Tftolo : CA 3AC'PRKIZACION DE L O S COKPLGJOS NICEHICINA/CA!?ION.

DETEHN~INACION POT'S VCIOMET.3ICA UE LAS CQNS"AN?'SS Dd

D I S O C I A C I O N Y ? O M A C I O W DE LOS MISMOS

1' Autores: Gonzalo de Allende A . , y RaÚl Alva G.

Laboratorio de Bioqpfmica y Biof fs ica. Departamento de Ciencias de l a Y d . u d . División de C i e n c i a s BiolÓgiccLs y de l a Salud. Universidad Autdnorna lñe t ropol i t ana-I zt apal apa .

%dxico, D. P. a 14 de noviembre de 1983 J

I _

. .. ,..

. ..

" C A K A C ! C ~ I Z A C I O N DE LOS C 9RPL':SJOS V I G E H I C I I\IA/CATI ON.

DETZR=RIiIINACION POT!3WIOlYIBTRICA DE L A S CQ!TSTANTES DE

D I S W I A C I O N Y RWMAGI 3N D E LOS MISkIOS"

Allende Arr:rr& Gonzalo de ('73333703)

Alva Garcfa Ha6l (793326711

I . W R O D : X C I 3N.

Las menabranas bio ldgicas, por SU naturaleza l ip fd i ca , re-

nresentan una barrera a l p a m de rnol6culas hidrot ' f l ieas, entre

e l l a s , l o s Atones. Debido a que las cadenas hidrocarbonadas t i e -

nen una baja constante d i e lbo t r i ca , l a energfa requerida para

in troducir im idn de una f a se acuosa a una membrana, serfa de

var ias vecea l a energfa t6rmica de l i8n. S in embargo esta barre-

r a energdtica es vencída. por sistemas de transporte membranaien.

Ya que muchoe procesos t>ioid&cos oomo son, entre otros:

l a contract i l idad muscular (I .) , l a transmisión a i d p t i c a (2),

el tranaoor1:e de metabolitos h i d r o f i i i c o s (3 1, l a f e r t i l i z a c i ó n

(d), y l a s transducciones enctrgdticas (5), dependen en gran oarte de loa n ive les idnicos y de su distr ibucidn celular , re-

mltz evidente Itr importancia que t i ene e l estudio de l o s sis-

temas transl.ocadores de ionsw en cuanto a su estructura q d m i -

ca, propiedades fisicoquímicw., mecanismo moiecdar y f ac tores químicos .y/o f is icoqufmicos que lo reguian.

~a caracter izacidn molecular y n e c d s t i c a de estos siste-

m a s " in vivo1* es complicada, nor l o que recientemente se han

intentado ai.slar, pur i f i car ,y reconstitu. ir en membranas artifi-

c i a l e s ( 6 ) . Aun cuando se han obtenido avances sa t i s f ac to r i o s

ut i l i zando emte enfoque experimental, es d i f f c i l dar respueetae

precisas, deibido a l a problenática que representa cada una de

les tres etapas aefialladas.

31 ernai,eo de moldcixias de entructiira química conocida con

caaacidad de translocar iones a t ravés de barreras l i p f d i c a s ha.

s i do de grm ut i l idad, 310 só lo para establecer e l papel de un

determinado i6n en nlflma Ihnición ce lu lar ( 7 ) , determinar el po-

t enc i a l transmembranal en cé lu las u. organelos (R), de f in i r e l

uapel de gmdientes electrogu.ímicos en procesos ce lulares ( 3 ), estudiar la. translocaci6n de aniones orgánicos e f n o r g b c o s

(ID), s ino tmb ibn p a r a m a l i z a r l o 3 mecanismos de translocaciok de iones y, de esta manera, estableces modelos de trsnsnorte ii

n i v e l molecular. , ~ i t i p o íle moléculas a la6 que se tiace re ferenc ia en el sá-

r ra f o anter ior , son ant ib idt icos aislados de actinomicetos que

t ienen l a propiedad de t r a m l m a r iones hacia ambos lados de 1a

rnembrnma (11 ) . Con respecto a l os modelos de t rampor te ct n i v e l molecular,

gracias n los estudios real izados en sistemas y membranae asti-

f i c i z l e s de ant ib i6t icos cotno l a valinomicina, niger ic ina, mom-

zarnicina y alameticina, 80 han diferencirrdu dos tiúos 0.e trans-

porter e l que ocurre mediante un acarrendor m ó v i l ( ionbforo) y

el que ocurre a través de iin c a l . E l t i p o ionóforo ha s ido

bastante est,udiado y es tá representado aor l a valinomicina (12).

Aun cuando s e ha Dlanteado la ex is tenc ia de es te t i n o de trans-

norte en rsem'h:riinas bio lbgicas, no se ha logrado a i s l a r ningún

comnonente meNbIYUla i con caracter ís t icas similares.

Entre l o s s n t i b i j t i c o s r e f e r i dos anteriormente, es tá e l

ionóf o r ? niger i c ina que se cnracterizd inici-almente corno inter-

cmbisdor e18ectroneutro (Kr/Fo ) (l3 ;. Posteriormente, datos de l

e g r ~ ? ~ d.el ,%. Rstrnda-O. indicaxon que la ni:3ricina es capaz

de oromover tal transporte de cwga neta; se encantró que es te

cambio de mejcanismo (electroneutro-e16ctrico), depende de l a

concentracidn de l ;rntibibtico y de :la presencia de cat ión mono-

f

valente (1411. As4 mismo, se t ienen datos que sugieren que e l cambio de mecanismo se debe a quo las c.>ndiciones favorecen l a

f ormacidn de otras estructuras de l complejo nigericina-catibn

(lif erentes a. l a s caracterizadas previamente.

A?FCT'SCBDgNTES.

Iiotchkiss en 1944, f u e el primero en reportar una altera-

c idn de la permeabilidad de m,embranas b io ldg icas prodiicida por

ant ib id t i cos (15) . #IC Murray :y Regg en 1959, reportaron que l a

valinomicinn desaconia in fosf or i inc ión ox idat íva (16). ~n

1364, Moore y Pressman publ iewon un t rabajo en e l cual señalan

que In vdinomiciruz promueve l a entrada de potasio a l a mitocon-

d r i a (17). Ei mecanismo de scci6:i de eet-as rnaiécuias comenad n

aclararse gracias a l t rabajo de Müeller y Yudin en 1967, e.n

membrtznaa a r t i f i c i a l e s (la). Gonside:rando la forma de acción de estos ,mtibSdticos, se

nuedsn d i v i d i r en dos grupos: iondforos y canaJ.es. Los iondfo-

r o e o acarreadores móviles f wmyn conoie jm ibn-ion6foso l i p +

solubles que se mueven a t r a d a de l a matriz, hidrofdbica de l a membrana, En general, e l trawiporte se l l e v a 8 cabo de l a si-

guiente manerrti i) formación i ie i complejo idn-ionóforo en la

i n t e r f ase membrana-agua; 2 ) tiranmorte d e l compleaJo a travds de

l a membrana; 3 ) disoc isc idn dqzl complejo p l i b e rac i ón de l ibn;

4 ) regreso d o l acarreador a travds de l a membrana. Los c a r d e s

o noros, awnontan 18 permeabilidad a iones Be l a membrana, per-

mitiendo su paso por e l i n t e r i o r de l canal., de un lado de l a

membrana a l otro.

LOS ioniíf'oros se c l a s i f i c a n en dos grup?si neutros g cax-

boxf l icos. Las neutros t i enen un& estructura cerrada y no po- seen grupos i.onizables. Los grupos polares que in te racc iomn

con e l i bn sei orientan hacia el i n t e r i o r de l a moldcula, mien-

t r a s q,ue en 1.a. parte externa tie la misma, están los pupae 110

- 4 -

polares que permiten la interaccidn hidrófoba con la. matriz

membranat. 33ta c lase de ionb:roros está rspresentada -or l a va-

i inomicina (U), eniantinas (:i9), nntamanidas (20) y po l i é t e res

(21). Los ioint5foros carboxflijcos sori mnlkculas de cadena abier-

t a con un g u p o carboxiLo en iin extremo p grupas h idrox i los en

e l o t ro ; estos grupo8 forman mentes de hidrbgeno haciendo que

ia rnoidcu~a itoms una estructura c í c l i c a con una cn.vidad en ~n

que c la t ra alt i6n. Contienen ;adem&, oxa.ciclos de 5 a. 6 dtoxios

(?2)(s)ig. I)<,

Figura 1.. Estructiu'a moie)cular uel iondforo rJi-ericina

Entre 10~s ionóforos carboxhicos tenemos 8 1% niger i c ina (23),

rnonensina (24 1, dimemicint; ( 2 5 ) 7 p i s o r i x i n a , que tramportan

cationes monovalentes, v e l & ido lasa ldc ido (X-537A) Y e l

A-23187 que £orman complejos con cationes nonovalentes, divaLen-

t e s y t r i va l en t es (26,271. Se ha demostrad9 que 1s trarwlacacibn de iones s e r e a l i z a

ya sea Q O r un proceso eléctricamente activo, o por uno eldctri-

camente s i l enc ioso . a t r m p o r t e de un catidn por un ionóforo

neutro genera corr iente e i € c t r i cn w.ieRto que t rans f i e re caree

a tr-ivds de la membrana (28), y se na encontrado que Keneral-

mente l a eatequiometda ión-ionbforo ea 181. Por otro lado, se

establec id que los iondforos carboxí l icos promueven un trans-

norte del t i p o antiport eléctricaamente s i lencioso, en e l cuai una Carga se mueve en un sentido :r otra carca en e l sentido

opuesto.

Lz nigerici.na es un ion6foro nonocsrboxílico que se ais-

la de cul t ivos de Strep%omyci- hygroscopicus. Se ha demostra-

do, tanto en sistemas s r t i f i c i a i e s como bioldgicos, que l a nige- -9 r i c i na a concentraciones de 1(3 a NI, act& como intercam-

biador ~+/k+ en f o r m eiectroineu.tra, 1 3 que coincide con e i he-

cho de que a t a l e s concentrac:iones, no a l t e ra l a res is tenc ia

ohmica de membranas i i p í d i c m negras (eQW)(29-34). Por lo tanto,

l a nigericinui a estas concantiracionea a610 cambia e l componente

qu ím i co (Alir) de l a fuerza protbn motriz generada por la oxida-

c ión de substxatos o l a i iumii~cibn, en membranas3 que conservan

energía, siendo capaz de desair.oplar l a f otof osf or i l ac idn en clo-

roplastoe en presencia de IC+, pero en mitocondrias no desacopla

1.8 iosf or i i ao ión oxidativtt.

Sin embargo, en 1967, e l gruoo de Estrada-0. encontró que

la nigericirui a concentraciones ntiyores de d' ií y en presen-

c i a de K+, dwacopia i n f oa f o r i i a c i&n oxidativa en mitocondrias

(35,36), l o i,ual muestra que, de acuerdo aon l a Hipbtesis Qui- minsmótica, ILR niger ic ina puetie transportar carga neta n. t r a d e

de l a nembraila. Datos de l Rru;?o de trabajo de l Dr. Estrada-O.,

muestran que la nigericiria en es te raneo de concentraciories

a l tas , efect:ivamente transporta cax~(a neta, ya que aumentn l a

condirctancia e l e c t r i ca en membmnas l i p id i cas negras (3G). LOS

xesuitaüos e:merimentaiea sugieren cami.,iozo; de mociacióri de ea-

t e RntihiÓtioo, de monómeros ;a dímeros. De manera que R bajas

concentraciones, se tendrá un transporte electroneutro de l t i 9 0

antiaort, y Id aumentar Ira co:ncentraci6n, se pJdrdn L o r m a r dime-

ros por a8ociacidn de dos mondmeros de rY,:ericiriP. que formarán

- 6 -

complejo Cor1 un i ó n potmi1), Re& l a sstequiornetrfa obtenida por experimentos en bicapsla.

Datw rec ientes obtenidas en membrxnas l i p f d i c a s negras,

en e l l sbora tor io del Dr, IPBtm.da-O., indican que l a nzgerici-

na nuede presentar un& q y o r agregación dependiante de pE 8ci-

do. Se plantes l a formación de trfmeros que c>ordinan un xbn potasio (37,38), c m se l ec t i v idad d i ferente a l a de mondmeros y

dineros.

Por l o expuesto nblsta este momento, l a f ina l idad de es te

trabajo es estudiar los cambios de rnecanismos de traneiporte y,

efi su caso, plantear un modelo. Una forms de abordar e l proble-

mti ea La de loredecir por al vs l o r d e l pKa, e l grado de disocía-

ciÓn de l a ciigericina en un medio de pt; determinado, en la in-

t s r f ase memhi-~na-sgua y en l a matriz membranal. De l a misma ma-

nara, ia determinación de l a s eomtar.tes de formacidn (u) de

los comole jot+ niger ic ina-cat i<h se r f a de ut i l idad para predecir

l a naturalezrL de los complejos que se forman en d is t in tas con-

d i c i ones.

OBJETIVO3

Determirw el i3Ka de la riigerxcine en dos medios de cons-

tnnt.0 d i e l h r i c a (D) definidtirr de a l t a y de be ja polaridad.

Calcular. l a s constantes die rormación (Kp) de los complejos

nigericina-catiÓn en medios de po lwidad similar a l a s de la.

determinacióni del Qña.

MATERIAL.

Potencidmetro Beckman 3550 ~otenc idmetro ~eckman 4500 Eiectrodo para protones Beckman Electrodos de Calomel Beckman Electrodo para Potasio Beckman Biectro6.o para Sadio Beckman

RBACTIVOS

Bi f t a l a t o de! Potaaio Baker Hidrdxido de! Sodio Baker Tri8-HFdroxi-metil-amino-msteLno (TRW) Sigma Acido Clorhfdrico Baker Hidróxido de Tetra-metil-anordo (TMAQI:) Iaerck Acid0 ACdtiCo Merck 1.4-Dioxsno 3ferck Agua bidest i lada Thoisser Cloruro de Sedio Herck Cloruro de aotas io Xerck Trietanolamina (TEA) iüerck Soiución estándas p~ 4 Beckman SoiuciBn estáiiüar p~ 7 Beciman Solución estándar p ~ f i ~ Beakman Yiigericinn o'bsequiada por e l Dr. J. Berger de los Laboratorios iioffaann-La 'Roche Inc. de Nutlay, New Jeraey.

I~FODOLOCIA. 31 vd.n:r de l pKa. indica l a iucrza ácida de una molécula,

est9 es, l a f a c i l i d a ü o In di , f i cu l tad con 4ue una mol6cula tje

des-rencie d s x i 0 o ads protones. Y1 pKa se def ine como aquel v8-

l n ~ rie pi1 en e l OL&L hay iw.ir,lles proporciones de l a a formss pro-

tgnada y des-protonada de Uii ácido. Por arr iba da este pi1 las

nglécULas es.ttrr&n en su móryor parte dismiadao, y por debUjo,

la myor. -iu-te %e las moi6cuiiae tendrán su grupo ion izable pro-

t o n a d o .

Por l o 'tanto, so :mede d i3Ci I ' que e l pKa, representa I n

a f in iüd i do imni6ri üe protonee. Por ejemalo, s i una substancia

t i ene un pña bajo, entonces t i ene una b3.ja af inidad por prota-

nes; éste. un@ a los protones ( Ihi lmente p los l i b e r a fdcilmente.

38 un &ido fuerte. Por e l contrmio , SI una substancia t iene

un pKa d.to, entonces t i ene una alta afi?iidr,d por protones; l o s

une fuertemente y los l i b e r a (:m di f ic i f i tad. ES un &Ado débi l

(39).

h i f t i c m e n t e , e i QKR eo define como e l iogarktrno nega.ti- 'YO de l a c9mitsnte de disoci:ioi6n ácida ( K R ) ; :? gdf icamente,

' p l ~ isoeiéctrico I

fueron l as que se muestran en l a Tabla I.

Tabla I,, Condiciones expurimentales para l a medición de

las cowstantes de formación ( ~ f )

lxlo-2mA ~ x ~ O - ~ E

-I 9.86

30 k 50.0 { 6.93 1xf0-41d ~ x ~ O - ~ M i

Los valones de fl usados. se e l ig ieron de acuerdo con los va-

lores de pKai calculados en l a primera parte del proyecto. El pli

de 4.00 corr-esponde a l punto donde se aaume l a formacidn de Trf- meros y donüe l a concentración de nigericina protonada es mayor

que de disociada; los @I ma,yores SL pKa pertenecen a l a proporddn

inversa a l a anterior, de t3ig.H y disociada; por dltimo, L los pH iguales al. pKa l a nigericina está disociada en alrededor del 50%.

Se titularon lae soluci*nes de nigericina con las diferentes

soluciones de cationes, ajustando a l pH deseadocon e l amortigua-

dor adecuado. Se observó que en los casos de pH iguales o mmo- res al pKa, los amortiguadores (TEA y !MACH) inter fer ían con l a

lectura del potencial de los cationes. Para eliminar estas varia-

ble% se hicieron titulaeiones controles de soluciones s i n nigeri-

cincr, añadiendo primero IR misma cantidad de amortiguador usada

para ajustar l a solucidn de nigericina y, luego agregando BC1

(que no in te r f i e re con ei potencial de cati3n) para ajustar a i

pH deseado.

En e l caso de los pH bajos (4.00, menores que e l $a), e l

saiortiguadar ut i l izado fue HiC1, por l o que no exiet ié e l proble-

- 12 -

ma mencionado en e l párrafo anterior.

ZESüLTADOS . ñ l valor del pKa del &ido acdtico se determind en un medio

de constante d ie léctr ica de 37.0. compuesto por un 45 $, peso en

peso, de dioxano en agua (Tabla 11, Figura 3); mientras que l a

medicidn de los valores de pKa de l a nigericina se l l evd a cabo

en dos medios de co,letante d ie léctr ica diferentes 37.0 (Tabla

111, Figura 4 ) y 50.0 (Tabla I V , Figura 5).

Un resumen de l o s resultados obtenidos son presentados en

l a Tabla V.

$n cuanto a los resultados de las constantes de formación,

estos se discuten d e adelanta.

Tabla 11. Titulación de ácido acético 1.0 x ~ O - ~ M con "MAOF1

0,777 M en dioxana 45 $ en agua [D = 37.0). Suatitucidn a-

na l í t i ca (derecha)

pl TMAOK PH O 5 e10 [!?+I= 10 -6*65= 2.2387 f10-781.

5 5.66 vb = 0.020 n l

10 6.02 Cb 0.777 M 1 5 6.32 Va = 30.0 m l

20 6.65 pKa ca = 1 ~ 1 0 - 3 ~

25 7.09 f = 0.5185

30 7.80 Ea = 2.413

35 9.33 pRa = 6.617 40 11.u2

.- 13 - 12

11

1c

9

PH

8

7

6

20 pl TYAOH

30

Figura 3. TIitulacíán de &ido acético 1.0 x i o 3 M con 'flAM

0.777 M en lnoxano 45 $ en agua (Tabla 11)

40

.- /A '-

Tabla 1:iI. Titulacibn de nigesicina &ido libre 1.0 x ~ O - ~ ~ I con !i!M&X 0.777 M en dioñano 45 $ en agua (D = 37.0)

pl TEBAOI.3 @* O 5.67 [H+]= ~ o - ~ * ~ ~ = 1.862 ~ i o - ~ s s 5

10

1 5

17 19 21

2s

30

35

37 39 41

4 3 45

6.66 w = 0.021 ail

7.08 Cb 0.777 M 7.38 Va = 30.0 m l

7.51 Ca = 1 x 1 ~ - 3 ~

7.59 f = 0.5444

7.73 Ka = 1.733 7.96 pKa = 7.761 8.36

8.99 9.47 9.75

10.95 11.28

11.49

Tabla IV. Titülacidn de nigericina ácido libre 1.0 X10-41dI

con TMAOH 1.07 M en dioxano 30 % en agua (D = 50.01

pi FMAOR PH O 5.72 [*+L 10 -0.80 3 1.585 x ~ O - ~ M

10

20

30 40 59

5 o 70 a0

6.36 Vb = 0.020 m l

6.80 Cb = 1.07 M

7.25 Va -i 600.0 ml

8.05 C a = I ~ ~ O - ~ E A

10.00 f - 3.3566 19-56 Ka = 1.17 xLO'7 10.91 ~ K R = 6.932

l O . 9 Y

,

*- 1 5 - l2 1

11

1 0

5i

e /*

~ ~ 2 ~ ~ -

io io 30 40 F-- -' -

pi TnIAC4-l

Figura 4. Titulacibn de nigericina dcida libre 1.0 ~ l O - ~ C o n

TYAOH 0.ST7 Y en dioxano 45 $ en agua (Tabla 111)

9 .

PA

/ i

5 -

.. .~ ~ .- I ~ 1. . ~ ~ .... 1..~ . .

O 10 20 io 40 50 6.0 70 80 pl TMAOH

Figura 5. Tlitulacldn de nigeiricína ácido libre 1.0 XLO-~ con

TMAoíI 1.07 I6 en dioxano 30 $ en agua (Tabla IV)

- 17 -

Tabla ti. pKs medidos 7 reportados en l a l i te ra tura

DI WLAM D pKa medidas pKa reportada

Acldo ~icdtico 45 $ 37.0 6.62 6.31 (41-42)

Nigerioina 45 $ 37.0 7-7620.39

Pligerlcina 30 46 50.0 6.93+0.21 - Nigerioina (ETANOL) 24.3 8.45 (43)

DISOUSION. Como so observa en l a Tiabla V, e l valor de pKa obtenido pa-

ra el dcido acdtico presenta un error de 4.78 $ respecto al va-

lor reportado en l a l i te ra tura (41-42). Este error posiblemente

puede atribuir a l a metodoloda empleada en e l laboratorio,

por LO que 13e consideré e i mismo error en 10s vaiores de pña cni-

culadoe parir l a nigericlnar 7.76 2 0.39 en D r: 37.0 y, 6.93 4: 0.21 en D = 50.0.

En cuanto a l a s Conatantea de formacidn de l o a complejos ni- gerlcina-catiÓn, l a s titulaciones de la niyerlcina con 10s catio-

neu ~ a + y K' en l o s distinton medios propuestos conforme a los

pKa obtenldoe, no proporcionaron informacidn sat is factor ia (re-

sultados no mostrados ).

Rn los resultados s e observó que l o s potenciales registra-

dos de nfgeiricina y de catidn l i b r e s no eran aigebraicamente su-

matorios. POT i o tanto, no resultó posible medir i a concentracidn

de catidn l i b r e en l a s titulaciones, necesaria para rea l i za r los

c a c u l o s de las Kf.

cor?cLvsIomIs. A pa r t i r de l o a resultados presentados en l a Tabla V, se

puede observar que, conforme va disminuyendo l a constante die-

l 6c t r i ca de'L medio (DI, e l pKa del i d d f o r o niger ic ina se in-

crementa.

De l o anterior se puede concluir Que, a medida que aumenta

I

- 18 -

l a hidrofoblcidad de l medio ut i l izado, resulta ni& d i f í c i l l a

dleociacidn clel antibiót ico. En consecuencia, en un medio de D similar a i do l a matriz de Isus membranas l ip íd ica í , (D-2) o al

de l a i n t e r f m e membrana-agua (0-401, ser fa sumamente d i f í c i l

que l a nigerltcina we encontrara disociada, l o cual apoya l a exis-

tencia de loel comple jos mencionados anteriormente (36-381, es

c i r , estructuras formaüas por dos o t res nigericinas protonadaa

unidas a potíreio (Ng2K)*, (N:TI3K)+.(44)

una conclusieh aos i t i va sobre las constantes de formacidn. Poai-

blemente sea necesaria alguna modificación en 61 enfoque metodo-

l dg i co encaminado hacia l a consecución de esta8 constantes para

e i ionóforo ern cuestión.

Por 10 ya expresado en ia discusión, no ae puede bosquejar

Miembroel del grupo de trabajo continúan estudianao los re-

sultados de 1.08 experimento8 nfectuados, con e l propdsito de dil-

lucidar una reapuesta c lara a l a s numerosa6 interrogante0 que Ian

surgido de esta investigación.

RESUMEN. Se determinaron los pKa cte l a niger ic ina en dos medios de

dioxano/agua de d is t in ta o o l d i d a d por mdtodos potenciom&ricos.

Los valorea cibtenidoe fueron: pKa de 7.76 + 0,39 en un medio de

constante dleil8ctrica (D) m 37.0 y, pKa de 6,93 2 0.21 en el me-

Se t i tu lb l a niger ic ina con cationea Na' y K* en los medios

- dio de D = 50.0.

mencionados, a t r e e pH diferentes en cada uno (D = 37.0: 11.52,

7.76 ,y 4.00; I) = 50.0, 9.86, 6.93 y 4.00).

LZTERATLRA CIYADA

I .Tonomura, Y'. , F. Oosawa. XOLBCDLAH MECHAIPISII O* CONTRACTION. Ann. Rev. BPophya. bioeng. 1.8159~ 1972.

~ ,

3.

4 .

5.

6 .

7.

80

9.

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