bioesponja reporte técnico por alain tapia ortiz
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DIVISIÓN DE BIOTECNOLOGÍA
DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE BIOESPONJA
REPORTE TÉCNICO
PARA OBTENER EL TÍTULO DE
TÉCNICO SUPERIOR UNIVERSITARIO
EN BIOTECNOLOGIA
P R E S E N T A
ALAIN EDUARDO TAPIA ORTIZ
ASESORES INDUSTRIALES
ARQ. GERARDO ALTIERI MEGALE HIDALGO
I.Q. HÉCTOR RODRIGO GUTIÉRREZ MÉNDEZ
ASESORAS UNIVERSITARIAS
M. EN E. MARIA EUSTOLIA LLANILLO FLORES
BIOL. MARIA YESENIA SANCHEZ ZEPEDA
EMPRESA: NOVOINJERTOS, S. C.
GENERACIÓN: ENERO 2012 – ABRIL 2012
AGRADECIMIENTOS
A MI FAMILIA
Por todo el amor, amistad, y apoyo que me han brindado a lo largo de mi vida, para que esta etapa que concluye fuera posible, porque a pesar de todo, confiaron siempre en mí y en lo que soy capaz de lograr.
Muchas gracias, siempre los llevaré conmigo, porque nada de esto sería posibles sin ustedes.
A LA UNIVERSIDAD TÉCNOLOGICA DE TECAMAC
Un agradecimiento a mis asesoras académicas, las profesoras Yesenia Sánchez Zepeda y Eustolia Llanillo Flores, que me dieron la oportunidad de trabajar con ellas y por estar al pendiente de que la conclusión de mi estadía profesional fuera posible.
A mis compañeros con los que conviví a lo largo de estos años.
A mis amigos Gonzálo, Ariana, Hugo, Abraham, Alejandra, Dani, Adriana y todos los que me faltaron por compartir tanto, y pasar momentos tan únicos y especiales.
A NOVOINJERTOS S.C
A la empresa por haber permitido realizar mi proyecto de estadía profesional, en especial a mis compañeros y amigos de producción Carlos G, Jesús L, Jhon H, César, por apoyarme con lo que necesité durante mi estancia.
A mis asesores industriales Héctor Gutiérrez y Gerardo Altieri, por haberme orientado en el proyecto y disipar tantas dudas, y por supuesto a Rodolfo Sosa por su apoyo para concluir mi proyecto.
A UNA PERSONA MUY ESPECIAL EN MI VIDA
Que por más difícil que fuera el camino por recorrer, y lleno de adversidades y dudas, siempre estuvo a mi lado incondicionalmente, dándome las fuerzas necesarias para lograr todo lo que he soñado.
Gracias, muchas gracias Gabriela Espejo Bustamante.
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INDICE DE CONTENIDO
RESUMEN
El objetivo y misión principal del proyecto que se realizó en Biograft – Novoinjertos S.C.
es el desarrollo del procedimiento para la obtención del “Implante derivado de tejido
óseo; bioesponja”, dentro de las “Áreas Controladas de Proceso” en la planta de
Novoinjertos S. C. en el cual fueron utilizados protocolos de validación necesarios para
demostrar un proceso sin variaciones para las buenas prácticas de manufactura, para
lograr la obtención de la matriz ósea desmineralizada en la presentación de bioesponja
de una manera estable que sea capaz de cumplir con sus funciones biológicas.
En este proceso fue necesario y utilizado tejido músculo-esquelético humano de las
epífisis y diáfisis de los siguientes huesos: tibia, fémur, húmero, hueso calcáneo, por
contener la mayor cantidad de tejido esponjoso y cortical.En el proyecto se realizaron
todas las etapas necesarias para la obtención implantes derivados de tejido óseo
desmineralizado, entre los que se obtuvó como primera instancia, el bloque de tejido en
el proceso de corte, ya después se llevó a cabo la desmineralización dentro de los
Clean Rooms, posteriormente se realizó una medición del producto desmineralizado,
para empaquetarlo y liofilizarlo. En una etapa posterior, se almacenaron los empaques
con producto en los ultracongeladores, para irradiarlos a una dosis de 17 a 31 kGy
dentro del ININ (Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares).
Así también, se trabajó en paralelo con el asesor industrial Héctor Gutiérrez Méndez
para los estudios pertinentes, como la determinación del porcentaje de calcio para
verificar el proceso de desmineralización para las concentraciones con las que se
deseó experimentar para el proceso, colaborando también en pruebas de pH,
determinación de calcio de acuerdo a la farmacopea, determinación de humedad
residual, prueba de esterilidad en medio fluido tioglicolato y caldo soya tripticaseína de
acuerdo a la farmacopea.
Finalmente se concluyó que el procedimiento empleado para la obtención del “Implante
derivado de tejido óseo; bioesponja” permite obtener el producto de acuerdo con las
especificaciones requeridas disminuyendo la utilización de insumos y reactivos
necesarios para el proceso, impactando positivamente en tiempo de elaboración del
mismo.
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ABSTRACT
The purpose and mission of the project made in Biograft - Novoinjertos SC is the
development process for the production of "bone-derived implant; bioesponja" inside
the "Controlled Process Areas " in Novoinjertos S. C. are used validation protocols
necessary to demonstrate a unchanged process for good manufacturing practices to
obtain the demineralized bone matrix in bioesponja form in a stable way to be able to
do their biological functions.
This process was necessary and used human skeletal muscle-tissue of the epiphysis
and diaphysis of the following bones: tibia, femur, humerus, calcaneus for obteinig
the greatest amount of cancellous and cortical tissue. In this project we follow all the
stages necessary for obtaining implants derivatives of demineralized bone tissue,
first it was obtain the tissue block in the cutting process, and thenthe
demineralization on the Clean Rooms, subsequently we made a measurement of
demineralized product, so we could package it and introduce it to the freeze dryer,
then the packages were stored in the freezers so we could send them to irradiation.
We worked with an industry consultant Hector Gutierrez Mendez for relevant studies,
in the samples we made a determination of the percentage of calcium to verify the
demineralization process on the concentrations wished to experience on the
process, also working in tests of pH, determination of residual moisture, test for
sterility in thioglycollate fluid medium and tripticaseína soy broth according to the
pharmacopoeia.
We concluded that the procedure used to obtain the "bone-derived implant;
bioesponja" allows obtaining the product in accordance with the specifications
required by decreasing the use of supplies and reagents required for the process,
impacting also time based.
1. INTRODUCCIÓN
En su relación entre el hombre y la biotecnología, éste ha encontrado su beneficios en
el área de la salud, entre lo que destaca regeneración de tejidos a partir de la utilización
de viejos en este caso a partir de la utilización de tejido cadavérico y así obtener un
aloinjerto; un implante trasplantado entre dos individuos de la misma especie pero
genéticamente diferentes, mediante el uso de tecnologías bien incorporadas para
realizar este proceso. Mecanismos y procesos son llevados a cabo por ciertos animales
de una forma natural, gracias a la biotecnología es posible la obtención de tejidos
gracias al desarrollo, innovación e investigación de procedimientos están logrando que
las expectativas de vida en el ser humano aumenten, haciéndolo de una manera natural
y más resistente, evitando los efectos nocivos o rechazo del paciente a tratar.
En la empresa Biograft – Novoinjertos S.C., en el área de procesamiento dentro de la
cual se realiza todo el proceso de los implantes, desde el momento en el que un
donador liberado (está libre de enfermedades) entra en las “áreas de control de
proceso” hasta el empaque del mismo, para el que se abordan con especial interés los
tejidos óseos y de acuerdo al proyecto la matriz ósea, la cual tiene propiedades
altamente competentes para ser implantado por su capacidad la proliferación y
diferenciación de células progenitoras, que a la vez permitan la osteoconducción
(capacidad del injerto para funcionar como andamiaje para la formación de hueso
nuevo) y osteogénesis (función de aportar las células necesarias como osteoblastos
para la formación de hueso nuevo a partir de los materiales estructurales del injerto).
Los huesos están compuestos por trabéculas de matriz ósea, que está formada por dos
partes principalmente, la matriz orgánica que son fibrillas de colágeno y la inorgánica
que son sales de fosfato de calcio en su forma de hidroxiapatita, lo que le brinda gran
resistencia, tracción, así como flexión. El hueso está en constante remodelación gracias
a sus células osteoprogenitoras que intervienen con la matriz ósea, empezando por los
osteoclastos que se encargan de la resorción ósea disolviendo y reabsorbiendo el
hueso, situándose en la superficie durante de este durante el proceso, los
osteoblastos, que es la célula osteoformadora que secreta tanto colágeno de tipo I
como proteínas de la matriz que tienen a su cargo la fijación de calcio. Regularmente
estos dos procesos mantienen un equilibrio en la formación y degradación del hueso,
6
sin embargo, el hueso tiende a degradarse más rápido de lo que construye nuevo,
haciendo menos densos los minerales que lo constituyen.
Dentro de Biograft - Novoinjertos S.C existe una alternativa para rellenar defectos
óseos, causados por osteoporosis, fracturas o intervenciones quirúrgicas. Por lo que se
empleará el “implante derivado de tejido óseo; bioesponja” una gama de la matriz ósea
desmineralizada que será utilizada para aplicaciones ortopédicas ó sustitutos de
injertos.
La bioesponja (con matriz ósea desmineralizada) ha sido utilizada con éxito en cirugías
ortopédicas, cráneo maxilofaciales, periodontales y diversos defectos óseos, su
capacidad osteoconductora se debe a sus proteínas de bajo peso molecular, capaces
de diferenciar las células mesenquimáticas, formación de bazos sanguíneos y
revascularizandolo. También al perder la matriz el tejido tiene las propiedades de ser
flexible y compresible al perder sus componentes inorgánicos que brindan la dureza.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Apoyar en la validación del “Proceso para la obtención de bioesponja” como implante
de hueso desmineralizado desde su inicio hasta la etapa final.
2.2. Objetivos particulares
Conocer los parámetros operativos y etapas involucradas en la obtención de
bioesponja.
Evaluar los resultados de los análisis del proceso de desmineralización.
Dejar asentados los pasos del procedimiento a seguir, la duración e insumos
necesarios para el proceso.
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3. JUSTIFICACIÓN
Dentro de la empresa Novoinjertos S.C. (Banco de tejidos el cual se especializa en el
procesamiento de tejido músculo esquelético para ser utilizado en diversos
procedimientos quirúrgicos), en uno de sus procesos de producción, se lleva a cabo la
elaboración de “Implante derivado de tejido óseo desmineralizado: Biosponja”. A través
de un proceso del cual se debe realizar mejoras y ajustes a la validación aun no
documentada y falta de conclusión. La importancia de que el proceso, no tenga
variaciones dentro del procesamiento desde la etapa inicial hasta su etapa final, es
debido a los requerimientos de las autoridades sanitarias que rigen a la empresa
Novoinjertos S.C. las cuales son COFEPRIS (Comisión Federal para la Protección
contra Riesgos Sanitarios) y AATB (American Association of TissueBanks). Por lo que
se un procedimiento establece para abordar el problema, a fin de colaborar con la
complementación de dicha validación del proceso para la obtención de “Implante
derivado de tejido óseo desmineralizado: Biosponja”, y de esta manera obtener la
licencia necesaria para la comercialización del producto.
Por lo que se realizarán inspecciones y monitoreos de los productos obtenidos y se
realizará una comparación en cuanto al tiempo de obtención y desmineralización entre
los nuevos productos y los obtenidos previamente; para de esta manera, mejorar el
proceso de elaboración, impactando en tiempos y en la reducción de costos por
elaboración.
4. PROGRAMA Y CRONOGRAMA
Desarrollo de procedimiento para la obtención de bioesponjaPeriodo enero-abril 2012.
Semana / Actividad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Definición del tema Objetivosy Justificación. Resumen eintroducción
Cronograma
Marco Teórico
Metodología
Experimentación
ResultadosAnálisis de Resultados
Conclusiones
Realizado
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5. MARCO TEÓRICO
5.1Tejido Conjuntivo
A diferencia de las células unidas del tejido epitelial, estas células de tejido conjuntivo o
conectivo se encuentran más o menos separadas por sustancias extracelulares. Estas
sustancias, que son las que determinan la función y las propiedades del tejido
conjuntivo, son producidas por fibrocitos y por células emparentadas, como las células
óseas (osteoblastos, osteocitos).
En el tejido conjuntivo con función esquelética especial, el tejido óseo, la sustancia
extracelular se calcifica.
5.2Desarrollo del tejido conjuntivo
Las diversas formas de tejido conjuntivo y también el tejido muscular se desarrolla a
partir del denominado mesénquima, que con frecuencia recibe el nombre de tejido
conjuntivo embrionario. Este tejido es un tejido embrionario indiferenciado como es el
caso del fibroblasto (Figura 1) desde el punto de vista morfológico que tiene un origen
principalmente mesodérmico pero, en una parte considerable, tambien
neuroectodérmico, es decir que proviene de la cresta neural. Está compuesto por
células dispuestas relativamente juntas y con prolongaciones abundantes que estan
incluidas en una extensa sustancia extracelular viscosa con mucho hialuronano y pocas
fibrillas colágenadas delgadas. La acumulacion de células mesenquimáticas reciben el
nombre de blastemas que a su vez desarrollan órganos o partes de ellos.1
1UlrichWelsch, Johannes Sabotta, “Histologia”, Editorial Medica Panamericana, 2° Edicion, 2008
Figura 1. Tipos de células. Las flechas indican la dirección evolutiva probable dentro de esta clasificación. REFERENCIAS
5.3Tejido Óseo
Es un tejido conjuntivo especializado en la función esquelética y de sostén cuyas
propiedades especiales se deben a la composición de su matriz, en la cual se depositan
sales de calcio “calcificación”.
El tejido óseo es una parte fundamental del aparato locomotor. El tejido óseo también
posee una función metabólica central, a saber, el almacenaje de calcio. El calcio es un
ion esencial en muchas funciones del organismo como la contracción muscular,
secreción y coagulación de la sangre, entre otras. Además en el hueso se almacenan
magnesio, fósforo, sodio y otros iones.
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5.4Hueso
El hueso posee una gran resistencia a la tracción y a la compresión, cierta elasticidad y
una arquitectura ligera eficaz. Es un material dinámico que sufre un recambio notable
de sustancias, está muy bien irrigado y se moldea en forma continua. Las lesiones se
curan con facilidad (con el tratamiento correcto).
La composición y la estructura de los huesos están sujetas a influencias hormonales,
metabólicas y nutricionales múltiples. En principio, el hueso es un material compuesto
por dos fases: una mineral dura y una fase de matriz orgánica en relación estrecha con
la primera y compuesta en su mayor parte por colágeno de tipo I, este material es ideal
para soportar cargas mecánicas.
5.5Funciones del hueso
Soporte: Forma la estructura de nuestro cuerpo y presentan inserción en los
músculos para generar movimientos gracias a las articulaciones.
Protección: Protegen órganos internos como el corazón y pulmones.
Homeostasis mineral: Almacena minerales, liberándolos a la sangre
cuando sus niveles son bajos.
Hematopoyesis: es la formación de células sanguíneas. Se produce en el
interior del hueso, en la denominada médula ósea.
Almacenamiento energético: la médula ósea amarilla está compuesta
fundamentalmente por células adiposas, que pueden llegar a utilizarse como
reserva energética.2
5.6Hueso largo:
2LlusaPerez, Manual y atlas fotográfico de anatomía del aparato locomotor, Editorial Medica panamericana, 1° edición, 2004
Es aquel en que una de las tres dimensiones predomina sobre las otras dos. En
los huesos largos se pueden distinguir varias partes, comunes también para los
otros tipos de hueso (excepto la diáfisis, epífisis y metáfisis) como se observa en
la Figura 2:
5.6.1 Diáfisis: Es el cuerpo o parte central, normalmente triangular al corte.
5.6.2 Epífisis: Son las extremidades del hueso largo, sin solución de continuidad.
Generalmente se describe una epífisis proximal y otra distal, que suelen tener
una parte de cartílago hialino.
Figura 2- Corte longitudinal de un hueso largo (fémur) y sus partes.3
5.7Huesos planos
3 Alfredo Liard & Michel Latarjet, “Anatomía Humana”, Editorial Médica Panamericana, 4ta Edición, 2004, Buenos Aires
Metáfisis
Hueso compacto
Periostio
Diáfisis
Hueso esponjoso
Cavidad medular
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Son aquellos donde dos de las dimensiones predominan sobre la tercera. Acostumbran
a estar formados por dos caras, una cóncava y otra convexa. Suelen estar cubiertos por
una capa de sustancia cortical más densa en los bordes, separadas por sustancia
esponjosa que encontramos en el interior. Entre los huesos planos destacan la esc
´zpula, esternón, entre otros huesos del cráneo2 como se observa en la Figura 3.
Figura 3 – Corte de un hueso plano del cráneo.3
5.8Huesos cortos
Son aquellos donde no predomina ninguna dimensión sobre otras (Figura 4). Están
recubiertos por una capa fina de sustancia cortical y contiene en el interior tejido
esponjoso.2
Figura 4 – Corte de un hueso corto (astrágalo).3
5.9Periostio
Es una membrana fibro elástica que rodea la superficie exterior de los huesos, con
exclusión de las partes revestidas por cartílago articular y donde se insertan tendones y
ligamentos. Está ricamente vascularizado e inervado, se adhiere de forma variable de al
hueso que reviste, se lo libera más fácilmente la diáfisis que de las crestas e
irregularidades. Participa en forma activa en el crecimiento del hueso.
5.10 Endostio
Es la capa que recubre la cavidad medular y se caracteriza por contener células
ósteoprogenitoras.
5.11 Matriz ósea
Las características y las propiedades específicas de un hueso se deben a la matriz
ósea. Dado que está calcificada, le imparte al hueso gran resistencia a la compresión, y
a la tracción. La composición especial de la matriz, consiste en fibrillas colágenas y
sales inorgánicas en esencia fosfato de calcio en la forma de hidroxiapatita
[Ca10(PO4)6(OH)2], también permite un esfuerzo de torsión y de flexión pronunciado. La
matriz también cumple funciones metabólicas.
5.11.1 Componentes orgánicos: el colágeno representa alrededor del 90% del
material orgánico del hueso pertenece al tipo I.
Otras proteínas del hueso son la ósteocalcina, la ósteopontina
(fosfoproteína), la osteonéctina (semejante a la fibronectina), la
sialoproteinaosea, trombospondina, etc. La síntesis de proteínas en los
osteoblastos es estimulada por muchos factores de crecimiento, por
somatomedinas y en parte por la vitamina D3. La función de estas proteínas
se conoce parcialmente, jugando un papel de mineralización, mientras otras
regulan la diferenciación de osteoclastos.
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5.11.2 Componentes inorgánicos: el material inorgánico consiste en una forma
cristalina de depósito de fosfato de calcio; hidroxiapatita. Los cristales aciculares
de apatita miden unos 40nm de largo y 1.5-3 nm de ancho.1
5.12 Mineralización ósea
Es el depósito de sales de calcio y fósforo en el frente de la matriz orgánica. Para que
progrese normalmente, se requiere concentraciones plasmáticas de calcio y fósforo en
el líquido extracelular óseo sean adecuadas. El calcitriol interviene probablemente en la
mineralización influyendo en el osteoblasto y , sobre todo, en la homeostasis cálcica. Se
cree que el inicio de la mineralización puede transcurrir de dos modos: en el cartílago y
en el hueso primitivo comenzaría en las vesículas matriciales, estructuras derivadas de
los osteoblastos y los condrocitos en cuyo interior aparecerían esferulitas de
hidroxiapatita, y en el hueso laminar se formarían fosfoproteínas derivadas de la
interacción fosfatos- fibras colágenas determinantes del comienzo de la fase mineral.
Durante el proceso de mineralización, la fosfatasa alcalina hidroliza los ésteres
fosfóricos de la glucosa y libera ácido fosfórico, causante de la precipitación de fosfato
de calcio.4
5.13 Vascularización ósea
Como órgano el hueso recibe un 5- 10% del gasto cardiaco. Los huesos largos reciben
sangre a través de tres orígenes (sistemas): uno de ellos es la arteria nutricia; la
segunda el platillo metafiso-epifisiario, y el tercero el periostio. Las estructuras con
vascularización más débil son escafoides, el calcáneo, la cabeza femoral y la apófisis
odontoides.
5.13.1 Sistema de arterias nutricias. Estas ramas proceden de arterias sistemáticas
mayores, penetran en la cortical diafisiaria (tablas externa e interna) a través de
agujeros de nutrición y a continuación penetran en el canal medular,
ramificándose en arterias menores ascendentes y descendentes. Este sistema
es de alta presión.
5.13.2 Sistema metafisiario-epifisiario. Procede del plexo vascular peri articular.4Manuel Hernández, “Pediatría”, Ediciones Diaz de Santos S.A, 2da Edición, Madrid España
5.13.3 Sistema perióstico. Compuesto fundamentalmente por capilares que irrigan el
tercio externo de la cortical diafisiaria madura. Se trata de un sistema de baja
presión.5
5.14 Lagunas u ósteoplastos de la matriz ósea
En la matriz ósea hay espacios llamados lagunas u ósteoplastos (Figura 5), cada uno
de los cuales contiene una célula ósea u osteocito. El osteocito extiende una gran
cantidad de prolongaciones en túneles estrechos denominados canalículos. Los
canalículos atraviesan la matriz mineralizada para conectar las lagunas y permitir el
contacto entre las prolongaciones de osteocitos vecinos. De esta manera se forma una
red continua de canalículos y lagunas con células y sus prolongaciones en toda la masa
del tejido mineralizado. El tejido óseo depende de los osteocitos para mantener su
viabilidad.
Figura 5- Imagen microscópica de las lagunas u osteoplastos (L)6
5 Mark D. Miller, “Review of orthopedics” , Editorial Elsevier, 5ta Edición, Publicación española.
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5.15 Variedades del tejido óseo
5.15.1 Hueso esponjoso
Se encuentra como un sistema tridimensional de espículas (trabéculas) óseas
finas y ramificadas en el interior del hueso del esqueleto: entre las trabéculas
quedan espacios amplios para tejido hematopoyético o tejido adiposo, también
se encuentra médula ósea (Figura 6). La orientación de las trabéculas es
paralela a los grandes esfuerzos de presión (cuerpos vertebrales), de flexión
(epífisis proximal del fémur), con lo cual se combinan una gran robustez
mecánica con un uso escaso de material y un peso reducido. Se encuentra en
los huesos cortos y planos, en las metáfisis, y las epífisis de los huesos largos.1
Fig. 6 – Tejido óseo esponjoso, meseta tibial (humano) a 35 X.1
5.15.2 Hueso compacto
El hueso compacto (sustancia cortical o compacta) aparece como una masa
sólida y dura que se encuentra en la periferia de los huesos individuales del
esqueleto, por ejemplo, en la parte externa de los huesos largos de los
miembros. No cuenta con cavidades intermedias.1
5.16 Células del tejido óseo
Los tipos celulares que hay en el tejido óseo son: células ósteoprogenitoras,
osteoblastos, osteocitos y osteoclastos (Fig.7). Cada una se transforma de una forma
más inmadura en una forma más madura en relación con la actividad funcional
(crecimiento óseo). En cambio, el osteoclasto tiene su origen en la línea celular
diferente y actúa en la resorción ósea, una actividad relacionada con el remodelado de
los huesos.6
Figura 7. Representación esquemática de las células asociadas al hueso. Todas las
células excepto los osteoclastos, tienen origen en células madre mesenquimáticas.6
5.17 Células ósteoprogenitoras
Esta célula deriva de las células madre mesenquimáticas. La osteogénesis necesita
una población renovable de las células osteoprogenitoras (células precursoras de los
osteoblastos) que respondan a estímulos moleculares que las transformen en células
formadoras de tejido óseo. La proteína que desencadena la diferenciación de las
células es un factor d transcripción llamado factor fijador central alfa 1. Esta proteína
estimula la expresión de genes característicos del fenotipo del osteoblasto.
6Ross, Michael &Wojeiech Pawlina, “Histología: texto y atlas a color con biología celular y molecular”, Editorial Medica Panamericana, 5ta edición, 2008.
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La célula osteoprogenitora es una célula en reposo que puede transformarse en un
osteoblasto y secretar matriz osea.6
5.17.1 Osteoblastos
El osteoblasto es la célula osteoformadora diferenciada que secreta matriz ósea.
Similares a los fibroblastos, el osteoblastos es una célula secretora versátil que
conserva su capacidad de dividirse. Secreta tanto colágeno de tipo 1 (que localiza el
90% de la proteína ósea) como proteínas de la matriz ósea, que constituyen la matriz
no mineralizada inicial, llamada osteoide.
Las proteínas de la matriz ósea producidas por el osteoblasto incluyen proteínas
fijadoras de calcio como la osteocalcina y la osteonectina, glucoproteínas
multiadhesivas como las sialoproteinas óseas I y II entre otras.
El osteoblasto también tiene a su cargo la calcificación de la matriz. El proceso de
calcificación parece ser iniciado por el osteoblasto mediante la secreción hacia la matriz
de vesículas mediante secreción hacia la matriz de vesículas matriciales, pequeñas
vesículas entre 50 y 250 nm de diámetro.
Los osteoblastos secretores que se ven donde hay depósitos activo de matriz tienen
forma cubica o poliédrica, en contraste los osteoblastos inactivas son células aplanadas
o adelgazadas que revisten la superficie ósea. Los osteoblastos responden a estímulos
mecánicos para mediar los cambios en el crecimiento y remodelado de los huesos.6
5.17.2 Osteocitos
El osteocito es la célula madura y esta encerrado en la matriz ósea que secretó antes
como osteoblasto. Una vez que el osteoblasto queda totalmente rodeado por osteoide o
matriz ósea cambia su nombre por osteocito, y la célula ahora es responsable de
mantener la matriz ósea. Una de las funciones de las células es la mecano-
transducción, en la cual responden a fuerzas mecánicas aplicadas al hueso. Los
osteocitos pueden sintetizar matriz y resorberla, al menos en un grado limitado.
La muerte de los osteocitos por traumatismos (ej., fractura), envejecimiento celular o
apoptosis da como resultado la resorción de la matriz ósea por actividad de los
osteoclastos, seguida por la reparación del tejido óseo por actividad de los
osteoblastos.6
5.17.3 Osteoclastos
La función del osteoclasto es la resorción ósea. Son células multinucleadas grandes
que aparecen en la resorción. Están apoyados directamente sobre la superficie ósea
durante este proceso. Como consecuencia de su actividad, en el hueso situado
exactamente por debajo del osteoclasto se forma una bahía o laguna de resorción
(laguna de Howship). Los osteoclastos derivan de la fusión de células progenitoras
hematopoyéticas mononucleares bajo el efecto de citocinas múltiples.6
5.18 Injertos Derivados de Hueso Humano
Los injertos óseos, tienen una doble función; mecánica y biológica. En la interfase
injerto óseo – hospedero existe una compleja relación donde múltiples factores pueden
intervenir en la correcta incorporación del injerto; dentro de ellos destacan la zona de
implantación, vascularización del injerto, interfase hueso- hospedero, inmunogenética
entre donante huésped, técnicas de conservación de los materiales a injertar, factores
locales y sistemáticos diversos (hormonales, uso de medicamentos, calidad ósea,
enfermedades crónico degenerativas tales como cáncer o diabetes) y las propiedades
mecánicas que dependen del tamaño forma y el tipo de injerto utilizado).
Aunque el tejido óseo exhiba un gran potencial de regeneración y pueda restaurar por
completo su estructura y su función originales, los defectos óseos muchas veces no
pueden resolverse con tejido óseo. Con el objeto de facilitar o promover la curación se
han aplicado materiales para injertos orto biológicos. En general se acepta que los
mecanismos biológicos fundamentales para los injertos en huesos incluyen tres
procesos básicos: osteogénesis, osteoconducción y osteinducción.
5.18.1 Osteogénesis: La osteogénesis ocurre cuando se transplanta osteoblastos
viables y células precursoras de los osteoblastos al defecto junto con el material
del injerto y ese sitio establecen centros de formación de hueso.
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5.18.2 Osteoconducción: Ocurre cuando materiales de implante no vitales sirven
como andamiaje para que crezcan precursores de los osteoblastos en el interior
del defecto. Este proceso suele ser seguido por una resorción gradual del
material implantado. Un ejemplo de material implantado con osteoconducción
son el hueso cortical. Estos materiales para injerto, así como los derivados de
huesos o sustitutos sintéticos de hueso, poseen propiedades similares.
5.18.3 Osteoinducción: Incluye neo-formación de hueso por la diferenciación de
células indemnes del tejido conjuntivo en células formadoras de hueso
(osteoblastos) bajo la influencia de una sustancia inductora o de varias. La matriz
ósea desmineralizada es un ejemplo de estos materiales.
5.19 Requisitos para la regeneración ósea
5.19.1 Provisión de células formadoras de hueso o de células con capacidad de
diferenciarse en células formadoras de hueso.
5.19.2 Presencia de estímulos osteoconductores para iniciar la diferenciación de las
células mesenquimáticas en osteoblastos.
5.19.3 Presencia de ambiente osteoconductor que forme un andamiaje sobre el cual
pueda proliferar un tejido invasor y en el cual las células ósteoprogenitoras
estimuladas puedan diferenciarse en osteoblastos y formar hueso. 7
5.20 Bioesponja
Se describe como un implante óseo desmineralizado derivado de tejido humano , en
especifico el tejido óseo esponjoso utilizándose con éxito en muchos tipos de cirugía
cráneo maxilofacial, ortopédico, periodontal y procedimientos de reconstrucción manual
con la finalidad de rellenar defectos óseos.
Los estudios han demostrado que los cambios celulares secuenciales en respuesta a
los implantes de hueso desmineralizada incluyen quimiotaxis y adjunto de células
7JanLindhe&ThorkildKarring, “ Periodontología clínica implantologíaodontológica”, Editorial Médica Panamericana, 5ta Edición, 2009
progenitoras a la matriz; la proliferación y diferenciación de células progenitoras de
condrogénesis secuencial, mineralización de cartílago, vascularización y resorción ósea
del cartílago inducido y en la última instancia osteogénesis y medula. También han
demostrado que el polvo de hueso desmineralizado induce condrogénesis de los
fibroblastos dérmicos humanos en un sistema de esponja de hueso desmineralizado
que optimiza la interacción entre partículas de hueso desmineralizado y las células del
cultivo celular, haciendo posible la perfecta aceptación en el cuerpo.
En la empresa Novoinjertos S.C la Bioesponja es procesada en dos presentaciones:
a) Bloque de tejido óseo esponjoso desmineralizado.
b) Tira de tejido óseo cortical desmineralizado
Las siguientes tablas muestran las especificaciones necesarias para la comercialización
de bioesponja en bloque de tejido esponjoso (Tabla 1) o tira de tejido cortical (tabla 2)
en las que se considera, color, aspecto, dimensiones del bloque o tira, humedad,
porcentaje de calcio, entre otras.
Tabla 1. Especificaciones de Bloque de tejido óseo esponjoso
Parámetro Límites de especificación
Grosor 8 a 15 mm
Aspecto Esponja de color marfil a
amarillo claro (color
hueso), sólida, seca.
Rango de edad del
donador
Masculino: 16 a 60
Femenino: 16 a 60
Color de tejido óseo De acuerdo a Patrón. En
caso de ser color café se
rechaza.
Rango de Humedad
residual
6 a 20%
Rango de % de Calcio < al 12%
referencias
24
Tabla 2. Especificaciones de Tira de tejido óseo cortical
Parámetro Límites de especificación
Grosor 30-35mmX15mm
Aspecto Esponja de color marfil a
amarillo claro (color
hueso), solida, seca.
Rango de edad del
donador
Masculino: 16 a 60
Femenino: 16 a 60
Color de tejido óseo De acuerdo a Patrón. En
caso de ser color café se
rechaza.
Rango de Humedad
residual
6 a 20%
Rango de % de Calcio < al 12%
referencias
#METODOLOGÍA
El proceso de obtención de bioesponja se realizó en dónde, con la finalidad de…de
acuerdo al instructivo en su versión vigente “Instructivo de obtención de implantes de
tejido músculo-esquelético”, siguiendo también la “Hoja de ruta de bloques; bioesponja”.
Para el particular caso de los “Implantes derivados de tejido óseo; bioesponja” se
siguieron los siguientes pasos:
Alain, Quedamos que aquí iba un diagrama de flujo en donde se represente el proceso
general del proyecto y luego manejas toda la explicación que ya tienes
5.21 Obtención del tejido óseo a desmineralizar
Se ingresó al área asignada de acuerdo al “Procedimiento de vestimenta para el
ingreso Áreas Controladas y Clean Rooms” y al “Procedimiento para el ingreso
de insumos, instrumental y equipo a áreas controladas”.
Se acondicionó el cuarto limpio asignado a este proceso con los siguientes
equipos e insumos: sábanas de riñón estéril (figura 8), compresas estériles, agua
estéril, ácido clorhídrico a una concentración 6% grado USP, báscula analítica,
envase de frasco ámbar ó de polipropileno de 1 litro estéril, tanque de filtración
de 10 litros, potenciómetro, embudo, digestor (Bottleroller).
NOTA: En caso de desmineralizar una gran cantidad de tejido óseo se utilizó un
garrafón de Nalgene de 10 ó 20Lt.
26
Figura 8. Acondicionamiento del área de trabajo
Se solicitó al técnico circulante pasar bloques de tejido esponjoso, cortando la
bolsa externa para que el técnico en procesamiento tomara la siguiente bolsa,
siempre cuidando no contaminar este empaque (el último empaque se retiró
dentro de los Clean Rooms).
5.22 Desmineralización
a) Se pesaron los tejidos cortical o esponjoso, colocarlos dentro de su envase
correspondiente (un envase por donador) y se registró el peso en el formato
correspondiente de la hoja de ruta de proceso de desmineralización de tejido
cortical o esponjoso.
b) Se colocaron los tejidos dentro del frasco ámbar o el envase de polipropileno
(Figura 9).
Figura 9. Introducción del tejido en el frasco para desmineralización.
c) De acuerdo a la proporción: 30 mL de ácido clorhídrico 0.5N por cada gramo de
tejido óseo, se adicionó el ácido al envase que contiene los tejidos, éste puede
ser un frasco ámbar o un frasco de polipropileno estéril (Figura 10)
28
Figura 10. Porción de HCl utilizado.
d) Se colocó el garrafón en el digestor (Figura 11).
Figura 11. Colocación de frasco con tejidos en el digestor.
e) Se encendió el digestor a 50 rpm (Figura 12).
Figura 12. Frasco de tejidos en el digestor encendido.
f) La digestión duró 24hrs.
g) Posterior a la digestión, se sacaron los tejidos del envase y se verificó que
tuvieran una consistencia tal, que pudieran ser fácilmente comprimidos (no
debía presentar dureza en la parte media del bloque), como se observa en la
figura 14, en caso de tener dureza se realizaba una nueva digestión con ácido
fresco (se repiten los pasos1-5)
30
Figura 13. Verificación de textura y características de bioesponja
h) Luego de que se obtuvieron las características deseadas, se enjuagaron los
bloques de tejido, con abundante agua de irrigación, por un periodo de entre 5 a
10 minutos.
Figura 15. Enjuague de los tejidos con agua de irrigación.
i) Se tomó una muestra de alrededor de 0.3g de tejido y se envió al laboratorio de
control de calidad para que determinara el porciento de calcio contenido. Si el
porciento de Calcio era menor a 12% se podía continuar con el proceso, en caso
contrario, se debería realizar una digestión adicional.
j) Una vez que el calcio haya sido menor al 12% se realizaron 2 o 3 enjuagues del
tejido utilizando solución PBS (preparada en el laboratorio).
k) Se tomó una muestra de agua del enjuague realizado y se midió el pH.
l) El pH debía quedar en un rango de entre 6 y 7, en caso contrario, se debía
continuar enjuagando utilizando la solución PBS (paso 8)
m) Al mantener el pH en un rango de entre 6 y 7, se dio por terminado el proceso de
digestión.
5.23 Medición
Se realizó la medición de acuerdo al instructivo de medición en versión
vigente, empacándola en bolsas Tyvek, para la preservación de los
productos que serán posteriormente liofilizados.
5.24 Liofilización
La liofilización es un método de desecación, donde el producto es congelado en una
primera fase, en donde empieza a sublimarse el agua contenida por las condiciones de
vacío en las que se encuentra dentro de la cámara de la liofilizadora.
Este método sirve para conservar diversos materiales biológicos conservando sus
características originales como color, forma, propiedades, y textura, además de que
ayuda a preservar el producto y evitar el crecimiento de patógenos.
Para el proceso de Bioesponja fue necesario liofilizar, aunque la característica de
textura cambia debido a que la compresibilidad presentada por el producto es dada por
el agua, es necesario reconstituirla (hidratarla) antes de su uso clínico. Se utilizaron dos
ciclos de liofilización ya programados (tabla 3).
32
Tabla 3. Ciclos utilizados para Bioesponja en liofilizadora según quién???
Ciclos utilizados para Bioesponja en la lioflizadora
Ciclo Número de Ciclo
Ciclo real # 6 duración de 1080 minutos
Ciclo de prueba # 8 duración de 1085 minutos
Realizar la liofilización de acuerdo al “Instructivo de carga y descarga de tejidos de la
liofilizadora” y el “Instructivo para realizar empaque secundario”.
5.25 Irradiación
En este método se utiliza la radiación de alta energía proveniente de los rayos X, rayos
gamma, neutrones y otras fuentes de energía para la eliminación de células
cancerígenas. En este proceso se someten los productos a radiaciones ionizantes o
aceleradores de electrones, que emanan aces o fuentes radioactivas de rayos gamma,
mediante el Co- 60 (Cobalto), que es el utilizado por el ININ (Instituto Nacional de
Investigaciones Nucleares).
Se realizó irradiación a una dosis de 17 a 31 kGy, de acuerdo a “Procedimiento de
irradiación” y quedara en el Almacén de Q4 hasta que el producto haya sido liberado
6 DIAGRAMA DE FLUJO DE DESMINERALIZACION ÓSEA
Inicio del Proceso de Desmineralización
Bioesponja
Acondicionamiento del cuarto asignado para
proceso
Obtener y pesar del tejido derivado de humano.
Colocar el tejido en un frasco ámbar o de
polipropileno de 1 L.
Agregar Acido Clorhídrico de acuerdo a la porción que le
corresponda; 30 ml por gramo de tejido.
Colocar el frasco ámbar o envase de polipropileno con
el tejido y el acido clorhídrico en el digestor y
encenderlo a 50 rpm.
Dejar el tejido en el digestor durante 24 horas.
Extraer los tejidos y verificar que tengan las
características requeridas por el producto.
¿Cumple con las Características
deseadas?NO
SI
Enjuagar con agua de irrigación el tejido
durante 5 o 10 minutos.
Tomar una muestra aproximadamente de
0.3g de tejido y enviar a laboratorio de calidad
para % de calcio
34
¿Cumple con el % de calcio<12?
NO
SI
Realizar de 2 a 3 enjuagues con solución Buffer PBS
Final del Proceso de Desmineralización de
Bioesponja
¿pH en rango 6-
7?
Tomar una muestra de
agua del enjuague y medir pH
SI
NO
7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. Prueba #1
El día 28 de Marzo del 2011 se llevó a cabo una prueba de bloque de tejido esponjoso
en el que se usaron 3 distintas concentraciones en el ácido clorhídrico utilizado en el
proceso de Bioesponja para la desmineralización de la misma.
El donador para estas pruebas es el GV003911, para el cual se utilizaron 3 botes de 1lt para las diversas concentraciones.
Se realizó con una proporción de 30 mL X gr. de tejido.
Tabla 4. Datos de Lotes de prueba #1
No. De Bote
Concentración HCl (N)
Peso de esponjoso
(g)
HCl (mL)
Hora de inicio para
la digestión
1 0.5 N 7.31 grs. 219.3 ml. 12:45
2 0.75 N 7.31 grs. 219.3 ml. 12:47
3 1.0 N 7.2 grs. 216 ml. 12:50
Después de 2 días se detuvo el digestor a las 12:45.
36
#Prueba #2
El día 9 de Abril del 2012 se llevó a cabo una prueba con tiras de cortical para las
cuales se utilizaron nuevamente 3 concentraciones distintas de acido clorhídrico
utilizado para la desmineralización de bioesponja que son: 0.5N, 0.75N, 1.0N.
El donador utilizado fue el GV003911, para el cual se utilizaron 3 botes de Nalgene de
1lt, uno para cada una de las concentraciones de HCl.
Tabla 5. Datos de lotes de la prueba #2
No. De Bote Concentración
de HCl N.
gr. de
cortical
ml. de HCl Hora de inicio
de la primera
digestión.
Bote No.1 0.5N 6.71grs. 201.3 11:31
Bote No.2 0.75N 9.36grs. 280.8 11:33
Bote No.3 1.0N 6.73grs. 201.9 11:35
Se hicieron dos revisiones del tejido: una a las 24 horas del inicio de la primera
digestión y la otra a las 48.
#Prueba #1
Los resultados mostrados en la tabla 3 sobre las características organolépticas como el
tacto y la vista después de dos días de digestión cumplieron las especificaciones, pero
fue necesario corroborarlo con análisis de porcentaje de calcio perdido en cada día de
desmineralización para ajustar el tiempo necesario para el proceso.
Tabla 3. Resultados de las características del tejido desmineralizado prueba #1
Bote Concentración de HCl Descripción
1 0.5 N 2 bloques de esponjoso tienen las características necesarias del producto (no presentan dureza, color claro)
2 0.75 N Los 3 bloques de esponjoso muestran las propiedades requeridas del producto, bloques totalmente flexibles
3 1.0 N Los 3 bloques presentan las propiedades requeridas además de que se distingue un color mucho más claro que el de las demás pruebas y son totalmente flexibles los bloques.
En la tabla 4 se observa una pérdida de peso similar entre cada trozo de tejido
desmineralizado.
38
Tabla 4. Resultados del peso del tejido desmineralizado prueba #1
Concentración del tejido Peso (g)del Tejido antes
de la digestión
Peso(g) del Tejido
después de los 2 días de
digestión
HCl a 0.5N 7.31 4.2
HCl a 0.75N 7.3 4.2
HCl a 1.0N 7.2 3.94
#Prueba #2
En la siguiente tabla se observa la perdida de peso entre cada desmineralización con
24 horas en el digestor, para hacer pruebas de porcentaje de calcio, y definir el tiempo
optimo, que el tejido debe estar en el ácido clorhídrico y si este tiene repercusiones en
el tejido si hay una sobreexposición.
Tabla 5. Resultados del peso del tejido en desmineralización prueba #2
Bote a 0.5 N Bote a 0.75 N Bote a 1.0 N
Hora y fecha de inicio
1ra digestión
11:31- 9/Abr/12 11:33- 9/Abr/12 11:35- 9/Abr/12
Peso (g) cortical antes
1ra digestión
6.71 9.36 6.73
Hora y fecha de
término 1ra digestión
11:30-10/Abr/12 11:31-10/Abr/12 11:32-10/Abr/12
Peso (g) cortical
después 1ra digestión
4.12 5.74 3.99
Hora y fecha de inicio 11:47-10/Abr/12 11:49-10/Abr/12 11:51-10/Abr/12
2da digestión
Peso (g) cortical antes
de iniciar la
2dadigestión
3.43* 5.22* 3.35*
Hora y fecha de
término de la 2da
digestión
11:25-11/Abr/12 11:26-11/Abr/12 11:28-11/Abr/12
Peso (g) después de la
2 da digestión
3.12 4.84 3.21
Hora y fecha de inicio
3ra digestión
11:29-11/Abr/12 11:31-11/Abr/12 11:33-11/Abr/12
Peso
(g) cortical antes 3ra
digestión
1.57* 2.80* 1.16*
Hora y fecha de
término 3ra digestión
11:20-13/Abr/12 11:21-13/Abr/12 11:23-13/Abr/12
Peso (g) cortical
después 3ra digestión
1.48* 2.71* 1.07*
* = Se tomó un trozo de la muestra para determinar el % de calcio
Para las pruebas de la tercera digestión que duró 48 horas más, la cual fue considerada
como una prueba destructiva para saber si la exposición prolongada al HCl afectaba la
calidad del implante mediante la prueba de % de calcio.
Los resultados del análisis de calcio son mostrados en los gráficos 1, 2 y 3.
40
En la tabla 6 se presenta el porcentaje de peso perdido por cada digestión realizada
observando asi que la mayor parte del peso perdido se da en el primer dia de digestión,
y va disminuyendo cada vez menos en las dos siguientes digestiones.
Tabla 6. Porcentaje de peso perdido entre cada digestión.
En la gráfica 1, se muestra el porcentaje de calcio dentro en cada muestra de tejido
cortical a una concentración 0.5N, en el primer día aun hay demasiado calcio en la
muestra, haciendo que la desmineralización requiera otra digestión, en los análisis
muestra un porcentaje optimo de calcio para las especificaciones del implante con
11.67% del mismo.
Pruebas a 0.5 N
Peso al iniciar primera digestión (g)
Peso al terminar primera digestión (g)
% Peso Perdido
6,71 4,12 38,60
Peso al iniciar segunda digestión (g)
Peso al terminar segunda digestión (g)
% Peso Perdido
3,43* 3,12 9,04
Peso al iniciar tercera digestión (g)
Peso al terminar tercera digestión (g)
% Peso Perdido
1.57* 1.48 5.73
Gráfica 1. Porcentaje de calcio perdido entre cada digestión con HCl a 0.5 N
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 1000
5
10
15
20
25
30% CALCIO CON HCL A 0.5 N
% d
e Ca
lcio
Prue
ba #
2 a
0.5N
Tiempo(horas)
La tabla 7, muestra el porcentaje de peso en las muestras con una concentración a
0.75N con la mayor pérdida de peso en el primer día de digestión para desmineralizar el
tejido, los siguientes 2 digestiones muestra una reducida cantidad pérdida.
Tabla 7. Porcentaje de peso perdido entre cada digestión con HCl a 0.75 N
Pruebas a 0.75 N
Peso al iniciar primera digestión (g)
Peso al terminar primera digestión (g)
% Peso Perdido
9.36 5.74 38.68
Peso al iniciar segunda digestión (g)
Peso al terminar segunda digestión (g)
% Peso Perdido
5.22* 4.84 7.28*
Peso al iniciar tercera digestión (g)
Peso al terminar tercera digestión (g)
% Peso Perdido
2.80* 2.71 3.21
42
En la gráfica 2, se muestra la disminución del calcio en el tejido durante cada digestión
con HCl, después de las 24 horas el tejido contaba con gran cantidad de este mineral,
la segunda digestión elimina una cantidad considerable de calcio, la tercera digestión
elimina una menor parte de calcio.
Nótese que el porcentaje de calcio en el segundo día no es el indicado para la
comercialización del producto haciendo más duradero el proceso, haciéndolo poco apto
para la elaboración del implante.
Grafica 2. Porcentaje de calcio perdido entre cada digestión con HCl a 0.75 N
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 1000
5
10
15
20
25
30
35
% de Calcio con HCl a 0.75 N
Tiempo (horas)
% d
e Ca
lcio
Prue
ba #
2 a
0.75
N
En la tabla 8, se presenta la digestión con ácido clorhídrico a una concentración de 1.0
N, al igual a las dos anteriores muestra el porcentaje de peso perdido entre cada
digestión realizada, aunque se puede apreciar que la pérdida de peso no es constante,
si no que aumenta y disminuye. La similitud presentada entre esta concentración y las
dos anteriores es únicamente en la pérdida de peso en el primer día de digestión es el
más alto.
Tabla 8. Porcentaje de peso perdido entre cada digestión con HCl a 1.0 N
Pruebas a 1.0 N
Peso al iniciar primera digestión (g)
Peso al terminar primera digestión (g)
% Peso Perdido
6,73 3,99 40,71
Peso al iniciar segunda digestión
Peso al terminar segunda digestión (g)
% Peso Perdido
3,35* 3,21 4,18*
Peso al iniciar tercera digestión (g)
Peso al terminar tercera digestión (g)
% Peso Perdido
1.16* 1.07 7.76
En la gráfica 3, se muestran los resultados de la determinación del porcentaje de calcio
en el tejido óseo, siendo así, un 22.65% después de un día de digestión, y un 12.93%
en la segunda digestión, lo que indica que debe seguir en el proceso de
desmineralización, tomando más tiempo y gasto de ácido clorhídrico para llevar a cabo
el proceso.
Gráfica 3. Porcentaje de calcio perdido entre cada digestión con HCl a 1.0 N
44
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 1000
5
10
15
20
25
% de Calcio a 1.0 N
Tiempo (horas)
% d
e Ca
lcio
Pru
eba
#2 a
1.0
N
De cada una de las desmineralizaciones realizadas a concentraciones a 0.5 N (figura
17 y 18), 0.75 N (figura 19 y 20) y 1.0 N (figura 21 y 22) se tomaron fotografías que
muestran las características fisiológicas del implante derivado de tejido humano
después de la desmineralización.
Todas las muestras de tejido óseo presentan características físicas correctas, aunque
no el porcentaje de calcio, y no presentan deterioro después de la prueba destructiva.
Cortical con HCl a concentración 0.5 N
Figura 17. Tira de tejido óseo cortical, flexible por su desmineralización
Figura 18. Tira de tejido óseo cortical, flexible por su desmineralización
Cortical con HCl a concentración 0.75 N
46
Figura 19. Tira de tejido óseo cortical, flexible por su desmineralización
Figura 20. Tira de tejido óseo cortical, flexible por su desmineralización
Cortical con HCl a 1.0 N
Figura 21. Tira de tejido óseo cortical, flexible por su desmineralización
Figura 22. Tira de tejido óseo cortical, flexible por su desmineralización
La fórmula utilizada para la determinación del porcentaje de calcio fue la siguiente:
48
% decalcio=( |.|mtra .Pesomtra . )(Peso std .|.|std . )∗100
Fórmula #1
Se observa que en las muestras que se encontraban a una concentración de HCl a 0.5
N se pierde el 38.6% del peso del tejido en la primera desmineralización lo que es un
avance satisfactorio para este proceso, para la segunda desmineralización se perdió
9.04% del peso del tejido, lo cual para el segundo día del proceso es excelente
porcentaje y en la prueba que se tomó para la determinación de % de calcio obtuvo
para la primera digestión fue de: 31.32 % un porcentaje promedio para el primer día. En
la muestra del segundo día de desmineralización el % de calcio alcanzó las
especificaciones necesarias con el 11.67% de calcio.
Con la prueba destructiva (96 horas) se observó que no había degeneración del tejido,
a pesar de la sobre exposición al HCl y el porcentaje de calcio no disminuye
considerablemente como para prolongar las digestiones.
En las muestras sometidas a una concentración de HCl a 0.75 N se observa una
pérdida de 38.2% muy similar al peso perdido en la primera digestión con HCl a 0.5 N,
mientras que para la segunda perdió el 7.28% un porcentaje aceptable para el proceso.
De la prueba que se tomó para la determinación de % de calcio registro: para la primera
digestión de 24 horas un 31.32% de calcio, en la segunda digestión se registró un
porcentaje del 12.07 que a pesar de estar muy próximo a las especificaciones, no
puede comercializarse.
En la prueba destructiva alcanza el porcentaje de calcio 8.68% permitido pero, debido
al aumento en tiempo no es viable para el procedimiento a seguir.
En las muestras que se encontraban a una concentración de HCl a 1.0 N se registró en
la primera desmineralización una pérdida del 40.71% del peso del tejido, en la segunda
desmineralización del tejido perdió el 4.18% menos que en las pruebas a una
concentración menor de HCl. El porcentaje de calcio de las muestras obtenidas
mostraron: para la primera digestión 22.56 % de calcio, en la segunda digestión la
muestra presentó el 12.93% que tampoco cumple el porcentaje de las especificaciones
del producto a pesar de encontrarse a una concentración mayor.
Para la prueba destructiva después de 96 horas de digestión llego al 9.55, pero al igual
que la prueba con HCl a 0.75 N requiere más tiempo y no es viable.
8 CONCLUSIONES
50
Al evaluar las concentraciones de ácido clorhídrico a 0.5, 0.75 y 1.0 N, en la etapa del
proceso de desmineralización del bloque del tejido óseo cortical o esponjoso; la
concentración de 0.5 N fue la más conveniente, ya que presenta un comportamiento
constante en cuanto pérdida de peso y porcentaje de calcio, con lo que para llegar a
esta concentración de HCl, se utiliza una cantidad menor de este insumo, insumo
responsable de la pérdida de matriz ósea, presentando a la par el tiempo necesario que
debe ser sometido el tejido a digestión que permitió para alcanzar las características
necesarias, cumpliendo los estándares de calidad y garantizar la funcionalidad del
implante, en el que no solo se asegura la calidad del producto, sino que también la
reducción en costos de manufactura, debido a merma en equipo técnico como: guantes,
escafandras, batas esterilizadas, casco de ventilación etc. utilizado para hacer
inspecciones visuales constantes del proceso.
Y qué hay con los demás objetivos y/o resultados, ya no hay nada más que concluir!!!!
9. BIBLIOGRAFÍA
1. Ulrich Welsch, Johannes Sabotta, “Histología”, Editorial Medica Panamericana, 2°
Edición, 2008
2. Llusa Perez, “Manual y atlas fotográfico de anatomía del aparato locomotor”, Editorial
Medica panamericana, 1ra edición, 2004
3. Alfredo Liard & Michel Latarjet, “Anatomía Humana”, Editorial Médica panamericana,
4ta Edición, 2004, Buenos Aires
4. Manuel Hernández, “Pediatría”, Ediciones Díaz de Santos S.A, 2da Edición, Madrid
España
5. Mark D. Miller, “Review of orthopaedics” , Editorial Elsevier, 5ta Edición, Publicación
española
6. Ross, Michael & Wojeiech Pawlina, “Histología: texto y atlas a color con biología
celular y molecular”, Editorial Medica Panamericana, 5ta edición, 2008.
7. Jan Lindhe & Thorkild Karring, “Periodontología clínica e implantología
odontológica”,
Editorial Médica Panamericana, 5ta Edición, 2009
10.ANEXOS
52
8.1Anexo A. Bitácora de procedimiento
Realizó: Alain Eduardo Tapia Ortiz, Héctor Rodrigo Gutiérrez Méndez
Se realizó una prueba en la elaboración de bioesponja, en la cual se utilizó el donador
con ID. GV023811 que contenía dos bloques de esponjoso obtenido con anterioridad
del procesamiento primario del donador con un peso de 9.32 gr. Para la
desmineralización de los bloques se utilizaron 280 ml para la porción en gramos
procesada y fueron colocados en un frasco ámbar de 1lt y posteriormente colocado en
el digestor.
Fecha: 13 / Febrero / 2012
Hora de inicio: 12:15pm
Hora de término: 12:30pm
Fecha: 14 / Febrero / 2012
Hora de revisión de tejido: 12:20pm
Hora de ingreso a la 2da digestión: 12:40pm
Los bloques fueron vaciados a un tazón para proceder a enjuagar con agua estéril 2
veces.
Al observar las características deseadas se percató que la parte media del bloque aun
presenta dureza, por lo que se continua a verter nuevamente frasco ámbar de 1lt los
bloques de esponjoso, para llevar a cabo una nueva digestión durante 24 hrs más.
Fecha: 15 / Febrero / 2012
Hora de revisión de tejido: 12:30
Se realizó nuevamente el lavado del tejido con agua de irrigación para comprimir los
bloques de esponjoso y evaluar las características necesarias del producto, y esta vez
se obtuvo el resultado deseado, así que se agrego solución buffer a los bloques para
amortiguar el pH. Se enjuagó por segunda con agua de irrigación y el agua obtenida de
este enjuague entre 50 y 100ml se toma para medirlo en el potenciómetro.
Se calibró el potenciómetro para medir el pH.
El pH obtenido fue de 7.4, por lo tanto se empaqueto para su etapa de proceso
siguiente la liofilización.