MICROBIOLOGIA GENERAL- FARMACIA

Microbiologa General

Facultad de Ciencias Exactas

UNLP

Laboratorios N10: Antimicrobianos1. Prueba de difusin en gar: ANTIBIOGRAMA, tcnica de Kirby y Bauer.Objetivo: Determinar el espectro de susceptibilidad a antimicrobianos de Escherichia coli, Pseudomonas. sp. por la tcnica de difusin en agar.

Preparacin del medio de cultivo

gar Mueller-Hinton

Infusin de carne de buey 300 ml

Aminocidos de casena 15 g

Almidn 1.5 g

Agar 17 g

Agua destilada c.s.p. 1000 ml pH final=7.4.

El medio de cultivo, agar Mueller-Hinton, se entuba a razn de 25 ml por tubo y se esteriliza en autoclave, 120C por 15 min. Una vez esterilizado se vuelca en placas de Petri, sobre una superficie horizontal y uniforme con el fin de obtener una profundidad aproximada de 4 mm. Esto requiere unos 25 ml de medio en placas de 100 mm de dimetro. Antes de ser utilizadas se secarn a 35C durante 20 a 30 min.Preparacin del inculo A partir de un desarrollo en agar nutritivo se realiza una suspensin directa a partir de 4 5 colonias con 18-24 hs. de incubacin en solucin fisiolgica ajustando la turbidez al 0.5 de la escala de Mc Farland (aprox. 1.5 x 108ufc/ml). Dentro de los 15 minutos de estandarizado en inculo, se siembra el medio de la siguiente manera: se sumerge un hisopo de algodn estril en la suspensin estandarizada y el exceso de lquido se elimina presionando y rotando el hisopo firmemente contra el interior del tubo por encima del nivel de lquido. Luego se pasa el hisopo en franjas uniformes en tres direcciones cubriendo toda la superficie de la placa de agar para obtener una siembra uniforme. Las placas se dejan secar de 3 a 5 minutos antes de aplicar los discos. El inculo debe dar un desarrollo confluente (aplicar los discos dentro de los 15 min. posteriores a la inoculacin). Aplicacin de los discosLos discos de antimicrobianos se aplican sobre la superficie de las placas inoculadas con pinza estril. Todos los discos deben presionarse suavemente sobre el agar para asegurar contacto total con la superficie. Deben colocarse a una distancia igual o mayor de 15 mm del borde de la placa y lo bastante separados para evitar la superposicin de los halos de inhibicin. No usar ms de 6 discos por placa de 100 mm.Dentro de los 15 min. de colocados los discos llevar a incubar con la placa invertida a 35C durante 16 a 18 hs.Lectura e interpretacin

Luego del perodo de incubacin se leen los halos de inhibicin utilizando un calibre o una regla.

El punto final es la inhibicin total del crecimiento, sin tener en cuenta las colonias diminutas que puedan detectarse solo con una observacin muy minuciosa. Los dimetros de zonas para antimicrobianos individuales se traducen a las categoras de susceptibles, intermedios o resistentes con referencia a tablas interpretativas. Generalmente son aquellas recomendadas por el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)Control de calidad del ensayo

Para monitorear la exactitud y precisin del procedimiento y la calidad de los reactivos se realiza un control de calidad peridico con cepas control de susceptibilidad conocida y genticamente estable. Las cepas recomendadas para control de mtodos de difusin son: Escherichia coli (ATCC 25922 y ATCC 35218), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Enterococcus faecalis (ATC29212).

CepaAntibiticoHalo de inhibicin (mm)Criterio de corte (mm)Interpretacin

2. Prueba de dilucin en caldo: Determinacin de la C.I.M.Objetivo: Determinar el valor de la concentracin inhibitoria mnima (C.I.M.) de ampicilina sobre Escherichia coli por la tcnica de dilucin en caldo.

Preparacin del medio de cultivoCaldo de Mueller-Hinton suplementado con Cl2Ca (25 mg/l) y Cl2Mg (50 mg/l).

Preparacin de la solucin del antibiticoPesar 10 mg del antibitico ampicilina y llevar a volumen en matraz aforado de 10 ml con agua destilada estril (solucin stock de 1000 g/ml). En el momento de usar se diluye 1/10 con agua destilada estril (solucin de trabajo de 100 g/ml).

Preparacin del inculoA partir de un cultivo puro de E. coli en agar nutritivo se prepara una suspensin en solucin fisiolgica ajustando la turbidez al 0.5 de la escala de Mc. Farland. Diluir esta suspensin 1/100 colocando 0.2 ml en 19.8 ml de caldo Mueller-Hinton.

Preparacin de las dilucionesSe preparan diluciones al doble a partir de la solucin de trabajo, directamente en los tubos de la siguiente manera

a- Disponer y enumerar 14 tubos estriles.

b- Comenzar colocando el caldo de Mueller-Hinton de acuerdo a lo indicado en la tabla.

c- A los tubos 1, 2 y 12 agregarles 0.5 ml de la solucin de antibitico 100 g/ml.

d- A partir del 2 tubo, luego de homogeneizar muy bien, extraer 0.5 ml y pasarlos al tubo siguiente. Realizar esta operacin hasta el tubo 11, descartar de aqu 0.5 ml..

e- Agregar a todos los tubos que indica la tabla 0.5 ml de inculo.

Tubo 12: Control de esterilidad de la solucin de antibitico.

Tubo 13: Control crecimiento de la cepa.

Tubo 14: Control de esterilidad del caldo.

Incubar los tubos a 35C durante 18 a 20 hs.

LecturaLa menor concentracin de antimicrobiano que produce una inhibicin completa del desarrollo visible representa la C.I.M.

Para la interpretacin de la lectura (S, I, R) se recurre a las tablas de C.I.M. para el antibitico ensayado recomendadas por el CLSI.

Control de calidad

Para monitorear la exactitud y precisin del procedimiento y la calidad de los reactivos se realiza un control de calidad en paralelo al ensayo con cepas control de susceptibilidad conocida y genticamente estables. Las cepas recomendadas para control de mtodos de dilucin son: Escherichia coli (ATCC 25922 y ATCC35218), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Enterococcus faecalis (ATC29212) entre otras.

Esquema para la realizacin de la C.I.M.TuboCaldo M-HDil. del antibitico (ml)InculoConc. final antibiticoResultado (turbidez)

1----0.5 de 100 g/ml0.5 ml50 g/ml

20.5 ml0.5 de 100 g/ml0.5 ml25 g/ml

30.5 ml0.5 del tubo 20.5 ml12.5 g/ml

40.5 ml0.5 del tubo 30.5 ml6.25 g/ml

50.5 ml0.5 del tubo 40.5 ml3.12 g/ml

60.5 ml0.5 del tubo 50.5 ml1.56 g/ml

70.5 ml0.5 del tubo 60.5 ml0.78 g/ml

80.5 ml0.5 del tubo 70.5 ml0.39 g/ml

90.5 ml0.5 del tubo 80.5 ml0.195 g/ml

100.5 ml0.5 del tubo 90.5 ml0.09 g/ml

110.5 ml0.5 del tubo 10

y retirar 0.5 ml0.5 ml0.045 g/ml

120.5 ml0.5 de 100g/ml--------Control de est. de dil. Atb.

130.5 ml--------------------------0.5 mlControl de cepa

141 ml----------------------------------Control de est. del caldo

CIM: ...................................... Interpretacin:.......................................................

3. Valoracin microbiolgica de antibiticos

Objetivo: Determinar la potencia de una muestra de ampicilina inyectable por la tcnica microbiolgica de difusin en gar (3+3).

Ensayo aleatorizado en dosis (3+3), por la tcnica de difusin en agar.

En el trabajo prctico se realizar la valoracin de una muestra de ampicilina inyectable de 1000mg por el mtodo cilindro-placa.

Previo a la valoracin de cualquier antibitico debe realizarse la curva de calibracin Dosis-Respuesta para la seleccin de las diluciones de prueba en las condiciones del ensayo. En este caso el anlisis de la curva log concentracin (g/ml) vs halo (mm) permiti seleccionar las siguientes tres concentraciones de trabajo: 0,15 g/ml - 0,30 g/ml - 0,60 g/ml.

Realizacin del ensayo de valoracin-Preparacin de las diluciones del estndar de referencia.

Utilizar un estndar de Ampicilina de 980 g/mg, Proceder de acuerdo a lo indicado en la USP-XXV (Biological Test/ Antibiotics-Microbial Assays). Pesar exactamente alrededor de 20 mg del estndar. Calcular el volumen de agua destilada estril para resuspender la pesada de forma de obtener una solucin de 5000 g/ml, teniendo en cuenta la potencia (g/mg). Realizar el siguiente esquema de diluciones:

1:50 1:10 0.15: 10 ==> 0.15 g/ml

5000 g/ml 100 g/ml 10 g/ml 0.30: 10 ==> 0.30 g/ml

ADE S3 S3 0.60: 10 ==> 0.60 g/ml

Solucin 3 (S3): P04K2H -------16.73 g

P04KH2 ------ 0.523 g

AD -------1000 ml pH 8, 0.1M

-Preparacin de las diluciones de la muestra.

Preparar las diluciones de la muestra siguiendo el esquema utilizado para el estndar. Considerar que la muestra tiene una potencia del 100% segn lo declarado por el fabricante.

-Preparacin del inculo.

El microorganismo utilizado como indicador es el Micrococcus luteus, ATCC 9341. Sembrar la cepa en 3 tubos de gar para antibiticos N11 de Merck, e incubar 24 hs a 32 C. Resuspender los desarrollos en solucin fisiolgica (0.85% NaCl), de forma de obtener un inculo denso y homogneo. Finalmente calibrar el inculo al 25% de transmitancia leda a 580 nm. As preparado puede conservarse a 4C durante 14 das.

Calcular el volumen de inculo a sembrar por placa sobre la base de la relacin propuesta por USP-XXV: 0.5 ml cada 100 ml del medio.

-Preparacin de las placas.

Se utiliza el gar para antibiticos N11 de Merck, envasado a razn de 16 ml por tubo. Fundir 6 tubos del medio N11, enfriarlos a 45-50C y mantenerlos en Bao Mara. Inocularlos, homogeneizar y volcar en las respectivas placas de Petri estriles. Dejar secar 10 minutos en flujo laminar.

-Reservorio del antibitico

Utilizar cilindros de vidrio o de acero inoxidable esterilizados en estufa. Sus dimensiones son: dimetro externo: 8 mm; dimetro interno: 6 mm y longitud: 10 mm.

-Ensayo

Dibujar 4 esquemas de distribucin de las diluciones sobre papel asignndoles las letras A,B,C y D. Cada esquema tendr las 6 diluciones: dosis baja (1), media (2) y alta (3) del estndar y dosis baja (4), media (5) y alta (6).de la muestra

Colocar las placas rotuladas con una letra sobre las plantillas segn los esquemas.

Con pinza estril disponer 6 cilindros por placa.

Cargar con pipeta automtica 25 l de cada una de las diluciones en los respectivos cilindros, de acuerdo a la distribucin de cada esquema. Cambiar de la punta descartable (tip) en cada dilucin.

Dejar las placas sobre la mesada para permitir la predifusin del antibitico durante 20 minutos.

Llevar a incubar a 37 C durante 24 horas.

Retirar los cilindros y descartarlos en formol al 5%.

Rotular los halos de inhibicin y leer con calibre por el reverso de las placas.

Registrar los datos segn la planilla: placas vs. diluciones.

EstndarMuestra

Placas0,15 g/ml0,30 g/ml0,60 g/ml0,15 g/ml0,30 g/ml0,60 g/ml

A

B

C

D

A*

B*

Prom. (mm)S1S2S3T1T2T3

Luego de evaluar estadsticamente los datos mediante un anlisis de varianza, calcular la potencia real del producto.

Graficar el logaritmo de las concentraciones ensayadas en funcin de los halos de inhibicin para el estndar y la muestra.

De acuerdo al procedimiento realizado las dosis alta, media y baja del estndar son iguales a las dosis alta, media y baja de la muestra, por lo tanto se esperara una respuesta coincidente entre ambas. Esto equivale a decir que la potencia real de la muestra es igual a la potencia supuesta. La diferencia real que pueda existir entre las dos respuestas lineales queda demostrada por la distancia vertical que aparezca entre las dos lneas paralelas: M, de donde se estima la potencia real de la muestra.

Deduccin de las ecuaciones en el ensayo 3 + 3.

Como puede observarse en la figura, para cada una de las dosis supuestas de la muestra, existe una respuesta que puede traducirse en una dosis real si se interpola el dimetro en la curva correspondiente al estndar. Tomando en cuenta lo que se acaba de enunciar podemos decir que:

Considerando que la relacin entre la dosis real y la dosis supuesta es idntica a la relacin entre la potencia real (de la muestra) y la potencia supuesta (del estndar) podemos escribir:

Si se logra determinar la relacin entre Preal y Psup (R) puede determinarse la potencia de la muestra ya que la potencia supuesta es conocida. Para esto calculemos la pendiente de las rectas teniendo en cuenta los datos de que disponemos. Hay dos maneras de hallarla que quedan claras si se observa el Grfico -1.

Grafico-1: Relacin entre el log Dosis y el halo de inhibicin en un ensayo de valoracin microbiolgica de un antibitico por el mtodo de difusin en gar, en tres niveles de dosis (3+3).

Con(Ntese que se hace un promedio de tres distancias).

(Ntese que se hace un promedio de cuatro distancias).

Simplificando

El valor de I tambin es conocido ya que es el logaritmo de la relacin entre dosis sucesivas (usualmente log 2=0.301). Queda claro que

Por lo tanto estamos en condiciones de calcular M y R a partir de los resultados de los halos de inhibicin obtenidos. La potencia real de la muestra estar dada por

En este caso, como R>1, la potencia de la muestra es mayor que la del standard (Preal>Psup) lo cual concuerda con el grfico. En el caso que la situacin real sea la inversa de la planteada para deducir las ecuaciones, esto es cuando la potencia de la muestra sea menor que la del standard, las mismas ecuaciones seguirn siendo vlidas pero el valor calculado para F ser negativo, el log M ser negativo y el R 18 mm.

c) Cmo se efectuaron las determinaciones de cada uno de los puntos de la figura 1?

d) Dibuje un grfico de log CIM en funcin de dimetro del halo de inhibicin y marque las zonas donde se verifiquen los errores que se mencionan en el texto.

e) Podra aplicar el criterio de considerar sensibles a los microorganismos que presentan un d > 18 mm? Por qu?11- En un ensayo realizado para determinar la susceptibilidad de Sthaphylococcus aureus a tres antibiticos se obtuvieron los resultados de la tabla siguiente:Cepas ensayadas

de S. aureusAntibiticoValores de corte

de CIM (g/ml)Valor de CIM halladosN de cepasSIR

MSSA

(n =32)Meticilina( 8 ( 160.5 a 432

Penicilina( 0.12 ( 0.250.085

0.427

Ciprofloxacina( 1 ( 40.524

24

> 644

MRSA

(n = 63)Meticilina( 8( 16> 12863

Penicilina( 0.12( 0.25863

Ciprofloxacina( 1( 40.5

2

>6412

2

49

a) Complete la tabla segn % de cepas S, I, y R.

b) Defina que es la CIM y explique en forma de esquema como realizara el ensayo para determinar uno de los casos de la tabla.

12- El antibiograma de la cepa Streptococcus thermophilus arroj los siguientes resultados: Nitrofurantona (carga de disco: 300 g/ml): 19 mm y Kanamicina (carga de disco: 10 g): 25 mm. Si las normas de interpretacin de halos y correlacin con la CIM son: Halos de inhibicin (mm) CIM

RISRS

Nitrofurantona

300 g/ml( 1415-16( 17( 100 g/ml

( 25 g/ml

Kanamicina

10 g/ml( 1314-17( 18( 25 g/ml( 6 g/ml

a) Cmo interpreta los resultados?

b) Cmo podra confirmar estos resultados y qu situaciones se podran presentar?

13- Los datos que se detallan a continuacin fueron extrados de una coleccin de cultivos de referencia. Estas cepas son utilizadas peridicamente para verificar la interpretacin de los halos de inhibicin en los ensayos de susceptibilidad a los antibiticos. El antibitico estudiado es vancomicina.a) Grafique un difusograma con estas cepas de referencia e indique las normas de interpretacin de los halos. Considere los valores de corte para CIM ( 8 g/ml y ( 16 g/ml.

b) El aislado fue ensayado en un test de susceptibilidad a este antibitico y el halo obtenido fue de 28 mm de dimetro. Indique de acuerdo al difusograma la sensibilidad de la cepa a este anibitico.

c) Describa esquemticamente y fundamente el ensayo realizado al aislado en b).

d) Qu tipos de discrepancias entre CIM y dimetro de halo conoce? Indquelas en el grfico.

CepasCIM (g/ml)Log2 CIMHalo (mm)

Shigella- 10.250-240

Shigella - 20.250-238

Shigella - 30.250-237

Shigella - 40.250-239

Pseudomonas 1- 2- 3- 4 y 50.250-2< 8

Klebsiela- 11022

Klebsiela- 21029

Klebsiela- 31032

Proteus- 116416

Proteus- 216415

Aerobacter- 16469

Aerobacter- 26468

14- En qu casos justificara una valoracin microbiolgica de un antibitico?15- Un laboratorio farmacutico necesita controlar la materia prima para la elaboracin de comprimidos de Gentamicina (sulfato). Para tal fin realiza la valoracin microbiolgica por difusin en gar (3+3), obteniendo los siguientes resultados:

PlacasStandardMuestra

A205239293190228283

B206252295197230281

C204234299178220290

Los halos fueron registrados como dcima de mm.

Dosis 1= 0,2 g/ml, Dosis 2 = 0,40 g/ml.

Los datos cumplen con las condiciones del anlisis de varianza.

a) Cul es la potencia de la materia prima valorada?

b) Grafique los resultados y deduzca la ecuacin que permite su clculo.

c) Cul es el fundamento del mtodo empleado?

10 15 20 25 30 (35 mm

CIM g/ml >32 --

32 --

16 --

8 --

4 --

2 --

1 --

0.5 --

0.25 --

D real (3)

D sup (3)

D real (2)

D sup (2)

D real (1)

D sup (1)

1

2

4

3

5

6

A

EMBED Equation.3

EMBED Equation.3

EMBED Equation.3

EMBED Equation.3

EMBED Equation.3

EMBED Equation.3

EMBED Equation.3

Dimetro del halo

Log Dosis

192 1 1 3 2 4 4 1 2 1 3 1 6 2 1 1

4 1 2 1 2 1 2 3 1 1 4 2 1

1 2 1 1 1 1 2 1 2 1 1 1

1 2 2 2 1 2 2 1 1 1

1 2 5 3 6 6 3 1 1 2 1 1 1

1 1 2 4 10 4 9 7 6 2 2 3 2

1 1 2 1 8 14 22 11 18 7 11 6 3 1 2 8

2 13 11 7 11 13 7 6 1 8

1 6 2 6 1 1 1 2

S1T1 S2 T2S3T3

F

E

I

M

Standard (S)

Muestra (T)

EMBED Equation.3

PAGE 1

_1143542261.unknown

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