Filtrante

para análisis bacteriológico en muestras de agua

Actualización de Norma Argentina IRAM 29107-1:2015

Capacitación Mayo 2016

Dirección Técnica y Desarrollo TecnológicoLaboratorio Central Area Microbiólogia

aysa

Título de la presentación / Dirección Gerencia o Sector / Fecha

NORMA ARGENTINAIRAM 29107-1:2015

Calidad ambiental – calidad de aguaDetección y recuento de bacterias coliformes y de

Escherichia coli

Parte 1- Método de filtración por membrana para agua con bajo contenido de flora bacteriana

Este método se basa en un procedimiento de filtración a través de una membrana, el posterior cultivo en un medio

cromogénico y el recuento de organismos presentes en la muestra

Capacitación RELAS Mayo 2016Dirección técnica y Desarrollo Tecnológico / Lab. Central / Area Microbiología



DOCUMENTOS NORMATIVOS IRAM 29104 - Calidad del agua - Evaluación de membranas filtrantes

utilizadas para análisis microbiológicos.ISO 11133:2014 Microbiología de los alimentos, piensos y agua.

DOCUMENTOS BIBLIOGRAFICOSIRAM 29107 -1:2006 Calidad ambiental – calidad de agua

Detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coliParte 1- Método de filtración por membrana para agua con bajo

contenido de flora bacterianaISO 9308-1: 2014 Calidad de agua- Enumeración de Escherichia coli y

bacterias coliformes.Standard Methods for the examination of water and Wastewater- 22nd

edition, 2012.Capacitación RELAS Mayo 2016

Dirección técnica y Desarrollo Tecnológico / Lab. Central / Area Microbiología



www.iram.org.arInstituto Argentino de Normalización y certificación

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NORMAS ARGENTINAS IRAMBúsqueda de Normas

Titulo Bactérias coliformes



Correciones a la norma iram 29107-1

• En punto 8.2 cambia a (21 a 24hs) • Salmon cambia a rosa.• Violeta cambia a azul oscuro.• En tabla 1 se cambia idem 8.2• En punto 12 cambia asimilable domiciliario

por según legislación vigente .• En A.2.1 reactivo de Kovacs se elimina de la

norma.



Control de calidad Microbiológicos

• Controles Ambientales• Control de materiales• Controles medios de cultivo• Controles de Temperatura• Envases para toma de muestra• Controles de esterilización



Instrumental y EquiposSM Tabla 9020 B:I

IRAM 29107-1(normativo)



Medios de cultivocorrectamente preparados , acondicionados, refrigerados 4 ±2º rotulados, fecha preparación , fecha de vencimiento



Preparación y Fraccionamiento(autoclave de medios de cultivo hasta 9 litros)



Medios de cultivo y su preparación• Respetar y cumplir con las recomendaciones especificadas

en el rotulo del envase por el fabricante. • pH, esterilización, conservación, vencimiento , etc• AGAR ENDO LES (99°C , 1´, no autoclavar , plaqueado

conservar máximo hasta 15 días a 4 ±2ºC).• AGAR NUTRITIVO (MUG) (121°C , 15 minutos ).• ACC (AGAR CROMOGENICO COLIFORMES(99°C ,1´ no

autoclavar y agregar el suplemento selectivo cuando la temperatura descienda a los 50°C, plaqueado conservar hasta 1 mes a 4 ±2ºC ).

• Suplemento selectivo E.Coli/Coliformes Vancomicina 5 mg/L(inhibe el crecimiento de bacterias Gram-positivas)

Cefsulodina 5 mg/L (suprime el crecimiento de Pseudomonas spp y Aeromonas spp



Componentes de ACC

• Promotores de crecimiento( aún células injuriadas)• Peptonas• Piruvato• Sorbitol• Buffer fosfatos• Inhibidores(Gram+ y gram – no coliformes) • Tergitol 7• Sustratos cromogénicos• Salmon –Gal• X-Glucuronido



CHROMOCULT COLIFORM AGAR(E.coli /Coliformes suplemento selectivo

Sustrato + Enzimas Producto

Sustrato Cromogénico

Salmon-GAL

Sustrato Cromogénico

X-Glucuronide

Color

Coliformes totalesβ-D-galactosidasa + -

Rosa- Roja

Escherichia coliβ-D-glucuronidasa + + Azul



Autoclave realizar control biológico de esterilización(Esporas de Bacilo Stearothermophilus)



Sondas registradoras monitoreo del

ciclo completo de esterilización



Informe control esterilización


¿Cuanto tiempo deben permanecer los caldos con

Carbohidratos?(SM 9020 B 4)


Registradores de ciclo de esterilización



Material acondicionado para su esterilización cintas indicadoras, papel no tóxico

Rampa de filtración acero Inoxidable



FILTROS PLASTICOS autoclavables



Equipo de filtración acero inoxidable



EQUIPOS DE FILTRACIÓN CON SENSORES TÁCTILES



CONTROLES DE CALIDAD EN SIEMBRA:

• Sistema de filtración: cada 6/12… filtrar 100 ml de agua desionizada estéril y sembrar en el agar en estudio(alfa,beta,gama). La frecuencia de estos controles las establece el propio laboratorio. Aplicando este tratamiento se realizan blancos de método para control de esterilidad de las placas de petri , medios de cultivo y membranas al mismo tiempo.

• Control Ambiental : control en superficie para mesadas control en aire del ambiente de trabajo control de envases para la toma de muestra



controles ambientales del ensayo



Buffer de Lavado Standard Methods 9050 C

se utiliza para el lavado de filtros

• Sn stock de Buffer fosfato: (disolver 34,0 g de fosfato monobásico de potasio en 500 ml de agua desionizada).Ajustar el pH a 7,2 ±0,5 con soluciones de HCl 1N o NaH0 1N utilizando pHmetro y llevar a 1000 ml con agua desionizada

• Sn de Cloruro de magnesio: (disolver 81,1 g de cloruro de magnesio-hexahidrato en 1 litro de agua desionizada).

• Solución Buffer de Lavado: medir con pipeta 1,25 ml de solución buffer fosfato y 5 ml de solución de Cloruro de magnesio y llevar a un volumen de 1000 ml con agua desionizada.

• Fraccionar en pisetas autoclavables de 1000 ml.• Esterilizar por autoclave a 121 º C durante 15 minutos.• Mantener en cámara fría a una temperatura de 4 ± 2ºC por un

período no mayor a 15 días.



ENSAYO

Etapa 1: FiltraciónEtapa 2: IncubaciónEtapa 3: Lectura (recuento)

ConfirmaciónConfirmación Colonias Coliformes Totales (ENDO)Confirmación Colonias Escherichia Coli

Pasaje NA-MUG (ENDO)

Test de oxidasa(ACC)Etapa 4 : Informe de ensayo



Método filtración por membrana

• Se hace pasar un volumen determinado de muestra a través de una membrana filtrante de un poro tal que retenga los microorganismos en estudio ; la membrana luego se transfiere con una pinza colocando el frente de la misma hacia arriba sobre la superficie de un medio sólido , evitando la formación de burbujas entre ambas.(para ciertos microorganismos la membrana se coloca en forma invertida)

• Se requiere de un equipo de filtración y una bomba de vacio para acelerar el proceso.



Esquema tipo de filtraciónMuestra

Embudo

bomba de vacio Membrana

marriotplaca petri medio sólido

colector



Aplicación:

• Adecuada para muestras de agua que contengan bajo contenido de materias en suspensión por ejemplo:

• Agua potabilizada de toma superficial• Agua potabilizada de toma subterránea• Agua cruda de toma subterránea• Agua en sistema de distribución• Rango de la determinación :<1 a >100 ufc/100ml.



Microorganismos :

• Grupo Coliformes totales Genero klebsiella spp Kp Genero Escherichia spp Ec Genero Enterobacter spp Ea Genero citrobacter spp

• Enterococcus faecalis Ef• Pseudomonas aeruginosa Ps



Abreviaturas y definicionesANEXO B (informativo)

• UFC: unidad formadora de colonias.(considerando que cada colonia fue generada por un microorganismo).

• ATCC: American type coulter colleccion.• Coliformes Totales: microorganismos perteneciente a la familia

Enterobacteriaceae que expresan la enzíma β -galactosidasa .BacílosGram negativos (G-), anaerobios facultativos , no esporulados,citocromo oxidasa negativos , capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas. En el medio de agar M-Endo-Les, fermentan la lactosa produciendo aldehídos y ácidos que junto con la fucsina ,recubren la superficie de las colonias con un característico brillo metálico en un tiempo no mayor a 24 hs a 35(±0,5)ºC.

• Escherichia coli :microorganismo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae que expresa las enzimas β galactosidasa y β-glucuronidasa .Capaz de escindir el sustrato MUG, formando 4-metilumbeliferona, que se caracteriza por ser fluorescente a la luz ultravioleta. Pertenece al grupo de coliformes fecales.

• MUG: 4-metilumbeliferil-β-D-glucurónido.



Etapa Nº1Siembra

Flujo Laminar



Siembra BHV 36ºC /Agar Endo LesAgar Cetrimide



Etapa Nº 2 INCUBACIÓN

Coliformes Totales, E. coli Agar Endo Les Incubar 22 a 24 hs a 35+/- 0.5ºC

Agar Coliformes Incubar 21+/- 3 hs a 36ºC +/- 2ºC



CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

ISO 11133:2014• Contar con un cepario para evaluar todos los

medios de cultivo producidos • Realizar controles con organismos target y

organismos no target• IPR (Agar evaluado/Agar referencia) ≥70%

• Selectividad. Inhibición total del crecimiento de una cepa de referencia no target en el medio de cultivo selectivo, bajo

condiciones definidas.

• Especificidad. Demostración de las características visuales específicas de los microorganismos target pero no de los no target,

bajo condiciones definidas.



Control calidad Agar ENDO LES/COLIFORMES/BRILLANCEEscherichia coli ATCC 25922



Control calidad AgarENDO LES/ COLIFORMES/ BRILLANCE

klebsiella pneumoniae ATCC 13883



Aseguramiento de la calidadIRAM 29107-1:2015



Control calidad Agar coliformesI Productividad

IRAM 29107-1:2015



Enterobacter aerogenes Escherichia coliATCC 13048 ATCC 25922

rosa azul



Control calidad Agar coliformesIRAM 29107-1:2015

Especificidad - Selectividad



MIX CONTROL 3 CEPAS(Ec-Kp-Sal)

CHROMOCULT COLIFORM AGARAGAR M-ENDO LES



Etapa Nº3Lectura y confirmación

• Realizar lectura de las placas una por una diferenciando el o los tipos de colonias presentes en la membrana.

• Diagnostico presuntivo: AGAR ENDO LES Coliformes: Colonias típicas con brillo metálico.

Colonias atípicas(rojas oscuras)No Coliformes ( transparentes , rosa claro)

• Diagnóstico definitivo : confirmar las colonias de coliformes en caldo LST 48 hs y caldo VB 48 hs (del LST)

• n ≤ 5 picar 5 n 6 a 25 picar 5 • n >25 siguiente formula √n (redondear al entero superior)• Ejemplo: 32 ufc √32= 5,… ≈ 6 picar 6 colonias.• Ejemplo: 61 ufc √61= 7,…. ≈ 8 picar 8 colonias.



Confirmación

• Repicar las colonias presuntivas de coliformestotales (Agar Endo LES)

• Caldo LST incubar por 24 a 48hs a 35± 0,5 °C.• Repicar los tubos LST positivos a caldo VB, incubar

por 24 a 48 hs a 35± 0,5 °C.• Traspasar membrana al Agar Nutritivo + MUG

incubar por 4 hs a 35 ± 0,5 ºC leer bajo lamparaUV

• Realizar test de oxidasa del PCA ansa de plástica o platino. (Agar Cromogénicos; Agar Endo LES)

• Realizar api test (opcional).



Confirmación


Agar ENDO Repicar las colonias presuntivas de coliformes totales

1)Test de oxidasa

2) Caldo LST

24 a 48hs a 35± 0,5 °C.Repicar los tubos LST positivos

3) Caldo VB

24 a 48 hs a 35± 0,5 °C.

4)Traspasar membrana al Agar Nutritivo + MUG

4 hs a 35 ± 0,5 ºC

leer bajo lampara UV

Agar CROMOGENICO

1)Test oxidasa


Lectura Agar Endo LES presuntivo



Lectura Agar Endo LES Agua cruda subterránea

presuntivo

Capacitación RELAS mayo 2016Dirección técnica y Desarrollo Tecnológico / Lab. Central / Area Microbiología


Repique a Caldo Lauryl sulfato triptosa



MUESTRAS CLIENTE EXTERNO

CHROMOCULT COLIFORM AGARAGAR M-ENDO LES



Lectura Agar ColiformesAgua cruda subterránea



MUESTRA CLIENTE EXTERNOMedio ACC



Lectura Agar ColiformesAgua cruda subterránea



MUESTRAS CLIENTE EXTERNO Medio ACC



Lectura Agar Coliformesmuestras particulares



Confirmación Test oxidasa



Método de partición (SM-9222-G)

• Traspasar la membrana a un agar nutritivo conteniendo sustrato MUG (4-metil-umbeliferyl-ß-D-Glucurónido).

• Incubar por 4 hs .• observar bajo lampara de luz UV. • la presencia de halo azul fluorescente. (E. coli).• (se puede recomfirmar en caldo EC/triptofano,44,5

± 0,2 °C,24 hs incubación,reactivo kovacs).



Escherichia coli ATCC 25922Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

Medio NA-MUG



VENTAJAS Y DESVENTAJAS

M. CROMOGÉNICOS MEDIO ENDO LES

PROTECCIÓN AL PERSONAL

PROTECCIÓN MEDIO AMBIENTE

COLONIASCOLIFORMES TOTALES

21 +/-3 hs + 24HS 24 hs+96 hs

COLONIAS E.COLI

21+/-3hs 48 hs

BENEFICIOS/COSTOS



control de Agar cetrimida cepa ATCC 27853Pseudomonas aeruginosa


Enterococcus faecalis ATCC 29212 en medio Agar de Slanetz-Bartley.



Calidad de agua para ensayos microbiológicos

(SM tabla 9020:II)(Anexo D informativo)



EQUIPO SELLADOR TERMICOMPN (Colilert)



ß-D galactosidasahidroliza el sustrato cromogénico ONPG (orto-nitrofenil-B-D-galactopiranósido)



ß-D-glucuronidasa hidroliza sustrato fluorogénico MUG

(4-metil-umbeliferil-B-D-glucurónido) bajo acción luz UV



Incubación y lectura colilert ventaja y desventaja• Rápido diagnostico 20 a 24 hs.

• Se puede detectar presencia/ausencia (sin el uso de la bandeja cuadriculada ni el sellador térmico)

• Costo muy elevado.



Colilert falsos positivos

• Coliformes totales :Bacterias no coliformes como Aeromonas y/o Pseudomonas pueden producir pequeñas cantidades de B-D-galactosidasa pero son suprimidas

• E.coli Algunas cepas de Shigella sp poseen enzima B-D-glucuronidasa (pero por tratarse de un patogeno humano , fuera del huesped permanece poco en medio ambiente).



Ventajas MF

• Técnica ampliamente reproducible, puede ser utilizada para estudios con gran cantidad de muestras.

• Mayor Volúmen de filtrado.• Produce resultados numéricos mas rápido que el procedimiento de

MPN.• Extremadamente útil para monitoreo de aguas de red de distribución

y otras variedades de aguas naturales.• Requiere poco espacio para muchas muestras.• Facilita el alerta Temprano de riesgo sanitario por su menor tiempo

incubación.• Cuando la técnica de MF no ha sido utilizada previamente en un

laboratorio , se recomienda trabajar en paralelo con el método utilizado hasta el momento ,para demostrar su aplicabilidad y comparabilidad .(9222 A. introducción SM)

• Se puede aplicar aguas salinas.



Desventajas MF

• Limitaciones: No para aguas con alta turbiedad o con alto contenido de bacterias no coliformes (efecto Background )

• No recomendable para aguas servidas • No aguas cloacales con tratamiento primario

( pueden contener sustancias tóxicas tales como metales pesados y/o compuestos orgánicos tales como fenoles).



Ventajas y desventajas NMP

• Adecuado método para muestras con alta carga bacteriana • Útil para muestras con alta turbiedad • Moderado a ¿bajo costo?• Mayor espacio para moderado numero de muestras • No es tan fácilmente reproducible como MF• No siempre se procesa un volumen representativo de la muestra• Mayor tiempo de incubación • Demora mucho mas tiempo en dar aviso el alerta por riesgo

sanitario • Mayor volumen de Material utilizado previo al ensayo

(acondicionamiento vidrio) y posterior (descontaminación)



Desventaja NMP espacio tiempo material



Desventaja (tiempo incubación)



LOGRAR DISMINUIR TIEMPO DE DIAGNOSTICO DEFINITIVO



Muchas gracias


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