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Universidad de Zaragoza Centro Politécnico Superior

Proyecto Fin de Carrera

Ingeniero Químico

BIOSÍNTESIS DE LA COCAÍNA: ESTUDIO DE LA FORMACIÓN DE UN

PAR COCAÍNA-ÁCIDO CLOROGÉNICO EN ERYTHROXYLUM COCA

Autor: JOSÉ CARLOS PARDO TORRE

Zaragoza, Junio 2011

Ponente: PROF. JOAQUÍN CORONAS CERESUELA Director: DR. JOHN D’AURIA

Instituto Max Planck para la

Ecología Química.

Departamento de Bioquímica

Departamento de Ingeniería

Química y Tecnología del

Medio Ambiente

A todos los que me han

ayudado a llegar hasta aquí,

en especial, a mis abuelas,

Marina y Maribel.

BIOSÍNTESIS DE LA COCAÍNA: ESTUDIO DE LA FORMACIÓN DE UN

PAR COCAÍNA-ÁCIDO CLOROGÉNICO EN ERYTHROXYLUM COCA

RESUMEN:

Las plantas de la especie Erythroxylum coca producen cantidades de cocaína en torno al 1% en

peso (seco). La importancia socioeconómica que ésta ha tenido a lo largo de la historia del ser

humano y la posibilidad de uso en aplicaciones medicinales hacen de su biosíntesis un tema de gran

interés para la investigación. Además, su carácter tóxico hacia otros seres vivos y su abundancia en

la planta convierten su almacenamiento en objeto de estudio.

Este PFC, llevado a cabo en el grupo de investigación “Biochemistry and evolution of tropane

alkaloid biosynthesis” en el Instituto Max Planck para la Ecología Química (Jena, Alemania), estudia

la forma de almacenamiento de la cocaína en plantas de la especie Erythroxylum coca, partiendo de

la hipótesis de que existe una interacción con el ácido clorogénico que forma la base de este

almacenamiento. Para ello se siguieron tres principales líneas de trabajo.

La primera fue expresar el gen que codifica la enzima –aciltransferasa– responsable de la síntesis

del ácido clorogénico en diferentes sistemas –bacteria y dos tipos de levadura– para después realizar

su caracterización bioquímica. Para ello se utilizaron técnicas de clonación y recombinación de ADN,

cultivo de células y purificación de proteína por cromatografía de afinidad.

La segunda, estudiar la interacción entre el ácido clorogénico y la cocaína, llevando a cabo

medidas de espectrofotometría UV-Visible y de resonancia magnética nuclear.

La tercera, conocer más sobre el lugar de almacenamiento de la cocaína: partes de la planta, fase

de desarrollo de las hojas, capa de tejido celular, etc. para lo cual se utilizaron técnicas histológicas y

de extracción y análisis por cromatografía líquida.

En conjunto, los resultados han permitido conocer más sobre la forma de almacenamiento de la

cocaína, que parece concentrarse en las capas intermedias de las hojas adultas. Igualmente, el

estudio de la interacción con el ácido clorogénico ha permitido determinar la fuerza de la misma en

forma de su constante de equilibrio, y se ha podido conocer que esta interacción se centra en la

parte aromática de ambas moléculas. Además, se caracterizó la enzima EcHQT que cataliza la

formación de ácido clorogénico, obteniendo resultados similares a los de otras enzimas HQT.

Índice de contenidos

i


Agradecimientos ............................................................................................................. iv

Abreviaturas .................................................................................................................... v

1. Introducción ................................................................................................................. 1

1.1 Contexto del PFC ........................................................................................................................... 1

1.2 Cocaína: una clase de metabolito secundario en plantas ............................................................. 1

1.3 Almacenamiento de cocaína. Ácidos hidroxicinamilquínicos ....................................................... 3

1.4 Motivación e interés del PFC ........................................................................................................ 6

1.5 Estructura del PFC ......................................................................................................................... 7

2. Hipótesis y objetivos ..................................................................................................... 8

3. Procedimiento Experimental ......................................................................................... 9

3.1 Extractos de Erythroxylum coca: el punto de partida ................................................................... 9

3.2 EcBAHD aciltransferasas: ¿Qué enzima cataliza la síntesis de ácido clorogénico (ACG)? ............ 9

3.3 Optimización de la producción de proteína: clonación, expresión, purificación ....................... 10

3.4 Caracterización bioquímica de EcBAHD4 .................................................................................... 11

3.5 Estudio de la interacción ACG-cocaína en disolución ................................................................. 12

3.5.1 ¿Interaccionan la cocaína y el ácido clorogénico formando un par? ................................... 12

3.5.2 Caracterización del par ACG-cocaína por espectrofotometría UV-Visible ........................... 12

3.5.3 Caracterización del par ACG-Cocaína por RMN ................................................................... 13

3.6 Estudio de la interacción ACG-cocaína en plantas de la especie E.coca ..................................... 13

3.7 Inmunohistoquímica: localización de la cocaína dentro de la hoja ............................................ 13

4. Resultados y discusión ................................................................................................ 15

4.1 Altos niveles de cocaína, cinamilcocaína y ACGs en Erythroxylum coca .................................... 15

4.2 EcBAHD4 es la única enzima EcHQT ........................................................................................... 15

4.3 Pichia pastoris como sistema de expresión de EcHQT ............................................................... 16

4.4 Caracterización bioquímica de EcHQT ........................................................................................ 18

4.5 El ACG y la cocaína sí interaccionan ............................................................................................ 23

4.5.1 Espectrofotometría UV-Vis: la interacción ACG-cocaína es real y cuantificable .................. 23

4.5.2 Resonancia Nuclear Magnética: la interacción ACG-cocaína se centra en la parte

aromática ...................................................................................................................................... 25

4.6 ¿Dónde se almacena la cocaína? ................................................................................................ 27


ii

5. Conclusiones .............................................................................................................. 29

5.1 Compleción de los objetivos ....................................................................................................... 29

5.2 Posibilidad de continuación ........................................................................................................ 29

5.3 Incidencias y valoración personal ............................................................................................... 30

Bibliografía ..................................................................................................................... 31

Anexo I: En detalle .......................................................................................................... 35

I.1 Estructuras dentro de la planta ................................................................................................... 35

I.2 Ruta de la lignina .......................................................................................................................... 36

I.3 Tecnología de recombinación y clonación de ADN y purificación de proteínas .......................... 38

Anexo II: Protocolos ....................................................................................................... 41

II.1 Materiales, disoluciones y medios .............................................................................................. 41

II.2 Métodos ...................................................................................................................................... 42

II.2.1 Extracción del contenido de hojas de E.coca........................................................................ 42

II.2.2 Reacción de recombinación LR ............................................................................................. 42

II.2.3 Transformación en E.coli ...................................................................................................... 42

II.2.4 PCR de colonias .................................................................................................................... 43

II.2.5 Electroforesis de gel de agarosa .......................................................................................... 43

II.2.6 Cultivo de E.coli y extracción del vector ADN ....................................................................... 43

II.2.7 Secuenciación y análisis de ADN y proteína ......................................................................... 43

II.2.8 Expresión de proteína en E.coli ............................................................................................ 44

II.2.9 Lisis y colección de proteína en E.coli ................................................................................... 44

II.2.10 Transformación en Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris ........................................ 44

II.2.11 Expresión de proteína en S.cerevisiae ................................................................................ 44

II.2.12 Expresión de proteína en Pichia pastoris ........................................................................... 45

II.2.13 Lisis y colección de proteína en Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris ..................... 45

II.2.14 Purificación de proteína por cromatografía de afinidad (FPLC)......................................... 45

II.2.15 Electroforesis de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) .............. 46

II.2.16 Ensayo enzimático de actividad HQT ................................................................................. 46

II.2.17 Ensayo Bradford de proteínas ............................................................................................ 46

II.2.18 Reconcentración y desalinización de proteínas ................................................................. 47

II.2.19 Análisis de muestras mediante LC-MS-IT y HPLC-UV ......................................................... 47

II.2.20 Análisis de muestras mediante LC-MS-TripleQuad ............................................................ 48

II.2.21 Detección y análisis del par ACG-cocaína por espectrofotometría UV-Visible................... 48

II.2.22 Análisis del par ACG-cocaína por RMN (Resonancia Nuclear Magnética) ......................... 48

II.2.23 Lavado de cocaína de discos de E.coca .............................................................................. 49

II.2.24 Inmunohistoquímica (preparación del tejido) .................................................................... 49

II.2.25 Inmunohistoquímica (procedimiento) ................................................................................ 49

II.3 Secuencias de ADN ...................................................................................................................... 50


iii

Vectores ........................................................................................................................................ 50

Primers .......................................................................................................................................... 50

II.4 Desarrollos de ecuaciones .......................................................................................................... 51

II.4.1 Modelo de Michaelis-Menten .............................................................................................. 51

II.4.2 Derivación de la ley de Beer-Lambert aplicada al complejo ACG-cocaína ........................... 52

Anexo III: Resultados complementarios .......................................................................... 53

Anexo IV: Glosario .......................................................................................................... 61

Agradecimientos

iv

Agradecimientos

Agradezco a mi familia y a Beatriz Seoane el apoyo constante durante todos estos años. A mis

padres, por la educación impagable que me han dado; a mis hermanos, porque ser el tercero

siempre es más fácil. Agradezco en especial la inestimable ayuda de mis abuelas, Marina y Maribel,

en todos y cada uno de los exámenes a los que me he enfrentado durante la carrera.

Agradezco de corazón a mis amigos el poder contar con ellos en todo momento –consciente de la

paciencia que a menudo requiere mi carácter–, especialmente en los dos últimos años fuera de

España. Agradezco a Cristina Díaz que me pellizcara al principio de la carrera y me ayudara a ser

mejor persona.

Agradezco al Prof. Joaquín Coronas la minuciosa atención prestada y el apoyo durante todo el

PFC.

Agradezco a la gente de Max Planck Institute for Chemical Ecology la oportunidad de realizar el

PFC en dicho instituto. Al Prof. Jonathan Gershenzon, por su rápida y satisfactoria respuesta a mi

solicitud y por la financiación del proyecto; a mi supervisor, Dr. John D’Auria, por permitirme

trabajar en su grupo de investigación y por lo aprendido, en especial en el análisis crítico de

resultados; a mi compañero, Jan Jirschitzka, por su inagotable paciencia al enseñarme durante

meses a trabajar en un laboratorio biotecnológico; al Dr. Christian Paetz y al Dr. Michael Reichelt,

por su tiempo y ayuda en temas científicos; a Gregor Schmidt, por completar la enseñanza de mis

supervisores.

José C.

Abreviaturas

v

Abreviaturas

A Adenina

A.thaliana Arabidopsis thaliana

ADNc Ácido desoxirribonucleico complementario

ACG Ácido clorogénico, ácido cafeilquínico

ACGs Ácidos clorogénicos (conjunto de ácidos hidroxicinamilquínicos de

estructura similar al ACG)

ARNm Ácido ribonucleico mensajero

attB, attP, attL, attR (Del inglés: attachment site) Sitios de unión B, P, L, R, respectivamente

BAHD (Acrónimo a partir del nombre de cuatro enzimas: BEAT, AHCT, HCBT, DAT)

BSA (Acrónimo inglés) Albúmina de suero bovino

Bis-tris Bis-tris metano, 2-[bis(2-hidroxietil)amino]-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol

Bis-tris propano 1,3-bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano

C Citosina

CoA/CoASH Coenzima A/Coenzima A en su forma de hidrosulfuro

COSY (Acrónimo inglés) Espectroscopía de correlación –homonuclear

bidimensional–

Da Dalton

DAB 3,3’-Diaminobencidina

DO600 Densidad óptica medida a una longitud de onda de 600nm

E.coca Erythroxylum coca

E.coli Escherichia coli

EcBAHD Enzimas BAHD identificadas en E.coca

EcHQT Hidroxicinamil-CoA quinato: hidroxicinamil transferasa aislada de E.coca

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

et al. Et álii

EtOH Etanol

FPLC (Acrónimo inglés) Cromatografía Líquida Rápida de Proteínas

G Guanina

His-tag1 (Del inglés) Etiqueta de polihistidina

HQT Hidroxicinamil-CoA quinato: hidroxicinamil transferasa

HPLC-UV2 (Acrónimo inglés) Cromatografía Líquida de Alta Resolución acoplada a

detector Ultravioleta

HRP (Del inglés: horseradish peroxidase) Peroxidasa de rábano picante

(Armoracia rusticana)

IHQ Inmunohistoquímica

IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido

LC-MS-IT (Acrónimo inglés) Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de

Masas de Trampa de Iones

LC-MS-TripleQuad (Acrónimo inglés) Cromatografía Líquida de Alta Resolución acoplada a

Espectrometría de Masas de Triple Cuadrupolo

1 El his-tag usado en este PFC en particular consiste en 9 histidinas.

2 Todas las cromatografías líquidas llevadas a cabo en este PFC fueron en fase reversa.

Abreviaturas

vi

MeOH Metanol

MPI-CÖ Max Planck Institute für chemische Ökologie

NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

N.alata Nicotiana alata

N.tabacum Nicotiana tabacum

ORF (Acrónimo ingles) Marco Abierto de Lectura

pb Par de bases

PBS (Acrónimo inglés) Tampón de fosfato salino

PBT (Acrónimo inglés) Tampón de fosfato salino con Tween 20

PCR (Acrónimo ingles) Reacción en Cadena de la Polimerasa

P.pastoris Pichia pastoris

PFC Proyecto Fin de Carrera

PMMA Polimetilmetacrilato

RMN Resonancia Magnética Nuclear

S.cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

S.lycopersicum Solanum lycopersicum

SCPL (Acrónimo ingles) Familia de enzimas del tipo serina-carboxipeptidasa

SC-U Medio mínimo para Saccharomyces cerevisiae sin uracilo

SDS-PAGE (Acrónimo inglés) Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato

de sodio

SOC (Acrónimo inglés) Medio de cultivo de E.coli Súper Óptimo broth sin

represión por Catabolito

Strep-tag® (Del inglés) Etiqueta “Strep”, consistente en ocho aminoácidos: triptófano,

serina, histidina, prolina, glutamina, fenilalanina, ácido glutámico, lisina

T Timina

TAE Tampón compuesto de tris, ácido acético y EDTA en agua

TFA Ácido trifluoroacético

Tris/Tris-HCl Tris(hidroximetil)aminometano/Forma ácida o de hidrocloruro de tris

TMSP-d4 Ácido 3-(trimetilsilil)-2,2’3,3’-tetradeuteropropanoico

U Uracilo

YNB (Acrónimo inglés) Extracto de levadura con base de nitrógeno

YPD (Acrónimo inglés) Extracto de levadura con peptona y dextrosa

MEMORIA

1. Introducción

1

1. Introducción

1.1 Contexto del PFC

Este PFC de Ingeniería Química se llevó a cabo en el grupo de trabajo Biochemistry and Evolution

of Tropane Alkaloid Biosynthesis, en el Departamento de Bioquímica del Instituto Max Planck para la

Ecología Química (MPI-CÖ) en Jena, Alemania, bajo la supervisión del Dr. John D’Auria, y la dirección

del Prof. Jonathan Gershenzon. Este grupo de trabajo actualmente investiga las reacciones

bioquímicas involucradas en la biosíntesis de alcaloides tropánicos, en especial de cocaína, en

plantas de la especie E.coca, haciendo uso para ello de técnicas biotecnológicas como la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR), la recombinación de ADN, o la hibridación in situ, entre otros

(D'Auria y Docimo, 2011).

1.2 Cocaína: una clase de metabolito secundario en plantas

Las plantas producen una inmensa cantidad de compuestos químicos cuya clasificación histórica

distingue entre metabolitos primarios y secundarios. En 1981, A. Kössel fue el primero en clasificar

como metabolitos secundarios aquellos compuestos no esenciales para la vida de la planta (Rhodes,

1994). Si bien los metabolitos primarios son los únicos que por definición son esenciales para el

crecimiento, desarrollo y reproducción de las células, hoy en día nadie duda del importante papel

que los secundarios juegan en la supervivencia de la planta como un todo, por ejemplo, en la

comunicación entre plantas, atrayendo agentes polinizadores o como defensa contra herbívoros y

patógenos (Roberts y Wink, 1998).

Precisamente este último papel es el que más comúnmente se atribuye a los alcaloides, uno de

los grupos más importantes dentro de los metabolitos secundarios (Facchini y St-Pierre, 2005). Los

alcaloides, según una definición general propuesta por Pelletier en 1983, son “compuestos cíclicos

que contienen nitrógeno en un estado de oxidación negativo, cuya distribución es limitada en

organismos vivos”. En la actualidad, unos 12.000 de los más de 50.000 productos naturales

conocidos son alcaloides. Éstos han sido usados por el ser humano desde el principio de la

civilización como medicinas, venenos, drogas, tés, etc. (Roberts y Wink, 1998). Ejemplos de

alcaloides son la cafeína, la nicotina, la morfina, la codeína, la teobromina, relacionada con el sabor

amargo del chocolate, o la ouabaina, que incluso hoy en día es utilizada en zonas de África y

Sudamérica para fabricar dardos venenosos (Ordoñez y Ordoñez, 2006).

Dentro de los alcaloides, una importante familia es la de los alcaloides tropánicos, que se

caracterizan por el núcleo 8-azabiciclo[3.2.1] en su estructura química, más conocido como el anillo

de tropano (Figura 1). Los alcaloides tropánicos son comunes en la familia de las solanáceas, aunque

aparecen también entre las convolvuláceas y las eritroxiláceas, y menos frecuentemente en las

crucíferas, euforbiáceas, proteáceas, rizoforáceas y elaeocarpáceas (Asano et al., 2001).

Entre los alcaloides tropánicos más comunes se encuentran hiosciamina, escopolamina y cocaína.

Por sus efectos anticolinérgicos –reducen los efectos del neurotransmisor acetilcolina–,

antiinfecciosos y analgésicos, los alcaloides tropánicos se han utilizado en la historia con fines

médicos, e incluso hoy en día tienen aplicaciones médicas. Escopolamina e hiosciamina pueden ser

usadas en el tratamiento de náuseas, mareos e incluso algunas formas de Parkinson (Theodoridis et

1. Introducción

2

Figura 2: Erythroxylum coca var. coca

al., 2003). Además, la atropina, una mezcla racémica de (+) y (-) hiosciamina, se usa para dilatar las

pupilas y como anestésico en cirugía ocular (Broadman et al., 1990).

Figura 1: Algunos alcaloides tropánicos.

Hoy en día se conocen unas 230 especies dentro del género

Erythroxylum, la mayoría de ellas distribuidas en Sudamérica, pero

también en África, India y Australia. De éstas, solamente dos contienen

cocaína en cantidades alrededor del 1% (materia seca), Erythroxylum

coca y Erythroxylum novogranatense, cada una con dos variedades,

E.coca var. coca –usada en este PFC–, E.coca var. ipadu, E.

novogranatense var. novogranatense y E. novogranatense var.

truxillense (Plowman y Hensold, 2004; Bieri et al., 2006) (Figura 2). Ésta

última, bien conocida como “Coca trujillo”, aparece frecuentemente en

excavaciones en yacimientos arqueológicos en Perú que se remontan

hasta el año 1750 a.C. (Plowman, 1981). También junto a la momia de

un rey peruano en la zona Nazca, año 500 d.C., se encontraron varias

bolsas que contenían hojas de coca (Wink, 1998). Este tipo de hallazgos

indican que estas variedades de coca no han evolucionado de forma

natural sino que han sido cultivadas desde hace miles de años,

escogiendo las plantas que debían tener mayores efectos estimulantes,

lo cual explica el alto contenido en cocaína de la planta –pocas plantas

almacenan metabolitos secundarios en cantidades alrededor del 1%.

Las hojas de coca se mascan en zonas altas de Sudamérica o se

hierven en forma de té para vencer el mal de altura, para combatir el

hambre, por ejemplo, en viajes largos con alimentos limitados, o

simplemente como estimulante (Plowman, 1981). Este efecto

estimulante se debe a que la cocaína inhibe la reabsorción del

neurotransmisor dopamina en el cerebro. Puesto que los receptores de

la dopamina están involucrados en el control de las respuestas de

placer, la cocaína estimula los llamados “centros de placer” (Meltzer et

1. Introducción

3

al., 1994; Wink, 1998). En medicina, si bien hoy en día su uso es bastante limitado, la cocaína se ha

utilizado, por ejemplo, en cirugía nasal como anestésico, en cirugía ocular también como anestésico

o para dilatar la pupila, o como tratamiento de úlceras en la boca o los pulmones.

Previo a este PFC, en este grupo de trabajo se han estudiado y caracterizado las dos últimas

reacciones de la ruta de la cocaína (Figura 3). Precisamente la última reacción es interesante para

este PFC, no sólo por producir cocaína, cuya compartimentación es tema central de este trabajo,

sino también por el tipo de reacción y enzima involucrada, que comparten elementos comunes con

la reacción que da lugar al ácido p-cumarilquínico, como se explicará más adelante.

Figura 3: Dos últimas reacciones en la ruta de biosíntesis de la cocaína.

1.3 Almacenamiento de cocaína. Ácidos hidroxicinamilquínicos

Diferentes estudios llevados a cabo sobre el almacenamiento de alcaloides, en particular sobre

alcaloides purínicos, p.ej. cafeína, argumentan la interacción del alcaloide con compuestos fenólicos

dentro de la célula, en particular con el ácido clorogénico (ACG), quedando atrapados en su interior

en lugar de ser secretados, y siendo ésta la forma de acumulación del alcaloide (Mondolot et al.,

2006). Estos compuestos fenólicos serían diferentes ácidos hidroxicinamilquínicos –conocidos en la

bibliografía como ácidos clorogénicos (ACGs)– almacenados dentro de la vacuola de la célula (Figura

4). Precisamente la interacción entre ambos permitiría la acumulación del alcaloide en contra de un

gradiente de concentración entre el exterior –el citoplasma– y el interior de la vacuola3 (Waldhauser

y Baumann, 1996). Incluso, en 1987, A.W. Kappeler et ál. calcularon la constante de formación del

par cafeína:ACG, así como de otros complejos de alcaloides purínicos con ACG (Kappeler et al.,

1987). Otros autores han confirmado la presencia de este complejo e incluso caracterizado su

estructura por medio de medidas cristalográficas de rayos X y resonancia magnética nuclear (Martin

et al., 1986; D’Amelio et al., 2009).

El ácido clorogénico, al igual que otros ácidos hidroxicinamilquínicos, está relacionado con la ruta

de la lignina, entre cuyas funciones biológicas están la de conferir fuerza mecánica a las paredes

celulares y a la planta, y la de facilitar la conducción de agua a lo largo del tallo4 (Chabannes et al.,

2001).

3 Ver Anexo I.1 para ver en detalle la estructura de la célula vegetal.

4 Ver Anexo I.2 para más información sobre la ruta de la lignina y para conocer la relación del ACG con ésta.

1. Introducción

4

Figura 4: Ácido quínico y ácido cinámico junto a cuatro compuestos fenólicos (ACGs) encontrados en extractos de E.coca.

La síntesis del ácido clorogénico se ha estudiado en plantas de tabaco dando lugar a tres

posibilidades. La primera sugiere la formación a través de los dos compuestos que lo conforman,

ácido cafeico y ácido quínico, mientras que la segunda involucra al ácido cumárico y al ácido quínico,

cuyo producto es hidroxilado más tarde por una enzima hidroxilasa. En ambas posibilidades el

substrato fenólico que usa la enzima aciltransferasa debe ser activado, lo cual se consigue a través

del tioéster con la coenzima A (Figura 5). La tercera posibilidad supone la esterificación del ácido

cinámico con glucosa como forma de activación del substrato. Esta reacción está catalizada por

enzimas del tipo serina-carboxipeptidasas (SCPL) (Niggeweg et al., 2004).

Estudios llevados a cabo por el director de este PFC –Dr. John D’Auria– en E.coca permiten

descartar la tercera ruta de síntesis del ACG, pues no se han encontrado enzimas SCPL en E.coca

(resultados no publicados). Por otro lado, enzimas de la familia Citocromo P450 presentes en E.coca,

cuya reacción más conocida es la de hidroxilación, relacionarían los ácidos p-cumarilquínico y

clorogénico.

Dentro de las aciltransferasas en el reino vegetal, la familia BAHD se caracteriza por catalizar

reacciones de acilación de aminas y alcoholes para formar amidas y ésteres, y por usar substratos

activados por la coenzima A. Tienen una masa molecular de unos 48-55 kDa y una longitud de unos

445 aminoácidos. Además, casi todas las aciltransferasas caracterizadas hasta el momento dentro de

la familia BAHD comparten dos motivos comunes en su secuencia de aminoácidos: HXXXDG –

histidina, cualquiera, cualquiera, cualquiera, ácido aspártico, glicina–, y DFGWG –ácido aspártico,

fenilalanina, glicina, triptófano, glicina– (D'Auria et al., 2007).

En el caso de E.coca en el grupo de trabajo donde se llevó a cabo este PFC, una biblioteca de

ADNc fue construida a partir de ARNm. En dicha biblioteca se identificaron ocho posibles

aciltransferasas con características comunes a las de la familia BAHD, llamadas EcBAHD por venir de

la especie E.coca. Los marcos abiertos de lectura5 de las ocho EcBAHD fueron clonados en vectores

de expresión en E.coli y posteriormente expresados (Figura 6).

5 Marco abierto de lectura (ORF): Cualquier secuencia de ADN situada entre un codón de inicio y un codón de

terminación. En el texto, cada uno de los ocho ORF a los que se hace referencia es una secuencia de ADN que se espera que sea el gen que codifica una enzima aciltransferasa.

1. Introducción

5

Figura 5: Síntesis del ACG.

Entre las ocho enzimas expresadas, EcBAHD7 y EcBAHD8 mostraron actividad cocaína-sintasa

(Figura 3), y EcBAHD4 mostró actividad hidroxicinamil-CoA quinato: hidroxicinamil transferasa,

abreviada EcHQT para E.coca (Figura 5). Sin embargo, el alto porcentaje de semejanza entre las

secuencias de aminoácidos de las enzimas EcBAHD sugiere llevar a cabo un nuevo análisis para

confirmar que sólo EcBAHD4 tiene actividad HQT.

Figura 6: Expresión de proteína (EcBAHD) en E.coli a partir de ADNc.

1. Introducción

6

1.4 Motivación e interés del PFC

Para poder usar compuestos naturales vegetales en aplicaciones médicas, y para poder después

modificar plantas con fines beneficiosos para el ser humano, es importante conocer cuál es su ruta

de biosíntesis.

Precisamente en el caso de la cocaína, a pesar de la importancia social y económica que

representa, y a pesar de la influencia que E.coca ha tenido en la historia del ser humano, hasta la

fecha muy poco se sabe sobre la ruta de biosíntesis a nivel molecular, genético o enzimático.

El inconveniente del uso de muchos compuestos naturales en aplicaciones medicinales son los

efectos secundarios que presentan, por lo que a menudo la investigación trata de dar con

compuestos similares que no presenten estos inconvenientes.

Diferentes feniltropanos poseen diferentes niveles de toxicidad, diferente duración de los efectos

estimulantes, diferente poder adictivo… Así, análogos de drogas conocidas con menor efecto tóxico

se administran como parte de terapias contra la drogadicción (Figura 7) (Kimmel et al., 2001). Otro

ejemplo de aplicación proviene de la sensación de saciedad que producen muchos feniltropanos,

efecto que podría desarrollarse para producir fármacos que ayuden en tratamientos contra la

obesidad.

Figura 7: Dos compuestos análogos de la cocaína. 2β-carbofenoxi-3β-(4-clorofenil)tropano fue propuesto como posible substituto de la cocaína en terapias de drogadicción.

Precisamente el estudio y caracterización de las enzimas involucradas en la ruta de biosíntesis es

lo que en un futuro puede permitir a la ingeniería genética diseñar enzimas con características

deseadas, siendo capaces de modificar la ruta síntesis, y produciendo de forma eficiente compuestos

beneficiosos para el ser humano.

Además, el hecho de que pocas plantas produzcan metabolitos secundarios en cantidades tan

altas, convierte el almacenamiento de la cocaína en un tema de interés. Por otro lado, si bien se ha

demostrado su carácter insecticida (Nathanson et al., 1993), hasta la fecha se desconoce el papel

biológico que juega en la planta, y siendo un compuesto de tal toxicidad, no parece probable que

aparezca disuelto en el citosol –zona no confinada de la célula vegetal– sino en algún

compartimento específico.

1. Introducción

7

1.5 Estructura del PFC

Este PFC está estructurado como sigue:

En el capítulo 2 “Hipótesis y objetivos” se presentan muy brevemente las hipótesis del

autor sobre lo que se espera obtener al final del PFC basado en extenso estudio

bibliográfico así como en el trabajo previo del grupo de investigación donde se realiza el

PFC. Además, se vuelven a redactar los objetivos de la propuesta.

En el capítulo 3 “Procedimiento Experimental” se explican en orden los sucesivos

experimentos llevados a cabo. Para hacer la lectura más ligera, los protocolos enteros

(cantidades exactas, métodos detallados, materiales, equipos, proveedores…), así como

cualquier citación de tecnologías patentadas y algunas secuencias de ADN con las que se

trabaja aparecerán como anexos.

En el capítulo 4 “Resultados y discusión” se muestran los resultados de los

correspondientes experimentos descritos en el capítulo 3, siguiendo en la medida de lo

posible el orden en que están redactados en ese capítulo. En el mismo capítulo se

discuten los resultados obtenidos.

En el capítulo 5 “Conclusiones” están las conclusiones sacadas por el autor tras la

realización del PFC, valorando los resultados obtenidos. Se ofrece, además, un pequeño

resumen de las perspectivas de continuación, así como una pequeña sección con algunas

incidencias y una valoración personal del conjunto del PFC.

El anexo I “En detalle” contiene información que puede ser de interés al lector para

entender y conocer más sobre ciertos conceptos que hayan aparecido a lo largo del PFC6.

El anexo II “Protocolos” contiene los protocolos de laboratorio redactados paso por paso,

métodos, equipos, material, proveedores, secuencias de ADN y desarrollos de

ecuaciones.

El anexo III “Resultados complementarios” presenta resultados que por espacio y por

hacer la lectura más cómoda no se han incluido en el capítulo 4.

El anexo IV “Glosario” contiene un glosario de términos que se consideró preciso aclarar

por su especificidad, cuyas definiciones se adaptan al uso dado en este PFC.

6 El autor de este PFC recomienda especialmente consultar el Anexo I para aclaraciones relacionadas con

temas de ingeniería genética que pueden resultar de ayuda al lector a la hora de entender muchos de los experimentos incluidos en el procedimiento experimental. En particular, se recomienda consultar el Anexo I.3 “Tecnología de recombinación y clonación de ADN y purificación de proteínas”.

2. Hipótesis y objetivos

8

2. Hipótesis y objetivos

La base de este PFC es el almacenamiento y la compartimentación de cocaína en plantas de la

especie Erythroxylum coca variedad coca.

Como punto de partida de este estudio, con base en publicaciones relacionadas con el

almacenamiento de alcaloides –en su mayoría de cafeína– y en el trabajo previo de investigación en

E.coca, las hipótesis que se plantean son:

El almacenamiento de cocaína en plantas de E.coca ocurre de forma compartimentada.

El almacenamiento está ligado a la interacción de la cocaína con el ácido clorogénico u

otros compuestos fenólicos de estructura química similar como el ácido cumarilquínico.

Estos compuestos fenólicos resultan de reacciones de acilación entre el ácido quínico y los

respectivos ácidos hidroxicinámicos en forma de tioéster con la coenzima A. Estas

reacciones de acilación están catalizadas por enzimas EcHQT.

Los objetivos de este PFC son:

Comprobar cuál(es) de las ocho enzimas EcBAHD encontradas en E.coca tiene actividad

HQT.

Realizar la caracterización bioquímica de aquellas enzimas que hayan mostrado actividad

HQT.

Determinar si la cocaína y el ácido clorogénico interaccionan formando un par y tratar de

conocer la fuerza y estructura de dicho par.

Estudiar si dicho par se forma también in vivo.

Conocer más sobre el lugar de acumulación de la cocaína: partes de la planta, tejidos,

estructuras intracelulares…

3. Procedimiento Expemerimental

9

3. Procedimiento Experimental

3.1 Extractos de Erythroxylum coca: el punto de partida

Para argumentar la hipótesis de que la cocaína interacciona con ACGs, es interesante conocer los

niveles de estos compuestos en E.coca, ya que para almacenar un alto contenido de alcaloides

tropánicos se requeriría también un alto contenido en ACGs.

Para ello, el contenido de tres réplicas de hojas de E.coca en diferentes fases de desarrollo –

brote, hoja enrollada, hoja joven, hoja adulta– así como del tallo, se extrajo en un 1 mL de tampón

de extracción y se analizó mediante LC-MS-IT y HPLC-UV, el primero para identificar cada compuesto

y el segundo para análisis cuantitativo.

3.2 EcBAHD aciltransferasas: ¿Qué enzima cataliza la síntesis de ácido clorogénico

(ACG)?

Puesto que el ácido clorogénico y el ácido cumarilquínico están relacionados a través de la familia

de enzimas Citocromo P450, como se ha comentado anteriormente, se decidió buscar actividad HQT

en base únicamente a la síntesis de ácido cumarilquínico (Figura 8).

Figura 8: Síntesis de ácido cumarilquínico.

Para determinar cuál de las ocho enzimas EcBAHD tenía actividad HQT, se llevaron a cabo ocho

ensayos enzimáticos7 usando ácido quínico y p-cumaril-CoA en tampón de adsorción8 bis-tris pH =

7,5, y añadiendo a cada reacción 20 μL de extracto crudo de enzima9 EcBAHD 1 a 8,

respectivamente, interrumpiendo el ensayo tras 12 h con HCl –pH final = 1. Como control negativo

se prepararon las mismas reacciones incubando previamente la enzima durante 10 min a 90 °C para

desnaturalizarla. El producto se analizó mediante LC-MS-IT10.

7

Para estos ocho primeros ensayos enzimáticos se usó proteína expresada en bacteria E.coli antes de este PFC. Más adelante se explica el proceso de expresión de proteína en diferentes microorganismos tal y como lo realizó el autor de este PFC para su posterior uso. 8

Tampón de adsorción: Es el primero de los tampones usado durante la purificación de una proteína por cromatografía de afinidad, siendo el otro el tampón de elución. La lisis celular y posterior colección de proteína se realizan comúnmente en tampón de adsorción. 9

Extracto crudo: Proteína no purificada obtenida tras la lisis celular. 10

Como se mostrará en los resultados, la única enzima con actividad HQT fue EcBAHD4, por lo que en los próximos capítulos se tratará únicamente con EcBAHD4 –llamada EcHQT– y no con las otras siete.


10

3.3 Optimización de la producción de proteína11: clonación, expresión,

purificación12

Partiendo de un vector pDONR207 con el gen EcHQT (clon de entrada), para elegir el sistema de

expresión de proteína óptimo –E.coli (bacteria), S.cerevisiae (levadura) o P.pastoris (levadura)– se

expresó el gen en los tres para poder comparar la cantidad producida, la actividad de la enzima, la

eficacia de la posterior purificación, etc. Para los sistemas mencionados, se usaron los vectores de

destino pH9GW, pYesDest52 y pEP-Strep, respectivamente (Figura 9).

Figura 9: Clon de entrada (izquierda) junto a los vectores de destino usados para la expresión de EcHQT en E.coli, S.cerevisiae y P.pastoris, respectivamente de izquierda a derecha.

Para cada uno de los tres vectores mencionados, en primer lugar se llevó a cabo la recombinación

LR entre el clon de entrada y el vector de destino (Invitrogen™, 2010). El producto de la

recombinación se transformó13 en bacteria E.coli TOP10 y las células transformadas se incubaron en

platos con medio de cultivo y antibiótico (kanamicina, ampicilina o zeocina, según el vector).

De las colonias que crecieron se seleccionaron cuatro para análisis. En primer lugar se realizó una

PCR de colonias, y el ADN amplificado se analizó por electroforesis de gel de agarosa para identificar

los clones positivos.

De uno de los clones positivos se preparó cultivo de 5 mL que se incubó durante la noche. Tras la

incubación se centrifugó y se extrajo el ADN del sedimento de células obtenido. El ADN extraído se

secuenció para confirmar que el vector contenía el gen de interés sin errores.

Una vez confirmada la secuencia se transformó el vector en su correspondiente organismo de

expresión –pH9GW en E.coli BL21(DE3), pYesDest52 en S.cerevisiae y pEP-Strep en P.pastoris KM71–

y se incubaron las células en platos con los respectivos medios de cultivo para cada sistema.

A partir de una colonia aislada del cultivo en plato se prepararon 50 mL de cultivo líquido de cada

uno de los sistemas, se dejó crecer hasta la DO600 apropiada y se indujo la producción de proteína.

Transcurrido el tiempo adecuado de expresión de proteína, se centrifugó el cultivo y se congeló el

sedimento de células hasta el momento de su lisis.

11

Siendo las enzimas proteínas que catalizan reacciones químicas, durante este PFC se hablará de “proteína” en el contexto del proceso de expresión (producción a partir del gen), y se hablará de “enzima” en el contexto de catálisis de una reacción química. 12

El Anexo I.3 presenta una explicación de la tecnología de recombinación adaptada a este PFC. 13

Transformación: Introducción de ADN externo en una bacteria. Aunque comúnmente usado también para levaduras, el término riguroso para las últimas es “transducción”.


11

El sedimento se resuspendió en tampón de adsorción y se llevó a cabo su lisis por sonificación,

agitación con esferas de cristal u homogeneización de alta presión. La suspensión resultante se

centrifugó y se tomó el sobrenadante como extracto crudo de proteína.

El crudo se filtró a través de una membrana de 0,22 μm de tamaño de poro y se purificó por

cromatografía de afinidad (FPLC). Las fracciones obtenidas se analizaron por electroforesis de gel de

poliacrilamida en dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para conocer la pureza de la fracción

purificada. Además, se prepararon ensayos enzimáticos de actividad HQT que se analizaron por LC-

MS-IT.

3.4 Caracterización bioquímica de EcBAHD4

Una vez elegido el sistema de expresión a usar se volvió a expresar y purificar proteína en mayor

cantidad. Ésta se reconcentró y desalinizó parcialmente en una columna de centrifugación con una

membrana de 10 kDa de corte de paso, reduciendo el volumen a la mitad (≈ 2,5 mL). Posteriormente

se midió la concentración de la proteína mediante un ensayo Bradford usando BSA para la recta de

calibrado.

Conocida la concentración de la proteína, se determinó el tampón y el pH óptimo de trabajo

preparando ensayos enzimáticos de actividad HQT en tampón bis-tris propano en el rango de pH =

6,7-9,5, además de tampón K2HPO4/KH2PO4 en el rango 5,7-8,3 y tampón tris en el rango 7,3-9,1. El

análisis se realizó por LC-MS-TripleQuad, usando ACG como estándar y asumiendo la cuantificación

del ácido cumarilquínico igual a la del ACG14.

Igualmente, se llevaron a cabo ensayos enzimáticos añadiendo diferentes iones metálicos a la

reacción en forma de cloruros para estudiar el incremento de actividad o inhibición de la enzima en

su presencia.

La estabilidad de la enzima en función de la temperatura se determinó preincubando la misma

durante media hora a 4, 10, 25, 35, 45 y 55 °C.

Finalmente, se estudió la cinética de la reacción aplicando el modelo de Michaelis-Menten –

usando una concentración de substrato mucho mayor que de enzima y manteniendo el estado

estacionario. Primero se prepararon ensayos enzimáticos con cantidades crecientes de uno de los

substratos –ácido quínico– manteniendo la concentración del otro –cumaril-CoA– en exceso, y

posteriormente se realizó el mismo proceso cambiando la relación de concentraciones de los

substratos.

14

El ácido cumarilquínico no se encuentra disponible comercialmente.


12

Fórmula 1: Velocidad de formación de producto: según el modelo de Michaelis-Menten para un solo substrato y sin inhibición (izquierda); con inhibición por substrato –acompetitiva– (derecha)

15.

3.5 Estudio de la interacción ACG-cocaína en disolución

3.5.1 ¿Interaccionan la cocaína y el ácido clorogénico formando un par?

Atendiendo al fenómeno del efecto batocrómico, el espectro de absorción del ácido clorogénico

se vería desplazado hacia longitudes de onda mayores si formase un complejo con la cocaína en

presencia de la misma (Kappeler et al., 1987).

El espectro de absorción del ACG se midió en disolución acuosa 0,2 mM en el rango 350-380 nm,

y se repitió el proceso añadiendo exceso de hidrocloruro de cocaína (4 mM).

3.5.2 Caracterización del par ACG-cocaína por espectrofotometría UV-Visible

Para conocer más sobre la localización de la interacción entre ambos compuestos se repitieron

las medidas espectrofotométricas usando por separado los compuestos que conforman las dos

mitades de la cocaína: tropina16 4 mM y ácido benzoico 4 mM.

Además, con base en el equilibrio de formación del complejo y en la ley de Beer-Lambert, es

posible derivar una ecuación que permita calcular la constante de formación KC, cuantificando así la

fuerza con que interaccionan ambos compuestos.

ACG = Ácido clorogénico; TA = Tropano-alcaloide (cocaína); C = Complejo

Fórmula 2: Equilibrio de formación del complejo ACG-Cocaína.

Fórmula 3: Derivación de la ley de Beer-Lambert aplicada a la formación del complejo ACG-Cocaína.

Conocidos [TA]0, [ACG]0 y A(λ), se puede representar una recta εC vs 1/KC usando valores

aleatorios de εC. Si se utilizan diferentes concentraciones iniciales de cocaína se obtendrá un

15

En el Anexo II.4 se muestran los desarrollos de las ecuaciones mostradas en la memoria. 16

La estructura de la tropina es muy similar a la de la metilecgonina la cual, por reacción con el ácido benzoico, da lugar a la cocaína (Figura 3). La metilecgonina no está disponible comercialmente.


13

conjunto de rectas que se corten en un punto de cuyas coordenadas se hallará KC y εC a una longitud

de onda determinada.

El espectro de absorción del ACG 0,2 mM en presencia de diferentes concentraciones de cocaína

se midió en el rango 350-380 nm a temperatura ambiente.

3.5.3 Caracterización del par ACG-Cocaína por RMN

Para confirmar los resultados obtenidos por espectrofotometría UV-Visible se analizaron

soluciones de ACG y cocaína mediante resonancia nuclear magnética (RMN). En particular, se

llevaron a cabo medidas de espectroscopía monodimensional de 1H y de espectroscopía de

correlación homonuclear bidimensional (COSY).

Para ello se utilizaron disoluciones ACG:Cocaína 0,2:50 mM y 50:0,2 mM en tampón de fosfato

deuterado pD = 7,5 en D2O, así como disoluciones de ACG y cocaína por separado para estudiar el

desplazamiento del espectro debido a la interacción entre ambos y determinar en qué partes de

ambas moléculas se centra dicha interacción. TMSP-d4 se usó como patrón externo.

3.6 Estudio de la interacción ACG-cocaína en plantas de la especie E.coca17

Una vez estudiada la interacción ACG-cocaína en disolución, el siguiente paso fue tratar de

detectar esta interacción in vivo. Para ello, se pusieron discos de Ø = 1 cm perforados de hojas de

E.coca en un volumen de agua abundante, se aplicó vacío y se tomaron muestras durante 4 días que

se analizaron por LC-MS-TripleQuad. Posteriormente se extrajo el contenido restante del disco para

cuantificar los ACGs y cocaína de la misma forma que en el apartado 3.1.

Puesto que la hipótesis inicial sugiere que la cocaína se almacena en algún compartimento

específico donde la interacción con el ACG impediría su liberación, se esperaba que la cocaína fuera

liberada con el tiempo hasta un límite donde toda la cocaína libre habría pasado al medio acuoso

mientras que la cocaína en forma de complejo habría quedado atrapada dentro del disco. Conocida

la cantidad total de cocaína y de ACG en un disco, y conocida la KC de formación del complejo, se

podría comparar la cantidad teórica de cocaína en forma libre con la cantidad real lavada del disco.

3.7 Inmunohistoquímica: localización de la cocaína dentro de la hoja

Para conocer el tipo de tejido y la capa del tejido donde se almacena la cocaína dentro de la

planta se llevaron a cabo experimentos de inmunohistoquímica (IHQ)18.

En primer lugar se tomaron hojas adultas de E.coca, se fijaron y se embebieron en bloques de

cera. De estos bloques se prepararon cortes de 10 μm de grosor en un micrótomo que se usaron

para la IHQ.

El primer experimento de IHQ se realizó usando anticuerpos policlonales anti-cocaína y

anticuerpos secundarios acoplados a una peroxidasa (HRP) y detección con DAB19. Las muestras se

analizaron por microscopía óptica.

17

Los datos obtenidos del análisis de estos experimentos resultaron irrelevantes, no mostrando patrón alguno de lavado de ninguno de los compuestos analizados entre diferentes réplicas. Por esa razón no se presentan en la siguiente sección “Resultados y discusión”. 18

Procedimiento basado en el uso de un anticuerpo para la detección de una especie (antígeno) en un tejido biológico. En este caso el antígeno es la cocaína.


14

Posteriormente se repitió el mismo experimento usando detección con tiramida (detección

fluorescente). Las muestras se analizaron por microscopía confocal.

Por último, se repitió el experimento con detección fluorescente, usando anticuerpos

monoclonales en lugar de policlonales, buscando así una mayor especificidad de la señal obtenida.

Dos tipos de control negativo se usaron en estos experimentos. Para el primero se realizó la IHQ

sin incubación de anticuerpos, y para el segundo se usaron hojas de A.thaliana en lugar de E.coca20.

19

DAB es oxidado por las enzimas peroxidasas tiñendo el tejido de un color marrón. 20

A.thaliana es una planta que no produce cocaína u otros alcaloides tropánicos, por lo que se puede utiliza como control negativo.

4. Resultados

15

4. Resultados y discusión

4.1 Altos niveles de cocaína, cinamilcocaína y ACGs en Erythroxylum coca

Los extractos de E.coca mostraron niveles altos de ambos, alcaloides tropánicos y ACGs (Figura

10). Además, al igual que otros autores han documentado la variación acompasada de los niveles de

alcaloide y ACG entre variedades de plantas del mismo género (Waldhauser y Baumann, 1996), en

E.coca los niveles de ambos también varían de forma conjunta de un tejido o fase de desarrollo a

otro, a pesar de no existir una relación molar entre ambos compuestos.

Por otro lado, se comprobó que con el tiempo las hojas acumulan cocaína, siendo así las hojas

adultas donde más cocaína se almacena.

Figura 10: Niveles de alcaloides tropánicos y ACGs en E.coca (valores por gramo de materia seca).

4.2 EcBAHD4 es la única enzima EcHQT

El análisis de las ocho aciltransferasas encontradas en E.coca muestra que únicamente EcBAHD4

posee actividad HQT, es decir, es la única enzima que cataliza la síntesis de ácido cumarilquínico

(Figura 11).

Además, se observa que no hay un único producto, sino varios isómeros del ácido cumarilquínico

(338 g/mol)21, a pesar de que uno de ellos es muy mayoritario. Es probable que uno de estos

isómeros se deba al pequeño porcentaje de p-cumaril-CoA que se encuentra en forma de isómero

cis22.

Por último, en el análisis de los ocho ensayos se aprecia la aparición de un pico en t ≈ 17,5 min,

correspondiente al ácido cumárico (164 g/mol), que desaparece cuando el crudo es desnaturalizado.

Este pico también desaparece prácticamente tras la purificación de EcHQT, lo cual hace razonable

pensar en la existencia de tioesterasas en el extracto crudo de bacteria E.coli que catalicen la rotura

del enlace entre el grupo cumaril y la coenzima A (Cho y Cronan, 1993).

21

Nótese que se muestra el cromatograma en modo de ionización negativo, por lo que la masa molecular mostrada es una unidad menor a la del compuesto en estado neutro debido a la pérdida de un protón. 22

El substrato p-cumaril-CoA no existe comercialmente y fue sintetizado por otro miembro del grupo de trabajo.

4. Resultados

16

Figura 11: Cromatograma Total de Iones (modo negativo) de los ensayos de actividad HQT de EcBAHD4 y 5. Los otros seis ensayos analizados resultaron en cromatogramas prácticamente idénticos al de EcBAHD5, por lo que no se muestran.

4.3 Pichia pastoris como sistema de expresión de EcHQT

La secuencia de aminoácidos de EcHQT obtenida previo a la transformación de los vectores de

destino en los respectivos sistemas de expresión revela las características de dicha enzima comunes

a todas las enzimas de la familia BAHD, con una longitud de 433 aminoácidos, una masa de 48,5 kDa

(aprox. 51,4 kDa teniendo en cuenta el his- o strep-tag) y conservando los dos motivos “DFGWG” y

“HXXXDG”. La figura 12 muestra esta secuencia alineada frente a otras tres enzimas HQT aisladas de

plantas de café (Coffea canephora), tabaco (Nicotiana tabacum) y tomate (Solanum lycopersicum)

mediante un análisis “blastp” (Lepelley et al., 2007). La similitud de EcHQT con las otras HQT

mostradas varía entre el 57% y el 61%.

Una vez expresada EcHQT en E.coli, S.cerevisiae y P.pastoris, el análisis por SDS-PAGE prueba una

clara purificación por cromatografía de afinidad con el uso de las etiquetas his-tag (en bacteria) y

strep-tag (en levadura). Una banda mayoritaria aparece entre 50 y 60 kDa en las fracciones

purificadas, correspondiente a EcHQT (Figura 13). Otra banda aparece aproximadamente a la altura

de 25 kDa. Puesto que aparece en la fracción purificada en los tres sistemas, resulta lógico pensar

que es una fracción de la proteína original que se degradó durante la purificación, siendo la mitad

que contenía el tag, la que se purificó.

Se debe tener en cuenta la dificultad de comparar cuantitativamente los sistemas de expresión

en un gel SDS-PAGE, ya que las condiciones de cada purificación no son exactamente iguales, ni las

fracciones purificadas se recogen en el mismo volumen, por lo que tienen diferentes diluciones, que

a su vez afecta a la tinción del gel. Por otro lado, la detección con nitrato de plata requiere

volúmenes de proteína inyectados muy pequeños, llegando a 0,25-0,35 μL para el crudo y el

flowthrough, lo que da lugar a una mayor variabilidad del resultado. Por esta razón, se estimó que

usando cantidades similares de proteína, el resultado del SDS-PAGE para S.cerevisiae y para

P.pastoris sería muy similar.

4. Resultados

17

Figura 12: Alineamiento de EcHQT con otras tres enzimas HQT, aisladas de plantas de café (CcHQT), tabaco (NtHQT) y tomate (SlHQT). En azul, aminoácidos del mismo tipo en las cuatro secuencias. En amarillo, aminoácidos del mismo tipo en más de una secuencia. Los dos motivos conservados se encuentran recuadrados en rojo. Números de acceso: CcHQT, G-10889 (PlantCyc); NtHQT, AJ582651 (GenBank); SlHQT, G-12431 (PlantCyc).

Por otro lado, y a pesar de tener en cuenta la diferencia de dilución, la figura 14 muestra que la

expresión en levadura da lugar a proteína más activa, como se esperaba, puesto que las células

eucariotas normalmente realizan el plegamiento de proteínas con múltiples dominios –como

EcHQT– de manera más eficaz que las procariotas (D'Auria, 2006; Jacob et al., 2007).

Se decidió, por tanto, trabajar con levadura, en particular con P.pastoris, teniendo en cuenta el

tiempo de expresión, menor en P.pastoris que en S.cerevisiae, y el uso de antibiótico –zeocina– en el

cultivo en P.pastoris, lo que hace más difícil el desarrollo de bacteria u otro tipo de contaminación

que pueda echar a perder el cultivo.

4. Resultados

18

Figura 13: Análisis SDS-PAGE de EcHQT expresada en tres sistemas (detección con nitrato de plata). El contraste de la imagen se aumentó para poder mostrar la banda común a los tres sistemas a la altura de 25 kDa. M: Marcador; C: Crudo; F: Flowthrough (proteína no retenida); P: Purificado

Figura 14: Cromatograma Extraído de Iones (337 g/mol; modo negativo). Comparación de la actividad de EcHQT en los tres sistemas de expresión.

4.4 Caracterización bioquímica de EcHQT

EcHQT se mostró relativamente estable en torno a pHs neutros, con máxima actividad a pH = 7,5,

que se redujo a la mitad a pH = 5,5 ó pH = 9,5. Se observó además que el uso de tampón de fosfato

maximiza la actividad frente a otros tampones (Figura 15). El uso de tris, por ejemplo, reduce la

actividad en más del 50% en referencia a la máxima actividad encontrada para el fosfato. Estos datos

van en concordancia con los de otras enzimas HQT caracterizadas previamente (Ulbrich y Zenk,

1979; Lotfy et al., 1992)23.

Igualmente se encontró que tanto la adición de Cu2+ como de Fe2+ inhibe casi completamente la

acción de la enzima. Además, el bloqueo de los iones metálicos por formación de quelatos con EDTA

mejoró la actividad en hasta un 25% (Figura 16).

23

La actividad mostrada en las figuras se calculó en μkat (μmol producto/s).

4. Resultados

19

El estudio de la estabilidad térmica reveló la labilidad de EcHQT, cuya actividad se redujo en un

20% tras 30 min de preincubación a 4 °C. Tras incubarla a 45 °C, EcHQT quedó prácticamente

inactiva (Figura 17).

Figura 15: Actividad de EcHQT a diferentes pHs, tomando el mayor valor obtenido como 100%.

Figura 16: Actividad de EcHQT en presencia de diferentes cofactores metálicos. El 100% se ha asignado a un ensayo de referencia sin iones añadidos.

4. Resultados

20

Figura 17: Actividad de EcHQT tras preincubación (30 min). El 100% se ha asignado a un ensayo de referencia sin preincubación.

Los valores de la constante de Michaelis-Menten (KM) y la velocidad máxima (vmax) se calcularon

por regresión hiperbólica de los datos obtenidos (Figura 18 y Figura 20). Además se calcularon la

constante catalítica (kcat), el ratio kcat/KM y la constante de inhibición para el p-cumaril-CoA.

Calculados los parámetros cinéticos, se representó la curva Lineweaver-Burk que muestra

claramente los dos modelos usados, sin inhibición y con inhibición por substrato (Figura 19 y Figura

21).

KM [μM] vmax *μmol/L·s+ kcat [1/s] kcat/KM [1/M·s] KSI *μM+

Ácido quínico 595,70±144,20 1,95·10-3±0,23·10-3 0,0888±0,0104 149,14±40,12 –

p-Cumaril-CoA 4,49±0,80 4,81·10-4±0,30·10-4 0,0219±0,0014 4872,3±922,3 579,2±116,7

Tabla 1: Valores referentes a la cinética enzimática de EcHQT para cada uno de los substratos.

Si bien los valores de velocidad máxima varían considerablemente en la bibliografía, los de KM a

menudo se encuentran en el mismo rango. Los valores obtenidos para EcHQT están precisamente

dentro de ese rango; por ejemplo para HQT en tabaco, N.tabacum (KM quínico = 727±150 μM)

(Niggeweg et al., 2004), N.alata (KM quínico = 392 μM; KM p-cumaril-CoA = 6 μM) (Ulbrich y Zenk,

1979) o en tomate, S.lycopersicum (KM quínico = 430 μM; KM p-cumaril-CoA = 3 μM) (Rhodes y

Wooltorton, 1976).

KM y kcat/KM son dos parámetros comúnmente usados en la caracterización cinética de una

enzima. El primero es una medida de la afinidad de la enzima por el substrato, siendo ésta mayor

cuanto menor es KM y viceversa; el segundo representa la especificidad de la enzima, o preferencia

por diferentes substratos, y tiene en cuenta la interacción enzima-substrato y la actividad catalítica

de la enzima.

Los valores obtenidos de KM y kcat muestran una alta afinidad por el p-cumaril-CoA, lo cual se

podría relacionar con estudios sobre el mecanismo catalítico de las enzimas BAHD que muestran el

posicionamiento del substrato acil-CoA en la zona central de la enzima (D'Auria, 2006).

4. Resultados

21

Figura 18: Cinética enzimática. Modelo de Michaelis-Menten aplicado al ácido quínico con saturación de p-cumaril-CoA.

Figura 19: Cinética enzimática. Gráfico Lineweaver-Burk para un solo substrato (ácido quínico) sin inhibición.

4. Resultados

22

Figura 20: Cinética enzimática. Modelo de inhibición por substrato (acompetitiva) aplicado al p-cumaril-CoA con saturación de ácido quínico.

Figura 21: Cinética enzimática. Gráfico Lineweaver-Burk para un solo substrato (p-cumaril-CoA) con inhibición por substrato (acompetitiva)

4. Resultados

23

4.5 El ACG y la cocaína sí interaccionan

4.5.1 Espectrofotometría UV-Vis: la interacción ACG-cocaína es real y cuantificable

El espectro del ACG se vio desplazado hacia longitudes de onda mayores en presencia de cocaína,

lo cual prueba la interacción entre ambos. Más aún, cuando el experimento se repitió con tropina,

cuya estructura es similar a la de la cocaína pero sin contener el anillo bencénico, no se detectó este

desplazamiento, que de nuevo sí se produjo cuando se usó ácido benzoico, sugiriendo que la

interacción se centra principalmente en la zona aromática de ambas moléculas (Figura 23 A, B y C).

El experimento con concentraciones crecientes de cocaína (Figura 23 D) permitió la

representación de una serie de rectas εC vs 1/KC –según la fórmula 3–, de cuyo punto de intersección

se obtuvieron KC y εC (Figura 22), descartando el punto más alejado del conjunto y tomando un

intervalo de confianza del 95%.

KC = 9,1 ± 1,4 [L/mol] εC (364nm) = 1901 ± 87 [L/mol·cm]

Figura 22: Espectrofotometría UV-Visible. Cálculo de la constante de formación del par ACG-Cocaína a 25 °C.

El valor de KC obtenido para el par ACG-cocaína es unas 5 veces menor al publicado para ACG-

cafeína –y menor también que el de otros alcaloides purínicos publicados conjuntamente–, cuya

interacción ha sido bien caracterizada en estudios de RMN o cristalografía de rayos X (Kappeler et

al., 1987).

4. Resultados

24

Figura 23: Espectrofotometría UV-Visble. Espectro del ACG (0,2 mM) junto al de la cocaína (4 mM) (A), la tropina (4 mM) (B) y el ácido benzoico (4 mM) (C), por separado y juntos en disolución. Nótese que la curva roja con la leyenda separada por “:” corresponde a los compuestos juntos en disolución, mientras que la curva morada con la leyenda separada por “+” corresponde a la suma matemática de las curvas por separado como prueba de que el desplazamiento de la curva no se debe a la simplemente a la suma de las absorbancias de éstos. Como blanco se usó H2O. La gráfica (D) corresponde al efecto batocrómico producido en el espectro del ACG (0,2 mM) por la cocaína a diferentes concentraciones. Como blanco se usó ACG (0,2 mM). La línea de puntos marca la longitud de onda escogida para el cálculo de KC (364 nm).

4. Resultados

25

4.5.2 Resonancia Nuclear Magnética: la interacción ACG-cocaína se centra en la parte aromática

El espectro de protón 1H de diferentes muestras ACG-cocaína permitió asignar individualmente a

cada protón el desplazamiento de su correspondiente pico debido a la interacción entre ambos

compuestos (Figura 25)24.

La figura 24 muestra claramente mayores desplazamientos en los protones cercanos a la parte

aromática de ambas moléculas, probando una vez más que es ahí donde se centra la interacción

entre ambas. Se observa además que el máximo desplazamiento ocurre en los carbonos 2 (80,4 Hz) y

3 (85,3 Hz) del anillo de tropano, y es de esperar que ocurriera de forma similar en el carbono 4 de

haber sido posible su cuantificación. Esto hace pensar en un cambio conformacional en el anillo de

tropano que pudiera así facilitar un posible posicionamiento en paralelo de las mitades más

próximas a la zona aromática de ambas moléculas, de forma similar a como se ha publicado para el

caso de la cafeína (Martin et al., 1986; D’Amelio et al., 2009).

Figura 24: Resonancia Nuclear Magnética. Asignación del desplazamiento del espectro 1H a los protones –unidos a

carbono– de las moléculas de ACG (izquierda) y cocaína (derecha). Los desplazamientos se representan con símbolos “Δ” y vienen dados en hertzios. Aquellos marcados con “n.d.” no están disponibles puesto que la zona alifática de ambas moléculas resuena en la misma región del espectro, lo que hizo imposible la asignación exacta de la posición del protón en el espectro.

Por otro lado, como se muestra en el ejemplo de la figura 25, todos los desplazamientos medidos

son desplazamientos hacia ‘campo alto’, es decir, hacia valores más bajos del desplazamiento

químico (ppm), lo que implica un mayor apantallamiento nuclear por parte de los electrones, que se

traduce en una mayor energía de resonancia. Es posible que el aumento de carga electrónica en la

zona aromática del ACG y de la cocaína se deba al solapamiento de los orbitales pi entre ambas

moléculas.

24

Otras zonas del espectro 1H del ACG y de la cocaína, así como los espectros COSY se muestran en el

Apéndice III “Resultados complementarios”.

4. Resultados

26

Figura 25: Resonancia Magnética Nuclear. Comparación del espectro 1H del ACG por separado y en presencia de cocaína. La zona del espectro mostrada corresponde a valores altos del

desplazamiento químico (ppm), es decir, a la parte aromática de la molécula.

4. Resultados

27

4.6 ¿Dónde se almacena la cocaína?

Los experimentos de inmunohistoquímica, tanto con detección por DAB, como con detección

fluorescente, muestran que el almacenamiento de la cocaína no tiene lugar de forma dispersa entre

todas las células sino que se centra en ciertas capas del tejido de la hoja, es decir, está

compartimentada (Figura 26, Figura 27 y Figura 28)25.

Si en el apartado 4.1 se ha mostrado que la cocaína se almacena con el tiempo en la hoja, siendo

las hojas ya desarrolladas –adultas– las que realmente realizan la función de almacenamiento, en la

figura 26 se aprecia cómo las células en el mesófilo26 son las que principalmente contienen cocaína.

En particular, la cocaína parece situarse en las células del mesófilo esponjoso, ya que la

fluorescencia que aparece en el mesófilo en empalizada se presenta siempre de forma más difusa, y

podría ser ruido debido a que todas las plantas presentan autofluorescencia –que a menudo resulta

complicada de eliminar. Por esta misma razón se detectaría igualmente señal en el control negativo

y en hojas de A.thaliana, aunque de manera más tenue (Figura 26 A).

Figura 26: Inmunohistoquímica. Detección –con fluorescencia– de cocaína realizada en una hoja adulta de E.coca. Imagen tomada en el extremo de la sección trasversal de la hoja con un aumento 40x. (A) Control negativo (sin anticuerpos); (B) Protocolo completo (con anticuerpos). Izquierda, imagen fluorescente; centro, campo claro (luz normal); derecha, imágenes superpuestas.

25

Otras imágenes de detección con DAB o de hojas de A.thaliana se aparecen el Anexo III “Resultados complementarios”. 26

El apartado 1 del Anexo I “En detalle” muestra la estructura por capas de una hoja de E.coca.

4. Resultados

28

Figura 28: Inmunohistoquímica. Detección –con fluorescencia– de cocaína realizada en una hoja adulta de E.coca. Imagen tomada hacia la mitad de la sección trasversal de la hoja con un aumento 10x. Izquierda, imagen fluorescente; centro, campo claro (luz normal); derecha, imágenes superpuestas.

Figura 27: Inmunohistoquímica. Detección –con fluorescencia– de cocaína realizada en una hoja adulta de E.coca. Imagen tomada entre la vena central y el extremo de la sección trasversal de la hoja con un aumento 40x. Izquierda, imagen fluorescente; centro, campo claro (luz normal); derecha, imágenes superpuestas.

5. Conclusiones

29

5. Conclusiones

5.1 Compleción de los objetivos

A lo largo de este PFC se ha estudiado la forma de almacenamiento de la cocaína en plantas de la

especie Erythroxylum coca variedad coca.

Analizando los objetivos iniciales del proyecto, el trabajo realizado ha permitido satisfacer casi la

totalidad de los mismos.

En primer lugar, es posible afirmar que de las ocho aciltransferasas identificadas en E.coca

pertenecientes a la familia de enzimas BAHD, solamente una posee actividad hidroxicinamil-CoA

quinato: hidroxicinamiltransferasa, es decir, es capaz de sintetizar ácido cumarilquínico.

Esta enzima, llamada EcHQT, se caracterizó bioquímicamente, encontrando las condiciones

óptimas de pH, temperatura y cofactores metálicos, y se estudió su cinética de reacción, obteniendo

resultados dentro del rango de valores publicados para otras enzimas del mismo tipo.

Además, se encontró que el ácido clorogénico y la cocaína interaccionan en disolución formando

un par, y que dicha interacción se centra en la parte aromática de ambas moléculas, de manera

similar a como se ha investigado en algunos alcaloides purínicos.

Por último, se obtuvo información sobre el lugar de almacenamiento de la cocaína. Se demostró

que las hojas adultas son las que acumulan la mayor parte de este alcaloide, y que las hojas más

jóvenes, al igual que las raíces, no poseen prácticamente cocaína. Experimentos de

inmunohistoquímica permitieron incluso conocer más sobre la relación entre las distintas capas de

tejido celular y la cocaína, sugiriendo que las células del mesófilo esponjoso acaparan la función de

almacenamiento. La presencia de puntos definidos y no una señal difusa, apoya la hipótesis de que

la cocaína aparece de forma compartimentada.

Si bien se necesita continuar investigando en este campo, el hecho de que la cocaína se acumule

sobre todo en las hojas adultas –mucho más abundantes que las hojas en desarrollo–, y de que se

almacene de forma compartimentada, ayuda a pensar en la función ecológica que juega dicho

alcaloide, función que hasta la fecha es desconocida. Se podría argumentar su papel dentro del

mecanismo de defensa de la planta, puesto que estando compartimentada no sería tóxica para la

célula vegetal, siendo liberada en caso de destrucción de la misma –por el ataque de un organismo

herbívoro– y realizando su función insecticida, parecido a como se ha propuesto en otras

publicaciones (Stephen et al., 1998).

5.2 Posibilidad de continuación

A pesar de haber satisfecho la mayoría de los objetivos de este proyecto, todavía quedan

incógnitas por resolver. El principal objetivo será aclarar si la interacción estudiada entre la cocaína y

el ácido clorogénico ocurre de hecho in vivo. Para ello, se tratarán de optimizar los experimentos de

lavado de cocaína descritos en el apartado 3.6, y posiblemente se lleven a cabo intentos de

aislamiento de vacuola que, por la dificultad y el tiempo que entrañan, no se consideraron dentro de

este PFC. Otros experimentos de histoquímica se han propuesto, no sólo para corroborar los ya

5. Conclusiones

30

realizados, sino también para la localización de ácidos clorogénicos, tinción de vacuolas y otras

pruebas que ayuden a la caracterización histológica de la cocaína.

Además, en estos momentos se sigue trabajando con los datos obtenidos de las pruebas de RMN

realizadas, para intentar modelar una estructura tridimensional del par ACG-cocaína. De la misma

manera, se han comenzado intentos de cristalización de este complejo para su posterior análisis por

cristalografía de rayos X.

Por otro lado, más allá del tema base de este PFC, la investigación de la biosíntesis de alcaloides

tropánicos se encuentra todavía en sus primeros pasos, y nuevos proyectos que abordar ya se

discuten, como por ejemplo la formación del doble anillo –anillo de tropano– que dará lugar a la

metilecgonona (Figura 3).

Por último, puesto que los resultados obtenidos son no sólo bastante positivos, sino además

novedosos, se espera publicarlos junto con los que resulten del trabajo en curso en los próximos

meses.

5.3 Incidencias y valoración personal

Este PFC se realizó en un laboratorio de biología molecular dentro del departamento de

bioquímica, en el Instituto Max Planck para la Ecología Química en Jena (Turingia, Alemania).

Empecé el trabajo en este laboratorio hacia mediados de octubre 2011, y pasé satisfactoriamente

un periodo de entrenamiento y evaluación de dos meses, puesto que era la primera que me

adentraba en el mundo de la biotecnología. Esto significó, no sólo aprender a trabajar en un

laboratorio biológico, sino además un estudio concienzudo de toda la teoría que ello requiere, desde

las bases de la biología, la bioquímica o la genética hasta los conceptos detrás de la biotecnología

más vanguardista aplicada.

Este periodo de prueba me dejó entre 5 y 6 meses de trabajo hasta la entrega en junio de 2011,

que se tradujo en unas 1200 horas de trabajo.

Pensando en los experimentos llevados a cabo, es difícil encontrar uno más difícil que otro, pues

la mayoría resultaron mucho más largos y complicados de lo esperado. Los experimentos más

químicos entrañaron más dificultad de puesta a punto, puesto que trabajar con cocaína de pureza

>99% implica requisitos legales y económicos que no permiten margen de error. A menudo se llevó a

cabo el experimento en primer lugar con cafeína, escopolamina o atropina, y una vez optimizado se

procedió con cocaína. Además, el análisis de resultados requirió mayor tiempo que los experimentos

bioquímicos.

Por otro lado, la parte bioquímica de los experimentos conlleva un tiempo de espera (por

ejemplo por frecuentes incubaciones de 24-72 h), y una variabilidad que ralentizan

considerablemente el siguiente paso y, por consiguiente, la obtención de resultados.

Bibliografía

31

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http://es.wikipedia.org/wiki/Célula_vegetal

ANEXOS

Anexo I: En detalle

35

Anexo I: En detalle

I.1 Estructuras dentro de la planta

Figura 29: Estructura de la célula vegetal. Imagen tomada de (Wikipedia, 2011).

Figura 30: Corte transversal de una hoja (esquema y vista real en E.coca). (Izquierda: imagen adaptada a partir de (BBC-GCSE, 2011); derecha: imagen tomada con microscopio “Zeiss Confocal LSM510”, aumento 20x).

Anexo I: En detalle

36

I.2 Ruta de la lignina

Como se observa en la figura 31, la lignina es un biopolímero sin estructura definida, formado por

unión de unidades simples derivadas de tres monolignoles que a su vez se derivan del aminoácido

fenilalanina: alcohol coniferílico, sinapílico y p-cumarílico. Éstos se originan de los correspondientes

ácidos y se incorporan al polímero como fenilpropanoides: guaiacilo (G), siringilo (S) y p-hidroxifenilo

(H), respectivamente. Reacciones de hidroxilación y metilación relacionan los tres ácidos al principio

de la ruta.

La lignina es uno de los polímeros naturales más abundantes del mundo junto a la celulosa y la

quitina. Al ser una matriz de polisacáridos, la lignina confiere rigidez y fuerza de compresión a las

paredes celulares. Por otro lado, su carácter hidrófobo hace posible el transporte de agua a lo largo

de la planta (Whetten y Sederoff, 1995; Whetten et al., 1998).

Anexo I: En detalle

37

Figura 31: Ruta de la lignina. Imagen adaptada a partir de (Riboulet et al., 2009).

Anexo I: En detalle

38

I.3 Tecnología de recombinación y clonación de ADN y purificación de proteínas

El primer paso para la expresión de proteína es la elección del sistema donde se va a expresar,

que determinará el tipo de clonación, cultivo y lisis, además de la cantidad específica producida, la

eficacia de la posterior purificación y, lo más importante, la actividad de la enzima.

Los tres sistemas en los que se expresó proteína en este PFC son: bacteria Escherichia coli,

levadura Saccharomyces cerevisiae y levadura Pichia pastoris.

Para poder seleccionar una bacteria o levadura donde se ha introducido el ADN deseado (clon

positivo) de entre un grupo de bacterias o levaduras sin ese ADN (clon negativo), es necesario dar

alguna ventaja al clon positivo. Si, por ejemplo, éste recibe resistencia a un antibiótico que otro clon

negativo no recibe, se podrá usar ese antibiótico para matar selectivamente todos los clones

negativos.

Por otro lado, una vez que la proteína haya sido expresada, y para poder caracterizar la enzima

deseada, se necesita purificar esa proteína de entre el enorme conjunto de proteínas que se

obtienen tras producir la lisis celular. Para ello, con base en el dogma central de la biología molecular

que explica cómo el ADN se transcribe a ARN, que se traduce después a proteína, se puede añadir

una secuencia corta de ADN –etiqueta o tag– antes del gen de interés que, una vez traducida a

proteína, haga de “ancla” para su purificación por cromatografía de afinidad. Dos ejemplos de esto

muy conocidos son las etiquetas His-tag y Strep-tag.

Estas dos y otras características pueden introducirse en los clones positivos si antes de insertar el

ADN deseado en el microorganismo se clona en un vector ADN diseñado con esas características. En

este PFC, este proceso, llamado recombinación genética, se realizó mediante la tecnología Gateway®

de Invitrogen™.

La base de esta tecnología son las reacciones de recombinación BP y recombinación LR. Una

recombinación LR tiene lugar entre un vector con sitios de unión attL y otro con sitios attR, y el

producto son dos vectores con sitios attB y attP respectivamente, donde las secuencias de ADN

entre sitios attL y attR han sido intercambiadas (Figura 32). Lo opuesto ocurre con la recombinación

BP (Invitrogen™, 2010).

Figura 32: Recombinación LR donde el gen deseado –EcHQT– se clona en un vector pH9GW portador de un His-tag.

Anexo I: En detalle

39

En la Figura 32, si esta reacción transcurre y posteriormente el producto se transforma27 en

bacteria, poniéndola en medio de cultivo con antibiótico kanamicina, el resultado es el siguiente:

Las bacterias donde el vector pH9GW no se haya introducido morirán por no tener

resistencia a la kanamicina (primer y cuarto vector).

Las bacterias que reciban el vector pH9GW pero sin reaccionar (segundo vector), morirán

por el efecto del gen ccdB, que inhibe la acción de las enzimas ADN girasas necesarias

para replicación y transcripción de ADN.

Por tanto, únicamente sobrevivirán y formarán colonias las bacterias con el vector

pH9GW y el gen EcHQT –gen deseado.

Una vez cultivada la bacteria se puede inducir la producción de proteína, donde EcHQT se

traducirá según su secuencia de ADN pero con un tag añadido de nueve histidinas. Así, después de

producir la lisis celular y recolectar la proteína, se podrá purificar por cromatografía de afinidad en

una columna diseñada para retener histidina.

En el caso de la levadura S.cerevisiae, el proceso de selección de la levadura deseada, en lugar de

usar antibiótico, se llevó a cabo mediante el uso de SC-U. SC-U es un medio de cultivo para

S.cerevisiae que no contiene uracilo, necesario para la transcripción de ADN, y por tanto para la

supervivencia. El vector pYesDest52 contiene sin embargo el gen de autoproducción de uracilo

(Figura 33).

Figura 33: Recombinación LR donde el gen deseado –EcHQT– se clona en un vector pYesDest52 portador de un Strep-tag.

De nuevo, únicamente las levaduras que hayan recibido el vector pYesDest52 con el gen EcHQT

incluido podrán sobrevivir, ya que serán las únicas que puedan producir uracilo y no llevan el gen

ccdB.

Además del vector pH9GW (para transformación en bacteria E.coli) y el vector pYesDest52 (para

transformación en levadura S.cerevisiae), el tercer vector usado en este PFC es el vector pEP-Strep,

utilizado para transformación en levadura P.pastoris. La reacción de recombinación LR

correspondiente a este vector es la mostrada en la Figura 34. En este caso, el antibiótico usado para

seleccionar los clones de interés será la zeocina.

27

Transformación: Introducción de ADN externo en una bacteria. Aunque comúnmente usado también para levaduras, el término riguroso para las últimas es “transducción”.

Anexo I: En detalle

40

Figura 34: Recombinación LR donde el gen deseado –EcHQT– se clona en un vector pEP-Strep portador de un Strep-tag.

Ambos vectores usados para levadura (pYesDest52 en S.cerevisiae o pEP-Strep en P.pastoris)

conllevan la adición de un Strep-tag a la proteína, cuya especificidad implica en la mayoría de los

casos una purificación más eficiente que con el uso del his-tag.

Anexo II: Protocolos

41


Todas las disoluciones se prepararon con agua doblemente destilada y de calidad Milli-Q.

Todos los materiales usados eran de la máxima pureza disponible y fueron provistos por Sigma-

Aldrich Chemie GmbH, Fluka (Sigma-Aldrich) y Carl Roth GmbH. En caso de excepción, se

especificará.

Para las esterilizaciones por filtración se usaron filtros de tamaños 0,22 μm ó 0,4 μm. Para las

esterilizaciones por autoclave los ciclos usados fueron de 20 min a 120 °C.

II.1 Materiales, disoluciones y medios

AAmix sin uracilo 5x 500 mg adenina, arginina, cisteína, leucina, lisina, treonina y

triptófano, 250 mg ácido aspártico, histidina, isoleucina, metionina,

fenilalanina, prolina, serina, tirosina, valina.

Biotina 500x 20 mg biotina en 100 mL agua. Filtrado.

BMMY 10 g extracto de levadura, 20 g peptona en 700 mL agua. Autoclave.

Añadir 100 mL K2HPO4 1 M pH = 6, 100 mL 10xYNB, 2 mL biotina

500x, 10 mL metanol.

Tampón de adsorción bis-tris Bis-tris metano 50 mM, imidazol 10 mM, glicerol 10% (v/v). Filtrado.

Tampón de adsorción tris-HCl Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM. Filtrado.

Tampón de elución bis-tris Bis-tris metano 50 mM, imidazol 500 mM, glicerol 10% (v/v).

Filtrado.

Tampón de elución tris-HCl Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, destiobiotina 2,5 mM.

Filtrado.

Tampón SDS 3,03 g tris, 14,4 g glicina, 1 g dodecilsulfato de sodio en 1 L agua.

Disolución de azul de 500 mL MeOH, 1 g azul de Coomassie R250, 100 mL ácido acético,

Coomassie enrasado con agua hasta 1 L.

Medio de inducción de S.cer. SC-U con 2% (m/v) galactosa y 1% (m/v) glucosa.

Medio LB 25 g/L “Miller’s Luria Broth Base” de Invitrogen GmbH en agua.

Medio SOC 20 g bactotriptona, 5 g extracto de levadura, 2 mL NaCl 5 M, 2,5 mL

KCl 1 M, 10 mL MgCl2 1 M, 10 mL MgSO4, 20 mL glucosa 1 M,

enrasado hasta 1 L con agua.

PBS 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, enrasado a 1 L a

pH = 7,4.

PBT PBS con Tween 20, 0,1% (v/v)


42

Plato de LB 32 g/L “LB Agar Lennox L Agar” de Invitrogen GmbH y 3 g/L de agar

en agua.

Plato de SC-U SC-U con 20 g/L de agar.

Plato de YPD YPD con 20 g/L de agar.

Solución de lavado de 50 mL ácido acético, 165 mL etanol, enrasado con agua hasta 1 L.

Coomassie

Tinte de inyección de proteína 50 mM Tris-HCl pH = 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 1% β-

mercaptoetanol, 12,5 mM EDTA, 0,02% azul de bromofenol.

SC-U 3,35 g YNB sin aminoácidos, 0,575 g AAmix sin uracilo x5, 400 mL

agua, 100 mL glucosa 10% filtrada. Autoclave.

YNB 10x 134 g levadura con base de nitrógeno en 1 L agua. Autoclave.

YPD 10 g extracto de levadura, 20 g peptona en 950 mL agua. Autoclave.

Añadir 50 mL glucosa 40%.

II.2 Métodos

II.2.1 Extracción del contenido de hojas de E.coca

Tres réplicas de hojas de E.coca en diferentes fases de desarrollo –brote, hoja enrollada, hoja

joven, hoja adulta–, así como del tallo, se pesaron (peso fresco), se congelaron en N2(l) y se molieron

formando un polvo fino cuyo contenido se extrajo en 1 mL de solución 95% H2O, 4,9% MeOH, 0,1%

ácido fórmico, mezclando en agitador de vórtice, centrifugando durante 15 min a 13000 rpm y

tomando el líquido sobrenadante. El polvo restante se secó y se pesó (peso seco).

Los extractos se analizaron por LC-MS-IT y HPLC-UV (ver sección II.2.18) para identificar los

compuestos principales y para su cuantificación, respectivamente.

II.2.2 Reacción de recombinación LR

En un tubo PCR se pipeteó 1 μL vector pH9GW 150 ng/μL, 1,5 μL pDONR207 con EcBAHD4 100

ng/μL, 1 μL LR tampón 5x y 2 μL LR clonasa (“Gateway LR Clonase Kit”, Invitrogen GmbH) y se dejó

reaccionar a temperatura ambiente durante 2 h. Después se añadió 1 μL de proteínasa K para parar

la reacción.

El mismo proceso se siguió para las recombinaciones con pYesDest52 y pEP-Strep. Los métodos

II.2.2 al II.2.6 son comunes a los tres vectores.

II.2.3 Transformación en E.coli

Se añadió el producto de la reacción LR a 100 μL E.coli variedad Top10 (Invitrogen GmbH)

conservada a -80 °C, se incubó 20 min en hielo, se sometió la mezcla a un choque térmico de 30s a

42 °C y se incubó en hielo 2 min. Se añadieron 200 μL medio SOC, se incubó 1 h a 37 °C con


43

agitación, se transfirió a un plato de cultivo con medio LB y 50 μg/mL kanamicina y se incubó a 37 °C

durante 24 h. Transcurrido ese tiempo serán visibles colonias de bacteria.

En lugar de kanamicina se usó ampicilina 100 μg/mL para bacteria transformada con pYesDest52

y zeocina 25 μg/mL para la transformación con pEP-Strep.

Para transformaciones con vector extraído se sigue el mismo proceso usando 150 ng de vector en

lugar del producto de la reacción LR.

II.2.4 PCR de colonias

Para cada colonia escogida, se tomó la misma con una punta de pipeta, se tocó el fondo de un

tubo PCR con ella y se usó la misma punta para cultivo de 24 h (ver II.2.6 “Cultivo de E.coli y

extracción del vector ADN”). Al tubo PCR se añadieron 25 μL mezcla PCR y se puso en el programa

adecuado de un termociclador “Tpersonal Thermocycler” de Biometra GmbH.

Mezcla PCR: 18,5 μL agua, 5 μL Green GoTaq Reaction Buffer (Promega GmbH), 0,5 μL dNTPs 10

mM, 0,5 μL primer directo 10 μM, 0,5 μL primer reverso 10 μM, 0,5 μL Taq polimerasa.

Programa: 94 °C 5 min, 30x (94 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 2 min), 72 °C 7 min y termina con 4 °C

hasta la recogida de la muestra.

El producto de la PCR se confirmó por electroforesis de gel de agarosa para identificar los clones

positivos.

II.2.5 Electroforesis de gel de agarosa

10 μL por muestra de producto de PCR se procesaron en un “i-Mupid Mini Agarose Gel

Electrophoresis System” de Eurogentec Deutschland GmbH, con “Modified TAE Buffer” de Milipore

GmbH a 100 V durante 25 min en geles de agarosa (1 g agarosa en 100 mL “Modified TAE Buffer” y 6

μL bromuro de etidio para visualización bajo luz UV). Como marcador se usaron 5 μL escalera de

ADN de 1 Kb “1Kb DNA Ladder” de Invitrogen GmbH. Las fotos se tomaron bajo luz UV con un

equipo “GeneGenius Bio Imaging System” de Syngene Europe Office.

II.2.6 Cultivo de E.coli y extracción del vector ADN

De uno de los clones positivos confirmados por PCR de colonias y electroforesis de gel, se preparó

cultivo poniendo una punta de pipeta con restos de la colonia positiva en 5 mL medio LB y el

antibiótico necesario (ver sección II.2.3 “Transformación en E.coli”) en un tubo de 13 mL, incubando

por la noche a 37 °C y 220 rpm.

Las células cultivadas se centrifugaron 8 min a 4200 g, se descartó el sobrenadante y del

sedimento se extrajo el ADN con el kit “NucleoSpin Plasmid - Plasmid DNA Purification” de

Macherey-Nagel GmbH según el manual. La concentración del ADN se midió con un

espectrofotómetro NanoDrop 2000c de Thermo Fisher Scientific Inc. El vector se almacenó a -20 °C

para su posterior uso.

II.2.7 Secuenciación y análisis de ADN y proteína

Para secuenciación de ADN se usó el sistema de polimerasa “BigDye v1.1” de Applied Biosystems.

Se mezclaron 2 μL tampón BigDye, 2 μL polimerasa BigDye, 1 μL primer directo 10 pM, 100 ng ADN a


44

secuenciar y se enrasó hasta 10 μL con agua. La misma mezcla se preparó por separado con primer

reverso. Las mezclas se pusieron en el termociclador con el siguiente programa:

96 °C 5 min, 35x (96 °C 10 s, 55 °C 30 s, 60 °C 4 min) y termina con 4 °C hasta la recogida de la

muestra.

El producto se purificó con el kit “DyeEX Spin Kit” de Qiagen GmbH según el manual y se analizó

con un “ABI Prism Gen Analysator 3100” de Applied Biosystems..

El análisis de la secuencia de ADN, su traducción, y el alineamiento “blastp” se realizó con el

software “Geneious 5.3” de Biomatters Ltd.

II.2.8 Expresión de proteína en E.coli

100 μL E.coli variedad BL21(DE3) se transformaron con 100 ng vector pH9GW, se incubaron

durante la noche en platos con antibiótico y se preparó cultivo de 5 mL a partir de una colonia

aislada tomada con una punta de pipeta, incubándolo durante la noche a 37 °C a 220 rpm. 1 mL de

este cultivo se inoculó con 50 mL de medio LB y antibiótico en matraces de 250 mL y se cultivó a 37

°C y 220 rpm hasta una DO600 de 0,3-0,4, momento en que se añadieron 50 μL IPTG 1 mM para

inducir la producción de proteína y se cultivó durante 2 días a 18 °C y 220 rpm.

II.2.9 Lisis y colección de proteína en E.coli

El cultivo de 2 días se centrifugó 10 min a 4000 g y 4 °C, se descartó el sobrenadante y el

sedimento de células se resuspendió en 4 mL tampón de adsorción bis-tris a pH = 8,0 con 50 μg/mL

lisozima por cada gramo de sedimento. Se aplicaron 3 ciclos de sonicación de 3 min con un equipo

“UW 2070” de Bandelin Electronic GmbH al 70% de potencia.

El lisado se centrifugó a 15000 g durante 15 min a 4 °C y el sobrenadante se tomó como proteína

expresada (extracto crudo de proteína) y se utilizó para su posterior purificación.

II.2.10 Transformación en Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris

El vector pYesDest52 de Invitrogen recombinado y con el gen de EcHQT se transformó en

levadura S.cerevisiae variedad INV Sc-1 (Invitrogen), para lo cual se usó el kit “S.c. EasyComp™

Transformation Kit” de Invitrogen según el manual y el transformado se incubó en platos con medio

SC-U durante 48 h a 28 °C.

El vector pEP-Strep recombinado con el gen EcHQT se transformó en P.pastoris variedad KM71

por medio de electroporación. 5 μL vector (100 ng/μL) y 38 μL P.pastoris se mezclaron, se pusieron

en una cubeta de electroporación y se aplicó un pulso de 1,5 kV, 200 Ω, 25 μF con un equipo “Gene-

Pulser” de BioRad). Se añadió 1 mL sorbitol 1 M y se incubó en un tubo de 1,5 mL a 28 °C durante 2

h. 200 μL de las células incubadas se pusieron en platos de YPD con zeocina 100 μL/mL y se

incubaron a 28 °C durante 3 días.

II.2.11 Expresión de proteína en S.cerevisiae

Una colonia aislada, resultado de la transformación e incubación (ver apartado anterior), se puso

en 50 mL SC-U en matraces de 250 mL y se incubó a 30 °C y 250 rpm durante 2 días (hasta DO600 ≈

1,5). Para inducir la producción de proteína, trascurrido este tiempo se midió la DO600, se calculó el

volumen necesario para 50 mL DO600 = 0,4 y se centrifugó este volumen a 1500 g y 4 °C durante 5


45

min. El sedimento se resuspendió en medio de inducción de S.cerevisiae (SC-U con glucosa 1% y

galactosa 2%) y se transfirió a 50 mL medio de inducción. El cultivo se incubó a 30 °C y 250 rpm

durante la noche.

II.2.12 Expresión de proteína en Pichia pastoris

Una colonia aislada, resultado de la transformación e incubación, se puso en 50 mL de YPD con

100 μL/mL zeocina y se incubó en un matraz de 250 mL a 28 °C y 250 rpm durante 2 días. Para

inducir la producción de proteína, de este cultivo se tomaron 10 mL y se mezclaron con 90 mL

BMMY con 100 μL/mL zeocina y se incubó en un matraz de 500 mL a 28 °C durante 3 días, añadiendo

1% (v/v) MeOH dos veces al día.

II.2.13 Lisis y colección de proteína en Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris

El cultivo se centrifugó a 1500 g y 4 °C durante 5 min, se descartó el sobrenadante, el sedimento

se congeló en N2(l) y se almacenó a -80 °C. Para la colección de proteína fue resuspendido en 4 mL

tampón de adsorción tris-HCl por gramo de sedimento. A continuación se produjo la lisis para lo cual

dos métodos diferentes fueron usados: esferas de cristal u homogeneizador de alta presión.

Para el primero, un volumen de esferas de cristal lavadas con ácido (dp ≈ 0,5 mm) igual a la mitad

del volumen total se añadió en un tubo de 50 mL y se agitó en agitador de vórtice durante 4 min,

tres veces, con un minuto de incubación en hielo entre ciclos. Tras la última agitación se congelaron

en N2(l) para provocar la formación de cristales dentro de la levadura y producir la lisis.

Para el segundo, se usó un homogeneizador de alta presión de Stansted Fluid Power Ltd. a

aproximadamente 150 MPa, haciendo pasar la muestra 3 veces.

El lisado se centrifugó 15 min a 15000 g y 4 °C y el sobrenadante se usó para purificación de

proteína.

II.2.14 Purificación de proteína por cromatografía de afinidad (FPLC)

Las proteínas expresadas con etiquetas añadidas, bien His-tag o Strep-tag, se purificaron por

cromatografía de afinidad con un equipo “ÄKTA: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, Frac-950” de GE

Healthcare. Las columnas de afinidad también fueron provistas por GE Healthcare.

Para purificación de proteínas con His-tag se usó una columna “HisTrap FF crude 1 mL”

empaquetada con Ni-Sepharose™ 6 Fast Flow, siendo la interacción niquel-histidina la base de la

purificación. Los tampones usados fueron tampón bis-tris de adsorción y elución a pH = 7,5, y el flujo

de 1 mL/min. Previo a la purificación se equilibró la columna con 5 volúmenes de tampón de

adsorción.

Similar procedimiento se siguió para proteínas con Strep-tag, usando una columna “StrepTrap HP

1 mL” empaquetada con StrepTactin™ Sepharose™ High Performance. Los tampones usados fueron

el de adsorción y elución tris-HCl a pH = 8,0. Tras la elución se añadió 10% (v/v) glicerol a las

fracciones obtenidas.

Además, a las todas fracciones obtenidas por ambas purificaciones se les añadió DTT

(concentración final 0,5 mM) y se guardaron a -20 °C. Además, estas fracciones se usaron para

posterior análisis por electroforesis de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).


46

II.2.15 Electroforesis de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE)

Cada fracción a analizar se inyectó (0,25-12 μL, según la concentración prevista de proteína y del

tipo de tinción a realizar posteriormente) mezclada por incubación 10 min a 100 °C con 4 μL tinte de

inyección de proteína y enrasado a 16 μL con tampón de adsorción en cada hoyo del gel de

poliacrilamida (Geles “4-15% Tris-HCl Gel” de Bio-Rad Laboratories GmbH). Como marcador se usó la

escalera “BenchMark Protein Ladder” de Invitrogen GmbH. Las proteínas se separaron a voltaje

constante en un cámara de electroforesis de proteínas con SDS hasta que la banda azul del tinte de

inyección abandonó la parte inferior del gel (100 V, aprox. 1 h 45 min para detección azul de

Coomassie; 60 V, aprox. 3 h 30 min para detección con nitrato de plata).

Detección con azul de Coomassie. El gel se tiñó con unos 150 mL disolución de azul de Coomassie

durante 2 h con agitación moderada y se lavó con 2 veces con solución de lavado de Coomassie

durante 1 h con agitación moderada.

Detección con nitrato de plata. El gel se tiñó con el kit “SilverXpress Silver Staining Kit” de

Invitrogen GmbH según el manual.

II.2.16 Ensayo enzimático de actividad HQT

Para determinar la actividad HQT de las enzimas se realizaron ensayos enzimáticos. 10 μL ácido

quínico 5 mM, 1 μL p-cumaril-CoA 50 mM, 69 μL tampón de adsorción y 20 μL enzima se mezclaron

en insertos de viales y se dejó reaccionar el tiempo deseado a temperatura ambiente. La reacción se

paró con 10 μL HCl 1 M.

Para análisis cualitativo y semicuantitativo el producto se analizó por LC-MS-IT, mientras que para

análisis cuantitativo se realizó por LC-MS-TripleQuad.

Para los ensayos usados durante la caracterización cinética de EcHQT, se usó un volumen total de

30 μL (22,4 μL tampón fosfato pH = 7,5, 2 μL ACG 33 μM estándar interno, 2 μL ácido quínico en

diferentes concentraciones, 0,6 μL p-cumaril-CoA 50 mM y 3 μL enzima), y se paró la reacción tras 30

min con 3 μL HCl 1 M.

La optimización de la actividad en relación a la adición de cationes se realizó usando

concentraciones finales de catión 5 mM, todos ellos en forma de cloruro (CaCl2, CoCl2, CuCl2, FeCl2,

KCl, MgCl2, MnCl2, NaCl, ZnCl2)

II.2.17 Ensayo Bradford de proteínas

Para determinar la concentración de la proteína purificada se usó el kit “Bio-Rad Protein Assay

Dye Reagent Concentrate” además de albúmina de suero bovino (BSA) como estándar, ambos de

Bio-Rad Laboratories GmbH.

La recta de calibrado se preparó en cubetas desechables de PMMA según la siguiente tabla.

BSA (μg) 0 1,3 2,5 5,0 7,5 10,0

BSA 1,39 mg/mL (μL) 0 0,94 1,8 3,6 5,4 7,2

Tampón de adsorción (μL) 20 19,06 18,2 16,4 14,6 12,8

Tabla 2: Recta de calibrado de BSA.


47

Para la muestra, dos volúmenes de proteína (p.ej 10 μL y 20 μL) se enrasaron hasta 20 μL con el

tampón de adsorción respectivo.

A cada cubeta se añadieron 0,98 mL de mezcla de colorante Bio-Rad y agua en relación 0,2:0,78, y

se dejó reaccionar durante 10-20 min. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 595nm

usando la muestra estándar de 0μg como blanco.

II.2.18 Reconcentración y desalinización de proteínas

Para proteínas cuya concentración medida por el ensayo Bradford apareció por debajo del primer

punto de la recta de calibrado, se usaron columnas de centrifugación “Microsep™ Centrifugal

Devices” de Pall Corp. La proteína se centrifugó durante 20-30 min a 7500 g y 0 °C en columnas

elegidas con una membrana de tamaño de paso de 10 kDa hasta la reducción del volumen inicial a la

mitad (20-30 min). La fracción que quedó por encima de la membrana se pipeteó y almacenó en

tubos de 1,5 mL a -20 °C.

II.2.19 Análisis de muestras mediante LC-MS-IT y HPLC-UV

Tanto para los extractos de E.coca como para el producto de los ensayos de actividad HQT, el

análisis por LC-MS-IT y/o HPLC-UV se llevó a cabo en fase reversa en columnas de sílica modificada

con octadecilo y propilfenilo de dimensiones 250 mm x 4,6 mm x 5 μm (longitud x diámetro interno x

tamaño de partícula) “Nucleodur Sphinx RP 5 μm” de Macherey-Nagel GmbH.

LC-MS-IT: Esta técnica se utilizó para análisis cualitativo o semicuantitativo y para identificación

de compuestos desconocidos. Se usó un equipo “HPLC-1100 series” de Agilent Technologies,

acoplado a un espectrómetro de masas de trampa de iones “Esquire 6000 ESI-Ion Trap” de Bruker

Daltonics en modo alterno de polaridad. El volumen de inyección fue de 20 μL. El nebulizador se

programó a una presión de 40 psi; la temperatura de secado fue de 330 °C; el voltaje a la salida del

capilar 113,5 V; el flujo de gas 11 L/min. La trampa de iones se programó con un rango m/z 60-1000

centrado en m/z = 300; la señal se promedió a partir de cuatro lecturas; el tiempo máximo de

acumulación fue de 100 ms.

La separación duró 33 min y se realizó a 25 °C. Como fase móvil se usó un flujo de 1 mL/min de

disoluciones A / B (ácido fórmico 0,2% / acetonitrilo) con el siguiente gradiente:

Tiempo (min) 0,00 21,00 27,00 27,10 29,10 33,00

% A 90 69 45 0 90 90

% B 10 31 55 100 10 10

Tabla 3: Gradiente de disolventes A / B usado como fase móvil en LC-MS-IT y HPLC-UV.

HPLC-UV: Esta técnica se usó para cuantificación de cocaína, cinamilcocaína y ACG en extractos

de E.coca. El equipo y las condiciones de la cromatografía usadas fueron idénticos a los de LC-MS-IT

a excepción del ácido fórmico 0,2%, que fue sustituido por TFA 0,05%. El volumen de inyección fue

de 40 μL. La detección se realizó por absorción UV con cadena de diodos (diode-array) a las

longitudes de onda 235 nm, 280 nm y 320 nm para cocaína, cinamilcocaína y ACGs,

respectivamente.


48

II.2.20 Análisis de muestras mediante LC-MS-TripleQuad

Este método de análisis se usó para la cuantificación de analitos por su alta sensibilidad y bajo

límite de detección. Se utilizó para los experimentos de lavado de hojas de E.coca, así como para el

análisis del producto de los ensayos de actividad HQT, el ácido cumarilquínico.

La cromatografía se llevó a cabo con un equipo “HPLC-1200 series” de Agilent Technologies

acoplado a un espectrómetro de masas en tándem de triple cuadrupolo “API 3200” de Applied

Biosystems, en una columna “ZORBAX RRHT Eclipse XDB-C18” de Agilent Technologies, con

dimensiones 50mm x 4,6mm x 1,8 μm (longitud x diámetro interno x tamaño de partícula).

Los parámetros usados para la detección de de ACG y ácido cumarilquínico fueron: volumen de

inyección, 5 μL; fuente de iones de turbo espray; modo negativo de polaridad; CUR (curtain gas) 25

psi; TEM (turbo heater temperature) 700 °C; GS1 (gas 1), 60 psi; GS2 (gas 2), 70 psi; ihe (interface

heater), ON; CAD (collision activation dissociation), 6psi; IS (ion spray), -4500 V; DP (declustering

potential), -35 V; EP (entrance potential), -4 V; CEP (cell entrance potencial), -36 V; CE (collision

energy), -22 V; CXP (cell exit potential), -4 V; tiempo de adquisión, 100 ms; y el modo de escaneo fue

MRM con valores de m/z para iones iniciales y fraccionados de 353,13 190,88 (ácido clorogénico)

y 337,13 190,88 (ácido quínico).

La separación duró 8 min a 20 °C con un flujo de 800 μL/min usando ácido fórmico 0,05% en agua

(A) y acetonitrilo (B) fase móvil, con el siguiente perfil de elución:

Tiempo (min) 0,00 0,50 4,00 4,10 5,00 5,10 8,00

% A 95 95 40 0 0 95 95

% B 5 5 60 100 100 5 5

Tabla 4: Gradiente de disolventes A / B usado como fase móvil en LC-MS-TripleQuad.

II.2.21 Detección y análisis del par ACG-cocaína por espectrofotometría UV-Visible

Inicialmente, para detectar interacción entre ambos compuestos, se midió el espectro entre 350-

380 nm de disoluciones acuosas de hidrocloruro de cocaína 4 mM y ACG 0,2 mM por separado y

juntos en una sola disolución, usando cubetas de cuarzo “QS 104.002B-QS” de Hellma Analytics y

agua como blanco en un equipo “UV-2501PC” de Shimadzu Corp. Se usó una abertura de 0,1 nm,

con medidas de espectro cada 0,5 nm en modo de lectura muy lento.

Para estudiar más a fondo la localización de la interacción se usaron disoluciones de tropina 4

mM en ACG 0,2 mM y de ácido benzoico 4 mM en ACG 0,2 mM y agua como blanco.

Para medir la KC, se usaron disoluciones de ACG 0,2 mM y cantidades crecientes de hidrocloruro

de cocaína (25, 100, 150, 200, 250 y 300 mM), usando ACG 0,2 mM como blanco.

II.2.22 Análisis del par ACG-cocaína por RMN (Resonancia Nuclear Magnética)

Se llevaron a cabo medidas de espectro 1H monodimensional y de espectro de correlación

bidimensional (COSY-90), de manera que se asignó cada pico del espectro a su correspondiente

protón en la molécula de ACG o cocaína. Las medidas se realizaron principalmente en un equipo

“DRX500” de Bruker BioSpin. Las muestras se prepararon en tampón fosfato deuterado 10 mM, pD =

7,5, a una temperatura de 300 K. La supresión de la señal del H2O se realizó según el método PURGE

(Simpson y Brown, 2005).


49

El desplazamiento del espectro 1H de una muestra de ACG 0,2 mM se midió en presencia de 50

mM usando TMSP-d4 3% en D2O como patrón externo ajustado a 0,0ppm, en tubos de Ø = 5 mm. De

la misma manera, el espectro una muestra de cocaína 0,2 mM se midió en presencia de ACG 50 mM.

II.2.23 Lavado de cocaína de discos de E.coca

Brotes de E.coca y discos de Ø = 1 cm perforados de hojas adulta y joven y se pusieron en

diferentes vasos de precipitados con 25 mL agua y 0,005% triton x-100, puestos a su vez en un

desecador al que se aplicó vacío durante 96 h y se tomaron muestras empezando cada 30 min y

posteriormente más espaciadas. Las muestras se analizaron mediante LC-MS-TripleQuad.

El contenido de cocaína no lavada, así como el contenido de ACG, se extrajeron (ver “II.2.1

Extracción del contenido de hojas de E.coca”) y cuantificaron mediante LC-MS-TripleQuad diluído

1:1000.

II.2.24 Inmunohistoquímica (preparación del tejido)

Fijación: Hojas de E.coca y hojas de Arabidopsis thaliana se cortaron en trozos de ≈ 1 cm de

longitud que se sometieron a vacío inmersos en una solución EtOH 63%, ácido acético 5%,

formaldehido 2%, ácido tánico 1 g/100 mL durante 2 h (Stephen et al., 1998). Posteriormente se

dejó el tejido en la solución durante 12 h sin aplicar vacío.

Lavado y encerado: El tejido se lavó dos veces con PBS durante 10 min. Posteriormente 1 h en

cada disolución de EtOH (10%, 30%, 50%, 70%, 95%), seguido de 1 h en cada disolución EtOH:Roti®-

Histol, 3:1, 1:1, 1:3, Roti®-Histol 100%. Tras el último lavado puso el tejido en viales con unos 7 mL

de Roti®-Histol y se mantuvo en un horno a 60 °C.

Embebido: Gota a gota se añadió Paraplast® precalentado a 60 °C hasta doblar el volumen y se

incubó durante 24 h. Esta operación se repitió 3 veces. Finalmente se embebió el tejido en pequeños

bloques de Paraplast® dejando enfriar a temperatura ambiente.

Seccionado: Del bloque de Paraplast® se cortaron secciones de 10 μm de grosor en un micrótomo

“Microm HM355 S”, se pusieron en láminas de cristal con polilisina y se incubaron a 42 °C durante 12

h. Posteriormente se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

II.2.25 Inmunohistoquímica (procedimiento)

Desencerado: Las láminas de cristal con el tejido a analizar se lavaron en Roticlear® 2 veces, 10

min cada una. Seguido, Roticlear®:EtOH 1:1, 5 min.

Rehidratación: Se lavó el tejido 2 min en cada disolución de EtOH (95%, 70%, 50%, 30%, 10%), y

dos veces en H2O.

Bloqueo de peroxidasas endógenas: El tejido se lavó en H2O2 0,3% en MeOH durante 30 min.

Incubación de anticuerpos primarios: Dos lavados con PBS durante 5 min se llevaron a cabo,

seguidos de otro con BSA 1% en PBS durante 1 h. Siguieron dos lavados de 5 min con PBT y

finalmente se añadió el anticuerpo primario anti-cocaína en diferentes diluciones en BSA 1% en PBS

(100 μL/muestra). Las muestras se cubrieron con una lámina de cristal y se incubaron durante 12 h a

4 °C.


50

Los anticuerpos primarios policlonales fueron cosechados en oveja, provistos por RayBiotech,

Inc., mientras que los monoclonales fueron cosechados en ratón, provistos por GeneTex, Inc.

Incubación de anticuerpos secundarios: Se lavaron las muestras en PBT dos veces, 5 min cada

una, y se añadió el anticuerpo secundario ligado a peroxidasa –HRP– (anti-oveja o anti-ratón, según

el anticuerpo primerio usado) en diferentes diluciones en PBS con BSA 1% (100 μL/muestra). Las

muestras se cubrieron con una lámina de cristal y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h.

Los anticuerpos secundarios anti-oveja fueron cosechados en vaca, provistos por Santa Cruz

Biotechnology Inc., mientras que los anticuerpos anti-ratón fueron cosechados en cabra, provistos

por Sigma-Aldrich, Inc.

(A) Detección con DAB: A cada muestra se añadieron 100 μL de DAB (10 μL DAB 10x en 90 μL de

Substrato Peróxido Estable 1x) y se incubó a temperatura ambiente durante 8 min. Seguidamente se

lavaron las muestras en PBT para parar la reacción.

Las láminas se analizaron bajo un microscopio óptico “Zeiss Axiovert 200” con cámara

acoplada “Zeiss Axiocam MRc5”.

(B) Detección con tiramida: A cada muestra se añadieron 100 μL de solución de tiramida a

partir del kit “Tyramide Signal Amplification Alexa Fluor® 546”.

Las láminas se analizaron bajo un microscopio confocal “Zeiss Confocal LSM510”.

II.3 Secuencias de ADN

Vectores

El vector pH9GW usado para expresión en E.coli es una modificación del vector pET-T7 (28a) de

Merck KGaA (Novagen), con un tag de polihistidina (9xHis), la secuencia attR Gateway, y resistencia

a la kanamicina (Yu y Liu, 2006).

El vector Gateway® pYesDest52 usado para expresión en S.cerevisiae y con resistencia a la

ampicilina es un vector de Invitrogen GmbH modificado con un strep-tag y la secuencia attR

Gateway.

El vector pEP-Strep usado para expresión en P.pastoris y con resistencia a la zeocina es una

modificación del vector pICHOLI de MoBiTec GmbH con un strep-tag y la secuencia attR Gateway.

Primers

Para PCR y secuenciación de EcBAHD4 en el vector pH9GW se usaron los primers T7 promoter y

T7 terminator; para el vector pYesDest52, T7 promotor y V5 reverse; y para el vector pEP-Strep,

5’AOX y 3’AOX.

Primer Secuencia (5’3’)

T7 Promoter TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG

T7 Terminator CCC AAG GGG TTA TGC TAG TT

V5 Reverse ACC GAG GAG AGG GTT AGG GAT

5‘AOX GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC

3‘AOX GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC


51

II.4 Desarrollos de ecuaciones

II.4.1 Modelo de Michaelis-Menten

A) Un solo substrato, sin inhibición

E = Enzima; S = Substrato; P = Producto

K’M = Constante de Michaelis-Menten; ki = constante cinética

Suponiendo una reacción irreversible:

La velocidad de reacción es, tomando la conversión a producto como etapa limitante, k-1>>kcat:

La concentración de enzima libre es la total (inicial) menos la adsorbida , por

tanto:

Sustituyendo en la ecuación (3):

B) Un solo substrato. Inhibición por substrato (acompetitiva)

En este caso, la ecuación (1) quedaría:

donde


52

Y asumiendo equilibrio rápido, la velocidad de formación de producto queda:

II.4.2 Derivación de la ley de Beer-Lambert aplicada al complejo ACG-cocaína

ACG = ácido clorogénico; C = complejo; TA = Tropano alcaloide (cocaína)

A(λ) = Absorbancia a la longitud de onda considerada; ε = Absortividad molar; KC = constante de

formación del complejo

Asumiendo un complejo ACG:TA en relación 1:1:

La concentración de TA y ACG es la inicial menos la que está en forma de complejo,

,

Teniendo en cuenta que la absorbancia total es la suma de las absorbancias de las tres especies

[ACG], [TA], [C], la ley de Beer-Lambert para una cubeta de 1 cm de longitud (l), queda:

Sustituyendo (8) en (4), y si se elige la longitud de onda y el blanco tal que la absorbancia de la

cocaína y del ACG se hacen prácticamente cero, la ecuación queda:

Anexo III: Resultados complementarios

53


En las páginas siguientes se muestran gráficas e imágenes en relación con los experimentos de

RMN e IHQ que por espacio no se han incluido en la memoria del PFC.


54

Figura 35: Resonancia Magnética Nuclear. Comparación del espectro 1H completo del ACG por separado y en presencia de cocaína.


55

Figura 36: Resonancia Magnética Nuclear. Comparación del espectro 1H de la cocaína por separado y en presencia de ACG. La zona del espectro mostrada corresponde a valores altos del

desplazamiento químico (ppm), es decir, a la parte aromática de la molécula.


56

Figura 37: Resonancia Magnética Nuclear. Comparación del espectro 1H completo de la cocaína por separado y en presencia de ACG.


57

Figura 38: Resonancia Magnética Nuclear. Espectro de correlación homonuclear bidimensional (COSY) del ACG en presencia de cocaína. El espectro COSY ayuda a determinar la posición exacta de ciertos picos no detectables por espectroscopía

1H como el mostrado en rojo, cuya señal en el espectro

1H es incierta debido la señal de la cocaína.


58

Figura 39: Magnética Nuclear. Espectro de correlación homonuclear bidimensional (COSY) de la cocaína en presencia de ACG. El espectro COSY ayuda a determinar la posición exacta de ciertos picos no detectables por espectroscopía

1H como el mostrado en rojo, cuya señal en el espectro

1H es incierta debido la señal del ACG.


59

Figura 40: Inmunohistoquímica. Detección –con DAB– de cocaína realizada en una hoja adulta de E.coca. Ambas imágenes tomadas entre la vena central y el extremo de la sección trasversal de la hoja con un aumento 10x. (A) Control negativo, sin anticuerpos; (B) protocolo completo (con anticuerpos).


60

Figura 41: Inmunohistoquímica. Detección de cocaína realizada en una hoja de A.thaliana. Imagen (A) tomada en el extremo de la sección trasversal de la hoja con un aumento 20x; imagen (B) tomada hacia la mitad de la sección con un aumento 10x. Izquierda, imagen fluorescente; centro, campo claro (luz normal); derecha, imágenes superpuestas.

Anexo IV: Glosario

61

Anexo IV: Glosario

Aminoácido (proteína): Molécula orgánica que contiene un grupo amino y otro carboxilo.

Cada uno de los bloques que componen una proteína.

Analgésico: Medicamento que calma o elimina el dolor.

Anticolinérgico: Compuesto que reduce los efectos del neurotransmisor acetilcolina en

el sistema nervioso central y el sistema nervioso periférico.

Anticuerpo: Proteína en forma de “Y” usada por el sistema inmune para identificar

o neutralizar cuerpos extraños.

- Monoclonales: Anticuerpos con afinidad por el mismo antígeno

que son idénticos entre sí por proceder de células también

idénticas clones de la misma célula madre.

- Policlonales: Anticuerpos que provienen de diferentes células

madre.

Antígeno: Sustancia que, cuando se introduce en un cuerpo, provoca una

respuesta inmune por parte del mismo, generando anticuerpos que

reconocen y neutralizan dicha sustancia.

Tampón de adsorción: Es el primero de los tampones usados durante la purificación de una

proteína por cromatografía de afinidad, siendo el otro el tampón de

elución. La lisis celular así como la posterior colección de proteína y

otros análisis de la misma se realizan comúnmente en tampón de

adsorción.

Tampón de elución: (Ver “Tampón de adsorción”).

Citoplasma: Emulsión coloidal fina de aspecto granuloso que reside dentro de la

membrana celular y cuya función es albergar los orgánulos de la

célula, excepto el núcleo. Está compuesto por el citosol y los

orgánulos.

Citosol: Parte líquida del citoplasma.

Codón: Cada triplete de nucleótidos (A, C, G, T) que codifica un aminoácido.

P.ej. ATG (codón de inicio) se transcribe a AUG, que se traduce al

aminoácido metionina.

Coenzima: Es un tipo de cofactor orgánico; un compuesto químico no proteico

que se adhiere a una proteína –normalmente enzimas– y que es

requerido para la actividad biológica de la misma.

Anexo IV: Glosario

62

Control negativo: Control que descarta la posibilidad de que un resultado se deba a un

efecto no relacionado con el experimento en cuestión, es decir, es un

experimento de no debería funcionar.

Control positivo: Control que confirma la veracidad de un resultado, es decir, es un

experimento que debería funcionar.

Electroforesis de gel Técnica usada comúnmente para analizar fragmentos de ADN. Puesto

que de agarosa (ADN): el ADN está cargado negativamente, la aplicación de corriente

eléctrica entre los extremos del gel de agarosa donde se inyecta el ADN,

permite su separación en función del tamaño.

Ensayo Bradford de Ensayo colorimétrico para determinar la concentración de una

proteína, proteínas: basado en la interacción de la proteína con el azul de Coomassie G-

250. Mayor concentración de proteína implica mayor interacción y por

tanto mayor estabilización de la forma azul del colorante, lo cual se puede

cuantificar por espectrofotometría preparando una recta de calibrado

con un patrón externo como la albúmina de suero bovino.

Enzima: Proteína que cataliza una reacción química.

Expresión (proteína): Proceso mediante el cual la información codificada en un gen (ADN) se

usa para la síntesis de una proteína mediante la transcripción y

traducción.

Extracto crudo de proteína: Proteína no purificada, obtenida tras la lisis celular.

Flowthrough: En purificaciones por cromatografía de líquidos, p.ej. FPLC, es la

primera fracción en abandonar la columna tras la inyección,

correspondiente al analito no retenido. Luego de la misma le suceden

el lavado y las fracciones purificadas.

Gen: Secuencia lineal de nucleótidos en una molécula de ADN con la

información necesaria para la síntesis de una macromolécula con

función celular específica, normalmente proteínas.

Inmunohistoquímica: Procedimiento basado en el uso de un anticuerpo para la detección de

una especie (antígeno) en un tejido biológico. El anticuerpo está

acoplado a una especie química que permita su visualización, p.ej. una

enzima que transforme un substrato en visible.

Inocular: Introducir un organismo en un medio para su cultivo y reproducción.

P.ej. Inocular una colonia de bacteria en 50 mL de cultivo.

Lisis (celular): Proceso mediante el cual se rompe la membrana celular, liberando

todo el contenido, incluidas las proteínas almacenadas en el

citoplasma.

Anexo IV: Glosario

63

Marco abierto de lectura: Cualquier secuencia de ADN entre un codón de inicio y uno de

terminación.

Minipreparación (ADN): Extracción a pequeña escala de ADN plásmido de una bacteria. En este

PFC hace referencia a la extracción del vector ADN introducido.

Patógeno: Que origina y desarrolla una enfermedad.

Par de bases: Par de nucleótidos opuestos y complementarios.

PCR: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica usada en

biología molecular para, a partir de una o de pocas copias de ADN,

producir miles de millones en pocas horas. En la PCR de colonias, al

empezar con células en vez de con ADN “puro”, se rompe la pared

celular en primer lugar para posteriormente amplificar el ADN

contenido en la misma.

Polipéptido: Cadena lineal de aminoácidos.

Proteína: Compuesto bioquímico que consiste en uno o más polipéptidos

típicamente plegado en forma de glóbulo o fibra de un modo

biológicamente funcional.

Recombinación de ADN: Proceso por el cual una hebra de material genético es rota y luego

unida a una molécula de material genético diferente.

Replicación: Proceso de duplicar una molécula de ADN, necesario cada vez que un

organismo se reproduce.

SDS-PAGE: Técnica comúnmente usada en bioquímica para análisis de proteína.

Gracias al medio de dodecilsulfato de sodio (SDS), todas las proteínas

adquieren la misma relación carga/masa, por lo que pueden ser

separadas en función de su masa por electroforesis a voltaje

constante.

Sobrenadante: Líquido que queda sobre la fase sólida tras centrifugar una mezcla

sólido-líquido.

Traducción: Uno de los procesos del dogma central de la biología molecular

mediante el cual se crea una proteína a partir de ARN, creado a su vez

a partir del ADN complementario.

Transcripción: Uno de los procesos del dogma central de la biología molecular

mediante el cual se crea una molécula de ARN a partir del ADN

complementario a ésta.

Transformación: Introducción de ADN externo en una bacteria. Aunque comúnmente

usado también para levaduras, el término riguroso para las últimas es

“transducción”.

Anexo IV: Glosario

64

Vacuola: Orgánulo celular presente en plantas que ocupa entre el 40 y el 98%

de la célula. Es un compartimento cerrado que contiene agua con

diferentes sales disueltas así como enzimas. Entre sus funciones está,

además de la de contener agua y otros compuestos que puedan ser

tóxicos para la célula, la de mantenerla turgente.

Vector (ADN): Molécula de ADN usada para transferir material genético externo en

una célula.

b e Ácido clorogÉnico en erythroxylum coca · alkaloid biosynthesis” en el instituto max planck...

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