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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
AISLAMIENTO DE CEPAS MÓVILES E INMÓVILES DE Salmonella spp. EN
CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN CAMALES INDUSTRIALES DE LA
PROVINCIA DE PICHINCHA
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para obtener el Título de Médico
Veterinario y Zootecnista
Grado Académico de Médico Veterinario y Zootecnista
AUTOR:
Nataly Estefanía Larco Andrade
TUTOR:
Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos M.Sc.
Quito, junio 2015
ii
DEDICATORIA
Dedicado a Gonzalo y María del Carmen, mis Padres, que por su esfuerzo y apoyo
incondicional han hecho posible que esta sea una meta cumplida, gracias Papis los quiero
mucho.
Nataly
iii
AGRADECIMIENTO
Agradezco a mis Padres que gracias a los valores inculcados a lo largo de mi vida han hecho de mí una
persona de bien. Gracias papis porque por ustedes sus hijas son su máximo orgullo.
A mis hermanas, Pamela y Yessenia, que han compartido conmigo toda una vida de altos y bajos
apoyándonos y ayudándonos siempre en todo. Gracias ñañas les quiero mucho. Un especial
agradecimiento a ti Chio que has formado parte de todos aquellos momentos importantes siendo una
madre más para nosotras; a mi sobrino Dylan que con su luz vino a cambiar nuestro mundo y queremos
ser para ti un gran ejemplo a seguir.
A mi tutor el Dr. Christian Vinueza y la Dra. María Belén Cevallos Directora del Laboratorio de
Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria (UCE) por brindarme la oportunidad de formar
parte de su equipo de trabajo y confiarme la realización del presente trabajo.
A los Gerentes de las empresas que forman parte del proyecto por darnos la apertura a las instalaciones
para realizar el presente trabajo.
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador y al
Laboratorio de Bacteriología de la FMVZ por facilitarme el uso de sus instalaciones y equipos durante
la realización del trabajo de tesis.
Valeria y Sofía gracias por su ayuda y apoyo durante el trabajo en el laboratorio haciendo del tiempo
que compartimos mucho más ameno. Mil gracias Chicas.
A todos mis amigos/as con quienes he compartido toda una carrera universitaria, haciendo de esta
etapa de nuestras vidas la mejor de las experiencias. Se me haría interminable nombrarlos, gracias a
todos/as.
fV
A{ITOBIZACIÓN DD LA ATITORÍA INTELECTUAL
Yq Nataly Estefanía Larco Andrade en calidad de autor del trabajo de la tesis realizada sobre..AISLAMIENTO DE CEPA§ MéVILE§ E NII¿ÓVU,ES DE SA\TWNEIIO §PP. ENCONTENIPO CECAL DE POLLO§ FAENADOS EN CAMALE§ INDU§TRTALES DE LAPROYINCIA DE PICHINCHA', por la presente a¡fiorizo a la LINWERSIDAD CENTRALDEL ECUADO& haeer um de todss los contenidos ql¡e nl€ pertanecea o de pmte de los que
contienen esta obra, con fisss esricfsnente rcdémicos o & investigrcioo_
Lcs derryhos qr¡e &mo autor rne cor.reepnder¡ eon exsepsión de la presente autorización,
ceguir&t vigenbs a mi ftvor, ds conformidad con lo esablesido en los artículos 5.6.8; 19 ydemas pe*inertes de la try ds Propiedad Intelscfi¡er y su Reglamento
Quito, a 11 de junio dÉl 2015
FIRMA
c.c.17227410s3
nathy_stefa@hotmail. es
vii
ÍNDICE GENERAL
CONTENIDO pp
LISTA DE CUADROS .......................................................................................................... viii
LISTA DE GRÁFICOS ......................................................................................................... viii
RESUMEN ............................................................................................................................... ix
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 1
CAPÍTULO I ............................................................................................................................. 2
EL PROBLEMA ................................................................................................................... 2
Planteamiento del problema .............................................................................................. 2
Justificación ....................................................................................................................... 3
OBJETIVOS ......................................................................................................................... 4
General .............................................................................................................................. 4
Específicos ........................................................................................................................ 4
CAPÍTULO II ........................................................................................................................... 5
MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 5
Antecedentes ..................................................................................................................... 5
Fundamentación Teórica ................................................................................................... 5
CAPÍTULO III ........................................................................................................................ 17
METODOLOGÍA ............................................................................................................... 17
Determinación de métodos a utilizar ............................................................................... 17
Tipo de investigación ...................................................................................................... 17
Diseño de la investigación ............................................................................................... 17
Descripción de la zona de estudio ................................................................................... 17
Población y muestra ........................................................................................................ 18
Muestra ............................................................................................................................ 18
Procedimiento de la investigación ................................................................................... 18
CAPITULO IV ........................................................................................................................ 22
Resultados ........................................................................................................................... 22
Discusión de resultados ....................................................................................................... 30
CAPÍTULO V ......................................................................................................................... 32
Conclusiones ....................................................................................................................... 32
Recomendaciones ................................................................................................................ 33
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 34
viii
ANEXOS................................................................................................................................. 39
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Especies y subespecies del género Salmonella spp. ……………..…..…….…. 6
Cuadro 2. Crecimiento de Salmonella spp en agar MSRV y Caldo Selenito ……..…..….. 24
Cuadro 3. Resultados de las pruebas bioquímicas en las muestras positivas
a Salmonella spp. .…………………………….………………………..………………. 25
Cuadro 4. Resultados de movilidad en cepas aisladas desde
Caldo Selenito …….…………………………………………………...……….……….. 28
Cuadro N° 5. Resultados de aislamiento de Salmonella spp.
de seis plantas de faenamiento ……….……………………………...…….…………….... 28
Cuadro 6. Resultados de aislamiento de Salmonella spp. en
las granjas muestreadas …………………………………..…………….…………….... 29
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Siembra en agar MSRV, resultados obtenidos luego
de incubación ………………...………………………………………………………… 22
Gráfico 2. Tubos con Caldo Selenito……………………….…………………………….. 22
Gráfico 3. Siembra en agar XLD, resultados obtenidos luego
de incubación …………………………………………………………………...……… 23
Gráfico 4. Resultados en TSI, Urea, Lisina e Indol obtenidos luego
de incubación …………………………………………………………...……………… 23
ix
AISLAMIENTO DE CEPAS MÓVILES E INMÓVILES DE Salmonella spp. EN
CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN CAMALES INDUSTRIALES DE
LA PROVINCIA DE PICHINCHA
Autor: Nataly Estefanía Larco Andrade
Tutor: Dr. Christian Vinueza M.Sc.
Fecha: Mayo, 2015
RESUMEN
Salmonella spp. es una enterobacteria localizada principalmente en el tracto gastrointestinal de
seres humanos y animales. Es la causante de salmonelosis que es la principal enfermedad
transmitida por alimentos (ETA) y diarrea en humanos. Además en pollos cuando produce
enfermedad causa alta morbilidad y mortalidad, derivando en grandes pérdidas económicas a
la industria avícola. El objetivo de esta investigación fue aislar cepas móviles e inmóviles de
Salmonella spp. de contenido cecal de pollos faenados en camales industriales de la Provincia
de Pichincha – Ecuador, mediante métodos microbiológicos. Al final del período de muestreo
se obtuvo un total de 181 muestras. Dichas muestras fueron analizadas con medio semisólido
Rappaport-Vassiliadis (MSRV) y Caldo Selenito, y confirmadas con pruebas bioquímicas. Se
obtuvo 34 aislamientos positivos (18,78%) de Salmonella spp., de los cuales 31 (91,18%)
fueron aislados a partir de MSRV y 11 (32,35%) a partir de Caldo Selenito. La presencia de
Salmonella spp. en pollos al faenamiento da indicios de la posible contaminación con la
bacteria de carcasas de pollos destinados al consumo, que pueden causar problemas de Salud
Pública.
Palabras clave: Salmonella spp., CEPAS MÓVILES, CEPAS INMÓVILES, MSRV,
CALDO SELENITO.
x
ISOLATION OF MOBILE AND INMOBILE STRAINS OF Salmonella spp. CECAL
CONTENT OF CHICKEN SLAUGHTERES IN INDUSTRIAL SLAUGHTERHOUSES
OF PICHINCHA PROVINCE.
ABSTRACT
Salmonella spp. is an enterobacterium mainly located in the gastrointestinal tract of humans
and animals. Salmonellosis is the main disease transmitted by food (FBD) and cause diarrhea
in humans. When the disease occurs in chickens, it causes a high morbidity and mortality,
causing high economic losses in poultry. The purpose of the investigation was isolating mobile
and immobile strains of Salmonella spp. in cecal content of poultry in industrial
slaughterhouses in Pichincha Province - Ecuador, through microbiological methods. At the
end of the investigation, a total of 181 samples were obtained. Samples were analyzed with
semi-solid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) and Selenite broth, and through biochemical tests.
Were obtained 34 positive strains of Salmonella spp. were obtained (18.78%), which 31
(91.18%) were isolated from MSRV and 11 (32.35%) from Selenite broth. The presence of
Salmonella spp. in slaughtered chickens is the departure point of possible contamination with
bacterium, contained in chicken carcasses intended for consumption that can cause public
health problems.
Keywords: Salmonella spp., MOBILE STRAINS, INMOBILE STRAINS, MSRV,
SELENITE BROTH
1
INTRODUCCIÓN
La salmonelosis es una de las principales enfermedades transmitidas por los alimentos
(ETAs). Debido a su carácter endémico, alta morbilidad y la asociación con el consumo de
una amplia gama de alimentos contaminados (en especial alimentos de origen animal), esta
enfermedad zoonótica es de gran preocupación para la salud pública (de Freitas et al., 2010).
Las aves de corral son una fuente de diseminación de Salmonella spp. en humanos, ya que
pueden ser portadoras de la bacteria y durante el proceso de faenamiento contaminar las
carcasas que son destinadas al consumo humano.
En aves de corral, la salmonelosis representa un gran problema en el área avícola debido a que
produce alta morbilidad y mortalidad de los animales y por consiguiente grandes pérdidas
económicas.
El propósito de esta investigación fue aislar cepas móviles (zoonóticas) e inmóviles (aviares)
de Salmonella spp. a partir del contenido cecal de pollos faenados en camales industriales de
la provincia de Pichincha, ya que la presencia de estas bacterias en el tracto gastrointestinal de
las aves nos puede indicar la existencia de estas en los diferentes procesos productivos de las
empresas avícolas.
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
Planteamiento del problema
La salmonelosis, infección causada por Salmonella spp., es de importancia tanto en salud pública como
en salud animal debido al impacto económico que ocasiona (Figueroa & Verdugo, 2005). Tiene una
distribución mundial, siendo más prevalente en áreas donde hay producción pecuaria intensiva,
especialmente de aves y cerdos (OIE, 2010).
Debido a que Salmonella spp. normalmente se encuentra en aves de corral, su carne ha sido un
vehículo importante en la transmisión de la enfermedad. En muchos países, el pollo es de amplio
consumo y se expende principalmente como carne congelada (Medeiros, Oliveira, Rodrigues, &
Freitas, 2011).
Actualmente con el incremento del comercio de comida, carne animal y ganado, así como el
incremento de viajes y la migración humana, han permitido que la enfermedad no se limite a un solo
país (Hendriksen et al., 2011).
Es así que durante los años 2001-2007 se estimó que Salmonella spp. causó 93,8 millones de
infecciones en humanos y 155.000 muertes anuales a nivel mundial. Así mismo se evidenció que en los
países más desarrollados, Salmonella Enteritidis y S. Typhimurium son los causas más frecuentes de
salmonelosis humana, obteniendo una proporción total de 43,5% y 17,1% respectivamente (Hendriksen
et al., 2011). Mientras que en Brasil, entre los años 1999 - 2008, se registraron 6.602 brotes de
enfermedades transmitidas por los alimentos, identificando a Salmonella spp. como el agente
etiológico del 43% de los brotes (Medeiros et al., 2011).
Por otro lado el sector avícola contribuye en gran medida en la economía de diferentes países. Esta
producción se ve obstaculizada por varias enfermedades que se presentan en las aves, entre las cuales
la salmonelosis es de gran preocupación, principalmente por la incidencia de Tifosis Aviar y
Pullorosis. Dichas enfermedades son responsables de inmensas pérdidas económicas debido a la alta
morbilidad y mortalidad que producen en las aves de toda edad (Habtmu, Rathore, Dhama, & Agarwal,
2011).
3
Justificación
Salmonella enterica es una de las causas más comunes de gastroenteritis humana en todo el mundo
siendo el manejo inadecuado y la ingestión de alimentos mal cocidos importantes en la transmisión de
la enfermedad (Hasman et al., 2005).
Salmonella spp. y las aves de corral siempre han sido vinculadas epidemiológicamente y,
recientemente, de manera económica (Barrow et al., 2012). Los pollos de engorde se crían en forma
intensiva; debido a esto se da una contaminación con Salmonella spp. que rápidamente se propaga en
todas las aves del lote. El procesamiento de los pollos en las plantas de faena es también intensivo por
lo que pollos que se encuentran infectados pueden contaminar a todo el lote que se faena (Velilla et al.,
2011).
Algunas serovariedades de Salmonella spp. pueden aislarse tanto en los pollos antes del faenamiento
como en los seres humanos infectados por enfermedades transmitidas por alimentos (de Freitas et al.,
2010).
La expansión de la industria avícola en América del Sur y en países orientales, se ha dado no sólo para
alimentar a su creciente población, sino también para la exportación, lo cual se ha traducido en una
economía globalizada con la transmisión de patógenos entre los países comerciantes (Barrow et al.,
2012).
La industria avícola ecuatoriana, se fundamenta principalmente en dos actividades: la producción de
carne de pollo y la de huevo comercial. Según la Corporación Nacional de Avicultores del Ecuador
(CONAVE), para el año 2013 la producción nacional de pollo de engorde fue de 230 millones de
pollos y un consumo per cápita de carne de pollo de 35 kg/persona/año (CONAVE, 2014).
Debido a la importancia que la industria avícola tiene en el contexto productivo del Ecuador y a la gran
demanda de proteína animal de origen avícola, para la alimentación humana que ha incrementado año
tras año, es de gran importancia tener datos actualizados de la presencia de cepas móviles e inmóviles
de Salmonella spp. en pollos broiler. Estos resultados ayudarán en estudios epidemiológicos
posteriores de esta bacteria tanto en la producción avícola como en salud pública.
4
OBJETIVOS
General
Aislar cepas móviles e inmóviles de Salmonella spp. en contenido cecal de pollos faenados en
camales industriales de la provincia de Pichincha en un periodo de 6 meses.
Específicos
1. Aislar en el laboratorio con medios de cultivo selectivos, selectivos diferenciales y pruebas
bioquímicas las cepas móviles e inmóviles de Salmonella spp. a partir de muestras de
contenido cecal de pollos faenados en camales industriales de la provincia de Pichincha.
2. Generar una colección de cepas de Salmonella spp. en el laboratorio de Bacteriología de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia.
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CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
Antecedentes
Existen pocas investigaciones realizadas en Ecuador, referentes a la presencia de Salmonella spp. en
aves de corral y las que se han realizado se han basado principalmente en investigaciones en huevos
frescos.
Es así que en el año 2012 se realizó un estudio para determinar Salmonella spp. en huevos frescos de
gallina en los principales mercados de la ciudad de Quito, analizándose 282 huevos agrupados en 94
muestras obteniendo un resultado negativo en todas las muestras. Las muestras fueron analizadas
bioquímicamente y tipificadas (Estrada & Valencia, 2012).
En el año 2013 se realizó un estudio para determinar la prevalencia de salmonelosis en huevos frescos
de granjas avícolas en la provincia de Tungurahua. En total se seleccionó 450 huevos de gallina
distribuyéndolos en 150 muestras; del total de las muestras procesadas y analizadas, se encontró una
prevalencia de Salmonella enteritidis de 0.0133% (n= 150). (Sánchez, 2013).
Fundamentación Teórica
GENERALIDADES DE Salmonella spp.
Uno de los patógenos entéricos más frecuentes tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo
es Salmonella spp. (Figueroa & Verdugo, 2005).
Salmonella spp. pertenece a la familia Enterobacteriaceae, que es el grupo más grande y heterogéneo
de bacilos gramnegativos con importancia clínica. Es un microorganismo ubicuo, y su hábitat es el
aparato gastrointestinal de los animales y el hombre, pero no es parte de la microbiota normal. Los
bacilos de Salmonella spp. tienen un tamaño intermedio de 0,7-1,5 x 2,0-5 μm, se comportan como
patógenos intracelulares facultativos, no forman esporas y son anaerobios facultativos (Caffer,
Terragno, & Binsztein, 2008; Figueroa & Verdugo, 2005; Murray, Rosenthal, & Pfhaller, 2009). Son
fermentadores de glucosa, oxidasa negativo, con rara excepción reducen nitratos a nitritos y son
catalasa positiva (Forbes, Sahm, Weissfeld, & Trevino, 2007).
6
Los bacilos de Salmonella spp. generalmente son móviles por flagelación perítrica, a excepción de
Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum. Los géneros móviles son causantes de enfermedad en
seres humanos principalmente, y los géneros inmóviles son causantes de enfermedad en aves de corral
(Winn et al., 2006).
Salmonella posee un flagelo perítrico que morfológicamente es una estructura compleja
homopolimérica, compuesto de subunidades de proteína única (flagelina) arregladas en un patrón
helicoidal. Usualmente tiene de 10 a 20 nm de diámetro y un largo variable. Se encuentra físicamente
relacionado al cuerpo basal, proporcionando fuerza física la cual impulsa a la bacteria (Rocha, Lozano,
& Martínez, 2006).
TAXONOMÍA
Salmonella spp. es un grupo muy amplio conformado por más de 2400 serotipos descritos en el actual
esquema de Kauffmann-White. Existen dos especies: Salmonella entérica y Salmonella bongori, y seis
subespecies de Salmonella entérica en el sistema utilizado por la CDC (cuadro Nº 1) (Winn et al.,
2006). Las subespecies a su vez contienen varias serovariedades o serotipos que son diferenciados por
su fórmula antigénica (Uribe & Suárez, 2006).
Cuadro 1. Especies y subespecies del género Salmonella spp.
Especie Subespecie
Salmonella entérica
entérica (I)
salamae (II)
arizonae (IIIa)
diarizonae (IIIb)
houtenae (IV)
indica (VI)
Salmonella bongori (antes
subespecie V)
Fuente: (Winn et al., 2006; McVey et al., 2013)
Elaboración: La autora
NOMENCLATURA
La nomenclatura de Salmonella spp. ha sido problemática por muchos años debido al uso de varios
esquemas taxonómicos (McVey et al., 2013).
7
La nomenclatura utilizada actualmente es la que recomienda el Centro de Referencia e Investigación de
Salmonella spp. de la Organización Mundial de la Salud en el Instituto Pasteur de París (McVey et al.,
2013; Winn et al., 2006). Para la escritura se ha recomendado que se incluya la serovariedad sin
mencionar la especie y/o la subespecie y la serovariedad sin cursiva e iniciando con mayúscula, así:
Salmonella serovariedad Typhimurium; o simplemente Salmonella Typhimurium, lo cual evita
nombres demasiado largos (Uribe & Suárez, 2006).
ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
Antígeno O.- denominado también antígeno somático. Está formado por complejos de fosfolípidos y
polisacáridos; su composición es aproximadamente: 60% polisacáridos, 20-30% lípidos y 3,5-4%
hexosamina. Son cadenas laterales de polisacáridos de envoltura (LPS) componentes de la pared
celular de todos los microorganismos gram-negativos. Se han identificado aproximadamente 60
antígenos diferentes. Estos antígenos son termoestables y resistentes a ácidos diluidos y alcohol (Caffer
et al., 2008; Winn et al., 2006).
Antígeno H.- denominado también antígeno flagelar. Son proteínas localizadas en el flagelo móvil. El
flagelo es una estructura compleja que consiste en un cuerpo basal, un segmento de unión (“hook”) y
un filamento. El filamento está constituido por flagelina, proteína de alto peso molecular. Estos
antígenos son sensibles al calor (Caffer et al., 2008; Winn et al., 2006).
Antígeno K.- denominado antígeno capsular o de virulencia (Vi). Es un polisacárido constituido por
ácido N-acetilglucosaminourónico, termolábil localizado en la cápsula. lntervienen en la acción
patógena por sus propiedades antifagocitarias. Se encuentra en sólo tres serovariedades: S. Typhi, S.
Paratyphi C y en algunas cepas de S. Dublin (Caffer et al., 2008; Winn et al., 2006).
PATOGÉNESIS Y PATOGENICIDAD
Después de la ingestión de agua o alimento contaminado, Salmonella spp. inicia su ciclo de infección
invadiendo al hospedero a través de tejido linfoide, infiltran las células M localizadas en las placas de
Peyer, enterocitos y tonsilas cecales en las aves (Figueroa & Verdugo, 2005; Murray et al., 2009).
La falta de flora competitiva causada por la mala alimentación, el estrés, o antibióticos puede reducir
potencialmente la dosis infectiva de la bacteria. La adhesión a la célula M es el primer paso en el
proceso de la enfermedad, mediada por una o más de las adhesinas (McVey et al., 2013).
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Después de la adhesión, Salmonella spp. invade las células del hospedero por un mecanismo conocido
como disparo (trigger). La bacteria envía señales a las células epiteliales que inducen arreglos del
citoesqueleto dando lugar a la formación de ondulamiento (ruffling) en su superficie, como respuesta al
contacto (Figueroa & Verdugo, 2005). Estas ondulaciones son activadas por Proteínas Invasivas
Secretadas por Salmonella spp. (Ssps) y Sops posteriores a su inyección por la SSTIII. La célula diana
es irreversiblemente dañada por esta interacción, experimentando apoptosis debido a los efectos
citotóxicos que produce Salmonella spp. (McVey et al., 2013).
Las bacterias se quedan dentro de una vacuola endocitica, donde se replican. También se pueden
transportar a través del citoplasma y liberarse hacia la sangre o la circulación linfática debido a una
invasión de células adyacentes (Murray et al., 2009).
A continuación una respuesta inflamatoria se inicia por la liberación de varias quimiocinas de las
células afectadas, así como la liberación de citoquinas proinflamatorias después de la interacción con la
pared celular LPS del huésped, las cuales están involucradas en el proceso diarreico. Estas actividades
dan lugar a una afluencia de neutrófilos y macrófagos (PMN) (Figueroa & Verdugo, 2005; McVey
et al., 2013).
El incremento de la permeabilidad vascular acompaña la inflamación en combinación con la perdida de
la integridad epitelial de la mucosa intestinal, un incremento de la salida de líquidos y electrolitos al
lumen intestinal provocando así la diarrea (Figueroa & Verdugo, 2005).
La gastroenteritis y la diarrea son causadas por una amplia variedad de serotipos que producen
infecciones limitadas a la mucosa y submucosa del tracto gastrointestinal. S. Typhimurium y S.
Enteritidis son los serotipos más comúnmente asociados (Forbes et al., 2007).
Tras la diseminación sistémica de Salmonella spp., se puede desarrollar septicemia y shock endotóxico.
Las cepas productoras de esta forma de enfermedad escapan de la destrucción mediada por el huésped
y se multiplican dentro de los macrófagos del hígado y el bazo, así como intravascularmente. La
multiplicación incontrolada de los organismos resulta en endotoxemia, daño vascular severo, y muerte
(McVey et al., 2013).
Las consecuencias de la invasión de Salmonella spp. se ven reflejadas en el tracto intestinal,
divisándose lesiones como: inflamación fibrino-supurativa, necrótica y hemorrágica del intestino
delgado distal y el intestino grueso. Así mismo, el hígado también se afecta viéndose inflamación
9
necrotizante multifocal que refleja la propagación de bacterias a través de la vena porta (McVey et al.,
2013).
FACTORES DE VIRULENCIA
La virulencia de los serotipos de Salmonella spp. se refiere a su capacidad para invadir y replicarse en
las células epiteliales (Quinn et al., 2011).
Se han identificado un amplio número de factores de virulencia en los miembros de la familia
Enterobacteriaceae. Algunos de ellos son comunes en todos los géneros mientras que otros son
específicos de las cepas virulentas (Murray et al., 2009).
Varios de estos factores sirven para proteger a los organismos de los ácidos estomacales, promover el
acoplamiento, impedir la fagocitosis por las células de la mucosa intestinal, permitir la supervivencia y
la destrucción de los fagocitos, y facilitar la diseminación a otros tejidos (Forbes et al., 2007).
Estos factores son: endotoxina, cápsula, variación de fase antigénica, sistemas de secreción de tipo III
(SSTIII), secuestro de factores de crecimiento, resistencia al efecto bactericida del suero, resistencia
antimicrobiana (Murray et al., 2009).
FACTORES DE PATOGENICIDAD
Adhesinas:
Tienen una estructura que le permite reconocer receptores, con una estereoquímica específica.
Además tienen la capacidad de activar a los linfocitos B y neutrófilos, lo que resulta en una variedad de
respuestas biológicas incluyendo proliferación celular y secreción de citosinas. Estas se dividen en dos
grandes grupos: ahesinas fimbriales y adhesinas afimbriales. En general son: fimbria, fibrilla, flagelo,
lipopolisacárido (LPS) y cápsula (Figueroa & Verdugo, 2005).
Sistema de Secreción Tipo III (SSTIII):
Es un complejo de proteínas que forma una estructura similar a una aguja que interviene en la
transferencia de los factores de virulencia de la bacteria a la célula huésped (Quinn et al., 2011).
10
Islas de Patogenicidad:
Las islas de patogenicidad de Salmonella spp. (SPI) se constituyen por un grupo de genes situados
en el cromosoma bacteriano o en plásmidos involucrados en codificar factores específicos de
virulencia. Se han descrito hasta la fecha 18 de estas “islas” en Salmonella spp., pero no todos los
serotipos contienen las 18 SPI. Las más estudiadas son cinco islas de patogenicidad: SPI-1, SPI-2, SPI-
3, SPI-4 y SPI-5 (Figueroa & Verdugo, 2005; Quinn et al., 2011)
Movilidad
Esta capacidad usualmente se debe a la presencia de flagelos. Juega un papel importante en la
fisiología y forma de vida de la bacteria. En microorganismos patógenos se ha observado que la
movilidad está íntimamente relacionada con mecanismos de daño al hospedero (Rocha et al., 2006).
Resistencia a los antimicrobianos
Los mecanismos de resistencia más prevalentes en las bacterias gram negativas podrían resumirse en
cuatro categorías: enzimas modificadoras, bombas de salida, cierre de porinas o alteración de la
permeabilidad de la pared celular y proteínas unidoras de penicilina (Tafur & Villegas, 2008).
La mutación adquirida principalmente por plásmidos y recientemente los integrones y casetes
genéticos de resistencia, han ido adquiriendo importancia (Stanchi et al., 2007).
En Salmonella spp. existen varios genes que proporcionan resistencia a los antimicrobianos, entre ellos
están los genes bla (CMY), responsables de la resistencia mediada por plásmidos de ceftiofur y
ceftriaxona (Medeiros et al., 2011).
Otra resistencia importante es a las fluoroquinolonas, la que se debe a mutación cromosómica. Hasta el
momento no se ha demostrado resistencia mediada por plásmidos, probablemente debido a que estas
drogas inhiben la conjugación. Tampoco se ha descrito inactivación por enzimas microbianas. El
principal mecanismo de resistencia a las fluoroquinolonas se debe a alteraciones en las enzimas diana,
y se origina en mutaciones espontáneas de los genes gyrA y gyrB que codifican las subunidades de la
ADNgirasa, y en los genes parC (grlA) y parE (grlB) que codifican las subunidades de la
topoisomerasa IV. La resistencia puede deberse a mutaciones puntuales en uno o más genes, a
mutaciones en más de un sitio del mismo gen, o a mutaciones múltiples, particularmente en gyrA y
parC (grlA) en forma simultánea (Otero, Mestorino, & Errecalde, 2001).
11
EPIDEMIOLOGÍA
Las infecciones de animales de abasto por Salmonella spp. tienen un papel importante en la salud
pública, ya que los alimentos de origen animal se consideran como la fuente principal de infecciones
por Salmonella spp. en el hombre, esto puede suceder cuando los animales infectados entran en la
cadena alimentaria dando lugar a productos alimenticios contaminados (OIE, 2010).
Estas bacterias pueden estar presentes en todas las especies de animales domésticos. Las aves y los
cerdos pueden estar infectados pero no mostrar enfermedad clínica siendo importantes en la
diseminación de la enfermedad (OIE, 2010).
Un gran porcentaje de las aves de corral son infectadas por Salmonella spp. durante el proceso de
engorda; el número de microorganismos presentes pueden ser bajos en un principio y aumentar como
resultado del manejo (Uribe & Suárez, 2006).
Salmonelosis en Humanos
La mayoría de la infecciones por Salmonella spp. son consecuencia de la ingestión de productos
alimentarios contaminado, y de una transmisión directa por vía feco-oral (Murray et al., 2009).
Las principales fuentes de infección en el ser humano son las aves de corral, los huevos, los productos
lácteos y los productos preparados sobre superficies contaminadas (p. ej., tablas de cocina donde se
prepararon aves sin cocinar) (Murray et al., 2009). Pero también se adquieren a través del contacto
directo o indirecto con animales en los hogares, clínicas veterinarias, zoológicos, entornos agrícolas u
otros lugares públicos, profesionales o privados (Hoelzer, Switt, & Wiedmann, 2011).
La manifestación clínica más frecuente de salmonelosis humana es la diarrea (McVey et al., 2013).
Además puede conducir a varios síndromes clínicos, que incluyen infecciones asintomáticas,
gastroenteritis aguda, bacteremia, fiebre tifoidea o un estado de portador crónico asintomático (Romero
C., 2007). La presentación de la enfermedad está definida por factores del huésped, la cepa de
Salmonella y la dosis. La gravedad de la enfermedad dependerá de la edad, el estado inmune, presencia
de enfermedad concurrente, y la composición de la flora normal (McVey et al., 2013).
Se ha definido que la dosis infecciosa para Salmonella spp. es aproximadamente de 106 a 108 bacterias
para que se produzca enfermedad sintomática. Estos microorganismos se pueden multiplicar hasta
12
alcanzar concentraciones elevadas cuando los alimentos contaminados no se conservan adecuadamente
(Murray et al., 2009).
Se estimó que entre 1995 y 1999 Salmonella spp. fue el segundo agente causal (35,3%) de brotes de
enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) en América Latina y el Caribe. Entre 1993 y el 2002
se registraron en Latinoamérica 1.256 brotes de salmonelosis, estos brotes afectaron 48.334 personas y
15 personas murieron por esta causa. Según el tipo de alimento consumido, 29,2% de los casos fueron
causados por el consumo de huevos y un 9,4% por la ingesta de carne de aves (Pérez, Sánchez, Henao,
& Cardona-Castro, 2008).
Tifosis Aviar y Pulorosis
La tifosis y pulorosis aviar, son causadas por Salmonella entérica subespecie entérica serovariedad
Gallinarum biotipo Gallinarum y Salmonella entérica subespecie entérica serovariedad Gallinarum
biotipo Pullorum respectivamente, las que se encuentran distribuidas ampliamente en todo el mundo
(OIE, 2012). Por fines prácticos solo se las denominan Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum.
S. Gallinarum y S. Pullorum se encuentran sumamente adaptadas al huésped y no causan enfermedad a
otras especies animales distintas de las aves, no presentan la movilidad característica de este género y
son de gran importancia en la industria avícola por las pérdidas económicas que generan (Betancor
et al., 2010). Ambos microorganismos presentan una estructura antigénica similar (pertenecen al
mismo serotipo) pero pueden diferenciarse mediante pruebas bioquímicas, tipificación electroforética y
estudios de ésteres ácidos metilados de célula entera (Terzolo & Chacana, 2003).
La tifosis aviar produce enfermedad en varias especies de aves jóvenes y adultas. Se caracteriza por
producir mortalidad variable desde moderada a elevada de acuerdo a su virulencia (Huberman &
Terzolo, 2014) que se ven influidas por la edad del animal, susceptibilidad del huésped, nutrición,
manejo de la parvada, y la virulencia de S. Gallinarum (este último afecta a la gravedad de la
enfermedad) (Tunca et al., 2012).
Se presentan síntomas como: pobre crecimiento, somnolencia, debilidad, inapetencia en pollitos y en
aves adultas se ven aves postradas, con fiebre, palidez de crestas y disminución de la producción de
huevos (Huberman & Terzolo, 2014). En las etapas subaguda y crónica de la enfermedad el hígado y el
bazo son mayormente afectados, observándose focos blancos múltiples, inflamación grave y
decoloración (Tunca et al., 2012).
13
La pullorosis es una enfermedad septicémica aguda que produce alta mortalidad principalmente en
pollos en las primeras semanas de vida, mientras que en aves adultas se presenta en forma crónica, sin
signos aparentes. En la enfermedad clínica se presentan síntomas como apatía, depresión, piar
constante, empastamiento en la cloaca, deshidratación y amontonamiento (The Center for Food
Security & Public Health, 2009).
La tifosis y pullorosis tienen muy baja posibilidad de curación, lo que determina una elevada
mortalidad y, por consiguiente, elevadas pérdidas económicas (Huberman, 2007).
Las aves infectadas no sólo pueden infectar a otras aves por vía horizontal por la ingestión de alimentos
o agua contaminados por los excrementos de aves infectadas o portadoras clínicamente infectadas, sino
también a través del huevo a su descendencia (transmisión vertical) (Huberman & Terzolo, 2014).
También se puede dar una transmisión desde los trabajadores a través de manos, pies y ropa
contaminados (Tunca et al., 2012). La transmisión horizontal es más significativa para S. Gallinarum
mientras que ambas rutas de transmisión son importantes para S. Pullorum (Barrow & Freitas Neto,
2011).
Dichas enfermedades son raras en los países con una industria avícola moderna, ya que han sido
erradicadas de las aves comerciales en muchos países desarrollados como Estados Unidos, Canadá, de
Europa occidental, Australia y Japón. A pesar de la aplicación de medidas de higiene, pruebas
serológicas y eliminación de animales enfermos pueden persistir en parvadas de aves de traspatio y
aves de caza ganando incidencia en América del Sur y otros países de África y Asia (Alvarez,
Ledesma, Téllez, Molinari, & Tato, 2003; Huberman & Terzolo, 2014; The Center for Food Security &
Public Health, 2009)
En muchos países son escasos los datos oficiales relacionados a la ocurrencia de pullorosis y tifosis
aviar por lo que probablemente la incidencia de estas enfermedades es subestimada (Barrow & Freitas
Neto, 2011).
Paratifosis Aviar
Se utiliza el término Paratifosis para describir la enfermedad en aves causada por los serotipos
zoonóticos de Salmonella spp. (OIE, 2010). Los serotipos zoonóticos son serotipos móviles de
Salmonella spp. que usualmente se conocen con el nombre de salmonelas paratíficas (María Cecilia
Soria, 2013)
14
La infección por estas cepas en aves de corral generalmente no produce morbilidad y mortalidad altas,
aunque ocasionalmente pueden presentarse síntomas observándose poca mortalidad en pollos. La
enfermedad puede darse por la acción de un serotipo más virulento de Salmonella spp. o quizá por la
presencia de aves inmunodeprimidas. Comúnmente, estas Salmonellas solo producen colonización
intestinal, siendo estas aves asintomáticas y convirtiéndose en importantes reservorios de Salmonella
spp. Con estos serotipos, el riesgo no es para la salud de las aves, pero sí para la salud pública
(Waltam, 2014).
TRANSMISIÓN
Las aves y sus productos son una importante fuente de infección de salmonelosis en humanos. Es así
que S. Enteritidis está especialmente adaptada para la transmisión desde el huevo (McVey et al.,
2013)
Los serotipos de Salmonella spp. parecen diferir claramente en su potencial patógeno para los seres
humanos y la distribución de serotipos a menudo varía enormemente entre las poblaciones humanas y
animales, así como entre diferentes poblaciones de animales en la misma zona geográfica (Hoelzer
et al., 2011).
Los procedimientos tecnológicos realizados en la industria para la obtención de las canales y cortes de
pollo para el consumo son también fuentes de contaminación, especialmente en las etapas de
evisceración, refrigeración, envasado y transporte donde puede ocurrir el crecimiento microbiano (de
Freitas et al., 2010).
Otras fuentes de transmisión al humano incluyen a cerdos (Salmonella Cholerasuis) o la leche
(Salmonella Dublin) (McVey et al., 2013).
DIAGNÓSTICO DE Salmonella spp.
Existe un gran número de métodos diagnósticos que pueden realizarse para la determinación de
Salmonella spp., sin embargo, según la mayor parte de estudios realizados, el cultivo microbiológico es
la prueba más comúnmente empleada para el aislamiento de la bacteria (Pachón, 2009).
Cultivo Microbiológico
Se pueden aislar cepas de Salmonella spp de diferentes muestras como: heces, sangre, órganos como
bazo o la medula ósea; así también alimentos de distintos orígenes y agua (McVey et al., 2013). El
15
aislamiento de Salmonella spp. no es tan sencillo como puede suponerse, pues la metodología depende
del tipo de muestra que se utilice (Stanchi et al., 2007).
Para realizar un cultivo eficiente se siguen las siguientes fases: aislamiento, identificación bioquímica y
serotipificación de las cepas aisladas. El aislamiento a su vez conlleva las siguientes etapas (Stanchi
et al., 2007):
Preenriquecimiento en medio no selectivo: se utiliza para aumentar el crecimiento de
Salmonella spp. mientras se inhibe el desarrollo de microorganismos no deseados,
principalmente bacterias gram positivas. Son muy útiles para la recuperación de
microorganismos de las heces de animales portadores, las bacterias entran en una fase de
crecimiento logarítmico y son más fáciles de aislar (Winn et al., 2006). Se lo realiza en Agua
Peptonada Buferada.
Enriquecimiento con medios selectivos: estos medios estimulan el crecimiento de formas
compatibles con Salmonella spp., e inhiben el desarrollo de bacterias intestinales y coliformes
(Pachón, 2009) esto se logra con el agregado de sustancias inhibidoras como antibióticos,
ciertos colorantes, sales biliares, etc. Entre los caldos mayormente usados se encuentran Caldo
tetrationato (Müller-Kauffman), Caldo Soja Peptona Rappaport Vassiliadis (RVS) o Caldo
Selenito F, recientemente se utilizan medios como MSRV o Rambach (Stanchi et al., 2007)
Enriquecimiento con medios selectivos- diferenciales: Permiten diferenciar bioquímicamente
las bacterias por su actividad metabólica. Poseen un sustrato, sobre el cual actúa o no la
bacteria, y esa actividad se revela por variación del pH del medio o por alguna actividad
enzimática que modifica su aspecto. Los medios más reconocidos para el aislamiento de
Salmonella spp. son: Agar Hektoen entérico, Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD), Agar
Salmonella-Shigella, Agar Verde Brillante (BGA) u otro medio sólido selectivo (Stanchi et al.,
2007).
Identificación Bioquímica: En la identificación final de Salmonella spp. las colonias sospechosas
observadas en el medio de cultivo selectivo-diferencial pueden ser identificadas directamente con
antisueros polivalentes o ser inoculadas en diferentes medios para una identificación bioquímica y
luego ser identificadas con antisuero (McVey et al., 2013). En general a Salmonella spp. se le realiza
un conjunto de pruebas, siendo positiva para las pruebas de Rojo de Metilo, Citrato, Fermentación de
la Glucosa, Arginina Dihidrolasa y Descarboxilación de Lisina y Ornitina, por su parte es negativa
para las pruebas de Indol, Vogues Proskauer y Ureasa (Stanchi et al., 2007).
16
Movilidad: El movimiento usual debido a flagelos, se puede determinar al microscopio, ya sea en
fresco (directamente en porta y cubreobjetos), o mediante gota pendiente. En estos casos, es importante
diferenciar el movimiento traslatorio de las bacterias (o movimiento verdadero) del movimiento
browniano, que es un movimiento vibratorio, originado por choques de moléculas del líquido contra las
bacterias, que provoca vibraciones sin movimiento. También puede determinarse la movilidad por el
comportamiento macroscópico de una población, cuando se inoculan las bacterias en un medio de
cultivo adecuado (Rodríguez, Gamboa, Hernández, & García, 2005).
Serodiagnóstico
La serotipificación constituye un importante complemento de la identificación bioquímica y desde el
punto de vista epidemiológico permite determinar la prevalencia de una serovariedad en distintas zonas
geográficas (Caffer et al., 2008).
La serotipificación de cepas de Salmonella entérica involucra la identificación de antígenos somáticos
de superficie (LPS, antígenos O), antígenos flagelares (proteínas, antígenos H) y antígenos capsulares.
La identificación de las serovariedades surge como consecuencia de la combinación antigénica de
factores somáticos O y flagelares H, con el agregado del antígeno capsular Vi para unas pocas
serovariedades y se presenta en el “Esquema de Kauffmann-White” (Caffer et al., 2008).
El diagnóstico serológico es posible reemplazarlo con el uso de una prueba de hemaglutinación pasiva
o ELISA; estas pruebas se realizan generalmente en laboratorios de referencia (Forbes et al., 2007).
17
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
Determinación de métodos a utilizar
Tipo de investigación
La investigación fue de tipo:
No experimental
Transversal.
Cualitativa.
Observacional.
Diseño de la investigación
En el presente proyecto se utilizó un diseño transversal descriptivo, porque no se manipulará
deliberadamente las variables.
Descripción de la zona de estudio
El trabajo de campo se realizó en cada uno de los camales industriales de las empresas en convenio,
ubicados en la provincia de Pichincha en las parroquias: Carcelén, San Antonio, Pifo, Píntag, El
Quinche, Tababela del cantón Quito y la parroquia Ascázubi del cantón Cayambe.
El trabajo de laboratorio se realizó en el Laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador, ubicado en la ciudad de Quito en la
ciudadela universitaria.
18
Población y muestra
La población objeto de estudio fueron todas las aves de una parvada (granja) que llegaron al
faenamiento a los Camales Industriales de seis empresas que colaboraron en el estudio, en la provincia
de Pichincha.
Debido a un convenio de confidencialidad no se nombró las empresas y en su lugar se utilizó un código
alfanumérico para la identificación de las muestras y la presentación de los resultados.
Muestra
El tipo de muestreo que se aplicó en la investigación es un muestreo no probabilístico aleatorio, porque
en el estudio se estableció la presencia o ausencia de cepas móviles e inmóviles de Salmonella spp., en
un periodo de tiempo de seis meses establecido por el “Estudio de Prevalencia y Resistencia a los
antibacterianos de Campylobacter spp., Escherichia coli BLEE y Salmonella spp. en muestras
gastrointestinales de pollos faenados en camales industriales de la Provincia de Pichincha-Ecuador”, al
cual pertenecía el presente proyecto.
Cada muestra se conformó por un pool del contenido cecal de 25 ciegos correspondientes a 25 pollos
diferentes de todas las parvadas que ingresaron a los camales de las empresas participantes. Una
muestra determinó a un galpón de una granja correspondiente a un ciclo productivo.
Procedimiento de la investigación
El procedimiento que se llevó a cabo dentro del laboratorio fue conforme a la norma ISO 6579:2002
(Anexo D), establecido para la detección de Salmonella spp. en heces de animales.
Técnicas e instrumentos de recolección de muestras
Las muestras se colectaron de pollos faenados en los camales industriales en el área de evisceración. Se
tomaron 25 ciegos de diferentes pollos, se los puso en una funda estéril, previamente identificada, y
dentro de un termo con refrigerante; posteriormente se llevó al laboratorio de Bacteriología en donde se
procesó las muestras.
Técnicas e instrumentos de recolección de la información
19
La información de cada muestra (granja) fue proporcionada por una persona específica dentro del
camal. Esta información incluía datos referentes a la granja (ubicación, nombre), edad de los animales
y terapéutica utilizada durante la crianza del lote.
Los procesos realizados en el laboratorio así como los resultados del aislamiento se apuntaron en un
registro de Laboratorio de Bacteriología para el aislamiento de Salmonella spp.
Técnicas de laboratorio
Técnica de procesamiento de muestras
Se colocó los 25 ciegos en un vaso de precipitación con alcohol al 70% por alrededor de 5
minutos, luego en una superficie plana se los colocó para retirar el exceso de alcohol. En una
funda estéril se pesó 25 gramos de heces (un gramo de cada ciego), se homogenizó las heces
formando un pool.
Técnica de aislamiento bacteriano
Se procesó las muestras siguiendo el siguiente esquema (Anexo 1 y 2):
Preenriquecimiento: se colocó 225 ml de agua peptona bufferada en el pool de heces para
luego incubar a 37°C ± 1°C durante 18-24 horas, dentro de un vaso de precipitación.
Enriquecimiento selectivo:
CEPAS MÓVILES: se colocó tres gotas del cultivo de preenriquecimiento en el
Medio Semisólido Rappaport-Vassiliadis (MSRV), se incubó a 42°C por 24 horas.
CEPAS INMÓVILES: Se colocó 1cm3 de cultivo de preenriquecimiento en un
tubo de ensayo con 10cm3 de Caldo Selenito, se incubó a 37°C por 48 horas.
Aislamiento diferencial.
CEPAS MÓVILES: (siembra en agar MSRV)
Positivo: presencia de un halo blanco alrededor del inóculo. Se procedió a
sembrar, por estriación simple, en Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato
(XLD) tomando una asada de la parte más distal del halo de crecimiento.
Se incubó a 37°C por 24 a 48 horas.
20
Negativo: se dejó en la incubadora por 24 horas más. Luego de las 24
horas si fue nuevamente negativo se reportó.
CEPAS INMÓVILES: (siembra en Caldo Selenito) Se tomó una asada de los
tubos previamente incubados, se sembró en agar XLD por estriación simple y se
llevó a incubación a 37°C por 24 – 48 horas.
Técnica de Identificación Bioquímica
Luego de la incubación se revisó las cajas de XLD.
Positivo: identificación de colonias incoloras con halos color rosado.
Negativo: identificación de colonias diferentes a las especificadas anteriormente.
De las muestras identificadas como positivas, se seleccionó dos colonias sospechosas y se
sembró en una batería de pruebas bioquímicas: TSI, urea, indol y lisina. Se incubó a 37°C por
24 horas.
Fue positivo a Salmonella spp. si todas las pruebas bioquímicas presentaron el siguiente
esquema:
TSI: Alcalino/ácido (K/A), producción de ácido sulfúrico (H2S) y poca producción de
gas
Urea negativo: sin cambio de color del medio o cambio a color amarillo.
Indol negativo: se reveló con reactivo de Kovacs, formación de un anillo amarillo
Lisina positivo: cambio de color del medio de verde a morado.
Técnica de identificación de movilidad (Gota Pendiente)
Se realizó a las cepas positivas a Salmonella spp. que se aisló desde Caldo Selenito,
para confirmar si hubo o no movilidad.
Se descongeló las cepas, previamente conservadas, se tomó una asada y se incubó en
Caldo de Tripticasa-Soya (TSB) a 37ºC por 6 horas.
Se tomó con un asa el equivalente a una gota de caldo y se colocó en un cubreobjetos.
Tratando de que no se corriera la gota, se dio vuelta al cubreobjetos y se lo colocó
encima del portaobjetos excavado.
Se llevó a observación en microscopio electrónico con lente 40X.
21
Se observó el movimiento de las bacterias, diferenciando entre movimiento Browniano
y movimiento de traslación.
Técnica de crioconservación (-70ºC)
Se colocó en un tubo Eppendorf con 0,3 ml de TSB las muestras positivas a las pruebas
bioquímicas de Salmonella spp. Se incubó a 37°C por 24 horas. Luego del tiempo de
incubación, se adicionó 0,6 ml de glicerol, se homogenizó y congeló a -70°C.
Técnicas de procesamiento y análisis de datos
Los procedimientos diarios y los resultados obtenidos se registró en un cuaderno de laboratorio y en
una base de datos en Excel®.
Se analizó porcentualmente los resultados en base al total de muestras procesadas durante el periodo de
muestreo y los aislamientos positivos. Para el análisis de los datos se utilizó Microsoft Excel®.
22
CAPITULO IV
Resultados
En el presente estudio se aisló cepas móviles de Salmonella spp. en agar MSRV. En el gráfico 1 se
observa un resultado positivo el cual se evidencia por la presencia de un halo blanquecino alrededor de
los inóculos.
Gráfico 1. Siembra en agar MSRV, resultados obtenidos luego de incubación.
(a) (b)
(a): resultado positivo; (b): resultado negativo
Fuente: La Autora.
El aislamiento de cepas inmóviles de Salmonella spp. se realizó en Caldo Selenito (gráfico 2), luego
del periodo de incubación en este medio se procedió a la siembra en agar XLD.
Gráfico 2. Tubos con Caldo Selenito.
(a) (b)
(a): medio de cultivo pre-inoculación, (b): medio de cultivo pos-incubación
Fuente: La Autora.
23
De los resultados positivos obtenidos en agar MSRV se sembró una asada tomada de la parte periférica
del halo en agar XLD. En el gráfico 3 se observa un resultado positivo en el cual se evidencian
colonias con centro color negro.
Gráfico 3. Siembra en agar XLD, resultados obtenidos luego de incubación.
(a) (b)
(a): resultado positivo; (b): resultado negativo
Fuente: La Autora.
Para confirmación de Salmonella spp. se sembraron dos colonias sospechosas seleccionadas al azar de
agar XLD en una batería de pruebas bioquímicas conformada por agar TSI, agar Urea Christensen,
Lisina Descarboxilasa e Indol. En el gráfico 4 se observa un resultado positivo que muestra las
reacciones típicas positivas a Salmonella spp.: TSI K/A, H2S+; Urea negativa; Lisina positiva; Indol
negativo.
Gráfico 4. Resultados en TSI, Urea, Lisina e Indol obtenidos luego de incubación.
(a) (b)
(a): resultado positivo; (b): resultado negativo
Fuente: La Autora.
TSI Urea
Indol
Lisina TSI
Urea
Indol
Lisina
24
Se analizaron un total de 181 muestras de seis plantas de faenamiento en un periodo de tiempo de 6
meses, durante el cual se obtuvieron 34 muestras positivas a Salmonella spp. equivalente al 18,78%.
En el cuadro 2 se expresa el crecimiento de Salmonella spp. en agar MSRV y Caldo Selenito de las
muestras positivas.
Cuadro 2. Crecimiento de Salmonella spp. en agar MSRV y Caldo Selenito
Muestras Positivas
# %
MSRV y Caldo
Selenito 8 23,53
Solo MSRV 23 67,65
Solo Selenito 3 8,82
TOTAL 34 100
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La autora
Los resultados positivos, que fueron confirmados con pruebas bioquímicas, se observan en el Cuadro
3.
25
Cuadro 3. Resultados de las pruebas bioquímicas en las muestras positivas a Salmonella spp.
MSRV CALDO SELENITO
Muestra XLD Colonia TSI UR IN LI RES XLD Colonia TSI UR IN LI RES
1 2ct0.081 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 1 0 0 0 B - - - - 0
2 3ct0.019 1 A A/A; H2S+ 0 0 1 0
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
3 2ct0.084 1 A A/A; H2S+ 0 0 1 0
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
4 3ct0.020 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
B K/A; H2S+ 1 0 1 0 B K/A; H2S+ 1 0 1 0
5 2cto0.086 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
1 A A/A; H2S+ 0 0 1 0
B K/A; H2S+ 1 0 1 0 B K/A; H2S+ 0 0 1 1
6 1ct0.102 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
1 A - - - - 0
B A/A; H2S+ 1 0 0 0 B - - - - 0
7 1ct0.106 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
1 A K/A; H2S+ 0 0 0 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B K/A; H2S+ 0 0 0 0
8 1ct0.107 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A K/A; H2S+ 0 0 0 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B K/A; H2S+ 0 0 0 0
9 1ct0.111 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
10 1ct0.116 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
11 1ct0.117 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
12 1ct0.118 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B A/A; H2S+ 1 0 0 0
13 3ct0.024 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B A/A; H2S+ 0 0 1 0
26
MSRV CALDO SELENITO
Muestra XLD Colonia TSI UR IN LI RES XLD Colonia TSI UR IN LI RES
14 1ct0.128 1 A K/A; H2S+ 1 0 1 0
1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B A/A; H2S+ 1 0 0 0
15 3ct0.025 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B K/A; H2S+ 0 0 0 0
16 2ct0.099 1 A K/A; H2S+ 1 0 0 0
1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
B K/A; H2S+ 1 0 0 0 B K/A; H2S+ 0 0 1 1
17 3ct0.028 0 A - - - - 0
1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
B - - - - 0 B K/A; H2S+ 1 0 1 0
18 1ct0.142 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
19 1ct0.147 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
20 1ct0.149 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
21 3ct0.029 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
22 6ct0.002 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
23 2ct0.109 0 A - - - - 0
1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
B - - - - 0 B K/A; H2S+ 0 0 1 1
24 1ct0.157 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
25 1ct0.158 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
26 4ct0.015 1 A K/A; H2S+ 1 0 1 0
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
27 1ct0.162 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
27
MSRV CALDO SELENITO
Muestra XLD Colonia TSI UR IN LI RES XLD Colonia TSI UR IN LI RES
28 1ct0.163 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
29 3ct0.031 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
30 4ct0.016 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
31 6ct0.006 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A K/A; H2S+ 1 0 0 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B K/A; H2S+ 1 0 0 0
32 2ct0.115 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B K/A; H2S+ 0 0 1 1
33 2ct0.117 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B K/A; H2S+ 0 0 1 1
34 1ct0.180 1 A K/A; H2S+ 0 0 1 1
0 A - - - - 0
B K/A; H2S+ 0 0 1 1 B - - - - 0
TOTAL 54 15
UR: agar urea; IN: Indol; LI: Lisina; RES: Resultado; K/A: Alcalino/Ácido; H2S+: producción de ácido sulfidrico.
1: positivo; 0: negativo
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La autora
28
Las muestras positivas obtenidas de Caldo Selenito fueron examinadas con el método de Gota
Pendiente para determinar la posible presencia de cepas inmóviles (Cuadro 3).
Cuadro 4. Resultados de movilidad en cepas aisladas desde Caldo Selenito.
GOTA
PENDIENTE
Cepas Aisladas desde
Caldo Selenito
# %
Móvil 11 100
Inmóvil 0 0
TOTAL 11 100
Fuente: Invetigación Directa
Elaboración: La Autora
En el cuadro 5 se exponen los resultados positivos obtenidos de cada planta de faenamiento y el
porcentaje de muestras positivas en relación al número total de muestras.
Cuadro N° 5. Resultados de aislamiento de Salmonella spp. de seis plantas de faenamiento.
EMPRESAS # Muestras
Procesadas
Muestras Positivas
# % por
empresa
%
TOTAL
1CT 94 16 17.02 8.84
2CT 37 7 18.92 3.87
3CT 17 7 41.18 3.87
4CT 12 2 16.67 1.10
5CT 15 0 0 0
6CT 6 2 33.33 1.10
TOTAL 181 34 - 18.78
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora.
Durante todo el periodo de muestreo se obtuvo muestras de 93 granjas de las cuales 27 fueron
positivas. En el cuadro 6 se presentan los resultados de los aislamientos positivos a Salmonella spp. en
base al número de granjas.
29
Cuadro 6. Resultados de aislamiento de Salmonella spp. en las granjas muestreadas.
EMPRESAS Granjas
Muestreadas
Granjas Positivas
#* %
1CT 53 13 24.53
2CT 14 6 42.86
3CT 6 4 66.67
4CT 8 2 25.00
5CT 6 0 0.00
6CT 6 2 33.33
TOTAL 93 27
*se toma en cuenta si la granja fue positiva por lo menos una vez.
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora
30
Discusión de resultados:
La norma ISO 6579:2002 Anexo D indica los protocolos usados en el laboratorio para el aislamiento
de Salmonella spp. a partir de muestras fecales por ello fue utilizada para realizar la presente
investigación. En esta norma se recomienda el uso de distintos medios de enriquecimiento selectivo
entre los cuales están el MSRV y el Caldo Selenito, utilizados en este estudio. La eficacia de estos
medios ha sido demostrada en varios estudios. Así, un estudio realizado en muestras de alimento
utilizando MSRV como medio de enriquecimiento, determinó una sensibilidad de 56% para este
medio (Koyuncu & Haggblom, 2009). También otro ensayo realizado en Argentina en muestras de
heces de pollos determinó una sensibilidad de 75% a 100% del medio MSRV al aislar cepas móviles
de Salmonella spp. (M. C. Soria, Soria, & Bueno, 2012). Mientras que al utilizar Caldo Selenito como
medio de enriquecimiento un estudio realizado en Brasil en muestras de heces de gallinas ponedoras
determinó una incidencia de Salmonella spp. del 6,25% (n=32) (Ramos Salles et al., 2008). En otra
investigación realizada en muestras de heces de pollos se obtuvo una presencia de Salmonella spp de
10,92% (n=641) utilizando caldo selenito (Fashae, Ogunsola, Aarestrup, & Hendriksen, 2010).
Los datos presentados anteriormente concuerdan con los resultados obtenidos en esta investigación en
la que, del total de muestras positivas a las pruebas bioquímicas, se identificó Salmonella spp. en un
91,18% al utilizar agar MSRV y el 32,35% al utilizar Caldo Selenito. Esto demuestra que el Agar
MSRV tiene mayor sensibilidad para aislar Salmonella spp. de muestras de contenido cecal de pollos
de engorde.
El aislamiento de Salmonella spp. que se obtuvo en esta investigación (18,78%) contrasta con otros
estudios realizados en el Ecuador. Es así que un estudio realizado con muestras de hisopos de arrastre y
análisis microbiológico se identificó Salmonella spp. en un 5% (n=141) (Díaz, 2014). En otro ensayo
se identificó la presencia de cepas móviles de Salmonella spp. en contenido cecal de pollos de engorde
en 8,45% (n=142) (Valseca, 2015) utilizando el mismo protocolo con el que se realizó esta
investigación. Estos resultados demuestran que la presencia de Salmonella spp. en el país puede ser
variable y podría depender de factores de manejo o ambientales.
Otras investigaciones también demuestran una presencia variable de Salmonella spp. Así, en Argentina
se aisló Salmonella spp. de contenido cecal en un 3,9% (n=128) utilizando la metodología de la norma
ISO 6579:2002 (Velilla et al., 2011), mientras que en Colombia se determinó el 41% (n=917) de
prevalencia de Salmonella spp. en muestras de hisopados de arrastre y pool de heces en granjas
(Donado-Godoy et al., 2012). En otras partes del mundo como en Corea del Sur se obtuvo una
31
prevalencia del 3,7% (n=80) utilizando como medio de enriquecimiento el caldo Rappaport-Vassiliadis
(RVS) (Yoon et al., 2014) mientras que en Zimbabwe se determinó Salmonella spp. en un 10% (n=
2833) utilizando RVS en hisopados cloacales (Makaya, Matope, & Pfukenyi, 2012). Estos datos
pueden ser atribuibles a las diferencias presentes en los sistemas de crianza y las zonas geográficas que
pueden influir en la presencia del patógeno.
El Caldo Selenito se utilizó para aislar cepas inmóviles de Salmonella spp. (S. Gallinarum y S.
Pullorum) sin obtener resultados positivos. La baja presencia de estas cepas reportada en este estudio
difiere de datos reportados en otros países. Así, en un estudio en Colombia se reportó que el 37,14% de
aislamientos de Salmonella spp de hisopados de arrastre en ponedoras correspondieron a S. Gallinarum
(Pulido-Landínez, Sánchez-Ingunza, Guard, & Pinheiro do Nascimento, 2014). Esta diferencia
probablemente puede deberse al tipo de muestras analizadas o al tipo de aves muestreadas (ponedoras).
En el Ecuador no hay datos oficiales registrados de casos de salmonelosis causada por S. Gallinarum o
S. Pullorum.
32
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones
1. La presencia de Salmonella spp. (18,78%) demostrada en este estudio genera la posibilidad de
contaminación de carcasas de pollo destinadas al consumo humano.
2. Al finalizar el estudio se obtuvo un total de 69 cepas de Salmonella spp. de las cuales todas
fueron confirmadas como móviles.
3. El aislamiento negativo de cepas inmóviles (S. Gallinarum y S. Pullorum) puede deberse a la
falta de sensibilidad del método bacteriológico conjuntamente a una baja prevalencia de estas
bacterias en las parvadas muestreadas.
33
Recomendaciones
1. Realizar investigaciones con un número mayor de muestras para aislar cepas inmóviles en la
industria avícola ecuatoriana.
2. Serotipificar las cepas de Salmonella spp. obtenidas en esta investigación para entender el
riesgo que podría causar su presencia en pollos que son faenados en camales industriales.
34
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39
ANEXOS
40
ANEXO 1
ESQUEMA AISLAMIENTO Salmonella spp.
(cepas móviles)
MSRV agar
(medio selectivo)
24h a 42°C
CIEGOS (25 muestras)
POOL DE HECES (25 gramos)
AGUA PEPTONADA (preenriquecimiento)
24h a 37°C
XLD agar (medio selectivo
diferencial) 24 - 48h a 37°C
Pruebas
Bioquímicas
24h a 37°C
POSITIVA (Presencia de halo blanco
alrededor del inóculo)
NEGATIVA
POSITIVA (Presencia de colonias
transparentes con centro negro, alrededor medio
color fucsia)
NEGATIVA
Incubar 24h más
POSITIVA (Presencia de halo blanco
alrededor del inóculo)
NEGATIVA
NEGATIVA
POSITIVA
-K/A, H2S+, poco gas
-UREA: negativa
-INDOL: negativo
-LISINA: negativa
41
ANEXO 2
ESQUEMA AISLAMIENTO Salmonella spp.
(cepas inmóviles)
CALDO SELENITO
(medio selectivo)
48h a 37°C
XLD agar (medio selectivo
diferencial) 24 - 48h a 37°C
CIEGOS (25 muestras)
POOL DE HECES (25 gramos)
AGUA PEPTONADA (preenriquecimiento)
24h a 37°C
Pruebas
Bioquímicas
24h a 37°C
POSITIVA (Presencia de colonias
transparentes con centro negro, alrededor medio
color fucsia)
NEGATIVA
NEGATIVA
POSITIVA
-K/A, H2S+, poco gas
-UREA: negativa
-INDOL: negativo
-LISINA: negativa
GOTA
PENDIENTE
(movilidad)
42
ANEXO 3.- Cuadro de antibióticos utilizados en las parvadas positivas a Salmonella spp.
Principio Activo Familia
Farmacológica
Muestras Positivas
# %
Avilamicina 1 2,94
Bacitracina de Zn Polepéptido 16 47,06
Cefalosporina Betalactámico 2 5,88
Ciprofloxacina Fluoroquinolona 3 8,82
Clorhidroxiquinolina
(Halquinol) Fenicol 7 20,59
Doxiciclina Tetraciclina 7 20,59
Enrofloxacina Fluoroquinolona 23 67,65
Florfenicol Fenicol 5 14,71
Fosfato de Tilmicosina Macrólido 2 5,88
Fosfomicina Cálcica Derivados del
Ácido Fosfórico 3 8,82
Gentamicina Aminoglucósido 3 8,82
Tiamulina Pleuromutilina 7 20,59
Tilosina Macrólido 2 5,88
Virginiamicina Estreptogramina 1 2,94
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora