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C5-Aplicaciones en medicina 1

Aplicaciones de Optoelectrónica en Medicina Semestre 2010-II

5. APLICACIONES EN MEDICINA

5.1 Radiación láser sobre el tejido vivo. Las características principales de la luz láser (coherente y monocromática) permiten enfocar el haz emitido por estos sistemas de manera muy precisa y a dimensiones muy pequeñas. El poder concentrar una gran cantidad de energía en una pequeña región en el espacio es de suma importancia para aplicaciones quirúrgicas, ya que, entre otras cosas, permite realizar cortes con gran precisión.

Los tipos de sistemas láser que tienen aplicaciones médicas varían de acuerdo a la aplicación en particular. Es necesario determinar, por ejemplo, de acuerdo al problema a tratar, cual es la longitud de onda más adecuada así como la potencia requerida. Fundamentalmente, estos parámetros y la interacción de la luz con los organismos vivos a tratar determinan la utilidad de un sistema láser para aplicaciones médicas y de análisis clínico. 5.1.1 Interacciones entre la luz y el tejido. Procesos básicos que causan atenuación y ocurren durante la interacción de un haz de luz con una muestra de material:

• Reflexión: dependiendo del tipo de superficie (suave o rugosa) puede ser similar a la reflexión de un espejo o difusa.

• Absorción: por lo general se debe a agentes de color dentro de la muestra (cromóforos) y generalmente, la luz absorbida se transforma en calor.

• Esparcimiento (scattering): la trayectoria del haz se divide en distintas direcciones; es obvia, por ejemplo, cuando el haz de luz pasa a través de humo o niebla.

Todos estos procesos son altamente dependientes de la longitud de onda del haz de luz incidente.

El tejido biológico atenúa la luz por los mismos procesos: se presenta reflexión del haz en la superficie del tejido (e.g., la piel), y hay además un efecto dispersivo grande dentro del tejido. La absorción, que es altamente dependiente de la longitud de onda, se presenta debido a agentes cromóforos como el agua, hemoglobina y melanina.

• Agua: absorción alta en el UV y en partes del espectro IR, transmisión alta en el visible.

• Hemoglobina: absorción en el UV y en la parte azul-verde del espectro (λ<0.6 µm); no absorbe en el rojo.

• Melanina: varía dependiendo del tipo; el pigmento de melanina en la piel absorbe en las partes visible y NIR del espectro.

En general, la interacción entre la luz y el tejido puede ser de dos tipos: térmica y no-térmica. Esta última es la que se genera por medio de otros agentes que se suministran al tejido para analizarlo o para realizar algún tipo de tratamiento (e.g., terapia fotodinámica). Existe también el proceso de foto-ablación, en el que el tejido se expone a un haz enfocado proveniente de un láser de excímero produciéndose un corte limpio del tejido. Este proceso se produce por una interacción en la que aparentemente no se genera calor, en principio, debido a la alta energía que contienen los fotones a esta



longitud de onda (UV). Sin embargo, este efecto ha sido observado también con otros tipos de láser (CO2 y Er:YAG). Interacción térmica: se genera debido a la absorción de luz en el tejido; este intercambio de energía se manifiesta en forma de calor , causando un incremento en la temperatura. Los efectos importantes originados por este tipo de interacción son la coagulación, el daño térmico (quemaduras) y la vaporización del tejido. La descripción teórica de este tipo de interacción, por ejemplo, las variaciones de la temperatura del tejido en función del tiempo (T(t)), se basa en las teorías desarrolladas para la ciencia de materiales (transferencia de calor).

Para temperaturas menores a los 40°°°°C, generalmente se observan efectos que no son dañinos. Al aumentar la temperatura a un rango mayor y mantenerla por un tiempo largo se pueden presentar daños en las células. Para temperaturas mayores a los 100°°°°C el agua comienza a evaporarse y si esta se evapora por completo la temperatura sigue elevándose hasta la temperatura de ablación (TA), a la cual los otros componentes del tejido se comienzan a evaporar . Este proceso es el que se sigue para remover tejido.

En la cirugía láser, el haz se enfoca en un punto muy pequeño y si la densidad de potencia es lo suficientemente grande, la temperatura se eleva hasta un valor mayor al de TA. En toda la región cercana al punto de exposición se genera un gradiente de temperatura, localizándose el máximo en la región central de exposición, mientras que en las regiones vecinas comienza a decrecer. En la región central se forma un agujero y se remueve el tejido, mientras que la variación de temperaturas en las regiones vecinas genera distintos efectos como daño térmico al tejido y coagulación.

Para entender los efectos que ocurren durante la interacción de un haz de luz láser con el tejido, es conveniente revisar que pasa cuando un haz de luz de este tipo interactúa con un material de manera general. Transmisión de luz láser a través de materiales Cuando un haz de luz colimado pasa a través de una muestra de material, únicamente una fracción de la energía se transmite. El resto se pierde por tres procesos fundamentales: reflexión, absorción y esparcimiento (scattering). Conociendo la intensidad o irradiancia del haz y por conservación de energía podemos establecer que:

tasri IIIII +++= (1)

en donde se desprecian reflexiones en la segunda superficie del material. Reflexión: Puede caracterizarse por un coeficiente que es función del índice de refracción del material. Puede demostrarse que para una incidencia normal a la superficie del



material con índice de refracción n, y considerando que el haz no es absorbido por el material, la reflectancia está dada por:

( )( )2

2

1

1

+−==

n

n

I

IR

i

r (2)

Absorción: El proceso de absorción puede presentarse de diferentes maneras incluyendo transiciones electrónicas y vibraciones moleculares. En la gran mayoría de los casos, la atenuación del haz debida a la absorción se expresa en términos de la ley de Beer-Lambert:

[ ]xExpIxI α−= )0()( (3) El factor αααα (unidades de L-1) se conoce como coeficiente de absorción y es característico para cada material. Un par de cantidades importantes derivadas de esta expresión son la profundidad de penetración (longitud a la cual se obtiene un tercio de la intensidad de entrada) y la longitud de extinción (longitud a la cual se obtiene el 1% de la intensidad a la entrada).

En general, el coeficiente de absorción, y por lo tanto las longitudes antes mencionadas, son dependientes de la longitud de onda.

Dispersión: se relaciona con el cambio de dirección que sufre alguna fracción del rayo; esta fracción eventualmente se absorbe o se escapa de la muestra. Puede



dividirse en dispersión de superficie (superficies rugosas sin pulir) y dispersión del grueso del material (defectos en la muestra como fracturas o impurezas). La atenuación de un haz de luz por dispersión puede aproximarse con la fórmula:

[ ]xExpIxI β−= )0()( (3) en donde β es el coeficiente de dispersión del material.

Si hay atenuación por absorción y por dispersión podemos escribir:

[ ] [ ]xExpIxExpIxI γβα −=+−= )0()()0()( (4) A partir de la ecuación (1) podemos definir los siguientes parámetros:

i

s

i

a

i

r

i

t

sarit

I

I

I

I

I

I

I

I

IIIII

−−−=

−−−=

1

de donde pueden reconocerse:

atenuación derazón

dispersión derazón

aabsorbanci

iareflectanc

→++

→

→

→

i

sar

i

s

i

a

i

r

I

III

I

I

I

I

I

I

Procesamiento de materiales con sistemas láser.

Consideremos un haz de luz láser con sección transversal A [cm2] e irradiancia I [W/cm2] que incide en un material. Supongamos que el rayo se absorbe totalmente a una longitud L [cm] dentro del material. Despreciando efectos de dispersión podemos calcular la potencia total absorbida como:

P=I A [W]

P representa entonces la potencia absorbida en el cilindro cuya base tiene área A y altura L. Suponiendo que el periodo de tiempo de exposición es t, la energía depositada en el cilindro es:

Material A

L



E=P t [J] De aquí podemos obtener la fluencia (energía por unidad de área):

[ ]2cmJ tI

A

EF ==

Las propiedades térmicas relevantes del material son la masa (m) y la capacidad térmica (C). El cambio de temperatura por absorción de energía puede estimarse como:

mC

ET =∆ ,

que es una expresión válida para paredes con aislamiento térmico, y sin considerar cambios de fase en el material. Esto se puede expresar en términos de la densidad del material como:

( )

LC

It

CT

TCLA

Pt

TCLATmCPtE

ρρε

ρε

ρ

==∆∴

∆==

∆=∆==

La temperatura final (Tf) se calcula como la temperatura inicial mas el incremento en la temperatura. Si Tf es lo suficientemente grande, el material puede evaporarse. El cambio de fase en el material puede considerarse con el calor latente de evaporación (entalpía, H). Despreciando pérdidas térmicas, la energía requerida para que el tejido cambie de fase (i.e., se evapore) puede calcularse como:

( )HTCLItA

EF

HTCLAmHTmCE

+∆===

+∆=+∆=

ρ

ρ )(

Con esto podemos finalmente calcular la razón a la cual se remueve el material (espesor de la capa evaporada por unidad de tiempo):

HAdxTdxCAdEIAdtIAtE ρρ +∆==→= dE representa la energía necesaria para vaporizar una capa de tejido de espesor dx durante un tiempo dt. La razón de vaporización es entonces:

HTC

I

dt

dxu

ρρ +∆==



De esta expresión se puede distinguir que el procesamiento de materiales está basado en incrementos de temperatura. El incremento necesario para procesar el material está determinado por la combinación de parámetros del material y del láser (longitud de onda, diámetro del haz, tiempo de exposición). Los efectos de los parámetros del sistema láser pueden describirse de la siguiente forma:

i) Operación pulsada: los pulsos cortos se absorben casi totalmente en el material. Si el material se aísla térmicamente pueden reducirse las pérdidas por calor.

ii) CW: hay más tiempo para que se presenten pérdidas por convección, conducción y radiación. Eventualmente, se alcanza un equilibrio (energía absorbida por unidad de tiempo igual a pérdidas de energía).

iii) Longitud de onda: se elige dependiendo del objetivo y del material (profundidad de penetración, longitud de extinción, etc.)

iv) Potencia: a mayor potencia el incremento de temperatura es mayor. v) Diámetro del haz: si el haz es gaussiano, puede enfocarse en un área

pequeña. Si el volumen de exposición es pequeño, ∆T es grande y es más fácil vaporizar el material.

Interacción de luz láser con el tejido.

• La mayoría de los tejidos del cuerpo humano contienen más del 70% de agua. • Cada tejido tiene un espectro de absorción característico. • Aproximación de primer orden: propiedades similares a las del agua (ver figura).

El tejido absorbe bastante la luz UV y la azul, pero transmite la luz roja. Además, la luz que se absorbe en el tejido casi no experimenta dispersión. Este parámetro se vuelve importante únicamente cuando se utilizan sistemas láser operando en el visible o en el cercano infrarrojo. Otro efecto importante es la luminiscencia del tejido. Existen básicamente dos tipos de luminiscencia: • Intrínseca (endógena): existen

varios fluoróforos internos como las proteínas, ácidos nucléicos.

Las proteínas, por ejemplo, tienen una energía de excitación pico a los 280 nm y emiten en el rango de 320 a 350 nm. En el colágeno la emisión ocurre a los 380 nm mientras que la melanina tiene un pico de emisión amplio centrado a los 540 nm.



• Extrínseca (exógena): cuando el tejido se excita con luz UV, todos los diferentes fluoróforos pueden emitir luz simultáneamente. Esto hace complicado el estudio de la luminiscencia intrínseca. Para poder utilizar técnicas como la espectroscopia de fluorescencia, se deben incorporar fluoróforos extrínsecos que permitan identificar el tejido que se desea estudiar.

Es evidente que el efecto de un haz de luz láser con el tejido depende de todos los parámetros del sistema láser. Tarea: 1. Calcular el incremento de temperatura en una muestra de agua expuesta al haz de un láser Nd:YAG con los siguientes parámetros: Sección transversal: 1mm2

Potencia de salida: 1 W Tiempo de duración del pulso: 2 s Considerar una temperatura inicial del agua de 20 °C y una profundidad de absorción de 1 cm. Despreciar la dispersión y las pérdidas por calor. Solución.

El incremento en la temperatura puede evaluarse con It

TC LC

ερ ρ

∆ = =

Evaluando la densidad de energía: ( ) ( )

( )( ) 32

1 2200

1 0.01

W sPt J

LA cmcm cmε = = =

La densidad del agua es 3

1g

cmρ =

, y la capacidad térmica es 1cal

Cg C

=

o

.

Considerando que 1 0.25J cal≈ , el incremento de temperatura es entonces:

3

3

200 0.25

50

1 1

J cal

cm JT C

C g cal

cm g C

ερ

∆ = = =

o

o

Si la temperatura inicial del agua es de 20 °C, la temperatura final será entonces de 70 °C. Nótese que la profundidad de penetración puede obtenerse también de las gráficas del coeficiente de absorción del agua utilizando la longitud de onda del laser (en este caso el Nd:YAG). También, hay que enfatizar que no se consideran efectos de esparcimiento ni pérdidas térmicas. 2. Calcular la energía necesaria para vaporiza 1 cm3 de agua iniciando a la temperatura corporal (Ti=37 °C). A partir de este resultado, obtener una expresión que permita determinar la energía de umbral de vaporización, la densidad de energía de umbral de vaporización y la fluencia de umbral de vaporización. Evaluar estos parámetros para cuando se utiliza un sistema láser de CO2 con una sección transversal de haz de 1 mm2,



cuya profundidad de absorción es de 0.004 cm. ¿Cuánto tiempo de exposición se necesita para llegar al umbral de vaporización? ¿Cuál es la razón de vaporización? Solución. Para llegar a la temperatura de vaporización (100 °C), se requiere un incremento de temperatura de 63 °C. Para 1 g de agua, se requieren entonces 265 J de energía para llegar de la temperatura corporal (37 °C) a la temperatura de vaporización. El calor latente de vaporización del agua es H=540 cal/g, por lo cual se requieren 2270 J para convertir 1 g de agua a 100 °C de líquido a vapor (1 cal = 4.2 J). Esto implica que se necesitan aproximadamente 2500 J para vaporizar 1 cm3 de agua a partir de la temperatura corporal. Con este resultado podemos evaluar (para el agua) el umbral de energía de vaporización para un haz láser con sección transversal A y profundidad de penetración L:

[ ]2500THE Pt AL J= =

El umbral de densidad de energía es entonces [ ]2500TH

PtJ

LAε = = .

El umbral de fluencia de energía para vaporización es:

22500TH

JF It L

cm = =

Supongamos que utilizamos un laser de CO2 con sección transversal del haz (A) de 1 mm2. El coeficiente de absorción del agua para la longitud de onda de este laser es α = 1000 cm-1, y podemos asumir (arbitrariamente) que L = 4/α =0.004 cm. Con estos datos podemos calcular:

a) Energía de umbral para ablación (evaporación del agua): ETH=100 mJ b) Fluencia de energía mínima para ablación: FTH=10 J/cm2 c) Supongamos que el laser tiene una potencia constante P = 10W. Esto implica

que se requiere un tiempo de exposición de 10 ms para alcanzar el umbral de ablación.

d) Si consideramos que en 10 ms se evapora un disco de agua de espesor de 40 µm, podemos estimar que la razón de remoción de agua es de 0.4 cm/s. Alternativamente podemos establecer que si un pulso de 100 mJ remueve 4x10-5 cm3 de agua, la remoción de “bulto” es entonces de 4x10-4 cm3/J.

5.1.2 Ablación, regeneración y reestructuración de tejido. El uso de sistemas láser para modificar el tejido es parte de un campo llamado “Ingeniería del tejido”, en el que interactúan diversas disciplinas como la química, la ingeniería y la ciencia de materiales. Los procesos que pueden realizarse con sistemas láser son:



• Reestructuración y conformación de tejido: los sistemas láser se utilizan para evaporar, dar forma o cambiar la pigmentación del tejido.

• Fusión o unión de tejidos: los sistemas láser se utilizan para inducir la unión de

los tejidos (“soldadura”) con el fin de reparar desgarramientos o inhibir crecimiento vascular.

• Generación de tejido: el láser se utiliza para activar el crecimiento de tejido, o

bien para realizar incisiones que estimulen el crecimiento de nuevos tejidos. Reestructuración y conformación de tejido. Las aplicaciones con más desarrollo se encuentran en la dermatología y en la oftalmología. Dermatología: El desarrollo de sistemas láser para estas aplicaciones se ha basado en la teoría de fototermólisis selectiva (Anderson y Parrish, 1983). Fundamentalmente, se han establecido las condiciones para la destrucción altamente localizada de “blancos” absorbentes de luz en la piel, causando un daño mínimo al tejido de los alrededores. La idea básica es elegir la longitud de onda, tiempo de exposición adecuados, así como también la fluencia de energía suficiente para que los blancos elegidos sean los únicos que absorban la energía del láser. Ejemplos de aplicación: • Malformaciones vasculares (manchas o lunares rojos de gran tamaño). El

cromóforo a atacar es la oxi-hemoglobina. La luz láser la absorbe la hemoglobina y se convierte en calor; este a su vez daña las paredes vasculares y se presenta un bloqueo de los vasos sanguíneos.

• Remoción de lesiones pigmentadas y tatuajes. El blanco es la melanina o el pigmento del tatuaje. La luz láser causa un calentamiento extremadamente rápido de la melanina o el pigmento, lo que fractura estas partículas matando a las células que los contienen.

• Resurgimiento de tejido (resurfacing). El cromóforo a atacar es el agua. En el caso de remoción de arrugas se evapora una capa superficial de la piel (1 µm o 20 µm) por medio de la absorción de energía en el contenido de agua de la piel.

• Remoción de cabello. Se ataca la melanina folicular. Hasta la fecha, no se han establecido los procedimientos para garantizar que este proceso es permanente.

Oftalmología: Este campo de aplicación es el que tiene más antecedentes y lleva más o menos tres décadas de haberse iniciado. Los mecanismos de interacción entre el tejido y los sistemas láser utilizados son muy variados debido a la estructura del ojo humano. Los ejemplos de aplicación pueden agruparse en dos categorías: • Tratamiento de enfermedades retinales o glaucoma. Se utilizan sistemas láser que

operan en el visible o en el cercano infrarrojo. Con estos pueden tratarse retinopatías diabéticas, oclusiones de venas retinales, degeneración macular, rasgados retinales, y el glaucoma.

• Cirugía para correcciones refractivas. Se utilizan longitudes de onda invisibles (UV) para darle la forma correcta a la córnea con el fin de corregir la miopía, la hipermetropía y el astigmatismo. Fundamentalmente se utilizan dos tipos de



procedimientos: PRK y LASIK. Recientemente se ha aprobado también el uso de LTK (keratoplastía térmica) que se basa en el calentamiento de regiones anulares concéntricas en la córnea para incrementar su curvatura (no hay ablación del tejido de la córnea).

Fusión de tejidos. Los tejidos que se han tratado con estas técnicas son hasta la fecha tejidos blandos. Procedimientos típicos:

a) Fusión directa. Calentamiento local a 60-80 C por absorción de energía láser para inducir la unión del colágeno.

b) Soldadura láser. Se emplean proteínas que tienen propiedades de soldadura que se activan por la interacción con luz láser. La longitud de onda se selecciona de tal forma que las proteínas la absorban para calentarse y sellar el tejido circundante.

c) Soldadura láser mejorada por tintes. Se añaden tintes que aumentan la absorción del láser haciendo más eficiente el proceso de soldado.

Los sistemas láser utilizados son el Nd:YAG, CO2, y el uso de tintes ha permitido el uso de diódos láser operando a 808 nm. Estos procedimientos pueden usarse en conjunto con endoscopía o lamparoscopía, lo que ofrece ventajas como:

• Posibilidad de realizar microcirugía • Inflamación reducida • Recuperación más rápida que con otro tipo de tratamiento • Sellado impermeable • Facilidad y rapidez de aplicación

Aplicaciones:

• Cirugía cardiovascular • Cirugía toráxica (sellado de fugas de aire en pulmones después de biopsias) • Dermatología (sutura de piel con mejor cosmética y sanado más rápido) • Neurocirugía (reparación y fusión de nervios periféricos) • Oftalmología (sellado de incisiones en la esclerótica y la córnea) • Urología (sellado de la uretra y próstata, en ambos casos es importante la

impermeabilidad) Regeneración de tejidos. Este tipo de tratamiento se encuentra todavía en etapa de investigación y es un gran prospecto para la reparación de tejido después de que se ha sufrido alguna lesión. La investigación en este campo se ha iniciado gracias a reportes que han estudiado los efectos de la luz para sanar heridas y regenerar tejido . En general, se ha establecido que con fluencias bajas de radiación visible e IR se puede estimular el crecimiento capilar y la granulación durante la formación del tejido.

La idea básica de este tratamiento es tratar de deshacer los coágulos en el tejido de las cicatrices para favorecer la regeneración del tejido nativo. Con ablación láser,



por ejemplo, los coágulos se minimizan y por lo tanto puede favorecerse la regeneración de tejidos. 5.2 Corrección de la visión. 5.3 Cirugía con técnicas laser. 5.4 Terapia fotodinámica. La terapia fotodinámica (PDT) ha emergido como un tratamiento promisorio del cáncer y otras enfermedades. Este tipo de terapia se basa en el empleo de un agente químico externo llamado fotosensibilizador (droga PDT) que se activa por luz. Suministro de medicina PDT:

• Intravenoso • Tópico

Etapas claves de la PDT:

• Suministro del fotosensibilizador • Retención selectiva durante tiempos largos de la droga PDT por parte del tejido a

tratar • Llevar la luz (generalmente láser) a la zona afectada • Absorción de luz en el fotosensibilizador para generar oxígeno de alta reacción

que destruya células cancerígenas con daño mínimo al tejido vecino • Eliminación del fotosensibilizador para reducir la sensibilidad a la luz solar

En general, todos los tejidos absorben la droga PDT, sin embargo, sólo el tejido maligno lo retiene por un tiempo mucho más prolongado. Se debe seleccionar también la longitud de onda adecuada para la activación de la droga. Dado que la luz que se utiliza es generalmente luz láser, pueden utilizarse sistemas de fibra óptica para llevar la luz a las zonas afectadas. En el caso de cáncer de piel, puede utilizarse iluminación directa. El proceso de generación de oxígeno en las células se conoce como foto-oxidación, y es el responsable de destruir las células malignas. 5.4.1 Fotosensibilizadores. Características:

• Habilidad para acumularse selectivamente en el tejido a tratar. • Debe ser capaz de dispersarse en el torrente sanguíneo y de penetrar membranas

celulares (puede lograrse químicamente) • Absorción considerable en la región espectral de máxima transparencia para

tejidos biológicos (de 800 a 1300 nm). Esto permite que la luz penetre más profundamente en el tejido para activar la droga. Debe considerarse también que las longitudes de onda mayores a los 900 nm son de energía muy baja como para lograr la generación de oxígeno en las células.

• Capacidad de ser expulsadas del cuerpo rápidamente después del tratamiento. Algunos ejemplos de drogas comerciales:



• Derivados de fotoporfirinas: se utiliza para tratar una variedad de tumores cancerígenos. Se excita con luz roja (630 nm) aunque esta longitud de onda no penetra más de 2 mm en el tejido biológico. A pesar de que algunos tumores gruesos pueden tratarse con la ayuda de fibras ópticas, no puede ser utilizada para tratamientos de tumores que se extiendan más de 4 mm. Por lo general se requieren de 4 a 6 semanas posteriores a la aplicación de la inyección para eliminarla y durante este periodo se debe evitar la luz directa del sol, luces artificiales muy brillantes o luces muy fuertes.

• Fotosensibilizadores catiónicos: la carga positiva permite que sean atraídos por las mitocondrias celulares, aunque su efectividad para generar oxígeno es baja. Para esto se añaden otras moléculas que permiten aumentar la eficiencia de producción de oxígeno. Ejemplo: azul de metileno.

• Fotosensiblizadores dendríticos: los dendrímeros son estructuras con ramificaciones que están ligadas secuencialmente para formar varias capas de crecimiento. Estas estructuras proveen sitios múltiples para enlazar fotosensibilizadores y, en algunos casos, pueden incorporarse varios de ellos en diferentes ramas.

5.4.2 Aplicaciones. Potenciales (no han sido aprobados por la FDA):

• Algunos tipos de cáncer pulmonar • Cáncer de esófago • Algunos tipos de cáncer de piel • Cáncer de mama • Cáncer colo-rectal • Tumores cerebrales

En la actualidad, para tratamientos de cáncer, el único fotosensibilizador autorizado es la Fotoporfirina. Otras enfermedades:

• Cardiovasculares (alternativa a la angioplastía) • Enfermedades crónicas en la piel (psoriasis) • Degeneración macular • Antibacterial

5.4.3 Mecanismos de acción. Los mecanismos que producen la destrucción de las células cancerígenas no han sido exactamente determinados. Sin embargo, se reconocen tres mecanismos involucrados en la acción fotodinámica:

• Celulares: los fotosensibilizadores atacan directamente a ciertos organelos de las células tales como las mitocondrias o los plasmas de las membranas. En este caso, se produce necrosis y las células vecinas destruyen a las células “pulverizadas” por la acción fotodinámica.



• Vasculares: se produce daño vascular provocando la activación de plaquetas y un incremento en la permeabilidad vascular. La sobreproducción de sangre genera exceso de oxígeno en las células hasta que estas mueren.

• Inmunológicos: estimulan la producción de sustancias que atacan las zonas inflamadas por los tumores y eventualmente matan el tejido cancerígeno.

5.4.4 Luz para terapia fotodinámica. Los primeros estudios de esta tipo de terapia utilizaban lámparas de filamentos incandescentes (tugsteno) y lámparas de arco (xenón o mercurio), ya que no se requiere una fuente coherente ni con alta potencia pico. Sin embargo, los sistemas láser ofrecen ventajas tales como:

• Luz monocromática para activar selectiva y eficientemente fotosensibilizadores específicos.

• Eficiencia de acoplamiento a fibras alta, haciendo posible el uso de endoscopios para uso intersticial.

Tipos de sistemas láser utilizados: Láser de tinte (Rodamina 6B, 665 nm, CW y pulsado) En el futuro:

• Diodos láser (CW y cuasi-CW, 780-850 nm) • Barras de diodos láser de alta potencia (100 W) • Sistemas láser de estado sólido en el NIR (cáncer subcutáneo) • Sintonizables de estado sólido (Ti:zafiro, 690-1100 nm, Alejandrita, 720-800 nm) • Osciladores paramétricos ópticos

Requerimientos para luz láser La dosis apropiada de luz para un tratamiento específico depende del tamaño, localización y tipo de tumor. Para fotoporfirinas excitadas a 630 nm los requerimientos son:

• Fluencia de 25-500 J/cm2 para tratamientos de superficie, 100-400 J/cm2 para aplicaciones intersticiales.

• Irradiancia máxima de 200 mW/cm2 para tratamientos superficiales, 400 mW/cm2 para aplicaciones intersticiales

• Potencia de salida de la fuente de 1-2 W Las nuevas generaciones de fotosensibilizadores tendrán los mismos requerimientos ya que el objetivo es incrementar la longitud de onda de excitación con el fin de lograr mayor penetración en el tejido. 5.5 Estudio y diagnóstico de organismos vivos. Los estudios bioquímicos se encargan de determinar el contenido de diversos tipos de moléculas en sistemas de todo tipo. Existen varios campos de investigación e industrias que requieren del análisis rápido y preciso de distintos productos o muestras; algunos ejemplos son:



• Investigación: Determinación de contenido molecular (concentraciones) en sustancias de interés.

• Diagnóstico clínico y medicina deportiva: Medición del contenido de niveles de glucosa en sangre y plasmas, así como el contenido de otras sustancias en fluidos corporales como el cerebro-espinal.

• Industria de bebidas y alimentos: Establecer el contenido en cantidades correctas de elementos alimenticios claves en los productos durante la etapa de producción (tiempo real).

• Bio-procesamiento: Se requiere del control preciso de nutrientes y productos secundarios para optimizar el crecimiento de células en cultivos y maximizar los productos finales a obtener.

En general, todo este tipo de estudios se realiza con distintas tecnologías, y las

aplicaciones biológicas y bioquímicas de estas se conocen como BIOTECNOLOGÍA. La industria de la biotecnología se ha desarrollado rápidamente en los últimos años gracias a las innovaciones tecnológicas en áreas que tienen aplicación directa en dicha industria. Tal es el caso de la optoelectrónica, en la que gran parte del gasto de inversión ha sido destinado a aplicaciones de biotecnología.

Los sensores desarrollados para el estudio de organismos vivos en un sistema biológico se llaman BIO-SENSORES. Estos detectan la interacción de moléculas biológicas básicamente en tiempo real, y lo hacen mediante un elemento sensor de origen biológico que se integra a un transductor que proporciona una señal física que puede medirse más fácilmente. La señal generada en el transductor es causada por la interacción entre el elemento sensor biológico (una molécula de bioreconocimiento inmovilizada) y la molécula bajo análisis (analyte).

Existen diversas técnicas de análisis que se basan en el empleo de dispositivos optoelectrónicos. En algunos casos, pueden utilizarse dispositivos de uso general para desarrollar aparatos de uso específico, aunque también se desarrollan dispositivos para satisfacer necesidades específicas de detección y análisis de diversos tipos. Algunas de las técnicas relacionadas con optoelectrónica son:

• Fluorescencia: Se basa en la detección de luz emitida específicamente por moléculas de interés, ya sea de manera natural, o por medio de tintes que se introducen al sistema biológico. El efecto fluorescente se presenta al excitar a las moléculas (o en su caso al tinte) por medio de luz láser o, en algunos casos, utilizando fuentes de luz de otro tipo (e.g., LEDs, lámparas de mercurio). Por lo general se utilizan técnicas espectroscópicas para analizar las muestras.

• Cromatografía: En general, la cromatografía se encarga de estudiar el desplazamiento de distintos componentes en una solución. El método utilizado para determinar el desplazamiento de un componente en particular se basa en el monitoreo de el índice de refracción o la absorción de luz UV en una columna que contiene la muestra en estudio. La información se presenta en una gráfica



llamada cromatograma que grafica los cambios en índice de refracción o absorción en función del tiempo. Esta información se compara con cálculos teóricos para determinar las velocidades de desplazamiento de las distintas especies contenidas en la columna y así poder identificar alguna en particular.

La cromatografía por afinidad se basa en la interacción de un ligando con el soluto de interés. Existen dos tipo de ligandos: específicos (se liga únicamente a una especie) y generales (se ligan a grupos específicos contenidos en las especies de estudio). Ejemplos de ligandos:

o Antígenos, virus o células: se ligan con aticuerpos. o Proteínas, polimerasas: se ligan con ácidos nucléicos. o Proteínas portadoras: se ligan con distintos tipos de hormonas.

La preparación de las muestras involucra distintas etapas que hacen el proceso

relativamente laborioso. Los componentes de la muestra son transportados por una fase móvil (líquido o gas) a través de una fase estacionaria. Las especies individuales retardan su desplazamiento a través de la fase estacionaria por medio de las interacciones con el ligando. Las interacciones fundamentales son adsorción en la superficie, solubilidad y carga. Generalmente se utilizan columnas que contienen todos los componentes. El análisis se basa en medir el índice de refracción de la columna, o en algunos casos, la absorción de luz ultravioleta. Se utiliza luz láser o lámparas UV y un detector que se monitorea en tiempo real para detectar picos de absorción o reflexión.

• Resonancia superficial de plasma: (Surface Plasmon Resonance, SPR) Este fenómeno ocurre cuando un haz de luz se refleja al incidir sobre películas delgadas de materiales metálicos (generalmente oro). Una fracción de la energía incidente a un ángulo específico interactúa con los electrones libres de la película metálica y esto genera una reducción en la intensidad de luz reflejada por el arreglo óptico. Para poder utilizar este efecto, se requiere la generación de un campo evanescente entre la película y la interfaz opuesta a la superficie de incidencia (cara sensora del areglo). Esto implica que las sustancias colocadas en la porción de sensado debe tener un índice de refracción menor.



Los aparatos basados en SPR miden la intensidad de luz reflejada por el arreglo en función del ángulo de incidencia. El ángulo al cual ocurre la reducción de intensidad reflejada se le conoce como ángulo SPR, y es función del índice de refracción de la sustancia colocada en la cara sensora del arreglo. El índice de refracción cambia al ligarse macromoléculas a la superficie y, como resultado, se produce un cambio en el ángulo SPR en función del número de macromoléculas ligadas. La relación entre la cantidad de material que se liga y el desplazamiento en el ángulo es lineal.

Existen aparatos que barren el ángulo de incidencia del haz de luz láser para determinar el ángulo SPR. Estos miden el desplazamiento del ángulo en miliradianes como una unidad de respuesta para cuantificar el ligado de las macromoléculas en la superficie del sensor. La respuesta depende también del índice de refracción de toda la solución utilizada. Un cambio de 120 miliradianes, por ejemplo, representa un cambio en el recubrimiento de la superficie por proteínas de aproximadamente 1 ng/mm2, o equivalentemente, un cambio en el índice de refracción de aproximadamente 10-3.

La parte clave de este tipo de

sensores es la superficie de ligado. Aquí es donde la interacción molecular se lleva a cabo y un evento de ligado se traduce en una señal optoelectrónica. Es por esta razón que la arquitectura a nivel nanométrico de esta superficie es de gran importancia. Por lo general se utilizan distintos tipos de recubrimientos que incorporan agentes biológicos que ligan ciertas moléculas de manera preferencial. Estos pueden incorporarse en capas de material poliméricos o en otros tipos de materiales.

• Otros métodos: Diferentes técnicas espectroscópicas y de fluorescencia.

SPR parameter Equivalent value

SPR angle shift 120 millidegrees

Change in protein surface concentration

1 ng/mm2

Change in bulk refractive index 0.001



5.1 Análisis celular Las técnicas de análisis celular se basan en análisis de fluorescencia. Estas se combinan con técnicas de microscopía que permiten identificar las células contenidas en un grupo. Existen diferentes métodos con diferentes resoluciones para identificación de células. Independientemente de la técnica utilizada, cualquier tipo de microscopio puede modificarse de manera simple para que proporcione imágenes más claras y definidas. Entre las opciones más sencillas se encuentra el manipular la luz que llega al objeto que se desea observar. Esta manipulación requiere únicamente de filtros espaciales que permiten definir los colores o los niveles de oscuridad en las distintas alturas del objeto iluminado.

La microscopía se basa en la absorción de la luz en cada célula. En algunos casos, la absorción de distintas células es similar, por lo que basarse en el efecto de absorción de cada una de las células que conforman un grupo no proporciona mucha información. En estos casos se debe aprovechar otra característica que permita establecer diferencias que puedan distinguirse en las imágenes. Un ejemplo es la microscopía de contraste de fase, en la que el objetivo incorpora una región anular que modula la fase de la luz utilizada para iluminar la muestra. Esta modulación permite aumentar el contraste en las imágenes. Otra técnica similar aunque más elaborada es la de contraste diferencial interferométrico, que permite obtener imágenes con aspecto de tercera dimensión y agregar colores.

La microscopía de fluorescencia se basa en la emisión de luz de tintes o

dispositivos de prueba que se mezclan con la muestra. Se han desarrollado diferentes materiales que pueden ser ligados no sólo por células específicas, sino también por



organelos intracelulares para hacer posible su identificación. En la figura se muestra una célula de una arteria pulmonar de bovino etiquetada con tres tintes fluorescentes diferentes. Pueden distinguirse claramente el núcleo (azul), los microtubos que forman el esqueleto celular (verde) y las mitocondrias (rojo).

5.2 Técnicas ópticas no invasivas para biopsia Los métodos ópticos utilizados para biopsias se basan en la interacción de las células cancerígenas con la luz. Los efectos que proporcionan información importante son:

• Luminiscencia (fosforescencia y fluorescencia)

• Efecto de Raman • Dispersión (Rayleigh, Mie)

******** Técnicas para obtención y análisis de imágenes. Las técnicas ópticas para adquirir imágenes pueden ser utilizadas para estudiar un amplio rango de especimenes biológicos en un rango que cubre varias escalas de tamaño. En general, las técnicas ópticas utilizadas para adquirir imágenes biológicas utilizan contrastes generados por diferencias entre la luz transmitida, reflejada y la fluorescencia de la región que quiere estudiarse y la zona aledaña. 5.5.1 Técnicas de microscopia.



Los métodos utilizados en la microscopia óptica se basan en el monitoreo de las propiedades ópticas de las muestras a analizar. Una clasificación general de estos métodos puede hacer de la siguiente manera: • Transmisión (transiluminación): se basa en la variación espacial de la absorción

y dispersión de luz generada por las estructuras microscópicas y macroscópicas del tejido. Durante su propagación en el tejido, la luz se descompone en:

o Luz sin dispersar (dispersa coherentemente): se propaga en la dirección del haz incidente y por lo tanto siguen la trayectoria más corta para salir del tejido. Estos fotones contienen la máxima información sobre la estructura interna del tejido.

o Dispersa débilmente: siguen trayectorias oscilantes y también se co-propagan con el haz de luz incidente. Estos fotones tienen un retraso temporal con respecto a los que componen la luz sin dispersar, y también contienen información sobre el tejido como medio dispersor.

o Dispersa en forma múltiple: compuesta por los fotones que viajan distancias muy largas debido a dispersión con las diferentes que componen el tejido. Esta luz es la que no trae ninguna información útil sobre el tejido y por lo tanto debe discriminarse.

Para eliminar la luz dispersa en forma múltiple pueden utilizarse las siguientes técnicas:

o Filtrado espacial (micoscopía confocal): método más simple, se utiliza un filtro que elimina la luz que se propaga fuera del eje óptico del microscopio (una fibra, un pinhole).

o Filtrado por polarización: la luz difusa pierde su polarización inicial y se elimina con filtros de polarización.

o Filtrado por tiempo: utiliza un láser pulsado y una compuerta óptica sincronizada con el láser (e.g., efectos no-lineales).

o Métodos en el dominio de la frecuencia: se modula en intensidad el láser y se mide el cambio de fase de la señal transmitida utilizando métodos como la mezcla heterodina.

• Reflexión (retro-dispersión): esta se basa en la recolección de la luz retro-dispersa

por la muestra. Al igual que en el caso anterior, la luz que contiene la información importante es la que contiene la luz que se dispersa de manera coherente. La discriminación se logra mediante dos técnicas:

o Microscopía confocal (filtrado espacial): misma idea que para microscopía de transmisión.

o Microscopía interferométrica: esta técnica ha llevado al establecimiento de la tomografía por coherencia óptica (OCT). Con esta, es posible obtener imágenes de tejido con alto coeficiente de dispersión.

• Fluorescencia: es la técnica más utilizada para la obtención de imágenes biológicas

ya que proporciona el sondeo más detallado de la estructura y la dinámica de especimenes biológicos tanto in vitro como in vivo.



Tarea: • Explicar cómo están constituidos un microscopio simple y un microscopio

compuesto. • ¿En qué consiste el método de iluminación de Kohler? • ¿Qué representan la resolución y la abertura numérica en un microscopio? • Investigar las siguientes técnicas de microscopía:

o Contraste de fase (Phase contrast microscopy) o Campo obscuro (dark-field microscopy) o Fluorescencia (fluorescence microscopy) o Tomografía por coherencia óptica (optical coherence tomography) o Campo cercano (near-field optical microscopy) o Reflexión total interna de fluorescencia (Total internal reflection

fluorescence microscopy)

Fuentes de información: o http://micro.magnet.fsu.edu o http://www.microscopyu.com o http://www.olympusmicro.com

Microscopio simple. Este es básicamente una lente que magnifica la imagen. El principio de funcionamiento se basa en la formación de la imagen por medio de una lente. Si un objeto se coloca a una distancia u de una lente, se forma una imagen real de este a una distancia v al otro extremo de la lente. Esta imagen es la versión magnificada por un factor v/u. En un microscopio, el objeto se coloca en el plano focal para formar la imagen magnificada y ser observada por el ojo o grabada en una cámara. Para obtener una imagen bien definida el objeto debe colocarse dentro de una distancia cercana al plano focal conocida como profundidad de foco.

Microscopio compuesto. Utiliza una combinación de lentes para mejorar significativamente la magnificación de las imágenes. La imagen magnificada por el objetivo se vuelve a magnificar con otro sistema de lentes (el ocular). La magnificación final está dada entonces por el producto de las magnificaciones de ambas etapas. La resolución del microscopio depende no sólo de los objetivos sino también de la iluminación. El método más utilizado de iluminación es el método de Kohler.



5.5.2 Técnicas en el dominio del tiempo y espectrales. Las técnicas anteriores permiten obtener imágenes de alta resolución a niveles sub-celulares. Sin embargo, el sondeo de funciones biológicas requiere de la combinación de todas las técnicas anteriores con técnicas en el dominio del tiempo y en el dominio de la frecuencia. Esto permite estudiar la dinámica de las funciones biológicas. Estas técnicas se usan principalmente en conjunto con la detección de fluorescencia.

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