ANALISIS INSTRUMENTALCROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

INTRODUCCION

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil. En cromatografa liquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija.La cromatografa liquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual esta rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones, lo cual genero la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil.De esta manera, naci la tcnica de cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la separacin, la Cromatografa liquida de alta resolucin puede ser:

1. Cromatografa de adsorcin.La fase fija es un slido y se utiliza casi exclusivamente slice (slica) y en mucha menor medida almina.

2. Cromatografa de reparto.En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos qumicamente a un soporte solido de slica. Se la subdivide en cromatografa en fase normal y fase reversa.En la cromatografa en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polares e luyen primero.En la cromatografa en fase reversa, el compuesto unido qumicamente es un hidrocarburo Aliftico y se emplean fases mviles polares. En este caso, las sustancias ms polares e luyen primero.

3. Cromatografa inica.Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio inico para separar y determinar iones.

4. Cromatografa de exclusin por tamao.La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento relacionado con el tamao molecular. Las molculas de tamao mayor son excluidas y e luyen primero, mientras que las ms pequeas que penetran en los poros son retenidas ms tiempo.

INSTRUMENTAL

Un equipo para cromatografa liquida de alta resolucin puede representarse por el siguiente esquema:

La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una Proporcin determinada y realice la mezcla en una cmara de mezclado. Cuando durante toda la separacin se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal realizar un gradiente de composicin del solvente a lo largo de la cromatografa para mejorar la eficiencia y acortar la duracin del proceso. Estos gradientes de solvente tambin son realizados en forma automtica por las bombas.La bomba enva al solvente a travs de caos de dimetro pequeo, generalmente de acero inoxidable, hacia la vlvula inyectora. Esta consiste en una vlvula de seis vas que permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Luego de que se produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan por el detector. Este produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de materia y esa seal es enviada al registrador que realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo (cronograma) del tipo:

Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El integrador calcula adems el rea correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia.Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los productos que salen de l. De esta manera, dependiendo del tamao del loop de inyeccin y de la columna, y del tipo de bomba, es posible realizar adems de separaciones analticas, cromatografas preparativas.

PARMETROS RELEVANTES

Los parmetros tericos que caracterizan las separaciones cromatografas por HPLC son idnticos a los descriptos en cromatografa gaseosa.En HPLC, en lugar de variar la temperatura de la columna para mejorar la resolucin del cronograma, se cambia la composicin de la fase mvil a lo largo de la separacin utilizando mezclas de entre dos y cuatro solventes.

ETAPAS DEL ANALISIS DE UNA MUESTRA

Son idnticas a las puntualizadas para cromatografa gaseosa.En lo que respecta a la optimizacin de las condiciones experimentales, en este caso es posible realizar ensayos preliminares orientativos utilizando cromatografa en capa delgada con la misma fase fija que contiene la columna.

Por otra parte es necesario tener en cuenta que dado que se utilizan altas presiones, es imprescindible evitar la presencia de partculas que puedan obstruir los caos y la formacin de burbujas que puedan deteriorar el relleno de las columnas y que produzcan inestabilidad en la seal del detector.

Para evitar las obstrucciones, los solventes y las muestras a inyectar se filtran con membranas de 0,45 a 0,22 m. Para evitar la formacin de burbujas, los equipos de HPLC cuentan con desgas adores de solvente por vaco o por burbujeo con He y, en el caso de no contar con los mismos, se deben desgasar los solventes por medio de ultrasonido o agitacin bajo vaco antes de utilizarlos como fase mvil.

PARTE EXPERIMENTAL

Objetivos

Realizar curvas de calibracin para distintos analitos. Cuantificar el contenido de los mismos en muestras sintticas y comerciales.

Materiales a emplear

Equipo para HPLC marca Thermo Separations compuesto por una bomba binaria modelo Spectra System P2000, una vlvula inyectora Reodyne provista de un loop de inyeccin de 10 l, un detector de absorcin UV-visible de longitud de onda variable modelo Spectra 100 y un integrador registrador modelo Datajet. Columna analtica marca Alltech econosphere C18 (fase reversa unida qumicamente formada por cadenas de hidrocarburo lineal de 18 tomos de carbono) de 150 mm de longitud por 4,6 mm de dimetro interno. Buffer fosfato 0,025 M; pH=3; calidad HPLC. Metanol calidad HPLC. Patrones de aspartamo, cafena y acido benzoico en agua, de diferentes concentraciones.

Muestra incgnita sinttica que contiene los tres analitos. Muestras comerciales que contengan uno o varios de los analitos mencionados (!mejor los tres!).

Procedimiento

Cuando se desarrolla una tcnica analtica por HPLC, normalmente se elige en primer lugar una fase fija adecuada y una fase mvil con una composicin tal que sea compatible con la fase fija, que disuelva los componentes a analizar y que permita una buena separacin. Luego se optimizan las condiciones de flujo de solvente, cantidad de muestra a inyectar y, en el caso de un detector de absorcin como el que se empleara en este caso, se determinara la/s longitud/es de onda de deteccin.

Para el anlisis de la mezcla de aspartamo, acido benzoico y cafena se utilizara una columna de fase reversa C18 y, como fase mvil, una mezcla formada por 45% de metanol y 55% de buffer fosfato (acuoso) 0,025M de pH=3. Se inyectaran 10 l de cada solucin.

Buscar en bibliografa los valores de pKa para los tres compuestos y, en base al estado de ionizacin de los mismos al pH de trabajo, predecir el orden de elucin. A continuacin se presentan los espectros de absorcin de soluciones acidas (pH=2) de aspartamo (18,7 mg/L); acido benzoico (6,55 mg/L) y cafena (7,83 mg/L).

Teniendo en cuenta los espectros, elegir la longitud de onda a utilizar en el anlisis.

Curva de Calibracin y anlisis de muestras

1. Una vez elegidas las condiciones, se realizara la curva de calibracin para cada analito inyectando 1 mL de cada solucin patrn mezcla de modo de saturar y limpiar el loop del inyector. Ajustar los valores de velocidad de papel y atenuacin adecuados en el integrador y registrar los cronogramas. Graficar luego el rea de pico en funcin de la concentracin y verificar que se est trabajando dentro del mbito lineal. Idealmente cada punto de la curva de calibracin se realizara por triplicado.

2. Realizar el anlisis cromatografico de la muestra sinttica y de las muestras comerciales. La muestra sinttica no requiere tratamiento previo mientras que las comerciales deben desgastarse al vaco (especialmente las de bebidas gaseosas) y filtrarse antes de ser inyectadas. El filtrado se lleva a cabo con una jeringa de 5 ml unida a un soporte conteniendo un filtro de nylon de 0,45 o 0,22 micrones; se descarta el primer ml de filtrado y luego se recoge el lquido en un recipiente limpio.

3. Si fuera necesario, diluir la muestra para obtener valores dentro del intervalo de calibracin. Para el caso de muestras slidas, preparar soluciones de concentracin adecuada y verificar que el material se disuelva por completo.

4. Para uno de los patrones mezcla utilizados en la curva de calibracion, realizar variaciones en la longitud de onda del detector. Discutir la longitud de onda de trabajo.

5. Por ltimo, realizar variaciones en el flujo de anlisis

Anlisis de los resultados

Una vez obtenidas las curvas de calibracin, comparar la sensibilidad del mtodo para la determinacin de cada compuesto en las condiciones de trabajo. Relacionar la misma con los espectros de absorcin y proponer mejoras en las condiciones experimentales para hacer ms eficiente el anlisis.

Informar las concentraciones de las muestras-problema con su error. Comparar con los valores informados en literatura y con los declarados por los fabricantes de las muestras comerciales.

Proponer un mtodo para evaluar el lmite de deteccin.

Discutir la necesidad de utilizar otros mtodos (estndar interno, agregado patrn) para realizar la cuantificacin.

Calcular los parmetros cromatograficos de relevancia y realizar los grficos de Van Demter.

EJEMPLO DE UNA ANALISIS DE CONTAMINACIONAnlisis de residuo de plaguicida organofosforado (Methamidophos) en muestras de papa de mercados de Lima Metropolitana

RESUMEN Se realiz el anlisis toxicolgico de identificacin y cuantificacin del residuo de plaguicida organofosforado METHAMIDOPHOS en 20 muestras de papa en diferentes puestos de venta en el Departamento de Lima. El anlisis cualitativo se realiz por cromatografa en capa fina (CCF) y el cuantitativo por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). Se determin presencia de Methamidophos en la totalidad de muestras analizadas. De los 10 muestreos realizados en mercados mayoristas: 7 muestreos (70%) exceden el Lmite Mximo Residual (LMR) mostrando una concentracin mxima de 2,7055 ppm de Methamidophos. De los 10 muestreos realizados en mercados minoristas: 2 muestreos (20%) exceden el LMR mostrando una concentracin mxima de 0,1753 ppm de Methamidophos. Se concluy que dichas concentraciones exceden el LMR establecido por el Codex Alimentarius (LMR = 0,05 ppm). Palabras clave: Residuo Methamidophos, plaguicida, organofosforado, LMR, CCF, HPLC.BIBLIOGRAFAGeneral de cromatografa: Anlisis Instrumental. Skoog y Leary. "Principios de Anlisis Instrumental", Skoog, Holler, Nieman. Mtodos Instrumentales de Analisis. Willard, Merritt y otros. Cromatografa liquida de alta presion. H. M. McNair y B. Esquivel. Monografia cientifica de la OEA.