apuntes tema preparación muestra

© Javier Señoráns

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Grado en Nutrición Humana y Dietética 1

Tema 2.

La preparación de la muestra

F. Javier Señoráns RodríguezSección Departamental de Ciencias de la AlimentaciónM - 08 – despacho 502

E-mail: [email protected]

Página web: www.uam.es/javier.senorans

Asignatura de Análisis Instrumental y Sensorial de AlimentosGrado en Nutrición Humana y Dietética

Tema 2. La preparación de la muestra

Aislamiento y concentración de compuestos en alimentos.

Técnicas de muestreo de la fase vapor: el análisis del espacio de cabeza (método estático y método dinámico). Técnicas actuales de concentración del espacio de cabeza.

La microextracción en fase sólida (SPME).

La extracción en fase sólida (SPE).

La extracción supercrítica analítica (SFE).

La extracción acelerada con disolventes (ASE).

La extracción asistida por microondas (MAE). Aplicaciones al análisis del aroma de alimentos y al análisis de residuos.




� La mayoría de las muestras de alimentos que se

analizan por métodos instrumentales de separación son demasiado complejas, están demasiado diluidas o son incompatibles con el sistema cromatográfico, lo que impide su introducción directa

Nuevas técnicas de preparación de la muestra

se necesita preparar la muestra antes de su introducción en el sistema,mediante fraccionamiento, extracción o pre-separación.

Consecuencia:

PREPARACIÓNDE MUESTRA

PROBLEMA PREPARACIÓN

DE MUESTRA

CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNAS CAPILARES

ALTA RESOLUCIÓN

MUESTRA GC

MUESTRA GC

Nuevas técnicas de preparación de la muestra




Problemas actuales de métodos oficiales y tradicionales:

• lentitud y laboriosidad• empleo de grandes cantidades de disolventes tóxicos

• poca selectividad• poco rendimiento

Métodos tradicionales de preparación de la muestra:-más de 2/3 del tiempo del analista-responsable de al menos 1/3 del error en el análisis-enorme volumen de disolventes

Necesidad de nuevas técnicas de preparación demuestras de alimentos

posibilidad de automatización

técnicas limpias y selectivas

mayor rapidez y eficacia

fiabilidad

Metas

Idealmente, además, baratas, sencillas, sin

disolventes tóxicos

Creciente demanda de :

mayor productividad en los laboratoriosanálisis más rápidosmétodos más automatizados

Necesidad de nuevas técnicas de preparación demuestras de alimentos




Posibilidades clásicas:

Cristalización

Destilación

Precipitación

Extracción con disolventesLLE, Soxhlet, etc.

Otras: Diálisis y microdiálisis

Filtración

Ultrafiltración

Separaciones con membranas

Técnicas instrumentales de preparación de muestrasde alimentos

Cromatografía en capa fina (TLC)

Cromatografía en columnas abiertas (flash)

LC prep. cromatografía preparativa

Acoplamiento LC-GC

SFC preparativa


Técnicas basadas en la cromatografía:




Extracción Sólido-liquido

Extracción Líquido-líquido

Extracciones modernas (ASE, MAE, SFE, etc.)

SPE, SPME, etc.


Técnicas basadas en la extracción

Fundamento

La cromatografía en capa fina al igual que otras técnicas

cromatográficas se basa en la retención y elución debido

a la diferente interacción del analito entre una fase sólida

y otra líquida.

La placa se introduce en un recipiente que contiene la

fase móvil y alineada con una tira de papel adsorbente. El

disolvente asciende por capilaridad y la separación se

basa en la diferente velocidad a la que los distintos

analitos presentes en la muestra ascienden por la placa.

Fundamentos de la Cromatografía en capa fina(TLC, Thin Layer Chromatography)




Cálculo de los Factores de Retención (RF)Para ello se emplea la siguiente formula

siendo DA la distancia recorrida por el analito y DS la distancia recorrida por el disolvente o frente del disolvente.

Fundamentos de la Cromatografía en capa fina

Frente del disolvente

Posición del analito

tras la cromatografía

origen

DS

DARF =

Cromatografía en columna

Fundamento

La cromatografía en columna al igual que otras técnicas cromatográficas se basa en la

retención y elución debido a la diferente interacción del analito entre una fase sólida que

rellena una columna abierta y otra líquida (normalmente un disolvente orgánico o una mezcla

de disolventes).




Esquema Tema 2. La preparación de la muestra

• Introducción a las técnicas de preparación de muestra

• Extracción líquido-líquido

• Extracción Asistida por Microondas (MAE, MicrowaveAssisted Extraction)

• Extracción Acelerada con Disolventes (ASE, AcceleratedSolvent Extraction)

• Cromatografía en capa fina y cromatografía en columna

• Extracción sólido-líquido

� Extracción en Fase Sólida (SPE, Solid Phase Extraction)

� Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME, Solid PhaseMicro-Extraction)

Muestras sólidas de alimentos:

Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)

Residuos y contaminantes en alimentos

MAE

ASE

SFE

Aroma y compuestos volátilesde alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante:

vinos, quesos, aceites esenciales, etc

Espacio de cabeza

SPME

Diferentes técnicas para problemas distintos

Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.

Extracción en fase sólida




Determinación de compuestos

volátiles en muestras de

alimentos

Cromatografía de gases

Técnicas de aislamiento y concentración de compuestos

volátiles de la matriz

Problemas:

• trazas

• aislamiento compuestos volátiles del alimento o del producto a analizar

• se requieren grandes cantidades de producto para obtener la adecuada cantidad para análisis por CG o CG-EM

Técnicas de aislamiento y concentración de compuestos volátiles de la matriz

Nuevas técnicas basadas en el análisis del espacio de cabeza

- se basan en la preconcentración, para posterior análisis y determinación, de los compuestos volátiles que se desprenden del alimento sólido o líquido

Objetivos:

• extraer analitos de interés lo más concentrados posible

• elevada recuperación cuantitativa

• mínimas interferencias




Micro-extracción en fase sólida (SPME)

Se basa en la adsorción de los compuestos orgánicos del

alimento por una fase sólida inmovilizada sobre una fibra de

sílice fundida.

Una vez alcanzado el equilibrio, los compuestos adsorbidos se

desorben térmicamente en el inyector de un cromatógrafo de

gases

La matriz puede ser aire, agua, muestras líquidas, etc.

Alternativamente, también se puede disolver el extracto en un

disolvente orgánico para analizarlo por HPLC.

Principios de la Técnica

Microextracción en fase sólida (SPME)

SPME es una nueva técnica de extracción para compuestos

orgánicos, que se basa en la adsorción de los analitos de la matriz

(aire, agua, muestras líquidas, etc.) por una fase sólida inmovilizada

sobre una fibra de sílice fundida.

Si se emplea un recubrimiento polimérico, la cantidad de analito

adsorbida por el recubrimiento en equilibrio está relacionada

directamente con la concentración en la muestra.





Esquema del sistema

para SPME y detalle de

la fibra adsorbente.

La fibra es de sílice fundida recubierta de un polímero adsorbente selectivo.


KfhVfVsCo

KfhVf+Vs

n =

n: masa de analito adsorbida por el recubrimiento

Vf,Vs: Volumen de recubrimiento y de muestra

K : coeficiente de reparto del analito entre el

recubrimiento y la muestra; [K = f ( T, fibra)]

Co: concentración inicial del analito en la muestra


Principio Teórico





En relación al reparto de los analitos.......

Principales variables que influyen en el proceso de reparto:

• constante de distribución

• temperatura de la muestra y tipo de calentamiento

25 °C

130 °C

200 °C

Es una técnica rápida y relativamente sencilla

Existen diferentes fibras adsorbentes disponibles en el mercado que permiten cierta selectividad

Se puede acoplar fácilmente a otras técnicas de separación (GC y HPLC)

No requiere ningún disolvente

SPME es una técnica económica (reutilizable)

� Está limitada a muestras líquidas o compuestos volátiles (espacio de cabeza)

� No permite conservar el extracto para otros análisis

Ventajas y desventajas de la Microextracción en fasesólida




• Detección de enranciamiento de aceites por SPME de aldehídos y otros subproductos de la oxidación

• Análisis de aromas naturales y extraños de alimentos

• Aromas de vinos, bebidas espirituosas, zumos y otras bebidas

• Diferenciación de tipos de café, origen, tueste, etc.

• Compuestos azufrados en cerveza y otras bebidas alcohólicas

• Caracterización y control de calidad de alimentos de alto valor: jamones, trufas, patés, etc.


Aplicaciones:

Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME)

Ejemplo de análisis de compuestos volátiles en un zumo de fruta

sin usar ningún disolvente tóxico







MAE

ASE

SFE



Espacio de cabeza

SPME




Técnicas de Purga y Trampa y Desorción Térmica

Procedimiento

• arrastre continuo de la muestra por medio de un flujo de gas

inerte (He o N2)

• captura o adsorción de los compuestos volátiles en una trampa

adsorbente

• desorción, mediante calentamiento, de los compuestos

retenidos




Técnica de Purga y Trampa

Arrastre y captura:

1

3

2

4

5

MS GCP&T

• Gas inerte: para no alterar componentes de la muestra

• Temperatura ambiente

Técnica de Purga y Trampa

Realiza, de forma automática, las etapas de arrastre, captura y

desorción

Elevada reproducibilidad

Evita manipulación de muestra

No requiere ningún disolvente

Elevada sensibilidad

No existen interferencias de compuestos no volátiles de la matriz

� Optimización de todas las variables en conjunto

Ventajas y desventajas P&T:







MAE

ASE

SFE



Espacio de cabeza

SPME




Esquema Tema 2. AISA














Espacio de cabeza

SPME







MAE

ASE

SFE

Extracción sólido-líquido: Extracción de alimentossólidos con disolventes

Método tradicional de extracción

disolvente orgánico (líquido) caliente, en ebullición, en contacto conmuestra de alimento (sólido)

(ej. Soxhlet)

Temperatura máxima del Disolvente== Punto de ebullición (60-80ºC)

Disolvente

Disolvente+ extracto




Necesidad de nuevas técnicas de extracción dealimentos sólidos

Métodos tradicionales de extracción sólido-líquido : líquido en ebullición en contacto con muestra sólida

difusividad del disolvente lentaintercambio de energía poco eficaz

procesos estáticos o semi-estáticos

Extracción lenta y poco eficaz

disolventes convencionales calor como única energía

Extracción lenta y poco selectiva

Pasos previos:

Homogeneizar la muestra

Reducir su tamaño

Evitar cambios en la muestra:

Inactivación enzimática

Protección de lípidos

Inhibición del crecimiento microbiano

Cambios físicos, agua, estructura, etc.

Congelación, secado, tratamiento térmico, conservantes

químicos (o una combinación de varios de ellos)





Extractor Soxhlet

• Método tradicional, muy aceptado y extendido

• Lento

Esquema Tema 2. La preparación de la muestra












Principios comunes a las nuevas técnicas de extracción:

Extracción asistida por microondas (MAE).

Extracción acelerada con disolventes (ASE).

Extracción supercrítica analítica (SFE).

Se emplean disolventes de alta difusividad elevando la temperatura

y controlando la presión

Debido a los mayores coeficientes de difusión, las extracciones se

aceleran considerablemente

Técnicas instrumentales de extracción de muestras sólidas de alimentos

Extracciones de sólidoscon mayor rapidez y eficacia

Líquidos a alta TªFluidos Supercríticos

SFE ASEMAE

Presiónelevada

Energía localizada

selectividad rendimiento

Técnicas avanzadas de preparación de muestrasde alimentos sólidos




Principios de la Extracción Asistida porMicroondas (MAE)

Se extrae la muestra aplicando energía de microondas en un

disolvente adecuado.

Energía de microondas:

� calienta selectivamente unas especies químicas frente a otras

� produce extracciones rápidas y con cierta selectividad.

El calentamiento producido depende de la naturaleza química de la

matriz y del disolvente

Cuanto mayor es la constante dieléctrica, mayor es la absorción de

energía.

Extracción Asistida por Microondas (MAE)

Cuando el disolvente absorbe energía microondas:

� La muestra se coloca en un recipiente cerrado

� se calienta a temperaturas mayores que su punto de

ebullición durante un tiempo muy corto (aumenta la presión)

�después se enfría y se despresuriza

�se separa o filtra el extracto

Procedimiento habitual





Esquema de una celda comercial con control de presión y de temperatura para MAE

Equipo necesario:• Microondas• Celdas apropiadas

Características de las celdas no absorber microondas,

ser inertes,

fáciles de abrir y cerrar

reutilizables

resistentes a altas P y temperaturas


Principales variables:

Relativas a la muestra

Tiempo de irradiación y extracción

Potencia de irradiación

Caudal de disolvente (en procesos continuos)

Disolvente: composición y propiedadesconstante dieléctrica





� MAE es más rápida (30 seg.-10 min) y emplea menos disolvente (1-15 mL) que la extracción líquida tradicional

� La energía esta localizada y se aprovecha mejor (menor consumo)

� El tamaño de muestra puede ser muy variado

� MAE es una técnica robusta y fácil de usar

� Se pueden extraer varias muestras a la vez

� No hace falta deshidratar o procesar la muestra

Ventajas


� MAE depende de la matriz y limita los disolventes que se pueden utilizar

� MAE plantea problemas de seguridad

� El extracto queda en contacto con la muestra al acabar la extracción y necesita una posterior filtración o separación

� MAE es difícil de automatizar o acoplar a técnicas de análisis

� Degradación de compuestos térmicamente lábiles

� Poca selectividad en la extracción

Desventajas





Esquema de un extractor asistido por microondas

Extracción de grasa de carne, huevo y sólidos lácteos

Extracción de oleorresina de pimentón

Extracción de monoterpenoles de mostos para análisis por GC

Extracción de contaminantes (residuos de pesticidas, PAHs, PCBs, etc.)

Ejemplos de Aplicaciones:

Extracción de esencias de vainilla, menta, ginseng, cítricos, etc.

Ejemplo de Extracción Asistida por Microondas (MAE)


Homogeneización de la muestra

Se añade el disolvente: éter de petróleo o hexano

La muestra se coloca en un recipiente abierto adecuado

Se irradia a 300 W durante 60 + 90 segundos

El extracto se filtra a vacío para separar la muestra del disolvente

Se concentra el extracto, evaporando el disolvente en rotavapor






SFE ASEMAE

Presiónelevada

Energía localizada



Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)

• nueva técnica de extracción • disolventes habituales • presiones y temperaturas elevadas • extracciones rápidas y efectivas de muestras sólidas


Temperaturas: 30 - 200 ºC

Presiones: 100 - 140 atm

Disolventes: orgánicos, agua, mezclas, etc.

Muestras: sólidas





• nueva técnica de extracción • disolventes habituales • presiones y temperaturas elevadas • extracciones rápidas y efectivas de muestras sólidas


Efectos interesantes que se producen a temperaturas elevadas: • mejores solubilidades de los analitos en líquidos • aumento de las cinéticas de desorción de los compuestos de la matriz


• La muestra sólida se coloca en un recipiente que se sella

• Se llena con disolvente y se calienta a temperatura mayor

que el punto de ebullición del disolvente, provocando un

gran aumento de la presión en la celda.

• Durante el tiempo de extracción parte del líquido es

liberado y recogido en un vial.

• Al final de la extracción, el extracto se expulsa de la celda

con nitrógeno y se transfiere automáticamente a un vial.

Procedimiento




Principales variables:

• Relativas a la muestra

• Tiempo de extracción

• Temperatura de extracción

• Número de ciclos

• Disolvente o mezcla de disolventes


Disolvente

Bomba

Nitrógeno

Válvula de purga

Vial colector

Horno

Celda de Extracción

Válvula Estática

Vial de desecho

Válvula de presión

Salidaaire





Imagen de un extractor con disolventes presurizados (ASE)


Pesticidas en harinas, piensos, etc.

Micotoxinas en cereales y frutos secos

Extracción de contaminantes (residuos de pesticidas, dioxinas, PCBs, etc.)


Extracción de productos naturales


Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)de alimentos

� ASETM es más rápida que los procedimientos de extracción líquida tradicionales <15 min frente a 2-24 h

� ASE emplea menos disolvente <15 mL para 10 g de muestra vs. 50-500 mL

� ASE es más eficaz independientemente de la matriz

� ASE es automatizable y puede extraer muestras secuencialmente

� El desarrollo de métodos es mucho más sencillo

Ventajas




Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)de alimentos

� Las extracciones son más completas, pero menos selectivas

� ASE requiere el empleo de temperaturas más altas que en SFE

� El equipo tiene un precio elevado

Desventajas



SFE ASEMAE

Presiónelevada

Energía localizada






Extracción Analítica con Fluidos Supercríticos (SFE)

Se extrae con un fluido a presiones y temperaturas mayores que las de su punto crítico

� extrae rápida y selectivamente algunos compuestos

Variando la presión (la densidad del fluido) se controla la solubilidad de los analitos en dicho fluido.


Diagrama de fases

Presión

Temperatura

Líquido

Gas

Sólido

FluidoSupercrítico

¿Qué es un Fluido Supercrítico?

Punto

Crítico

(Para CO2 es

31.3ºC y

72.9 atm)




• Moderadas presión (72.9 atm) y temperatura (31.3ºC)

críticas

• Gas a temperatura ambiente, no deja residuos

• No es tóxico ni inflamable

• Precio moderado y sin problemas de eliminación

• Baja polaridad, se pueden añadir modificadores en

pequeña proporción para extraer compuestos polares

Propiedades del dióxido de carbono

Extracción Analítica con Fluidos Supercríticos (SFE)

El fluido supercrítico más utilizado es el dióxido de carbono (CO2)




MAE

ASE

SFE

Aroma y compuestos volátilesde alimentos y bebidas cuyo flavor es importante:


Espacio de cabeza

SPME







Fundamentos de la Extracción Líquido-Líquido

Partición de los componentes

de una mezcla

entre dos líquidos inmiscibles

de diferente densidad

Extracción en fase sólida (SPE)

SPE es una técnica de extracción que se basa en la

retención sobre un adsorbente sólido de los compuestos

deseados disueltos en una muestra líquida.

La adición de un eluyente permite eliminar los componentes

de la matriz que interfieren, para después eluir y concentrar

los analitos de interés.

La extracción en fase sólida sustituye a la extracción

líquido-líquido clásica.





Procedimiento de la Extracción en Fase Sólida (SPE)

Muestra Acondicio-namiento

Adición de muestra

Lavado Elución del analito

Extracción en Fase Sólida (SPE)


• Eliminación de pigmentos de

vegetales y hortalizas

• Retención de antocianinas y otras

interferencias en análisis de

pesticidas en vinos

• Vitaminas en zumos

• Residuos de antibióticos en leches




Extracción en Fase Sólida (SPE)

Imagen de un colector

múltiple para SPE con aspiración a vacío.

Permite la extracción

simultánea de 20 tubos con muestra.

Equipo automático para SPE con microplacas de 96 / 384

Ventajas y desventajas de SPE

� Es una técnica muy sencilla y rápida

� Existen numerosos adsorbentes disponibles en el mercado para SPE

� Se puede acoplar a otras técnicas de separación

� Emplea poco o ningún disolvente

� SPE es muy efectiva para extraer compuestos polares o apolares de muestras líquidas

� Se puede automatizar

� Está limitada a muestras líquidas




Sumario de propiedades de nuevas técnicas deextracción

Rápidas: tiempos de extracción de 1 - 30 minutos

Ninguna técnica es ideal para todos los analitos de todas las matrices

Las nuevas técnicas son cada vez más comunes y van a continuar su expansión debido a sus numerosas ventajas

Posibilidad de automatización

Eficaces y selectivas

• Libros sobre Análisis Instrumental incluyendo preparación de muestra:

Rubinson K.A., Rubinson J.F. (2001). Análisis Instrumental.Prentice Hall-Pearson. Madrid.

Matissek R., Schnepel F.M., Steiner G. (1998). Análisis de losAlimentos. Fundamentos, Métodos, Aplicaciones. Acribia.Zaragoza.

Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. (2001). Principios de AnálisisInstrumental. [Quinta Edición] McGraw-Hill. Madrid.

Bibliografía recomendada

apuntes tema preparación muestra

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