UNIVERSIDAD DE ORIENTENCLEO DE NUEVA ESPARTAESCUELA DE CIENCIAS APLICADAS DEL MARBOCA DEL RIO

PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO

Evaluacin del rendimiento de fucoidanos a partir de dos especies de algas sometidas a cultivo, Sargassum spp, y Spatoglossum spp. (OCROPHYTAS, PHEOPHICEAE) presentes en la costa Oeste de la isla de Margarita, Estado Nueva Esparta.

JESUS LUNA FECHA

FABIOLA RUGUIEIRO FECHA

JULIO CESAR RODRGUEZ FECHA

___________________________ Coordinador de la CTG- Acuacultura

UNIVERSIDAD DE ORIENTENUCLEO NUEVA ESPARTADEPARTAMENTO DE ACUACULTURA2010

Evaluacin del rendimiento de fucoidanos a partir de dos especies de algas sometidas a cultivo, Sargassum spp, y Spatoglossum spp. (OCROPHYTAS, PHEOPHICEAE) presentes en la costa Oeste de la isla de Margarita, Estado Nueva Esparta.

INTRODUCCIONLa mayora de los estudios realizados en el campo de la ficologa se han enfocado en la investigacin sobre aspectos ecolgicos, taxonmicos y de distribucin de las algas. A pesar de esto, ciertos investigadores de muchos pases han mostrado un gran inters por el estudio de sus propiedades qumicas, fsicas y biolgicas. Estos trabajos han demostrado que muchas especies poseen propiedades con un sinnmero de aplicaciones industriales (Charzeddine & Farias 2001), donde las qumicas le confieren gran importancia para su utilidad en la industria farmacutica.Las especies pertenecientes a la clase Phaeophyceae o feofceas (algas pardas) son las de mayor tamao en ecosistemas marinos y las ms abundantes en regiones subtropicales y subtempladas del mundo. Desde la antigedad el grupo de las algas pardas han sido utilizadas como fertilizantes para suelos por su elevado contenido en minerales, vitaminas, protenas y polisacridos (McHugh, 2003). No obstante, en los ltimos 30 aos se han realizado numerosas investigaciones sobre los usos y aplicaciones de estas, tanto como material para alimentacin de humanos y animales, fertilizantes en cultivos de hortalizas y fitoplancton, y sobretodo en la intensiva bsqueda de drogas en la industria farmacutica.Dentro de la gama de compuestos que presentan las algas, se encuentran los fucoidanos, los cuales son polisacridos prcticamente lineales o con ramificaciones muy cortas, de peso molecular disperso, que dependiendo de la cantidad de L-Fucosa presente en la molcula, pueden clasificarse como homofucanos o heterofucanos y se han extrado de las feofceas (Martines 1998).Las algas pardas contienen alrededor de un 4,6% de polisacridos sulfatados, estos poseen propiedades farmacolgicas importantes, entre las ms estudiadas tenemos propiedades antivirales, anticancergenos, antitrombticas, antiinflamatrias y anticoagulantes (Roger et al. 2002, Casas et al. 2006, lvarez et al. 2006). Con el paso de los aos la comunidad cientfica ha incrementado el inters por el aislamiento e identificacin de nuevos polisacridos bioactivos especialmente los polisacridos sulfatados (Fucoidanos). Sus actividades biolgicas, son el resultado de la interaccin de carbohidratos y protenas, sin embargo es necesario desarrollar mtodos que faciliten la deteccin de polisacridos de bajo peso molecular para su identificacin, caracterizacin y estudios de sus funciones biolgicas (Roger et al. 2002).Los polisacridos sulfatados presentes en las algas pardas han mostrado actividad antiviral contra muchos virus que atacan el cuerpo humano, tales como el virus del herpes simple (HSV) 1 y 2 y contra el virus (RSV). Los compuestos fucoidanos aislados es de especies de Sargassum poseen amplia actividad antibitica, aglutinante, coagulante, mitognica, anticoagulante, anti-tumorales, anti-cancergena, anti-inflamatoria, insecticida, eutoxinas y otras muchas mas (Smit 2004).Entre algunos de los estudios realizados tenemos el fraccionamiento de fucoidanos con etanol a varias concentraciones, dichas fracciones han mostrado actividades anticoagulantes correspondientes a un 60 y 80 % de la actividad de la heparina en la sangre humana (Pelegrn 2001).Las investigaciones ms recientes llevados a cabo en el Instituto Francs de Investigacin y Explotacin del Mar (IFREMER) demostraron que el alga parda Ascophyllum nodosum es una especie de la cual se puede extraer compuestos bioactivos para combatir la trombosis. Existen estudios con otras especies tropicales como Turbinaria ornate y Sargassum mangarevense, las cuales son usadas en la industria alimenticia en el sur de Asia, como fertilizante en Vietnam y colectadas para la produccin de alginatos en Filipinas e India (Pelegrn, 2001).A nivel mundial la FAO ha reportado que la demanda de ficocoloides o gomas marinas aumenta anualmente y se necesita materia prima y extractos que suplan las necesidades de las diferentes industrias a nivel mundial. En los aos 1990-2000 el volumen y el valor de las macroalgas increment de US $ 4 a 5.5 billones- US $ 6 billones por un volumen de 10 millones de toneladas anuales, y se reporta que la produccin de algas pardas tuvo un increment en los aos 1991-1993 de 5-5.5 millones de toneladas con un valor de US $ 1.8 billones y su demanda sigue aumentando a nivel mundial (NDP Marine RTDI Desk Study Series. 2004).Adems de esto, las algas marinas como organismos fotosintticos, estn expuestos a una combinacin de luz y altas concentraciones de oxgeno, lo cual permite la formacin de radicales libres y otros agentes oxidantes. Los elementos del aparato fotosinttico son especialmente vulnerables al dao fotodinmico ya que los cidos grasos poliinsaturados son importantes componentes estructurales de la membrana de los tilacoides. La ausencia de estos daos en las algas nos lleva a pensar que las clulas de estos organismos marinos deben tener mecanismos y compuestos que previenen y protegen de la oxidacin. De esta forma constatamos que las algas marinas constituyen una fuente importante de compuestos antioxidantes y de enzimas protectoras que permiten luchar contra las especies reactivas del oxgeno formadas a partir de nuestro metabolismo. Estas sustancias antioxidantes son de naturaleza variada y pueden estar aisladas (Pelegrn 2001).Los principales compuestos bioactivos producidos por las algas marinas estn formados por muchos metabolitos secundarios, cada uno de estos posee una funcin especfica dentro de su medio, esto hace que cuenten con una gran defensa qumica contra herbvoros marinos. Estos metabolitos tambin estn asociados a la disminucin de epifitos, inhibiendo a los organismos competidores y patgenos microbianos (Magallanes 2003).De acuerdo a Fenical (1982), existen dos tipos de metabolitos, los primarios y los secundarios, al primer grupo pertenecen los carotenoides y los esteroles. Por lo que respecta a los metabolitos secundarios, al igual que sucede en las plantas terrestres, las estructuras son modificadas debido a los elementos presentes en el medio marino, tales como los cloruros, bromuros y yoduros. Dichos elementos son incorporados a los organismos marinos y participan en las sntesis de compuestos halogenados, va comn en el medio marino, mientras que en el terrestre es un proceso complejo.

Los tres principales tipos de metabolitos secundarios de acuerdo a Fenical (1982) son terpenos, acetogeninos y los metabolitos nitrogenados. Los terpenos son los metabolitos secundarios ms importantes en el medio marino, se forman va condensacin de unidades de isopentenil de pirofosfato y son metabolitos de peso molecular alto como los diterpenos. Por el contrario, en las plantas terrestres, es comn la obtencin de terpenos de menor peso molecular como los monoterpenos responsables del aceite aromtico de las plantas. En la biosntesis de terpenos marinos participan los halgenos, especialmente los bromuros, a travs de reacciones cclicas produciendo haloterpenos.

El segundo grupo de metabolitos secundarios es el de los acetogeninos, compuestos lineales producidos a travs del precursor acetil CoA, este patrn es el responsable de la sntesis de lpidos como los cidos grasos. A este grupo pertenecen los halometanos, considerados como potentes biocidas, como ejemplo se tiene al cido actico halogenado. Finalmente, los metabolitos nitrogenados son comunes en el medio terrestre y marino, en ste ltimo, existen las condiciones que propician la sntesis de una gran cantidad de aminocidos como algunos derivados de la tirosina.

Por otro lado, el metabolismo del aminocido triptofano es un proceso que genera residuos indol, como los polihaloindoles de Laurencia brongniartii y Rhodophyllis membranaceae. En general, dichas molculas son las que confieren a las algas su actividad antimicrobiana. El aislamiento de los metabolitos depender en primer lugar del tipo de solvente usado en la obtencin del extracto, es decir, del grado de afinidad polar entre los metabolitos y los solventes utilizados; y en segundo lugar, de la metodologa o tcnica de separacin de los metabolitos del extracto.

Ciertos estudios han demostrado que especies pertenecientes al Orden Fucales poseen excelentes propiedades anticoagulantes, hemaglutinante, antibacterianas, antivirales y anticancergenos, entre las ms importantes (Pelegrn 2001).Especies como Sargassum spp. han sido usada hace muchos aos para la alimentacin, medicina, comida para animales y fertilizantes, especialmente en Asia. En China, Filipinas, India y Vietnam es colectada como materia prima del medio para procesos industriales de extraccin de alginatos, de igual forma muchas especies de algas pardas han sido cultivadas en pases como India, Filipinas y Vietnam, siendo estos los de mayor produccin (Zubia 2003).El gnero Sargassum C. Agard 1820, se caracteriza por ser plantas erectas, fijas por un slido pie basal o por crecimientos externos rizoidales de los ejes principales, o de flotacin libre; ejes principales cilndricos, con ramas determinadas e indeterminadas produciendo lminas con costilla central, anchas a filiformes, simples ocasionalmente bifurcadas, enteras o aserradas; vesculas pediceladas comunes; ramas receptaculares desarrollndose en las axilas de las hojas o paniculadas, generalmente cilndricas, con menos frecuencia prismtica comprimida o aplanadas; monoica o dioica (Martnez 1998).En margarita se encuentran reportadas tres especies de este Gnero, las cuales son: S cymosum, S. vulgare y S. filipendula. (Aponte, 1985, Cappechi, 1989, Pardo y Sol, 2007). De estas las ms regulares durante todo el ao son las dos ltimas estando establecidas durante casi todo el ao. Durante los meses de Enero a Julio se originan en la isla arribazones causado por el embate del oleaje y la excesiva biomasa en los fondos costeros. Los arribazones se consideran como una representacin muestral de los bancos naturales en las costas, por lo que la presencia de estas especies siguiere la existencia de acumulaciones densas que garanticen su presencia en prcticas de extraccin o para siembra en acuacultura.Por su parte, existe en la isla un alga parda de gran tamao y de importante presencia en arribazones durante casi todo el ao (Aponte, 1985 Cappechi, 1989, Pardo y Sol, 2007). Se trata de Spatoglossum schroederi, la cual es perteneciente a la familia Dyctiotaceae y ha demostrado tambin gran rendimiento de los componentes glucoso-sulfatados mostrando inhibicin a la adhesin celular (Rocha et al 2001). Adems de ello, se demostr una particular actividad del compuesto aislado (Xilofucoglucoronano) en la estimulacin del heparan sulfato (Leite et al 1998).Los recursos algales presentes en la Costa margaritea no han sido valorizados ni explotados y cuentan con una gran riqueza y diversidad de especies aun sin explorar. En muchos pases estos estn siendo aprovechados econmicamente, la demanda de estos productos a nivel mundial es grande y actualmente no se suple toda esta demanda. Es por ello que la realizacin de estudios sobre la composicin qumica y el desarrollo de productos y compuestos de inters farmacolgico como los fucoidanos se hacen necesarios. Se espera que el presente trabajo pueda generar, aunque sea de manera preliminar, una valiosa informacin para las industrias farmacuticas permitiendo al mismo tiempo destacar la urgente necesidad de realizar programas y estrategias de aprovechamiento sostenible de este importante grupo de algas marinas. Es por esto, que se hace necesaria la presente investigacin como un primer paso hacia los conocimientos de la composicin qumica de las especies de los gneros Sargassum spp, y Spatoglossum spp en la costa margaritea y su posible utilizacin y aplicacin farmacolgica.

Caracteristica de las especiesSargassum cymosum Ktz. (Fig. 25)Taylor (1960); Daz-Piferrer (1970); Ros (1972); Bertossi (1973); Schnetter (1978); Lemus (1979); Szchy & Cordeiro (1991); Ardito et al. (1995); Camacho (2003).

Alga color marrn oscuro, 13,5 cm de alto; eje y ramas cilndricas con protuberancias; sin espinas. Ramificacin lateral, alterna y abundante. Filoides simples, aplanados, lanceolados a lineales, de (0,2) 0,33 (0,36) (DS = 0,12) cm de ancho, (1,50) 1,71 (2) (DS = 0,33) cm de largo, con base simtrica; filoides en la parte media del talo oblongos lanceolados; criptstomas de (113) 170,12 (208) (DS = 32,1) m de dimetro, ubicados irregularmente, cerca de la vena central; aerocistes ausentes. Margen de los filoides ondulado, entero. Regin interna de los filoides formada por ms de seis capas de clulas ovaladas, circulares, incoloras, de (98,4) 107,38 (131,5) (DS = 19,68) m de ancho y de (24,6) 43,73 (61,5) (DS = 15,04) m de largo; clulas de la corteza, cuadradas, pigmentadas, de (12,3) 13,94 (16,4) (DS = 2,24) m de ancho y de (16,4) 18,04 (20,5) (DS = 2,24) m de largo. Receptculos verrugosos, creciendo en forma de racimos de (3,2) 3,98 (5,12) (DS = 0,87) mm de ancho, con un pedicelo corto que las sostiene. Ramificacin dictoma, presentes en ramitas de primer y segundo orden, disminuyendo el tamao y el nmero de filoides por rama. Creciendo sobre sustrato rocoso, en la zona mesolitoral. Los ejemplares estudiados concuerdan con las caractersticas dadas por Lemus (1979) y Bertossi (1973) en estudios para Venezuela.

Sargassum vulgare C.Agardh nom. illeg. (Fig. 26)Taylor (1960); Ros (1972); Bertossi (1973); Schnetter (1976); Lemus (1979); Aponte (1985); Szchy & Cordeiro (1991); Garca (1999); Littler & Littler (2000); Camacho (2003). Alga de color marrn claro, 33,52 cm de alto; eje y ramas terete con espinas, de (0,05) 1,37 (2,49) (DS = 1,2) mm de largo, adheridas al sustrato por medio de un disco crneo del cual se desprenden varios ejes. Ramificacin alterna y radial. Filoides oblongos, lineales, de (0,41) 0,52 (0,68) (DS = 0,13) cm de ancho y (1,52) 2,42 (3,35) (DS = 0,66) cm de largo. Margen dentado; base asimtrica; criptstomas circulares de (48,6) 75 (103) (DS = 15,21) m de dimetro, esparcidos por ambos lados de la vena; aerocistes esfricos de (2,7) 3,38 (4,16) (DS = 0,57) mm de dimetro, con un pedicelo de 3,34 mm de largo. Regin interna de los filoides formada por dos a cuatro capas de clulas ovaladas, incoloras, de (49,2) 69,7 (82) (DS = 14,2) m de ancho y de (28,7) 36,9 (45,1) (DS = 6,48) m de largo; clulas de la corteza rectangulares, ovaladas, pigmentadas, de (16,4) 18 (20,4) (DS = 2,19) m de ancho y de (12,3) 14,76 (16,4) (DS = 2,24) m de largo. Receptculos verrugosos, pedicelados, dispuestos en grupos, con ramificacin dictoma y trictoma de (4,1) 5,58 (7,45) (DS = 1,14) mm de largo. Creciendo sobre sustrato rocoso, arenoso en las zonas mesolitoral e infralitoral. Sargassum vulgare se diferencia morfolgicamente de S. cymosum por la forma y tamao de sus filoides, los cuales son de cuatro a seis veces ms anchos que largos y presentan margen dentado, caractersticas que coinciden con la descripcin realizada por Szchy & Cordeiro (1991); internamente S. vulgare muestra de dos a cuatro capas, mientras que S. cymosum tiene ms de cuadro capas celulares, adems las clulas de esta especie son ms grandes que las de S. vulgare.

Spatoglossum schroederi (C.Agardh) Ktz. (Fig. 24) Vickers (1908); Taylor (1960); Hammer & Gessner (1967); Joly (1967); Ros (1972); Lemus (1974); Richardson (1975); Schnetter (1976); Lemus (1979); Szchy & Cordeiro (1991); Littler & Littler (2000).

Alga de color marrn oscuro, 17,52 cm de alto. Talos cintiformes, laminares, ondulados, de (0,75) 1,13 (1,09) (DS = 0,32) cm de ancho; proliferaciones en la parte basal. Ramificacin subdictoma, irregular, grupos de pelos largos sobre la superficie, ubicados irregularmente en ambas caras. Margen dentado. pices obtusos y algunas veces agudos, con clulas de crecimiento ordenadas en una fila longitudinal. Regin medular prxima al pice del talo, compuesta por dos hastacuatro capas de clulas, pigmentadas, de (20,5) 37,31 (53,3) (DS = 11) m de ancho y (49,21) 64,82 (86,1) (DS = 11,1) m de largo; porcin basal hasta de siete capas de clulas; corteza formada por una capa de clulas cuadradas, rectangulares, pigmentadas, de (12,3) 22 (69,71) (DS = 19,51) m de ancho y (16,4) 30,8 (53,30) (DS = 12,4) m de largo. Creciendo sobre sustrato rocoso, en la zona mesolitoral.

El nmero de capas celulares reportadas para Spatoglossum schroederi presenta gran variabilidad, puede tener desde cuatro (Ros 1972) hasta 10 capas celulares (Vickers 1908); sin embargo, Szchy & Cordeiro (1991) consideran que este nmero vara de acuerdo al crecimiento de esta especie, ya que el nmero mayor de capas se encuentra en la zona basal (20 capas) dando as mayor rigidez y dureza, mientras que la parte apical posee como mximo dos capas, es ms flexible y se encuentra expuesta al movimiento directo del agua. En los ejemplares estudiados se observaron alturas dentro de los rangos reportados por Lemus (1974), Ros (1972) y Taylor (1960).

OBJETIVOSGeneral

Evaluar el rendimiento de fucoidanos y de de dos especies de algas cultivadas: Sargassum spp y Spatoglossum spp. presentes en el Litoral Oeste margariteo.

Especficos Identificar taxonmicamente las especies de los gneros Sargassum, y Spatoglossum spp recolectadas en las dos zonas de muestreo.

Establecer un modelo de cultivo estndar para las dos algas identificadas.

Determinar el rendimiento de fucoidanos por deteccin qumica de las muestras de macroalgas cosechadas en los sistemas de cultivo implementados, luego de tres meses de cultivo.

Comparar la concentracin de fucoidanos de las diferentes especies cosechadas en los cultivos y entre estas y las presentes en los bancos naturales de donde se las extrajo. Relacionar los parmetros temperatura, salinidad, luminosidad, nutrientes y transparencia, con la concentracin de fucoidanos extrados de las especies estudiadas.

METODOLOGA

ESTUDIO DE CAMPO1. ColectaLas algas sern recolectadas en zonas meso y sublitoral rocosas de diferentes estaciones de la costa oeste de la isla, durante el mes de Septiembre del 2010. Paralelo al muestreo, se medirn ciertos parmetros ambientales como temperatura y transparencia del agua con ayuda de un termmetro de mercurio y un disco Secchi respectivamente, ya que la temperatura y luminosidad en el agua son los parmetros que tienen mayor incidencia en el crecimiento de las algas marinas (Bula, 1990, 2004). Adems de ello, se recogern muestras de agua para determinar los niveles de nutrientes y salinidad presentes en los bancos naturales.Las muestras se lavarn con agua de mar para eliminar los organismos epifitos y los restos de sedimento, arena y organismos adheridos a estas. Luego sern colocadas en bolsas plsticas debidamente identificadas para su traslado en cavas con hielo (Charzeddine & Farias 2001) hasta las instalaciones del laboratorio para su eventual identificacin y preservacin en fro (congelado a -20 C) luego se proceder a iniciar la fase de laboratorio desglosada a continuacin:

2. Fase de laboratorio.

a. Identificacin taxonmicaLas algas recolectadas sern identificadas en lo posible con la ayuda de las claves taxonmicas de Joly (1976), Taylor (1939) y Littler & Littler (1989). b. Extraccin de fucoidanosLas algas se descongelarn a temperatura ambiente en el laboratorio para luego secarlas en estufa a 40 C el tiempo suficiente hasta lograr peso constante. Posteriormente sern triturados unos 100 g de muestra con un molino y sern tratadas con etanol al 90% para remover los compuestos lipoflicos segn la metodologa descrita por Lee (2004). Diez (10) g de alga seca sern tratados con 0.05M de HCl por 3 horas a temperatura ambiente realizando movimientos constantes, luego esta mezcla ser sometida a centrifugado a 23000 g por 20 min. El sobrenadante ser filtrado con una membrana de Celite 545 y neutralizado con una solucin 0.5M de NaOH, posteriormente se precipitar con etanol al 90%. La muestra obtenida ser secada al vaco y se obtendr el fucoidano crudo (Zhu 2003).c. Purificacin del fucoidano crudo.A esta fraccin de fucoidano crudo le ser agregada una solucin de BaCl2 al 1,0%, luego ser filtrado con una membrana de Celite 545, dializado con agua destilada por 24 horas a temperatura ambiente, la muestra obtenida se filtra nuevamente con un filtro Celite 545 y se proceder a desionizar en una columna Amberlite IR-120(H+). Posterior a la desionizacin se neutraliza la muestra con NaOH al 0.05M para finalmente ser liofilizada, el producto ser molido con ayuda de un mortero y se obtendr el fucoidano puro (Zhu 2003).

3. Elaboracion de Sistemas de cultivoUna porcin de las macroalgas colectadas sern utilizadas para el encordado en hebras de polipropileno, que se suspender en el medio a modo de monolneas simples con manojos a 20cm de separacin y profundidad de 0,70cm. Se construirn dos mdulos de cultivo para cada alga cultivada, de manera que se pueda obtener una rplica por sistema empleado. Los sistemas se anclaran mediante muertos de concreto elaborados y la flotacin estar llevada a cabo por envases de polietilentereltalato de 5L. Luego de transcurrido tres meses bajo cultivo para las dos especies algales, se proceder a cosechar todo el contenido, homogeneizar toda la muestra obtenida y utilizar una porcin al azar para la determinacin de Fucoidano crudo llevada a cabo de igual manera para las muestras naturales.

4. Anlisis de los resultadosLos datos de temperatura, transparencia de agua, salinidad y nutrientes, as como tambin los obtenidos en la fase de laboratorio se consignarn en tablas estadsticas con ayuda del programa Excel, estos datos sern procesados con estadstica bsica: Media, Mediana y Anlisis de Varianza.Los datos de los parmetros ambientales medidos sern tratados con Anlisis de componentes principales, para determinar el componente medioambiental que define el comportamiento biolgico de las especies estudiadas con ayuda del programa estadstico Stat Graphic. .PRESUPUESTO

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El desarrollo de una industria de algas marinas en el estado de Tamaulipas. Una propuesta de desarrollo sostenible Raul E. Rincones y Mauricio Ondarza Beneitez UAM Reynosa-Rodhe UAT. Reynosa, Tam

Tiempo de ejecucin del Proyecto20102011

Acciones a realizarJun.Jul.Ago.Sep.Oct.Nov.Dic.Ene.Feb.Mar.Abr.May.

RevisinBibliogrficaXX

Elaboraciny entrega del proyectoX

MuestreoXx

Elaboracin de los bioensayos (sistemas).X

Anlisis de parmetros.XXX

Anlisis de muestras y datosXX

Redaccin del documento.XXX

Defensa de tesis x