El segundo paso

en el diagnóstico citológico:

La coloración

Dra Laura Denzoin Vulcano Facultad de Ciencias Veterinarias

UNICEN-Tandil

Toma de muestras

Coloración Interpretación

Los pasos del diagnóstico citológico

Toma de muestras

Coloración Interpretación

Los pasos del diagnostico citológico

Extendidos de células sanas dispuestas en

monocapa

Uniforme

CALIDAD

PASO 1: TOMA DE MUESTRAS Y EXTENDIDO Biopsia por Aspiración con Aguda Delgada/Biopsia con Aguja

Delgada/Improntas/Hisopados

Aguda Delgada

Aguda Delgada

PASO 1: TOMA DE MUESTRAS Y EXTENDIDO Importante

• El extendido debe ser delgado para que las células se dispongan en monocapa y estén sanas.

• Los portaobjetos deben ser nuevos y se deben dejar en alcohol para desengrasar.

• Es conveniente siempre realizar varios extendidos por paciente

• Siempre se utiliza un portaobjetos nuevo, limpio y desengrasado

• Los portas se mantienen en un frasco con en alcohol al cual se le agrega unas gotas de xileno

TOMA DE MUESTRAS Y EXTENDIDO Objetivo: Monocapa

¡No olvidar!

Portaobjetos nuevo, limpio y desengrasado

¿PARA QUE SE USAN LAS COLORACIONES?

1. Identificar las células

2. Identificar sus estructuras

Densidad de la cromatina

Nucléolos

Granulación

Características del citoplasma

PASO 2 : COLORACIÓN Objetivo: Uniforme

Buena calidad de colorantes

Coloraciones

Giemsa Wrigth Diff Quik

Romanowsky Papanicolaou

¡No olvidar!

Papanicolaou

• Compleja

• Fijación húmeda

• No tiñe bien citoplasmas, ni microorganismos

• Exelente para la evaluación de los núcleos

Giemsa

• La mas usada

• Muy simple

• Fijación con aire

• Buen detalle del citoplasma

• Tiñe microorganismos

Diff Quick

• No la recomiendo

• Inferior calidad

• No tiñe bien los gránulos de los mastocitos!!!!!

• No tiñe bien los gránulos de eosinófilos

Papanicolaou Giemsa

Diff Quick

1 2 3

Coloración rápida Frasco 1: Color verde pálido. Solución de fijación compuesto por Fast Green y metanol. Frasco 2: Color rojo. Solución de Eosina G en buffer. Frasco 3: Color azul. Solución de Triazina C en buffer

Procedimiento de coloración rápida

Se colocan las soluciones que vienen comercialmente en botellas dentro de contenedores de boca ancha que se van a utilizar para el pasaje de los preparados. Recordar renovar periódicamente el contenido de los frascos. 1. Secar los extendidos al aire durante 30 a 60 minutos dependiendo del espesor de la muestra 2. Sumergir el extendido en la solución 1 (Solución verde pálido) cinco veces 3. Escurrir el extendido sobre un papel absorbente. 4. Sumergir el extendido en la solución 2 (Solución roja) cinco veces 5. Escurrir el extendido sobre un papel absorbente. 6. Sumergir el extendido en la solución 3 (Solución azul) cinco veces 7. Enjuagar con agua destilada 8. Dejar secar

Coloración rápida: El citoplasma adquiere coloración azul (Forma amarilla). El núcleo toma coloración púrpura ( Forma roja). La flecha negra indica el nucléolo que adquiere un color violeta oscuro y permite diferenciarlo de la coloración del núcleo. La flecha violeta señala un eritrocito que adquiere tonalidad rosa anaranjada.

Precauciones

• Escurrir bien entre los pasajes por los colorantes, de manera que estos no se mezclen

• Renovar los colorantes cuando la coloración pierde intensidad.

• Renovar los colorantes si se contaminan. Una contaminación muy frecuente es cuando se colorean hisopados de oído de muestras con levaduras.

Diff Quick Giemsa

Recordar

• Con la coloración rápida en ocasiones no se tiñen bien las granulaciones de mastocitos y eosinófilos

• Con la coloración rápida no se tiñen bien los detalles nucleares

Diff Quick Por favor no lo uses……..

Coloraciones Hematológicas

Wright Giemsa May -Grünwald

Giemsa

Procedimiento de coloración de Giemsa

Procedimiento de la coloración de Giemsa

1. Fijar al aire la muestra durante 30 a 60 minutos dependiendo del espesor de la misma 2. Cubrir con metanol durante 5 minutos 3. Enjuagar con agua corriente 4. Cubrir con solución de Giemsa recién preparada durante 15 minutos. Preparación de la

solución de Giemsa: Se toma 1 parte de la solución comercial de Giemsa y se le agregan 9 partes de agua destilada.

5. Enjuagar con agua corriente 6. Secar al aire

Colocar las muestras a teñir sobre un juego de varillas colocadas en una superficie nivelada. Es importante que esté bien nivelada para que el colorante no se escurra por un extremo. De esta manera, se garantiza que la coloración resulte pareja en todo el extendido

Cubrir las muestras con metanol durante 5

minutos. Luego aclarar con agua corriente.

Cubrir las muestras con la solución de Giemsa 1 en 10 recién preparada. Preparar sólo lo que se va a usar. Con 10 ml de solución recién preparada se pueden cubrir 5 extendidos. Dejar actuar 15 minutos y enjuagar con agua coriente. Dejar secar.

Grueso: Más tiempo

Fino: Menos tiempo

¡No olvidar!

Colorante que sobra SE TIRA

MONOCAPA

Tonalidades adquiridas por la coloración de Giemsa

Núcleos Púrpura Nucleólos Púrpura intenso Citoplasma Azul pálido traslúcido Proteínas Rosado Gránulos de Eosinófilos Rojizo Gránulos de Mastocitos Púrpura Mucina Rosado a Púrpura brillante Colágeno Púrpura brillante a magenta Cuerpos linfoglandulares Azul pálido Plaquetas Rosado

Apariencia de la coloración de

Giemsa. Grupo de células mesoteliales

100X Forma roja: núcleo

color púrpura Forma amarilla : citoplasma azul

trasnparente.

Núcleo púrpura

Citoplasma azulado

Sedimento proteico

Apariencia de la coloración de Giemsa.

Inflamación purulenta. 100X

Flechas rojas : Bacterias. Flechas negras núcleos de

neutrófilos. Flecha azul: Hilos de cromatina

Apariencia de la coloración de Giemsa. Células sanguíneas de gato 100 X. Fecha negra eritrocitos. Flecha violeta:neutrófilo. Flecha roja : eosinófilo, se puede observar el tono rosado de las granulaciones citoplasmáticas. Flecha celeste: Plaqueta.

Apariencia de la coloración de Giemsa. Mastocitoma

100X. Núcleos de mastocitos señalados con

la flecha negra, en los cuales se distingue

nucleólos grandes más oscuros. Las granulaciones

de los mastocitos están señalas con flechas rojas.

Flecha verde eosinófilo

pH 6,8 pH 7,4

Plaquetas

Eritrocitos

Artefactos

Artefactos. 100x .La flecha negra indica un grano de polen, que es una contaminante ambiental que puede aparecer al dejar las muestras sin protejerlas del medio ambiente. Las flechas rojas indican precipados del colorante.

Polen

Imagen de un proceso inflamatorio purulento

10x. El círculo azul encierra un grupo de

neutrófilos. Las flechas azules muestran hilos de

cromatina. Este artefacto se produce por

la ruptura de las células por aplastamiento

durante el proceso de extención de la muestra.

La forma punteada encierra células

superpuestas

Restos de cromatina

Extendido de sangre de gato.100x. Las flechas

señalan precipitados de la coloración que pueden ser confundidos con bacterias,

la forma de diferenciarlo es que no tienen una

morfología bien definida en tanto que las bacterias claramente tienen forma

de coco o forma de bacilo.

Extendido de sangre de gato.100x. Las flechas señalan artefactos debidos a la falta de fijación. Este artefacto aparece cuando se tiñen muestras húmedas, no esperando el tiempo suficiente para que se encuentren totalmente secas.

Efecto de los vapores de formol sobre el extendido.100X. Este artefacto se produce cuando la muestra es transportada en forma conjunta con muestras fijadas en formol para histopatología. Puede verse un efecto esmerilado que no permite la diferenciación de las células

Normal and Benign Cervical Cytopathology Deborah Reich BSc MEd CTASC CTIAC

Recomendaciones prácticas para que tus coloraciones sean perfectas

Usar solo colorantes de la mejor calidad

Usar solo portaobjetos nuevos, limpios y desengrasados

Usar sólo colorante recién preparado

Dejar secar las muestras nunca teñir muestras húmedas

No exponer las muestras a vapores de formol

Tiempo de coloración

Si usas coloraciones rápidas

Proteger los extendidos

Efecto Malachowski-Romanowsky-Giemsa

Laura Denzoin-Vulcano laura@vet.unicen.edu.ar

Muchas Gracias