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Aplicaciones Técnicas DNA
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Separación de moléculas de DNA mediante geles de electroforesis
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La visualización de las moléculas de DNA se realiza mediante la utilización de colorantes fluorescentes
RNA total DNA Genómico El Bromuro de etidio fluoresce bajo la luz UV
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El DNA debe ser fragmentando para poder ser analizado
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El DNA debe ser fragmentando para poder ser analizado
Las enzimas de restricción son endonucleasas que cortan el DNA en sitios particulares mediante el reconocimiento de una secuencia de nucleótidos específica.
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- Las Enzimas de restricción reconocen secuencias de DNA de 4-8 pb. - Cortan en una posición determinada - Pueden generar 2 tipos de corte y generar extremos cohesivos o romos
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Las enzimas de restricción fueron aisladas de bacterias; su función natural es proteger contra DNA extraño
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Hibridación entre ácidos nucléicos (reconocimiento de secuencias con alta homología)
Temperatura 65oC
Temperatura 95oC
Desnaturalización alcalina
Sonda marcada
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Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)
Vorsanova et al., 2010
DNA-DNA
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Southern Blot (detección de secuencias específicas en muestras de DNA)
1. Aislamiento de DNA 2. Cortar con enzimas de
restricción 3. Separar fragmentos por
electroforesis 4. Desnaturalizar el DNA 5. Transferir a membrana de
nitrocelulosa o nylon 6. Hibridar con sonda específica 7. Revelar con placa de Rayos X ó
pantalla de fosforimager
Permite el análisis de genes, polimorfismos, mutaciones… DNA-DNA
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Southern Blot: Análisis de DNA
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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Permite el análisis de genes, polimorfismos, mutaciones, facilita la secuenciación…
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PCR: La amplificación es exponencial
En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento particular de interés
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El PCR se utiliza en Pruebas de identidad
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Secuenciación de DNA por el método de Sanger
No acepta elongación de la cadena de nucleotidos por la DNA polimerasa
• dsDNA molde (¿secuencia?) • 4 desoxiribonucleótidos (dNTPs)
• cebador de DNA
• DNA polimerasa
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Secuenciación de DNA por el método de Sanger
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Secuenciación de DNA por el método de Sanger
5’
5’ 3’
3’
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Secuenciación automatizada de DNA Fragmentos de DNA con ddNTPs marcados con fluorescencia(los fragmentos pequeños pasan primero a través del capilar
Como cada ddNTP tiene un fluoróforo distinto, al pasar por el detector se crea un pico de señal específico para cada ddNTP.
Tubo capilar
Laser Archivo de salida
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Técnicas avanzadas para el análisis de DNA
• Microarreglos de DNA
• Secuenciación masiva de DNA
6
Affymetrix oligonucleotide arrays
Affymetrix oligonucleotide arrays
8
Agilent DNA microarray platform
Single long oligonucleotide probes(25-60 bases)
High density(244,000 features per chip)
In situ synthesis printing process(highly consistent SurePrint technology)
Supports 1 or 2 samples hybridization
Great design flexibility(rapid design of custom arrays using eArray)
Possibility of multiplexing(as many as 8 arrays in one slide)
Comparison of microarray platforms
higher ($500)lower (<$100)Costmodel (sequenced)anyOrganisms
a posterioria prioriComparison designhighmoderateSpecificity
higherlowerReplicabilitylowerhigherVariability
~absoluterelativeQuantificationsingle colortwo colorHybridization
highmoderateRepresentation10,000-40,0005,000-10,000Gene density
25-60 mer oligoscDNAs/BACsProbes
Oligonucleotidearrays
Custommicroarrays
PCR, sondas, hibridación
Fragmentación de DNA, ligación de adaptadores, PCR, secuenciación
13
454 sequencing method
http://www.solexa.com/
Solexa Genome Analyzer
Chemistry based on reversible terminators
Sample amplified by solid-phase amplification
Read length 30-75 bp
>100 million reads per run
~10 Gb of sequence
4-8 days run
Solexa Genome Analyzer (Illumina)
14
Solexa sequencing method
1. DNA fragmentation and adapters ligation
2. Solid-phase amplification and cluster generation by bridge PCR
Solexa sequencing method
3. Flowing of fluorescent reversible terminator dNTPsand incorporation of a single base per cycle
4. Read identity of each base of a cluster from sequencial images
14
Solexa sequencing method
1. DNA fragmentation and adapters ligation
2. Solid-phase amplification and cluster generation by bridge PCR
Solexa sequencing method
3. Flowing of fluorescent reversible terminator dNTPsand incorporation of a single base per cycle
4. Read identity of each base of a cluster from sequencial images
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Análisis de la metilación de DNA
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Análisis de la metilación de DNA
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Uso de las Técnicas avanzadas para el análisis de DNA
• Identificación de patógenos en una muestra
• Metagenomas, población de organismos en un ambiente o microambiente
• Estimar número de copias de secuencias en un genoma
• Identificar secuencias de unión a proteínas reguladoras (factores de transcripción)
• Detección de modificaciones epigenéticas
• Y muchas otras….
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Uso del sistema de inmunidad bacteriana CRISPR para editar Genomas
CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas: Endonucleasa activada por RNA
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CRISPR-Cas9 modificado para editar genomas
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• Se diseñan varios sgRNAs ESPECIFICOS para el gen de interés que deben incluir sitios PAM
• Se clonan en tandem en vectores apropiados que ya contienen a Cas9.
• Se transforma el organismo de interés
• Se verifica mediante PCR la mutación