análisis microbiológico de un suelo agrícola mediterráneo tras la aplicación de lodos de...

7/22/2019 Anlisis microbiolgico de un suelo agrcola mediterrneo tras la aplicacin de lodos de depuradora urbana

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE FARMACIA

Departamento de Microbiologa II

TESIS DOCTORAL

Anlisis microbiolgico de un suelo agrcola mediterrneo tras la

aplicacin de lodos de depuradora urbana

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Clarissa Gondim Porto

Director

Federico Navarro Garca

Madrid, 2013

Clarissa Gondim Porto, 2012


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Da. CONCHA GIL, CATEDRTICA Y DIRECTORA DELDEPARTAMENTO DEMICROBIOLOGA II DE LA FACULTAD DEFARMACIADELAUNIVERSIDADCOMPLUTENSEDEMADRID,

CERTIFICA:QueDa. ClarissaGondim Portoha realizado en elDepartamentodeMicrobiologa IIde laFacultaddeFarmaciade laUniversidadComplutensedeMadriddentrodelProgramadeDoctoradodeMicrobiologa

yParasitologa

de

la

Facultad

de

Farmacia

bajo

la

direccindelDr.FedericoNavarroGarca,eltrabajoque presenta para optar al grado deDoctor por laUniversidadComplutenseconelttulo:

Anlisis microbiolgico de un suelo agrcolamediterrneo tras la aplicacin de lodos dedepuradoraurbana.

Yparaqueasconste,firmolapresentecertificacinenMadrida26juniode2012.

Fdo.Prof.Dra.Da.ConchaGil


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ESTA TESIS DOCTORAL HA SIDO POSIBLE GRACIAS A LASIGUIENTESAYUDAS: Beca del Ministerio de Asuntos Exteriores yCooperacin Agencia EspaoladeCooperacinInternacional para el Desarrollo (MAECAECID)20082012.

Concesin de la beca del pago dematrcula delcurso 2007 2008 por la UniversidadComplutensedeMadrid.

EL TRABAJO DESCRITO HA SIDO FINANCIADO POR LOSPROYECTOS: CGL200613915/CLI, 20062009, Ministerio deCiencia e Innovacin, Impacto sobre el cambioclimticodelaaplicacindelodosdedepuradoraurbana al suelo. Efectos en el secuestro decarbono.

MMA022/PC08/304.2,20092012,MinisteriodeMedioAmbiente Rural yMarino, Metodologaspara lamonitorizacin de la aplicacin de lodos

dedepuradora.

Bioseguridad

microbiana

ymodelosde flujoy transportede contaminantes

solubles.


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Ami

familia.

AmiesposoCarlos.

AmiinolvidableTioZilyamiprimoAndrLuisquenopudieronverestaTesislista.


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Despusde lograrterminar latesisdoctoral,solopuedoagradeceratodas laspersonasqueduranteestosaosdetrabajohanestadoami ladoyquehanhechopartedesurealizacincontribuyendodeunaformauotraparaqueestafasellegaraasufin.

Primeroantesquenada,doygraciasamiDiosporsaberysentirquelestuvopresenteprincipalmenteen losmomentosmsdifciles,yen losmomentosdealegra.Muchasgraciaspor

fortalecermi

corazn

eiluminar

mi

mente

cada

da

de

mi

vida.

Agradezco inmensamente ami tutor Prof. Dr. Federico NavarroGarca por habermetransmitidotodossusconocimientosconamabilidad,confianzaypaciencia,teadmiromuchoportu gran capacidad intelectual.Muchas gracias por haberme concedido tu tiempo y tu esfuerzosiempredicindomelascosasconsinceridadypornuncadejarmedesistirdemisueo:terminarlaTesis Doctoral. Fede,muchas gracias por la confianza que has depositado enm, por la granoportunidadquemehasproporcionadoypordarmeeseapoyoconstanteenestoscasicincoaosqueestuveenEspaa,al igualquetubellafamilia:Marta, InsyArturoquemeacogitanbien.Siempreosllevarenmicorazn.

QuisieraagradeceralProfesorMiguelngelpor losconocimientostransmitidos,portuestrechacolaboracin,portuinmensaayuda,portutranquilidad,serenidadyalegra,portuapoyo

entoda

mi

estancia

aqu

en

Espaa,

al

igual

agradezco

atu

linda

familia.

Siempre

llegabas

am

con

palabrasdenimodicindomequealfinaltodosaldramuybien.Teadmiromuchoportufuerzayalegrapermanente.

Agradezcoa todos losprofesoresdeldepartamentodeMicrobiologa II,enespecial losprofesores y profesorasConchaGil,MaraMolina,Humberto,Vctor, Jess, JosManuel, Luca,Gloria,Angelines,Conchita,Carmina,RebecaquemeacogierontanbiendesdemillegadaaEspaa.AgradezcoenespecialalProfesorRafaelRotgerqueconmuchaamabilidadcontestabamiscorreosdesdeBrasilyquemeencaminallaboratoriodemitutorFedericoNavarroGarca,siempreestaragradecidaporloquehashechoporm.MuchasgraciasespecialmentealaProfesoraCarmendelaRosa por el cario, por la ayuda y por haberme permitido compartir contigo las prcticas deMicrobiologaAmbiental.MuchasgraciasalProfesorJosAntonioporlaayudaconlosRDAsypor

lasdivertidas

salidas

al

campo.

Muchas

gracias

tambin

atodos

los

profesores

del

Departamento

deEdafologa,especialmenteaMaitequesiempremehatratadocontantocario.

Muitoobrigadaa todosmeusqueridose inesquecveisProfessoresdomeupasBrasil,

tantodaUniversidadedeFortalezacomodaUniversidadeFederaldoCear,emespecialaVnia,

Cristina,Romlia,Renato,PauloGermano,Arlndiaporhaver transmitido vossos conhecimentos

comtodapacincia!Muitoobrigadapelaconfianadepositadaemmimdurantetodosessesanos

docursodeFarmciaedaespecializaoemHematologiaClnicaepelascartasderecomendaes

que me enviaram para que pudesse conseguir a bolsa de estudos! Em especial, agradeo

enormemente ao meu querido Professor Everardo que me encaminhou a Madri para fazer o

doutorado me ajudando com os contatos, a quem deveria escrever e dando excelentes

recomendaes minhas aos outrosprofessores. Nunca me esquecerei dessa grande ajuda! No

possoesquecer

me

de

agradecer

atodas

as

pessoas

que

me

ajudaram

no

estgio

realizado

no

Laboratrio Central do Cear (Lacen), em especial a minha me Maria Lcia Gondim Porto

(obrigadamamepormemostrarcomo lindaanossaprofisso.Vocaminha inspirao,te

amo muito!), a Creuza e Iracema pelos conhecimentos transmitidos, pelo carinho e pacincia

sempre!

MuchasgraciasamisqueridosamigosycompaerosdetrabajoLetiyNachoquesiempreme apoyaron, ayudndome en diversos experimentos (nunca olvidar las siembras, al finalterminbamos rindonosde todo),porcompartir conocimientos y tambinmomentosalegres ytristes.Muchasgraciasporlasrisas(Leti,nuncaolvidartussonrisasquealegrabaneldaatodoelmundo), las bromas, los cafezinhos de todas lasmaanas (elmejormomento) y por hacermiestanciaenEspaaagradabley feliz.Nuncaolvidaredenuestrosmomentosen laU7.Losquiero

mucho,les

deseo

todo

de

lo

mejor

en

la

vida,

siempre

os

llevar

en

mi

corazn!

No

podra

dejar

de

agradeceramiqueridocompaerolvaroBarnuevo(Menino)decuandotodoempez,muchas


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Resumen

Loslodos

de

depuradora

son

los

residuos

slidos

obtenidos

del

tratamiento

de

las

aguasresiduales.Paraelreciclajedeestosproductos,elIIPlanNacionalIntegradodeResiduos(PNIR 20072015) exige que se lleve a cabo un tratamiento previo para concentrar la faseslidayeliminarposibles agentespatgenos.EnEspaa,el65%del totaldeestos lodosesutilizadocomoenmiendaagrcola,aunquesuusopuedeentraarposiblesriesgosparaelserhumano y elmedio ambiente que no han sido suficientemente evaluados. Por esa razn,hemosanalizado suefectoen lamicrobiologadeun sueloagrcolamediterrneoutilizandodistintas dosis (40, 80 y 160 tha1) y tipos (anaerobio y aerobio) mediante tcnicasdependientesdecultivoymoleculares.Desdeelpuntodevistasanitario,nuestrosresultadosmuestranquelasdosisbajaseintermediasproducenunincrementotransitoriodelnmerodebacteriaspatgenasyderesistentesaampicilinaquedisminuyehastanivelessimilaresa los

delsuelo

control

odesaparecen

al

cabo

de

dos

aos.

Por

el

contrario,

las

dosis

altas

provocan

quelosvaloresdeesosmicroorganismosseansuperioresalosdelsuelocontrolhastaelfinaldelexperimento.Desdeelpuntodevistaambiental,seproduceun fenmenopeculiarenelqueapesardequeelnmerodemicroorganismoscopiotrficosyheterotrficosaumentaenlossuelosenmendadoscon lasdosismsaltasde lodos,surespiracinybiomasadisminuye.Encambio,lossuelosenmendadoscondosisbajaseintermediaspresentanmayorestasasderespiracinconelconsiguiente incrementoen laemisindeCO2,gasqueproduceelefectoinvernadero e influye en el llamado cambio climtico. Por otro lado, se produce una granmodificacindelaspoblacionesbacterianasquecomponenelsueloagrcolatraslaadicindelodosquehapodidosermedidamediantetcnicasmoleculares.As,losfilosbacterianosmsafectadoscorrespondenaAcidobacteriayProteobacteria,quejuntoaActinobacteriason los

msabundantes

en

el

suelo

control.

El

incremento

de

bacterias

de

la

clase

GammaproteobacteriajuntoconladisminucindelaproporcindelasdelaclaseGp6delfiloAcidobacteria,constituyenlosprincipalesmarcadoresdelaalteracindelsueloporlaadicinde lodosdedepuradoraa largoplazo.A cortoplazo sehaencontradoun incrementode lapresencia de diversas bacterias del filo Firmicutes (Bacilli) que puede ser utilizado comoindicador de una contaminacin reciente. En las muestras tratadas con dosis bajas eintermedias las principales modificaciones se detectan en los primeros muestreos y vandesapareciendogradualmentehastaasemejarsealadelsuelocontroldosaosdespusdelaaplicacin,fenmenoquenosucedeenlasparcelasconmayoresdosis(sobretodoANAE160).Podemos concluir,por tanto,que la aplicacinde lodosdedepuradora en suelos agrcolasprecisa todava de ser evaluada en profundidad puesto que se producen importantes

alteracionessanitarias

yambientales

que

pueden

influir

negativamente

en

la

salud

del

ser

humanoeinfluirenelcambioclimtico.


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NDICE

1. EL SUELO Y LOS LODOS DE DEPURADORA. ..................................................................................... 7

1.1 ESTRUCTURAYCOMPOSICINQUMICADELSUELO. .............................................................. 9

1.2 LADIVERSIDADMICROBIANADELSUELO. .............................................................................. 101.2.1 BACTERIAS. .................................................................................................................. 111.2.2 HONGOS. ..................................................................................................................... 141.2.3 OTROS MICROORGANISMOS PRESENTES EN EL SUELO. .............................................. 15

1.3 VARIACIONESENLACOMPOSICINDELAMICROBIOTA DELSUELO. ..................................... 161.4 LOSLODOSDEDEPURADORACOMOENMIENDASENSUELOSAGRCOLAS. ........................... 18

1.4.1 LOS LODOS DE DEPURADORA PUEDEN INTRODUCIR MICROORGANISMOSPATGENOS Y RESISTENTES A ANTIBITICOS EN LOS SUELOS AGRCOLAS? .............. 21

2. EFECTOS A LARGO PLAZO EN LAS PROPIEDADES MICROBIANAS DE UN SUELO AGRCOLAMEDITERRNEO TRAS LA APLICACIN DE LODOS DE DEPURADORA URBANA. .............................. 25

2.1 RESUMEN ................................................................................................................................ 272.2 INTRODUCCIN ...................................................................................................................... 292.3 OBJETIVOS .............................................................................................................................. 312.4 MATERIALESYMTODOS ....................................................................................................... 32

2.4.1 LOCALIZACIN DE LAS PARCELAS. ............................................................................... 322.4.2 PREPARACIN DE PARCELAS DE ENSAYO. ................................................................... 332.4.3 RECOGIDA DE MUESTRAS. ........................................................................................... 342.4.4 ANLISIS DE LAS MUESTRAS DE SUELO MEDIANTE SIEMBRAS. .................................. 362.4.5 IDENTIFICACIN DE BACTERIAS PATGENAS. ............................................................. 392.4.6 MICROORGANISMOS TOTALES (OLIGOTRFICOS Y COPIOTRFICOS), HONGOS Y

BACTERIAS RESISTENTES A AMPICILINA. ..................................................................... 402.4.7 PREPARACIN Y MEDICIN DE LA BIOMASA Y RESPIRACIN MICROBIANA. .............. 402.4.8 ANLISIS DE LOS DATOS. ............................................................................................. 43

2.5 RESULTADOS ........................................................................................................................... 442.5.1 ANLISIS DE LA POBLACIN MICROBIANA DE LAS PARCELAS DEL ESTUDIO. .............. 442.5.2 EVOLUCIN DE LOS MICROORGANISMOS PATGENOS ANALIZADOS. ....................... 562.5.3 INFLUENCIA DE LOS LODOS DE DEPURADORA EN LA MICROBIOTA DE BACTERIAS

RESISTENTES A AMPICILINA DE LOS SUELOS. .............................................................. 632.5.4 CORRELACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS, ACTIVIDADES

MICROBIANAS Y PARMETROS AMBIENTALES. .......................................................... 702.5.5 INFLUENCIA DE LOS PARMETROS AMBIENTALES EN LAS PROPIEDADES

MICROBIANAS ANALIZADAS. ....................................................................................... 732.6 DISCUSIN .............................................................................................................................. 86

2.6.1 ALTERACIONES GENERALES DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS DEL SUELO TRAS LAAPLICACIN DE LODOS DE DEPURADORA. .................................................................. 86

2.6.2 SE TRANSMITEN Y MANTIENEN DETERMINADOS PATGENOS ENTRICOS EN LOS

SUELOS TRAS LA ADICIN DE LODOS? ......................................................................... 922.6.3 LA APLICACIN DE LODOS DE DEPURADORA INCREMENTA EL NMERO Y LA

PROPORCIN DE BACTERIAS RESISTENTES A AMPICILINA EN EL SUELO AGRCOLA. .. 952.6.4 ES AMBIENTAL Y SANITARIAMENTE SEGURO UTILIZAR LODOS DE DEPURADORA

URBANA COMO ENMIENDA AGRCOLA? ..................................................................... 982.7 CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 100

3. LA ADICIN DE LODOS DE DEPURADORA MODIFICA LA ESTRUCTURA DE LAS POBLACIONESMICROBIANAS DURANTE UN LARGO PERIODO DE TIEMPO. ........................................................ 101

3.1 RESUMEN .............................................................................................................................. 1033.2 INTRODUCCIN .................................................................................................................... 1053.3 OBJETIVOS ............................................................................................................................ 107

3.4 MATERIALESYMTODOS ..................................................................................................... 1083.4.1 ANLISIS MOLECULAR DE LAS MUESTRAS DE SUELO ................................................ 108


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NDICEDETABLAS

TABLA 1.TEXTURA DEL SUELO AGRCOLA MEDITERRNEO ANALIZADO. ..................................................................... 33TABLA 2.CARACTERSTICAS FISICOQUMICAS DE LOS LODOS DE LAS DEPURADORAS. ................................................... 33TABLA 3.PARCELAS QUE FUERON ANALIZADAS EN ESTE TRABAJO. ........................................................................... 34

TABLA 4.FECHAS Y ESTACIONES DEL AO DE LOS MUESTREOS. ................................................................................ 35TABLA 5.MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO. ................................................................................. 38TABLA 6.MICROORGANISMOS OLIGOTRFICOS (R2A). ........................................................................................ 47TABLA 7.MICROORGANISMOS OLIGOTRFICOS (ETD). ......................................................................................... 48TABLA 8.MICROORGANISMOS COPIOTRFICOS (AGAR ACTINOMICETOS). ............................................................... 49TABLA 9.BACTERIAS OLIGOTRFICAS (R2AC). .................................................................................................... 49TABLA 10.HONGOS (SABOURAUD CLORANFENICOL). ........................................................................................... 50TABLA 11.COLIFORMES FECALES (TTC). ............................................................................................................. 57TABLA 12.ENTEROCOCOS (BILIS ESCULINA). ....................................................................................................... 58TABLA 13.CLOSTRIDIOS SULFITOREDUCTORES (HIERRO SULFITO). .......................................................................... 58TABLA 14.BACTERIAS RESISTENTES A 32 GML-1 DE AMPICILINA. .......................................................................... 63TABLA 15.BACTERIAS RESISTENTES A 64 GML-1 DE AMPICILINA. .......................................................................... 64

TABLA 16.BACTERIAS RESISTENTES A 1 G L-1 DE AMPICILINA. ................................................................................. 64TABLA 17.CORRELACIONES ENTRE LOS TIPOS DE MICROORGANISMOS Y LA BIOMASA, RESPIRACIN Y HUMEDAD EN TODOS

LOS MUESTREOS DEL ESTUDIO. .......................................................................................................... 71TABLA 18.CORRELACIONES ENTRE LOS TIPOS DE MICROORGANISMOS Y LA BIOMASA, RESPIRACIN Y HUMEDAD EN TODOS

LOS MUESTREOS DEL ESTUDIO, SIN LOS DATOS DE AE160 Y ANAE160. .................................................. 72TABLA 19.ANLISIS DE LA INFLUENCIA DE LAS CARACTERSTICAS DEL SUELO Y DEL TRATAMIENTO APLICADO EN LAS

POBLACIONES Y ACTIVIDADES MICROBIANAS DE LOS SUELOS ANALIZADOS. ................................................ 84TABLA 20.NDICES DE BIODIVERSIDAD Y SUS RESPECTIVAS FRMULAS. .................................................................. 113TABLA 21.DIRECCIONES DE LAS PGINAS EN INTERNET DE LOS PROGRAMAS UTILIZADOS PARA EL ANLISIS DE SECUENCIAS.

................................................................................................................................................. 114TABLA 22.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DEL SUELO CONTROL EN JUNIO DE

2007(T0) Y EL RESTO DE LOS MUESTREOS. ...................................................................................... 119

TABLA 23.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DEL SUELO CONTROL EN OCTUBREDE 2007(T1) Y EL RESTO DE LOS MUESTREOS. .................................................................................. 121

TABLA 24.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DEL SUELO CONTROL EN FEBRERODE 2008(T2) Y EL RESTO DE LOS MUESTREOS.. ................................................................................. 122

TABLA 25.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DEL SUELO CONTROL EN JUNIO DE2008(T3) Y EL RESTO DE LOS MUESTREOS. ...................................................................................... 124

TABLA 26.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DEL SUELO CONTROL EN OCTUBREDE 2008(T4) Y EL RESTO DE LOS MUESTREOS. .................................................................................. 124

TABLA 27.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DEL SUELO CONTROL EN FEBRERODE 2009(T5) Y JUNIO DE 2009(T6). ............................................................................................. 124

TABLA 28.DIFERENCIAS ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS CARACTERSTICAS EN EL SUELO CONTROL EN T5COMPARADA CON EL RESTO DE LOS MUESTREOS. ............................................................................... 125

TABLA 29.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DE SOIL Y LAS MUESTRASTRATADAS CON LODO AEROBIO Y ANAEROBIO. .................................................................................. 168TABLA 30.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DE AE40 Y EL RESTO DE LAS

MUESTRAS TRATADAS CON LODO AEROBIO Y ANAEROBIO. ................................................................... 170TABLA 31.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DE AE80 Y EL RESTO DE LAS

MUESTRAS TRATADAS CON LODO AEROBIO Y ANAEROBIO. ................................................................... 171TABLA 32.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DE AE160 Y EL RESTO DE LAS

MUESTRAS TRATADAS CON LODO ANAEROBIO. .................................................................................. 172TABLA 33.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DE ANAE40 Y EL RESTO DE LAS

MUESTRAS TRATADAS CON LODO ANAEROBIO. .................................................................................. 173TABLA 34.COMPARACIONES ENTRE LAS POBLACIONES MICROBIANAS MS ABUNDANTES DE ANAE80 Y EL RESTO DE LAS

MUESTRAS TRATADAS CON LODO ANAEROBIO. .................................................................................. 174TABLA 35.COMPARACIONES ENTRE LOS FILOS BACTERIANOS MENOS ABUNDANTES Y RAROS DE SOIL Y EL RESTO DE LAS

MUESTRAS TRATADAS CON LODO AEROBIO Y ANAEROBIO. ................................................................... 176


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CAPTULO I

1.El suelo y los lodos de depuradora.


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textura del suelo. Las bacterias y los hongos son los dos grupos ms numerosos en elsuelo. Estos microorganismos son esenciales para los procesos de los ciclosbiogeoqumicos, tienen la capacidad de degradar compuestos contaminantes(principalmente los actinomicetos) y son responsables de la degradacin de la materiaorgnica presente en el suelo (Atlas y Bartha, 2002; Six et al., 2006; Lal, 2007; Maier et

al., 2009; Prosser, 2010). Debido a la enorme diversidad de la microbiota del suelo,hasta la fecha, ha sido imposible identificar todos los microorganismos presentes, perose ha podido estimar mediante diversas tcnicas. As, se ha estimado que en un sueloorgnico puede haber un total de 2,6 x 1029 clulas microbianas y entre ellas, 1012bacterias, 104 protozoos y 25 km de hifas de hongos (Young y Crawford, 2004;Voroney, 2007). Esta gran diversidad de microorganismos es utilizada como unindicador de la calidad del suelo, ya que los microorganismos responden rpidamentea los cambios de las condiciones ambientales en el suelo (Rees et al., 2001).

Lgicamente, al tener una gran diversidad, el suelo tiene que ser por fuerza unnicho complejo y competitivo. Hay una serie de factores que influyen en la actividad dela gran cantidad de microorganismos presentes en el suelo que como consecuencia,tienen que adaptarse al estrs del ambiente. Por ello, las poblaciones microbianas delsuelo son dinmicas y sufren un cambio continuo (Lavelle y Spain, 2003). Estos factorespueden ser biticos (p.ej. la competicin con otros microorganismos) o abiticos (lascaractersticas fsicas y qumicas del suelo, temperatura, humedad, pH, potencialredox) (Maier et al., 2009). Otros factores como las fuentes de energa y carbono, lapresin, la composicin inica y la interaccin gentica entre microorganismostambin son capaces de afectar a la ecologa, actividad y la dinmica de laspoblaciones de microorganismos en el suelo (Nannipieri et al., 2003).

Los microorganismos presentes en el suelo son factores clave en los ciclos dela mayora de los nutrientes presentes en la Tierra, especialmente en el ciclo delcarbono, nitrgeno, azufre y fsforo. En el caso del ciclo del carbono, son responsablesde la descomposicin de residuos orgnicos y de la degradacin de compuestosorgnicos contaminantes presentes en el suelo, siendo muy frecuente la utilizacin decosustratos como las enmiendas orgnicas para su activacin (Atlas y Bartha, 2002;Ros et al., 2010). La energa presente en el ecosistema del suelo deriva, entre otroscompuestos, de esa descomposicin de la materia orgnica por estos microorganismos(Nielsen y Winding, 2002; Pepper y Gerba, 2005). Otra de las funciones importantes delas bacterias es la secrecin de sustancias adherentes en forma de polisacridos queayudan en la formacin de micro y macroagregados que proporcionan estabilidad a laestructura del suelo (Voroney, 2007).

1.2.1 BACTERIAS.Las bacterias son los microorganismos ms numerosos en la superficie del

suelo y su cantidad y tipo vara dependiendo de las condiciones ambientales en l,principalmente la temperatura y la humedad (Paul, 2007; Voroney, 2007; Maier et al.,2009). Se estima que la poblacin bacteriana del suelo puede llegar a exceder de las1010 clulas por gramo de suelo. Estos microorganismos pueden ser cultivables (de


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Existen otros aspectos, generalmente fisiolgicos o metablicos, que permitenclasificar y distinguir las poblaciones de microorganismos presentes en el suelo. Uno deestos aspectos es la utilizacin del oxgeno, las bacterias del suelo pueden ser aerobias,anaerobias y anaerobias facultativas (Pepper y Gerba, 2005). En la superficie del suelo,las bacterias aerobias estn en mayor cantidad que las anaerobias, estimndose que el

nmero de stas se incrementa con la profundidad del suelo, pero raramentepredominan a menos que el suelo est saturado (Maier et al., 2009).

En cuanto a la utilizacin de los nutrientes, las bacterias del suelo pueden serclasificadas en oligotrficas y copiotrficas. Las primeras necesitan de una pequeaconcentracin de nutrientes y utilizan lentamente la materia orgnica. Las bacteriascopiotrficas, por el contrario, son aquellas que necesitan una gran concentracin denutrientes y se adaptan a intervalos de latencia y rpido crecimiento dependiendo dela disponibilidad de estos sustratos (Atlas y Bartha, 2002; Maier et al., 2009). Lapresencia de esas bacterias en el suelo va a depender de la disponibilidad denutrientes en ese ecosistema, aunque la mayora de los suelos representan unambiente oligotrfico (Whalen y Sampedro, 2010).

Respecto a la descomposicin de sustancias presentes en el suelo, losactinomicetos son muy efectivos en esa actividad. Esas bacterias pertenecientes al filo

Actinobacteria son capaces de descomponer compuestos presentes en el estircol,herbicidas o pesticidas que son utilizados en el suelo y de degradar muchas sustanciasresistentes como lignina, pectina, queratina, celulosa, hemicelulosa y cidos hmicosmediante la produccin de enzimas hidrolticas y oxidativas (Prosser et al., 2007; Maieret al., 2009; Whalen y Sampedro, 2010). Son bacterias Gram-positivas filamentosasmuy abundantes en el suelo (el 10-33 % del total) que se caracterizan por poseer un

micelio parecido al de los hongos pero de menor tamao, y cuya clasificacin estbasada en la estructura del aparato vegetativo (micelio) y el patrn de reproduccin(por fragmentacin, formacin de conidios vegetativos o esporangios sexuales)(Lavelle y Spain, 2003; Maier et al., 2009). Los actinomicetos son generalmenteresistentes a la desecacin y son termotolerantes, pudiendo sobrevivir en suelosdesrticos. El pH neutro o alcalino favorece su crecimiento (Atlas y Bartha, 2002;Pepper y Gerba, 2005). De todos los actinomicetos aislados del suelo, el 90 %pertenece al grupo de los estreptomicetos, siendo el ms diverso (Killham y Prosser,2007). En el caso del nitrgeno, nutriente que usualmente es limitante en el medioambiente, las cianobacterias tienen la capacidad de fijarlo y sus caractersticas son muysimilares a las de las algas (Maier et al., 2009).

Adems de la actividad de las bacterias en procesos generales descritospreviamente, estos microorganismos presentan otras caractersticas importantes. Unade ellas, relevante para nuestro estudio, es la capacidad de producir antibiticos. Lafinalidad de la produccin de antibiticos presumiblemente es la de competir ysealizar su presencia a otros microorganismos del suelo siendo un tipo de estrsbitico (Davies, 2006). Por ejemplo, los actinomicetos pueden producir antibiticoscomo eritromicina, neomicina, tetraciclina, anfotericina y estreptomicina. Las bacteriasdel gnero Bacillus presentes en el suelo tambin son capaces de producir antibiticoscomo la polimixina o bacitracina (Killham y Prosser, 2007). Adems, algunos patgenos

de plantas y rizobacterias como Erwinia, Serratia, Flavobacterium, Pseudomonas,


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Tobamovirus, que causa graves enfermedades en plantas llegando a provocar necrosisgeneralizada, es capaz de persistir en el suelo y de sobrevivir a esterilizacin del suelopor autoclave (Bloem et al., 2006; Whalen y Sampedro, 2010). La utilizacin deestircoles o lodos de depuradora como fertilizantes orgnicos en suelos agrcolas esuna forma de introducir virus que producen enfermedades en mamferos y humanos

en ese ecosistema, aunque los enterovirus por ejemplo, se inactivan tras periodos dedas o semanas en el suelo. Los hongos presentes en el suelo tambin pueden verseafectados por los virus (como por ejemplo, los micovirus) (Whalen y Sampedro, 2010).

Y por ltimo, el grupo de las arqueas es similar a las bacterias solamente en sutamao y forma, siendo muy diferentes gentica y bioqumicamente (Maier et al.,2009). Los gneros ms representativos son: Halobacterium, Natronobacterium,Methanobacterium, Methanospirillum y Methanococccus (metangenos);

Archeoglobus, Thermococcus y Thermoplasma (termfilos extremos); Sulfolobus yAcidothermus (termoacidfilos); y Pyrodictium (anaerobios estrictos) (Paul, 2007).Estos microorganismos predominan en ecosistemas con altas temperaturas ohipersalinos (Sylvia, 2005), pero tambin han sido detectados en ambientes noextremos en suelos prstinos de China y Amrica (Fan et al., 2006).

1.3 VARIACIONES EN LA COMPOSICIN DE LA MICROBIOTADEL SUELO.

La composicin del suelo puede ser alterada tanto por diversas actividadesantropognicas como por aspectos naturales (condiciones abiticas y biticas) en la

forma y la biodisponibilidad de los nutrientes del suelo y, como consecuencia, en laspoblaciones microbianas presentes en l (Blanco y Lal, 2010).

Las condiciones ambientales caractersticas de cada clima parecen producircambios temporales en la comunidad microbiana del suelo (Feng et al., 2003). Estosfactores ambientales pueden ser divididos en dos grupos respecto a sus efectos: losque afectan directamente a la estructura de la comunidad microbiana del suelo y susactividades (humedad, temperatura, pH, contenido de materia orgnica) y otrosfactores que producen efectos indirectos (latitud, elevacin, clima, textura,profundidad y minerales del suelo, posicin topogrfica y naturaleza de la vegetacinpresente) (Brockett et al., 2011). Entre esas variables ambientales, el pH del suelo hasido frecuentemente correlacionado con la estructura de la comunidad microbiana delsuelo, particularmente las bacterias (Lauber et al., 2009; Rousk et al., 2009b; Brockettet al., 2011).

En lneas generales, los cambios de las condiciones ambientales del suelopueden ser perjudiciales para la comunidad microbiana presente en ese ecosistema.Un ejemplo de cambio ambiental importante es la sequa. Ese tipo de estrs es quiz elms comn para los organismos que pertenecen al suelo. La regin mediterrnea es unejemplo de clima semirido donde los periodos de sequa son muy frecuentes (Schimelet al., 2007). El aumento de la erosin del suelo y las altas temperaturas que se

produce en esta regin conlleva la prdida del carbono de los suelos. En climas ridos ysemiridos la prdida de carbono del suelo es an mayor, comparada con la que se


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incremento temporal en el contenido en materia orgnica y nutrientes que favorecenla recolonizacin vegetal y la recuperacin de las propiedades fsicas, qumicas ymicrobiolgicas (Guerrero et al., 2001; Villar et al., 2004; Bastida et al., 2007b).

1.4 LOS LODOS DE DEPURADORA COMO ENMIENDAS ENSUELOS AGRCOLAS.

El trmino original usado para describir todos los residuos de una planta detratamiento de aguas residuales fue lodos. De hecho, lodo es el componente slido osemilquido de algunos tipos de efluentes residuales. El trmino residualse usa ahorapara describir todos los residuos del proceso de una planta de tratamiento, bien seanlquidos, slidos o gaseosos. La cantidad de los residuos slidos o lquidos generadosen el tratamiento de plantas de aguas residuales depende de diversos aspectos como

la cantidad del agua bruta, la dosis de productos qumicos, el rendimiento del procesode tratamiento, los mtodos de remocin de lodos, la eficiencia de la sedimentacin yla frecuencia del limpieza del filtro (retrolavados) (Cornwell, 2002). Actualmente, eltratamiento y vertido de residuos de una planta de tratamiento de agua es parteintegral de las operaciones de estas plantas debido a que las reglamentaciones localesy estatales tienen normas ms restrictivas para los programas de gestin de residuostradicionalmente practicados. En Estados Unidos de Amrica, el vertido de residuos notratados a la mayora de aguas superficiales est severamente restringido por elSistema Nacional de Eliminacin de Vertidos Contaminantes (NPDES) del Acta del AguaLimpia (Cornwell, 2002).

Los lodos de depuradora de aguas residuales (LDAR) estn generalmentecompuestos por slidos generados durante el tratamiento de aguas residuales queson, bsicamente, biomasa microbiana. A pesar de tener una composicin qumicavariable, los LDAR son ricos en materia orgnica y nutrientes esenciales para lasplantas y microorganismos. Dependiendo del origen de las aguas residuales, estosresiduos pueden contener altos niveles de metales como Zn, Cu y Cd y xenobiticos,adems de microorganismos patgenos para animales y humanos y por eso, esnecesario que estos residuos sean tratados adecuadamente (Bitton, 2005b; Lambais ydo Carmo, 2008).

Los lodos suelen ser eliminados de tres maneras: utilizacin como enmiendasen suelos agrcolas (como fertilizante orgnico), eliminacin en vertederos eincineracin (Grn et al., 2007; Wolna-Maruwka et al., 2007). Estos dos ltimosmtodos son tcnicas que acarrean efectos negativos para el clima, porque laacumulacin en vertederos genera gas metano y la incineracin, CO2 y, adems, lamateria orgnica y los nutrientes presentes en estos residuos son eliminados en lugarde ser reciclados (Grn et al., 2007). Actualmente en Espaa el 65 % de los LDAR sonutilizados como enmiendas en los suelos y el 60 % en los Estados Unidos de Amrica.Segn la clasificacin realizada por la Agencia de Proteccin del Medio Ambiente deEstados Unidos (US EPA, United States Environmental Protection Agency), los lodos dedepuradora tratados se les denominan bioslidos y se clasifican en dos tipos:

bioslidos de clase A y de clase B. Los bioslidos de clase A son tratados hasta el puntoen que la concentracin de patgenos se reduce a niveles tan bajos que no se


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patgenos en el producto final. El paso siguiente es el acondicionamiento de los LDARque puede hacerse por tratamientos qumicos (se aaden acondicionantes) o por calor(tratados a una temperatura de 175-230oC). Este paso facilita la separacin de losslidos de la fase lquida y reduce la afinidad del lodo con el agua. Posteriormente, sedeshidrata el lodo por filtracin o mediante lechos de secado. Tras este proceso los

LDAR ya estarn listos para ser utilizados como enmiendas en suelos agrcolasposteriormente a su extraccin manual o mecnica despus del secado. El tratamientode los LDAR y su eliminacin son operaciones costosas en el tratamiento de aguasresiduales de plantas (Bitton, 2005b).

Figura 2. Esquema del tratamiento de lodos de depuradora de aguas residuales.Modificado de (Bitton, 2005b).

La aplicacin de estos desechos tratados en los suelos agrcolas es la formams utilizada y ms econmica, y constituye una oportunidad de reciclar estosresiduos e incrementar la materia orgnica del suelo, mejorando as la produccin de

los cultivos (Catricala et al., 1996; Grn et al., 2007). Adems, podra facilitar larecuperacin de los suelos mediterrneos que tienden a una prdida de nutrientes porerosin y, por tanto, evitar la prdida de carbono y mejorar su calidad. Los suelosmediterrneos son muy pobres en materia orgnica (contienen menos de 1% decarbono orgnico total) y su contenido en metales pesados es relativamente bajo, loque abre amplias posibilidades de reciclaje de una parte importante de los lodos dedepuradora (PNIR 2008-2015) (Grn et al., 2007; Secretara de Estado de CambioClimtico, 2009). Por lo tanto, la utilizacin de enmiendas de lodos de depuradora ensuelos puede ser tambin una manera de recuperar suelos degradados de todo tipo(Ros et al., 2003; Larchevque et al., 2005).

Sin embargo, de esta aplicacin tambin pueden surgir problemasmedioambientales porque no se conoce completamente hasta qu punto la utilizacinde los LDAR puede ocasionar consecuencias perjudiciales para los suelos o laatmsfera: la mineralizacin del carbono aadido, la adicin de patgenos y/omicroorganismos resistentes a antibiticos que son capaces de contaminar acuferos ocultivos y la modificacin de la comunidad microbiana del suelo. Son problemasimportantes, puesto que se podra incrementar la emisin de CO2 a la atmsferaaumentando as, el cambio climtico, y a la vez podra producir modificaciones en laspoblaciones microbianas naturales de los suelos.

Por tanto, su utilizacin debe hacerse con las mximas garantas de seguridad

para la salud pblica y los lodos deben ser evaluados tal y como recomienda lalegislacin vigente y la Organizacin Mundial de la Salud (RD 13/10/1990) (BOE 1990)

Espesamiento

Estabilizacin

(Digestin aerbica

o anaerbica)

Acondicionamiento Deshidratacin LDAR

Aplicacin a

suelos


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Efectos a largo plazo en las propiedades microbianas deun suelo agrcola mediterrneo tras la aplicacin de

lodos de depuradora urbana.

2.1 RESUMENINTRODUCCIN: Los suelos que se encuentran en la regin mediterrnea se caracterizan porser ms propensos a la degradacin por erosin debido a las condiciones climticascaractersticas como, por ejemplo, altas temperaturas, perodos de sequa y precipitacionesirregulares. La utilizacin de lodos de depuradora de aguas residuales (LDAR) es una buenaopcin para mejorar las caractersticas del suelo. Sin embargo, no se conocen completamentelos efectos nocivos en la microbiota indgena del suelo, ya que en la composicin de estosresiduos pueden existir metales pesados, xenobiticos, bacterias patgenas y resistentes adiversos antibiticos.

MATERIALES Y MTODOS: Hemos estudiado la influencia de la aplicacin de lodos dedepuradora aerobio y anaerobio (40, 80 y 160 t ha-1) en diversas propiedades del suelo y de lamicrobiota presente en la superficie del suelo (0-20 cm) en parcelas de suelo agrcola.Mediante siembra en medios generales y especficos hemos determinado la presencia demicroorganismos oligotrficos y copiotrficos, bacterias indicadoras de contaminacin fecal ybacterias resistentes a distintas concentraciones de ampicilina. Adems, comprobamos elefecto de los lodos sobre la biomasa microbiana y sus niveles de respiracin. Estos anlisisfueron llevados a cabo durante 2 aos tras la aplicacin de los lodos, coincidiendo con lasestaciones de verano, otoo e invierno (cada 4 meses).

RESULTADOS: Hemos observado un incremento de la biomasa y la respiracin basal en lasparcelas tratadas con menores dosis de lodos, en concreto el aerobio, y una disminucin en lastratadas con mayores dosis. Por el contrario, tanto los microorganismos oligotrficos ycopiotrficos totales como los patgenos tuvieron recuentos superiores en los suelos tratadoscon mayores dosis de LDAR, incluso dos aos despus de la aplicacin de los lodos a los suelos.El nmero y el porcentaje de bacterias resistentes a ampicilina fueron superiores en lasmuestras tratadas con lodo aerobio hasta el ltimo anlisis del estudio, principalmente en lasparcelas tratadas con mayores dosis.

CONCLUSIONES: La aplicacin de los lodos, sobre todo los aerobios, influy notablemente enla microbiota del suelo incluso dos aos despus de su aplicacin, principalmente a dosiselevadas (160 t ha-1) llevando a una diseminacin de bacterias patgenas y su mantenimientoen el suelo incluso 2 aos despus. El incremento de la microbiota resistente a antibiticos con

la mayor dosis de lodo aerobio debe hacer reflexionar sobre la utilizacin de dosis elevadas enla fertilizacin de los suelos agrcolas. Sin embargo, las dosis bajas tampoco estn exentas deproblemas puesto que se incrementa la emisin de CO2 en las parcelas as tratadas,provocando un incremento del efecto invernadero y del cambio climtico, por lo que esnecesario reevaluar la aplicacin de lodos en su totalidad.


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2.2 INTRODUCCINLos suelos que se encuentran en la regin Mediterrnea se caracterizan por

ser ms propensos a la degradacin por erosin debido a la gran variabilidad climticaque sufren, como, por ejemplo, largos periodos de sequa (aumentando los riesgos deincendios) e inconstancia en la frecuencia de las precipitaciones (de Paz et al., 2006).

Muchos estudios han mostrado que la utilizacin de enmiendas orgnicas ensuelos con esas caractersticas puede mejorar su calidad, a travs del incremento de laestabilidad de los agregados, del ciclo de nutrientes, de la cobertura vegetal, de labiodiversidad, de la capacidad de almacenamiento de agua, de la biomasa, de laactividad microbiana, de la fertilidad y de la productividad del suelo agrcola (Ros et al.,2003; Prez-Piqueres et al., 2006; Prez-de-Mora et al., 2006; Lal, 2007; Bastida et al.,2009).

Los lodos de depuradora urbana (LDAR) pueden ser uno de estos residuos

orgnicos reutilizados como fertilizantes en suelos agrcolas y adems, es la mejorforma de reciclarlos porque es el procedimiento ms econmico y prctico (Rauch yBecker, 2000). En Espaa, la legislacin para el uso de los LDAR indica que la opcinms sostenible es la aplicacin como enmiendas en suelos agrcolas. Un 65 % del totales utilizado de esta manera (Secretara de Estado de Cambio Climtico, 2009). Las otrasformas de eliminar los LDAR son su acumulacin en vertederos o la incineracin (Grnet al., 2007; Wolna-Maruwka et al., 2007). Sin embargo, estos mtodos acarreanefectos negativos para el clima, porque la acumulacin en vertederos genera gasmetano y la incineracin, CO2, entre otros gases txicos y, adems, la materia orgnicay los nutrientes presentes en estos residuos son eliminados en lugar de ser reciclados

(Bitton, 2005a; Turovskiy y Mathai, 2006; Grn et al., 2007).Sin embargo, la utilizacin de los LDAR como enmiendas agrcolas depende de

sus caractersticas biolgicas y qumicas y aunque sea la opcin ms utilizada, no seconoce completamente cul es la influencia de la liberacin de estos residuos en elmedio ambiente. Los aspectos que se han estudiado con ms intensidad correspondena los que ejercen una influencia ms clara en la salud pblica, como son lacontaminacin con metales pesados o xenobiticos (Barajas-Aceves y Dendooven,2001; Barajas-Aceves et al., 2002; Mantovi et al., 2005; Prez-de-Mora et al., 2006;Martnez et al., 2009) o la liberacin de patgenos capaces de contaminar acuferos ocultivos (Bhattacharyya et al., 2005; Gerba y Smith, Jr., 2005; O'Connor et al., 2005). En

Espaa todava no existe ninguna legislacin que indique valores mximos permitidosde microorganismos patgenos en los LDAR. Sin embargo, en otros pases como en losEstados Unidos de Amrica, la Agencia Nacional de Proteccin al Medio Ambiente (US-EPA), indica que el nivel mximo permitido de coliformes fecales presentes en loslodos digeridos anaerbicamente puede llegar hasta 2x106 NMP g-1 de lodo seco(United States Environmental Protection Agency, 1995).

Aunque los tratamientos aplicados a estos lodos previamente a su salida delas depuradoras deberan asegurar la eliminacin de estos microorganismospatgenos, stos se encuentran presentes y son transmitidos al suelo subyacente(Entry y Farmer, 2001; Estrada et al., 2004; Lemunier et al., 2005) y comoconsecuencia, ste debera ser un aspecto preocupante para las autoridades sanitarias.


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2.3 OBJETIVOSEl objetivo general de este trabajo consiste en analizar los efectos sobre las

poblaciones microbianas derivados de la utilizacin de enmiendas de lodos dedepuradora urbana en un suelo agrcola mediterrneo, mediante el uso de tcnicasmicrobiolgicas dependientes de cultivo. Estos objetivos han sido desarrollados atravs del proyecto de investigacin CGL2006-13915/CLI en el que estudiamos laevolucin de la microbiota de un suelo agrcola tras la adicin de lodos de depuradoraurbana.

Los objetivos concretos de este captulo son los siguientes:

Determinar las alteraciones provocadas en la poblacin microbiana presente enel suelo agrcola control tras la aplicacin de distintas cantidades y tipos delodos de depuradora, mediante recuentos en medios de cultivo especficos y lamedicin de la biomasa y la respiracin microbiana.

Determinar la evolucin y persistencia de algunos microorganismos patgenos(coliformes, enterococos, clostridios) en los suelos enmendados con lodos dedepuradora.

Analizar la evolucin de microorganismos resistentes a distintasconcentraciones de ampicilina en los suelos tratados con lodos de depuradorarespecto del suelo agrcola control.


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2.4 MATERIALES Y MTODOS2.4.1 LOCALIZACIN DE LAS PARCELAS.

Este trabajo se llev a cabo entre los meses de junio de 2007 y junio de 2009en el Centro de Experimentacin Agraria La isla dependiente del Instituto Madrileode Investigacin y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario (IMIDRA) de la Comunidadde Madrid en Arganda del Rey (Figura 4). Las coordenadas son 40,31468347(latitud), -3,49746376 (longitud).

Figura 4. Localizacin de las parcelas. Localizacin y disposicin de las parcelas en elCentro de Experimentacin Agraria La isla del IMIDRA. En la ampliacin se muestrauna fotografa de satlite de la finca en la que se han dispuesto los tres bloques (Roja,Amarilla y Azul) cada una de ellas con 8 parcelas con diversos tratamientos.

El terreno sobre el que se localiza la finca est formado por sedimentoscuaternarios del ro Jarama, fundamentalmente arenas y limos. Estos sedimentos deorigen aluvial han dado lugar a un antiguo Fluvisol calcrico que en la actualidadpresenta caractersticas propias de Antrosol (IUSS Working Group WRB, 2007), y secaracteriza por tener una marcada influencia humana debido a su uso agrcola.Morfolgicamente se diferencian tres horizontes, un horizonte Ap (0-40 cm) conpropiedades anlogas a un horizonte Anthragric, con un contenido en carbonoorgnico prximo al 1 %, un pH moderadamente bsico (pH = 8), baja pedregosidadsuperficial y alta permeabilidad. Un horizonte subsuperficial (40-80 cm) concaractersticas de suelo de labor o compactacin subsuperficial por el uso de

maquinaria agrcola de manera intensiva, aunque tambin se aprecianmorfolgicamente cambios texturales de acumulacin de arcillas. Este horizonte se


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puede denominarAnthraquic ya que presenta un aumento significativo de los valoresde densidad aparente, lo que se traduce en una disminucin de la permeabilidad eficazy un menor contenido en carbono. A continuacin, de 80 a 240 cm, existen diversoshorizontes C que se diferencian por cambios texturales de los materiales, y provienendel transporte fluvial.

La textura del suelo se describe en la Tabla 1.

TEXTURA CANTIDADES (%)

% Arena fina% Limo

% Arena% Arcilla

Clase textural

7,841,323,627,3

Franco Arcilloso

Tabla 1. Textura del suelo agrcola mediterrneo analizado. Datos cedidos por elgrupo del Profesor Casermeiro del Departamento de Edafologa de la Facultad deFarmacia.

2.4.2 PREPARACIN DE PARCELAS DE ENSAYO.Los lodos de depuradora urbana escogidos proceden de las depuradoras de

Campo Real (11000 kg, aerobio) y Guadarrama medio (9000 kg, anaerobio), ambas delCanal de Isabel II de la Comunidad de Madrid.

Las caractersticas qumicas de los lodos se muestran en la Tabla 2.

Lodo ms% MO N Norg pH Cd Cr Cu Hg Ni Pb Zn P Fe K Ca MgAnaerobio 17 76 9,9 6,3 7,5 1,1 16 354 0,6 16 29 523 1,2 0,7 0,26 1,7 0,25

Aerobio 14 75 5,9 4,2 8,2 0,8 17 91 0,1 21 28 237 1,7 0,4 0,54 3,5 0,30

Tabla 2. Caractersticas fisicoqumicas de los lodos de las depuradoras. ms%,porcentaje de materia seca; MO, materia orgnica; N (nitrgeno total, ); Norg,nitrgeno orgnico; y metales pesados, en mg/kg de lodo seco; Fe (hierro total), P, K,Ca, Mg y, en % sobre materia seca.

Los lodos se distribuyeron en las parcelas a las concentraciones establecidas el5 de junio de 2007 de una manera aleatorizada. Su aplicacin se realiz manualmentey se mezcl con el horizonte superficial del suelo mediante el uso de una vertederasimple. A partir de ese momento comenzaron los anlisis subsiguientes.

La distribucin de las parcelas consisti en 3 bloques con 8 parcelas deaplicacin cada uno como se indica en la Figura 5. Los bloques de 8 parcelas estnseparados por pasillos de 10 metros que han sido frecuentemente desbrozados por elpersonal del Centro de Experimentacin Agraria del IMIDRA La Isla. Cada parcelamide 2,5 x 5 metros y se encuentra distanciada de la siguiente parcela adyacente poruna separacin de 5 metros. De esta manera, se pretendi evitar posibles influencias o

contaminaciones cruzadas entre unas parcelas y otras.


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Figura 5. Esquema de la distribucin

aleatorizada de los lodos aerobios yanaerobios. Bloque tipo. AE40, AE80 yAE160 son las parcelas a las que se hanaadido, respectivamente, 40, 80 y160 t ha-1 de lodo aerobio (AE), mientrasque ANAE40, ANAE80 y ANAE160 son lasparcelas a las que se han aadido,respectivamente, 40, 80 y 160 t ha-1 delodo anaerobio (ANAE). El suelo sin tratares Soil.

Finalmente, se obtuvieron 7 tipos de suelo con distintas cantidades de lodosde depuradora aerobio y anaerobio (toneladas/hectrea), como se indica en la Tabla 3.

NOMENCLATURA TIPO DE LODOCANTIDAD DE LODO

(TONELADAS*/HECTAREA)

SOIL - -AE40 Aerobio 40AE80 Aerobio 80

E160 Aerobio 160ANAE40 Anaerobio 40ANAE80 Anaerobio 80

ANAE160 Anaerobio 160

Tabla 3. Parcelas que fueron analizadas en este trabajo. Soil, Suelo agrcola control.AE, aerobio. ANAE, anaerobio. * Peso seco.

2.4.3 RECOGIDA DE MUESTRAS.Las muestras se tomaron cada 4 meses comenzando tras la aplicacin de los

lodos en junio de 2007 (T0), seguido de muestreos en octubre de 2007 (T1), febrero de2008 (T2), junio de 2008 (T3), octubre de 2008 (T4), febrero de 2009 (T5) y junio de2009 (T6), conforme la metodologa previamente descrita (Paetz y Wilke, 2005). Lasfechas exactas de la recogida de muestras estn especificadas en la Tabla 4.

La temperatura media y precipitaciones a lo largo del periodo de estudio, ascomo los porcentajes de humedad de las muestras recogidas estn especificados en laFigura 6 y Figura 7, respectivamente.

ANAE40

AE40

AE80

ANAE160

Soil AE160

ANAE

80 Soil

5 m 5 m 5 m

7,5 m

2,5

m

5 m 5 m


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MUESTREO FECHA ESTACIN

T0 25-JUN-2007 VERANO

T1 15-OCT-2007 OTOOT2 16-FEB-2008 INVIERNOT3 22-JUN-2008 VERANOT4 14-OCT-2008 OTOOT5 24-FEB-2009 INVIERNOT6 01-JUN-2009 VERANO

Tabla 4. Fechas y estaciones del ao de los muestreos.

Figura 6. Temperatura y precipitacin en las parcelas durante el periodo de estudio. Los datos han sido obtenidos de la estacin meteorolgica existente en la finca deexperimentacin del IMIDRA La Isla. Las fechas de muestreo se indica con diversoscolores: en verde, muestreo microbiolgico; en naranja, muestreo de respiracin(Li-COR 8100) y edafolgico; en violeta, muestreo de lixiviacin.

Se utiliz un cilindro de 20 centmetros de profundidad (5 cm de dimetro)(Eijkelkamp) para obtener tres muestras de suelo de puntos distintos de cada parcelaque se mezclaron en una bolsa estril distinta para cada una de ellas. Despus demezcladas, se transfiri cada muestra a un recipiente estril de 2 litros de capacidad.De la misma mezcla, se recogieron dos tubos de plstico de 50 mL de volumen (falcon)por muestra que se congelaron rpidamente in situ en nieve carbnica, reservandoestas muestras para los anlisis de las poblaciones microbianas por mtodos debiologa molecular. Las muestras destinadas a anlisis dependientes de cultivo sealmacenaron a 4oC. Las muestras destinadas a anlisis molecular se congelaron y

mantuvieron a -80oC.

Jun

07

Jul

07

Ag

07

Sep

07

Oct

07

Nov

07

Dic

07

En

08

Feb

08

Mar

08

Abr

08

May

08

Jun

08

Ju l

08

Ag

08

Sep

08

Oct

08

Nov

08

Dic

08

En

09

Feb

09

Mar

09

Abr

09

May

09

Jun

09

Jul

09

0

10

20

30

40

50

60

70

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

Precipitacin(mm)

Temperaturamedia(C)

Temperatura y precipi tacin en La Isla (Arganda , Madrid, Espaa)

Precipitacin Temperatura media (C)


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Figura 7. Porcentaje de humedad en los distintos muestreos del estudio.

2.4.4 ANLISIS DE LAS MUESTRAS DE SUELO MEDIANTE SIEMBRAS.2.4.4.1MEDIOS DE CULTIVO.

Se utilizaron diversos tipos de medios de cultivo para detectar distintos tiposde microorganismos. Los medios utilizados fueron generales (Atlas, 2004) o bienespecficos, de acuerdo a diversas normativas indicadas para cada tipo demicroorganismo (vase 2.4.5. IDENTIFICACIN DE BACTERIAS PATGENAS.).

Los medios de cultivo que se utilizaron en este trabajo estn descritos en laTabla 5. Se esterilizaron a 121oC durante 20 minutos a excepcin de los mediosSlanetz-Bartley y Bilis Esculina que se esterilizaron conforme a las normas delfabricante. Cuando se utilizaron antibiticos, se aadieron despus de la esterilizacincuando la temperatura del medio alcanz 55oC, aproximadamente.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Jun/2007

(T0)

Oct/2007

(T1)

Feb/2008

(T2)

Jun/2008

(T3)

Oct/2008

(T4)

Feb/2009

(T5)

Jun/2009

(T6)

Porcentaje de humedad

Soil AE40 AE80 AE160 ANAE40 ANAE80 ANAE160


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Bilis Esculina (BE)(Laboratorios CONDA)

Extracto de levadura 5 g L-1Peptona 3 g L-1

Triptona 17 g L-1

Bilis de buey 10 g L

-1

Esculina 1 g L-1Citrato frrico amnico 0,5 g L-1

NaCl 5 g L-1Azida de sodio 0,15 g L

-1

Agar 15 g L-1

Agua destilada csp 1000 mL

Confirmacin de Enterococcus spp pueshidrolizan la esculina.

Incubacin a 440C/2 horas.

Hierro Sulfito (HS-Concentracin Doble)

Triptona 20 g L-1

Sulfito sdico 1,5 g L

-1

Citrato frrico 1,5 g L-1

Agar 30 g L

-1

Agua destilada csp 1000 mL

Deteccin de clostridios (bacterias reductorasde sulfito produciendo sulfuro de hierro).

Incubacin a 370C/2 das en anaerobiosis (capade agar agua).

LBXGALIPTG

AMPICILINA

Triptona 10 g L-1

Extracto de levadura 5 g L

-1

NaCl 5 g L-1

Agar 18 g L

-1

Agua destilada csp 1000 mLDespus de atemperado, se aadieron almedio 100 g mL-1 de ampicilina, 0,5 mM

de IPTG y 80 g mL-1

de X-Gal

Seleccin de bacterias con plsmidos deresistencia a ampicilina. El plsmido tiene el gen

lacZque codifica la beta-galactosidasa quedegrada la lactosa. Cuando el plsmido no tieneinserto de DNA se expresa el gen LacZcompletoy se produce la degradacin del sustrato X-Gal,

produciendo un precipitado azul. Cuando elplsmido contiene DNA insertado, el gen lacZ

no se expresa y las colonias tienen color blanco.Se utiliz el medio LB con ampicilina parasembrar los transformantes en una placa

multipocillo (backup).

SOC

Triptona 10 g L-1Extracto de levadura 5 g L

-1

NaCl 0,5 g L-1

KCl 0,25 M 10 mL

Agua destilada csp 1000 mLSe ajust el pH del medio con 0,2 mL de

NaOH 5M. Se aadi en esterilidad 5 mL deuna solucin estril de Cl2Mg 2M y 20 mL

de una solucin estril de glucosa 1M.

Transformacin de E. coli.Incubacin a 37

0C/15 minutos.

TB SALES

Triptona 12 g L-1

Extracto de levadura 24 g L

-1

Glicerol 4 mLAgua destilada csp 1000 mL

Solucin de sales:K2HPO4 12,59 g 100 mL

-1

KH2PO4 2,31 g 100 mL-1

Se aadi la solucin de sales cuando elmedio estaba atemperado para que no

precipitara.

Siembra de los transformantesy extraccin de DNA plasmdico.

Incubacin a 370C/18 horas.

Tabla 5. Medios de cultivo utilizados en este trabajo.

2.4.4.2PREPARACIN DE LAS MUESTRAS PARA CULTIVO.Para cada muestra, se prepararon seis botellas con 90 mL de agua estril

(diluciones: -1 a -6).

Se pesaron 10 gramos de suelo de cada una de las muestras en un recipienteestril. Se resuspendieron con 90 mL de agua estril y la solucin resultante seintrodujo en una bolsa estril para su homogeneizacin.

Se introdujo la bolsa en un aparato homogeneizador Stomacher 400 (A.J.Seward) eliminando las posibles burbujas de aire. Se homogeneiz tres veces

durante un minuto con un minuto de reposo entre cada una de ellas. Se


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39

devolvi el lquido resultante al recipiente original. De esta manera se obtuvo ladilucin (1) de cada muestra.

A continuacin, se hicieron diluciones decimales tomando 10 mL de la dilucin(1) y aadindolo a una botella con 90 mL de agua estril para obtener la

dilucin (2). Se procedi de la misma manera, hasta obtener la dilucin (-6).

Se comenzaron las siembras por la muestra de mayor dilucin (-6) para evitarerrores, inoculndose 100 L en cada placa de medio de cultivo. Realizamos lasiembra por triplicado para cada dilucin con bolas pequeas de vidrioestriles, haciendo movimientos en zig-zag.

2.4.5 IDENTIFICACIN DE BACTERIAS PATGENAS.Una vez dispuestos los lodos en las parcelas procedimos al anlisis de los

patgenos en el suelo en la parcela Soil (control) y las tratadas con lodos dedepuradora. El primer muestreo (T0) se realiz 15 das despus de la aplicacin de lasenmiendas de lodos de depuradora.

2.4.5.1COLIFORMES FECALES.Los coliformes fecales fueron detectados mediante siembra de las muestras

del estudio en medio TTC (descrito en la Tabla 5). Para ello, se llevo a cabo una

modificacin del protocolo descrito en la Norma UNE-EN ISO 9308-1:2000, utilizando100 L de la dilucin correspondiente y sembrndolos directamente en el medio TTC,por triplicado, en lugar de filtrar 100 mL de cada dilucin como describe la norma.

Tras la incubacin a una temperatura de 44oC durante 48 horas, se hizo elrecuento de las bacterias fermentadoras de lactosa que crecieron en ese medio. Estasbacterias crecen dejando a su alrededor un halo amarillo debido al viraje de unindicador de pH (azul de bromotimol) presente en el medio tras la fermentacin de lalactosa. Se hicieron tinciones de Gram para identificar cada una de las bacterias y acontinuacin, se sembraron por estra en medio Agar Nutritivo que se incub a 37 oCdurante 24 horas. Tras esa siembra, se hicieron pruebas bioqumicas especficas

(prueba de la oxidasa, indol, Voges-Proskauer, rojo de metilo y citrato - IMVIC) paraidentificar y confirmar la presencia de coliformes fecales (Koneman y Allen, 2008).

2.4.5.2ENTEROCOCOS FECALES.La presencia de enterococos en los suelos se llev a cabo mediante una

modificacin del protocolo descrito en la Norma UNE-EN ISO 7899-2:2001 filtrandosolamente 10 mL de cada dilucin en lugar de 100 mL como describe la norma.Brevemente, se tomaron 10 mL de las diluciones adecuadas de cada muestra y se

filtraron a travs de un filtro Millipore con un tamao de poro de 0,22 m. Despus, el


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41

entre el 30 y el 60 % de la capacidad de campo (capacidad de campo: cantidad de aguamxima que puede captar el suelo o cantidad de agua que satura el suelo). Tras lahumectacin, se mantuvieron las muestras de suelo en una cmara a 24C durante 48horas previamente a su utilizacin en los anlisis descritos a continuacin (Campbell etal., 2003).

Los valores de biomasa y respiracin de las poblaciones microbianaspresentes en las muestras del estudio se obtuvieron por medio de la medicin de larespiracin en el sistema MicrorespTM (MSC Ltd). En el caso de la biomasa mediante laincubacin con una solucin de extracto de levadura (YE) (Fierer et al., 2003a),mientras que en el caso de la respiracin basal, mediante la adicin de agua ultrapuraestril. Este mtodo se basa en la captura del CO2 producido por el suelo en un gel conun indicador que vira de color en funcin de la cantidad que captura (Figura 8). Lamedicin de ese color con un espectrofotmetro de luz visible a 595 nm (Microplatereader Model680, Biorad) y la utilizacin de unas curvas patrn nos permiten calcularla cantidad de CO2 producido en ambos procesos.

Para ello, se reparti la placa multipocillo en dos mitades: las 6 primerascolumnas para medicin de la biomasa inducida por sustrato (extracto de levadura al16 %) y las 6 ltimas columnas para la medicin de la respiracin basal (agua ultrapuraestril). Se reserv la ltima columna de cada bloque para la medicin sin muestra(slo con YE y agua) como control de la esterilidad del proceso. La placa indicadora semidi 4 horas despus de la adicin de los sustratos.

Figura 8. Esquema de la determinacin de CO2 en un pocillo del sistemaMicrorespTM. Modificado de (Campbell et al., 2003).

2.4.7.1MEDICIN DE LA RESPIRACIN Y LA BIOMASA.La medicin de la respiracin basal (con agua ultrapura) y de la respiracin

inducida a partir de una solucin de extracto de levadura estril (YE) al 16 % se llev acabo de la siguiente manera:


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43

2.4.8 ANLISIS DE LOS DATOS.Los datos de recuentos de microorganismos (CFU g-1 de suelo), biomasa y

respiracin fueron procesados usando Excel 2007 (Microsoft Corporation). Eltratamiento estadstico de los datos comenz con la comprobacin de que seguan una

distribucin normal mediante el test de Kolmogorov-Smirnov. A continuacin serealizaron los anlisis de las medidas de dispersin. Se comprob la homogeneidad delas varianzas por medio del test de Levene y si eran homogneas, se analizaban lasmedias utilizando el ANOVA de un factor para las comparaciones entre las sietemuestras. Se aplic el test post-hoc Tukey para la obtencin de subgruposhomogneos con un nivel de confianza superior al 95 % (p


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Figura 9. Biomasa microbiana (SIR) demuestras de las parcelas del estudio.Anlisis realizado con el sistemaMicroresp y una solucin estril deextracto de levadura (16 %). Serepresenta la media junto con su errorestndar (SEM). Soil, suelo control; AE40,80 y 160, parcelas tratadas con lodoaerobio a 40, 80 o 160 t ha-1; ANAE40, 80

y 160, parcelas tratadas con lodoanaerobio a 40, 80 o 160 t ha-1.

Biomasa T0

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

0

5

10

15

20

bc

b

a a a

b

gC-CO2

g-1s

oilh-1

Biomasa T1

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE160

0

5

10

15

20

bcd

bc abccd

a ab

gC-CO2

g-1s

oilh-1

Biomasa T2

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE40

ANAE80

ANAE160

0

5

10

15

20

b b

cd

b

a

d

bc

gC-CO2g-1s

oi

lh-1

Biomasa T3

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

0

5

10

15

20

a

bc

d

e

a

cd

ab

gC-CO2g-1s

oilh-1

Biomasa T4

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE40

ANAE80

ANAE1

60

0

5

10

15

20

aab

b

ab

cc

a

gC-CO2g-1s

oilh-1

Biomasa T5

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

0

5

10

15

20

a

cd

bc bc bc

c

ab

gC-CO2g-1s

oilh-1

Biomasa T6

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

0

5

10

15

20

a

d

cd

b

c c

b

gC-CO2g-1s

oilh-1


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Figura 10. Respiracin en las parcelas delestudio. Anlisis realizado con el sistemaMicroresp. Se representa la media juntocon su error estndar (SEM). Lanomenclatura se describe en la Figura 9.

Respiracin Basal T0

SOIL

AE

40

AE

80

AE

160

ANAE

40

ANAE

80

ANAE

160

0

1

2

3

dbc

ab

a a

cd

gC-CO2g-1soilh-1

Respiracin Basal T1

SOIL

AE

40

AE

80

AE

160

ANAE

40

ANAE

80

ANAE

160

0

1

2

3

a

bcd

e

de

abbcdbc

gC-CO2g-1soilh-1

Respiracin Basal T2

SOIL

AE

40

AE

80

AE

160

ANAE

40

ANAE

80

ANAE

160

0

1

2

3

ab a

c

cd

dd

gC-CO2g-1so

ilh-1

Respiracin Basal T3

SOIL

AE

40

AE

80

AE

160

ANAE

40

ANAE

80

ANAE

160

0

1

2

3

a a

bc

a

bbc

d

gC-CO2g-1s

oilh-1

Respiracin Basal T4

SOIL

AE

40

AE

80

AE

160

ANAE

40

ANAE

80

ANAE

160

0

1

2

3

a a

c

d

b

a

b

gC-CO2g-1s

oilh-1

Respiracin Basal T5

SOIL

AE

40

AE

80

AE

160

ANAE

40

ANAE

80

ANAE

160

0

1

2

3

ab

a a

c

bb

gC-CO2g-1soilh-1

Respiracin Basal T6

SOIL

AE

40

AE

80

AE

160

ANAE

40

ANAE

80

ANAE

160

0

1

2

3

b

d

cc c bc

agC-CO2g-1soilh-1


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2.5.1.2MICROORGANISMOS OLIGOTRFICOS Y COPIOTRFICOS.Hemos determinado el nmero de microorganismos oligotrficos en los

medios R2A y ETD y los microorganismos copiotrficos, en medio Agar Actinomicetos.

En el medio R2A, con el que hemos cuantificado los microorganismosoligotrficos totales (Tabla 6 y Figura 11), se detect la existencia de algunasalteraciones importantes en la microbiota oligotrfica total del suelo entre la muestracontrol (Soil) y las muestras tratadas con lodos de depuradora en el primer muestreo(junio de 2007 T0), aunque no estadsticamente significativas. Las diferenciasimportantes y apreciables comenzaron a partir del muestreo de octubre de 2007 (T1)donde se apreciaron diferencias estadsticamente significativas principalmente entre lamuestra control (Soil) y las muestras tratadas con mayores dosis de lodo (AE160 yANAE160), existiendo un mayor nmero de microorganismos en esas muestras (Tabla6 y Figura 11). Estas diferencias se mantuvieron hasta el ltimo muestreo (T6), siendomayor el incremento del nmero de microorganismos oligotrficos totales en lamuestra tratada con mayor concentracin de lodo aerobio (AE160).

En las parcelas tratadas con dosis intermedias se detectaron diferencias entreSoily AE80 en los muestreos de octubre de 2007 T1 y de junio de 2008 - T3 (Tabla 6 yFigura 11) siendo superior en AE80. Entre las muestras Soil y ANAE80, existi unincremento del nmero de microorganismos en el muestreo de junio de 2009 - T6.Apenas hemos observado diferencias estadsticamente significativas entre Soily AE40,aunque entre Soily ANAE40 s existen en los ltimos muestreos (octubre de 2008 - T4,febrero de 2009 T5 y junio de 2009 T6) (Tabla 6 y Figura 11). En cuanto a la parcelacontrol (Soil), el nmero de microorganismos oligotrficos totales fue similar en casi

todos los anlisis realizados.

R2A (x109 CFU g-1 suelo)MUESTRA T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6

SOIL 1,09 (0,01) 1,27 (0,23) 1,58 (0,22) 1,32 (0,42) 1,43 (0,26) 0,76 (0,35) 1,59 (0,44)AE40 2,04 (0,30) 1,97 (0,31) 24,70 (19,90) 2,54 (1,12) 3,35 (0,90) 1,83 (0,34) 1,79 (0,40)AE80 5,00 (0,67) 3,46 (0,78) 5,84 (0,82) 2,79 (0,71) 2,43 (0,59) 2,09 (0,69) 2,34 (0,46)

AE160 7,84 (1,10) 10,30 (0,57) 8,40 (1,34) 11,20 (6,06) 11,50 (1,63) 3,06 (0,87) 6,04 (0,84)ANAE40 0,68 (0,16) 1,65 (0,13) 4,15 (1,10) 1,93 (0,58) 4,89 (0,85) 2,50 (1,04) 3,61 (0,31)ANAE80 1,19 (0,13) 2,42 (0,39) 4,18 (0,33) 2,30 (0,30) 1,76 (0,87) 1,93 (0,61) 5,34 (0,95)

ANAE160 2,86 (0,50) 8,04 (0,69) 18,70 (1,64) 9,93 (0,62) 3,39 (1,85) 2,01 (1,04) 3,53 (0,72)

Tabla 6. Microorganismos oligotrficos (R2A). Se indica la media y entre parntesis ladesviacin estndar. La media se representa en la Figura 11.

En el medio ETD (Figura 12) hemos obtenido resultados similares a losencontrados con el medio R2A ya que, en la mayora de los muestreos, el nmero demicroorganismos oligotrficos totales fue mayor en las muestras tratadas con mayordosis (AE160 y ANAE160). Sin embargo, a diferencia del anlisis con R2A, en losmuestreos de octubre de 2008 y junio de 2009 (T4 y T6) el nmero demicroorganismos oligotrficos totales en la muestra control (Soil) fue superior al de lasmuestras de mayor concentracin de lodos (Tabla 7 y Figura 12). En las parcelas


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49

AGAR ACTINOMICETOS (x109 CFU g-1 suelo)MUESTRA T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6

SOIL 1,42 (0,60) 1,33 (0,11) 2,16 (0,11) 1,43 (0,44) 0,81 (0,11) 0,67 (0,04) 1,46 (0,35)AE40 2,59 (0,11) 2,73 (0,62) 4,22 (0,66) 2,73 (0,48) 2,87 (0,62) 1,43 (0,18) 1,72 (0,01)AE80 7,32 (3,02) 7,05 (2,73) 4,15 (0,76) 2,51 (0,43) 2,17 (0,41) 1,48 (0,19) 2,51 (0,32)

AE160 3,49 (1,26) 16,20(3,04) 12,50 (3,70) 7,28 (0,33) 2,52 (0,52) 3,11 (0,33) 5,21 (0,30)ANAE40 2,33 (0,32) 3,16 (0,80) 3,28 (0,45) 1,43 (0,25) 1,86 (0,35) 1,45 (0,31) 1,76 (0,19)ANAE80 1,87 (0,15) 5,72 (2,10) 3,28 (0,41) 1,73 (0,24) 2,67 (0,19) 1,34 (0,28) 2,51 (0,32)

ANAE160 15,3 (2,48) 11,50(0,92) 13,50 (1,13) 9,69 (2,28) 3,88 (0,63) 1,64 (0,25) 2,47 (0,54)

Tabla 8. Microorganismos copiotrficos (Agar Actinomicetos). Se indica la media yentre parntesis la desviacin estndar. Datos representados grficamente en laFigura 13.

2.5.1.3BACTERIAS Y HONGOS.Con el fin de determinar si los efectos son ms acusados en las poblaciones

bacterianas o en las fngicas, hemos realizado recuentos en medios especficos paracada uno de ellos: para bacterias, R2AC que contiene cicloheximida, un inhibidor de lasntesis de protenas eucariota, y para hongos, Sabouraud-Cloranfenicol, que contienecloranfenicol, un inhibidor de la sntesis de protenas bacteriana.

El nmero de bacterias oligotrficas totales en medio R2AC(Tabla 9 y Figura14) fue superior en las muestras tratadas con mayores dosis (AE160 y ANAE160). Estadiferencia se mantuvo hasta el ltimo muestreo (junio de 2009 T6) siendo los valoresde ANAE160 superiores a los de AE160 en algunos de ellos (T1, T2, T3 y T4). En las

parcelas tratadas con menores dosis de lodos el incremento de la poblacin bacterianaslo ocurri en los primeros anlisis (Tabla 9 y Figura 14).

R2AC (x109 CFU g-1 suelo)MUESTRA T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6

SOIL 0,99 (0,02) 0,76 (0,41) 1,41 (0,18) 1,17 (0,15) 1,37 (0,31) 0,77 (0,09) 1,52 (0,32)AE40 1,16 (0,10) 1,91 (0,93) 14,00 (12,1) 2,36 (0,36) 5,45 (0,21) 1,71 (0,10) 1,94 (0,75)AE80 6,47 (1,41) 1,83 (0,42) 5,77 (2,32) 1,75 (0,12) 3,77 (0,67) 2,41 (0,50) 2,57 (0,21)

AE160 7,79 (1,17) 6,53 (0,80) 8,23 (1,04) 3,44 (0,87) 7,33 (1,13) 2,23 (0,58) 3,14 (0,40)ANAE40 2,74 (0,14) 2,25 (1,02) 4,15 (1,25) 1,65 (0,24) 3,11 (0,90) 1,93 (0,52) 2,58 (0,75)ANAE80 1,46 (0,11) 4,51 (0,49) 5,30 (0,92) 2,17 (0,53) 3,36 (0,67) 2,41 (0,70) 6,13 (0,64)

ANAE160 5,79 (0,45) 11,5 (0,35) 17,00 (1,44) 11,40 (2,99) 11,80 (0,50) 2,48 (0,87) 3,64 (0,70)

Tabla 9. Bacterias oligotrficas (R2AC). Se indica la media y entre parntesis ladesviacin estndar. Datos representados grficamente en la Figura 14.

El efecto en la poblacin fngica fue muy similar al detectado en losanteriores anlisis. Como se puede observar en la Figura 15, tras la aplicacin de loslodos en los suelos en junio de 2007 (T0), el nmero de hongos en las parcelasenmendadas fue muy similar al del suelo sin tratar. En cambio, a partir de febrero de2008 (T2) s hemos detectado un valor superior de estos microorganismos en las

muestras tratadas con lodo aerobio respecto a Soil, principalmente en las que seaplicaron 80 y 160 t ha-1 (AE80 y AE160) llegando incluso, a ser un orden de magnitud


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50

mayor en la mayora de los anlisis en AE160 (T2, T3, T4, T5, T6) (Tabla 10 y Figura 15).En algunos muestreos (T2, T3, T6), el nmero de hongos fue similar entre la parcelaAE80 y AE160 (Tabla 10 y Figura 15). En cuanto a las parcelas tratadas con mayoresdosis de lodo anaerobio (ANAE160), el nmero de hongos solo fue mayor en algunosmuestreos (T4 y T6). Sin embargo, los valores en ANAE160 fueron siempre inferiores

respecto a AE160 (Tabla 10yFigura 15). En las muestras tratadas con dosis menores eintermedias se observ un mayor nmero de hongos en algunos muestreos.

Parece existir una relacin entre el incremento del nmero de hongos y el tipode residuo utilizado en el estudio. El aumento de la poblacin de estosmicroorganismos pareci estar ms fuertemente relacionado con aplicacin de lodoaerobio, principalmente en aquellas tratadas con mayores dosis y ese patrn fueobservado hasta el ltimo muestreo en junio de 2009 (T6).

SABOURAUD CLORANFENICOL (x106 CFU g-1 suelo)MUESTRA T0 T2 T3 T4 T5 T6

SOIL 0,56 (0,08) 5,26 (2,30) 3,11 (0,23) 2,53 (0,46) 1,97 (0,16) 3,80 (1,35)AE40 0,69 (0,14) 4,60 (0,94) 3,12 (0,27) 1,80 (0,30) 2,17 (1,61) 2,83 (1,22)AE80 0,62 (0,25) 11,50 (1,87) 19,90 (6,92) 3,93 (0,87) 4,12 (2,64) 22,50 (4,30)

AE160 0,79 (0,05) 9,37 (1,06) 27,60 (3,76) 49,10 (16,90) 22,10 (8,13) 26,40 (7,06)ANAE40 1,09 (0,44) 3,65 (0,93) 1,91 (0,15) 2,02 (0,60) 1,91 (0,57) 2,35 (0,43)ANAE80 0,43 (0,02) 3,24 (0,55) 7,41 (3,05) 1,33 (0,23) 3,42 (1,04) 20,60 (7,09)

ANAE160 0,80 (0,20) 5,26 (0,47) 7,10 (5,48) 9,57 (2,19) 4,26 (0,23) 14,60 (3,71)

Tabla 10. Hongos (Sabouraud Cloranfenicol). Se indica la media y entre parntesis ladesviacin estndar. Datos representados grficamente en la Figura 15. No se

realizaron recuentos de hongos en octubre de 2007 T1.


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Figura 11. Microorganismos oligotrficos.El recuento se realiz 7 das despus de lasiembra en medio R2A. Se representa lamedia junto con su error estndar (SEM)en escala logartmica. La nomenclatura sedescribe en la Figura 9.ns, no significativoa p 0,05.

R2A T0

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

ns

CFUg-1s

oil

R2A T1

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

aa

b

d

aab

c

CFUg-1s

oil

R2A T2

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

a

ab bcab

ab

abc

ac

CFUg-1s

oil

R2A T3

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

aab b

c

ab ab

c

CFUg-1s

oil

R2A T4

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

a

abab

cb

a

ab

CFUg-1s

oil

R2A T5

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

a

ab abb b ab ab

CFUg-1s

oil

R2A T6

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE40

ANAE80

ANAE160

108

109

1010

1011

a aab

cb

cb

CFUg-1s

oil


69/267

52

Figura 12. Microorganismos oligotrficos.

El recuento se realiz 7 das despus de lasiembra en medio Extracto de TierraDiluido (ETD). Se representa la media

junto con su error estndar (SEM) enescala logartmica. La nomenclatura sedescribe en la Figura 9.

ETD T0

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

aab b a

c

dc

CFU

g-1s

oil

ETD T1

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

a

bc b

d

cbc

e

CFUg-1s

oil

ETD T2

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

a b c c a b

d

CFUg

-1s

oil

ETD T3

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

ac c

d

c b

d

CFUg

-1s

oil

ETD T4

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

d

ab a

c

b a

c

CFUg-1soil

ETD T5

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

cab

a

bc

aab abc

CFUg-1soil

ETD T6

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011

abc

bcabc

bcbc

d

CFUg-1s

oil


70/267

53

Figura 13. Microorganismos copiotrficos.El recuento se realiz 7 das despus de lasiembra en medio Agar Actinomicetos. Serepresenta la media junto con su errorestndar (SEM) en escala logartmica. Lanomenclatura se describe en la Figura 9.

AGAR ACTINOMICETOS T0

SOIL

AE4

0

AE8

0

AE1

60

ANAE4

0

ANAE8

0

ANAE1

60

108

109

1010

1011ns

CFUg-1s

oil

A

análisis microbiológico de un suelo agrícola mediterráneo tras la aplicación de lodos de...

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