Análisis Microbiológico de Cereales y Productos Derivados.Práctica N o 4 Muestra: Torta marmolada (De Despensa)Analista: Gabriel M. Siegfried N.Fecha: 12/9/12 (Preparación e inoculación de la muestra)Fecha: 14/9/12 (Lectura y análisis de resultados)

Temperatura: 24oCTemperatura: 25oC

Objetivo del Análisis Realizar el análisis microbiológico de cereales y sus derivados, interpretar los

resultados y posterior cálculo.FundamentoLa microbiota de los granos de cereales y leguminosas es la proveniente del suelo y el ambiente del depósito, además de la adquirida durante el procesamiento. Aunque tienen alta concentración de carbohidratos y proteínas, su baja actividad de agua restringe el crecimiento microbiano si se almacenan adecuadamente.Las condiciones de almacenamiento, tales como el contenido de humedad de los granos, la temperatura y el tiempo de almacenamiento, son factores críticos en el control de los microorganismos.Las distintas variedades de granos no presentan grandes diferencias entre sí, respecto a las poblaciones microbianas.Los mohos, las levaduras y la mayoría de las bacterias mesofílicas presentes, son indígenas de las plantas. Algunos tipos de granos están constantemente contaminados con mohos tales como Cladosporium, mientras que otros contienen Aspergillus, Fusarium, Alternaria y otros.Los contaminantes bacterianos (coliformes, enterococos, E. coli) son aportados por los pájaros, insectos y roedores, los cuales están ecológicamente asociados a los granos.Para prevenir el crecimiento de mohos, el contenido de humedad de los cereales debe ser tan bajo como sea posible.Un aumento de 0,5% en el rango de 14,2 a 15,5% eleva la cantidad del desarrollo de Aspergillus amstelodami, A. repensy otros en un período de un mes.El ataque fúngico de los granos comienza en el campo antes que el grano esté maduro. La contaminación con micotoxinas puede ocurrir en el campo o durante el almacenamiento y no está limitada a una región geográfica o climática particular.La población bacteriana en los granos es alta, pero el número de patógenos es bajo y suele incluir B. cereus, C. perfringens, C. botulinum y en algunos casos Salmonella spp.Los niveles de mohos y levaduras también son elevados, y si los granos están secos mueren lentamente. La baja actividad agua de los granos de cereales evita el desarrollo de las Carrillo L85 bacterias, pero estos organismos pueden sobrevivir durante la molienda y contaminar las harinas.El número de microorganismos de las harinas de cereales es relativamente bajo debido a los agentes blanqueadores.Cuando las condiciones de humedad favorecen el crecimiento aparecen por lo común las bacterias del género Bacillus y diversos tipos de mohos. Varias especies aeróbicas formadoras de endosporos, son capaces de producir amilasa, la que les permite usar la harina y productos relacionados. Con una humedad algo menor puede haber crecimiento micelial y formación de esporas fúngicas.Los panes caseros pueden presentar una alteración limosa debida a especies amilolíticas de B. subtilis y ocasionalmente B. licheniformis, B. cereus, B. firmus y B. firmus provenientesde la harina.Los panes producidos comercialmente carecen de humedad suficiente para permitir el crecimiento de microorganismos, excepto los mohos. Éstos aparecen cuando el pan es almacenado en un ambiente húmedo o envuelto mientras aún está caliente, los más comunes son Rhizopusstolonifer que crece a una aw>0,93 y Neurosporasitophila, pero también suelen desarrollar especies de Penicillium o Aspergillus cuyas esporas germinan a una aw entre 0,90 y

0,84. Las levaduras amilolíticas de los géneros Saccharomycodes e Hyphopichiaproducen el pan yesoso.El deterioro de los productos de pastelería refrigerados, por ejemplo la masa de pizza, es causado principalmente por bacterias lácticas (Lactobacillus, Leuconostoc y en menor proporción Streptococcus), alcanzando valores de 108 ufc/g en los productos alterados, pero los mohos se hallan en bajo número. Las tortas, en cambio, rara vez sufren un deterioro bacteriano debido a la alta concentración de azúcares pero son alteradas por los mohos; éstos provienen de cualquiera de los ingredientes.Definición y Característica dela muestraTorta marmolada: Es una masa dulce que se prepara mezclando en partes Cacao y Vainilla, presenta una consistencia esponjosa; una vez cocida, se diferencian bien la zona de chocolate y de vainilla.Vías de contaminación de la muestra:Durante el crecimiento de los granos cereales se desarrolla sobre su superficie:

Una microflora epífita que se alimenta de las secreciones normales de las células de la planta y que recubren la superficie.

Secundariamente se da una contaminación de los granos de cereales y productos procedentes del suelo y del aire sobre todo durante la recolección. Durante el almacenamiento de los granos de cereales y productos procedentes de los mismos, si su contenido en agua supera ciertos márgenes, pueden sufrir ataques microbianos causados generalmente por hongos y bacterias que producen alteraciones importantes: acidificación, aparición de gases, degradación de determinadas sustancias contenidas en los granos y en ocasiones acúmulo de metabolitos tóxicos como micotoxinas. También pueden infectarse los cereales por las heces y secreciones de diversos parásitos.

Los microorganismos tienen una singular importancia práctica durante el almacenamiento de los cereales que tan imprescindibles son durante todo el año. Se calcula que entre los microorganismos y los parásitos animales ocasionan durante el almacenamiento la pérdida del 10% de la cosecha mundial de cereales. En cambio, las pérdidas producidas por los gérmenes fitopatógenos como la roya y tizón; que tan graves daños causaban en otros tiempos, pueden ser erradicados gracias al tratamiento químico desinfectante de las semillas.

Durante el almacenamiento de los granos de los cereales el desarrollo microbiano está íntimamente relacionado con la temperatura y humedad del almacén. Se recomienda que el grano tenga un contenido de agua no mayor que el 14-15%, que la humedad relativa del aire no pase del 75% y que la temperatura esté comprendida entre 10 y 18 ºC.

DescripciónEquipos:Estufa de cultivo microbiológico: Aparato eléctrico utilizado para la incubación de muestras microbianas: bacterias, hongos, cultivos celulares, con el fin de dar las condiciones necesarias de temperatura a las cuales crezcan satisfactoriamente.Autoclave: Es un recipiente metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial, una cocción o una esterilización con vapor de agua. La acción conjunta de la temperatura y el vapor produce la coagulación de las proteínas de los microorganismos, entre ellas las esenciales para la vida y la reproducción de éstos, cosa que lleva a su destrucción.Materiales:Mechero: Instrumento que utiliza como fuente de calor la combustión de gas, es utilizado para crear un ambiente aséptico en el laboratorio de microbiología, esterilizar materiales, etc.Micro pipeta: Instrumento de laboratorio empleado para succionar y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas analíticas.

Placas de Petri: Es un recipiente redondo, de cristal o plástico, con una cubierta de la misma forma que la placa, pero algo más grande de diámetro, para que se pueda colocar encima y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermética.Se utiliza en los laboratorios principalmente para el cultivo de bacterias, mohos y otros microorganismos, soliéndose cubrir el fondo con distintos medios de según el microorganismo que se quiera cultivar.Erlenmeyer: Es un frasco de vidrio transparente de forma cónica, de base ancha y alargada, cuello muy estrecho, con una abertura en el extremo estrecho, generalmente prolongado con un cuello cilíndrico. Es útil para realizar mezclas por agitación y para la evaporación controlada de líquidos, ya que se evita en gran medida la pérdida del líquido; además, su abertura estrecha permite la utilización de tapones. Al disponer de un cuello estrecho es posible taparlo con un tapón esmerilado, o con algodón hidrófobo.Probeta: La probeta o cilindro graduable es un instrumento volumétrico, hecho de vidrio, que permite medir volúmenes considerables con un ligero grado de inexactitud.Extensor: Es una espátula triangular que puede ser de vidrio o de acero, es utilizado para distribuir una muestra líquida que se siembra sobre la superficie de un medio de cultivo sólido.Medios de cultivo:Agar PCA: Medio de cultivo recomendado para el recuento de bacterias aeróbicas en aguas, aguas residuales, productos lácteos y otros alimentos. También es recomendado como medio general para determinar poblaciones microbianas.Agar Saboraud: Medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos patógenos y saprófitos. También es útil para el cultivo de levaduras.Agua peptonada: Medio usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de interés sanitario.Agar Baird Parker: Medio de alta especificidad diagnóstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.Salmonella Shigella Agar: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.Bacillus Cereus Selectivo Agar: Medio diagnóstico selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de Bacilluscereus en alimentos.Mac Conkey Agar: Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.Reactivos:Agua Destilada estéril: Agua sometida a procesos de purificación tanto química como biológica.Descripción de metodología de trabajo:Técnica de toma de muestra:Con Calador de Bolsa (para granos embolsados):Se introduce totalmente en la bolsa con la parte acanalada hacia abajo y se retira con un movimiento de rotación hacia arriba para dejar caer el grano. Presenta distintas medidas de acuerdo al tipo de granos a muestrear.Con Calador cilíndrico o calador sonda (mercadería a granel):Se introduce en la masa con los compartimientos cerrados, se abre dejando entrar los granos, se cierra y se extrae el calador, volcando luego su contenido sobre un lienzo o catre para su inspección.Con Saca muestras cucharín (mercadería a granel y en movimiento):Se introduce en el flujo de granos a intervalos frecuentes y regulares.Transporte de muestra:

La muestra no posee muchas exigencias en el transporte, siendo bastante estable dentro de ciertos periodos de tiempo limitados. Debe mantenerse seca, a temperaturas controladas y protegidas del contacto con superficies contaminadas y corrientes de aire que puedan transportar carga microbiana (debe estar empaquetado). Preparación de la muestra:La muestra debe haberse almacenado según especificaciones, tomar no menos de 200 g representativos, cerciorarse que estos no posean humedad excesiva que pueda aumentar la carga microbiana.Se homogeniza y se inoculan las muestras en:PCA, BC, BP y McConkey se incuban a 37 °C, y Saboraud se incuba a 30°C.Análisis microbiológico:

- Investigación y recuento de Enterobacteriaceae lactosa positivo (coliformes).- Investigación y recuento de Aerobios mesófilos totales.- Investigación y recuento de Hongos y levaduras.- Investigación y recuento de Bacillus Cereus.- Investigación y recuento de Coliformes totales y fecales.- Investigación y recuento de Staphylococcus aureus.- Investigación y recuento de Salmonella sp.

CálculosAgar McConkey:

- 10-1: 0 - 10-2: 1 - 10-3: Ausencia

Agar PCA:- 10-1: >300- 10-2: >300- 10-3: >300

Agar Bacillus Cereus:- 10-1: Ausencia- 10-2: Ausencia- 10-3: Ausencia

Agar Saboraud:- 10-1: Incontable- 10-2: >300- 10-3: 221

Agar Baird Parker:- 10-1: >300- 10-2: >300- 10-3: >300

Agar Salmonella Shigella:- 10-1: Ausencia

Las Colonias presentes en el medio PCA y Baird Parker, en todas las diluciones, no se puede calcular, ya que requiere mayor dilución.En el agar McConkey, las colonias presentes no se consideran representativas ya que son menores a 25 colonias.En el agar Bacilus Cereus no hubo formación de colonias, tampoco en el Agar Salmonella Shigella Cálculo de colonias en Agar Saboraud:

- 10-1: Incontable, se visualizaba homogéneas las colonias.- 10-2: >300

- 10-3:

ResultadosNombre de la Bacteria Criterio Microbiológico Resultado

Aerobios mesófilos totales 1.102 – 1.105/g No se puede calcularColiformes Totales 1.102 – 1.104/g No se puede calcular

Staphylococcus Aureus 1 x101 – 1 x102 /g No se puede calcularSalmonella Ausencia Ausencia

Mohos y Levaduras 1.102 – 1.104/g 2,2.106 UFC/mlBacillus Cereus ≤1.101/g Ausencia

ConclusiónMediante el análisis microbiológico del producto derivado de cereales, se pudo observar que la muestra contiene una carga microbiana excesiva. Las muestras en los medios PCA y Baird Parker superan los límites estadísticos y se considera que la muestra no se ajusta a los criterios establecidos; se sugiere realizar mayores diluciones.El bizcocho exhibió ausencia se Salmonella spp. Shigella spp. y Bacilus Cereus.La carga microbiana de Coliformes es insignificante.Se debería repetir los análisis por presentar exceso de aerobios mesófilos totales y estafilococos. BibliografíaMicrobiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas. María del Rosario Pascual Anderson, Vicente Calderón y Pascual http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/aguapep.htm http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/8%20granos%20y%20harinas.pdfhttp://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/bacilcerselagar.htmhttp://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/maconkeyagar.htmhttp://es.scribd.com/doc/28920899/CEREALEShttp://www.bccba.com.ar/bcc/images/00000651_Anexo%20A.pdf