UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS CURSO: BIOLOGA MOLECULAR

PRACTICA

ANLISIS E L E C T R O F O R T I C O D E P R O T E N A S

Uno de los mtodos ms utilizados para el anlisis y caracterizacin de protenas es la Electroforesis en Geles de Poliacrilamina. En este caso la separacin de las protenas se realiza en una matriz de poliacrilamida que se forma a partir de la polimerizacin de dos monmeros: la acrilamida y la bisacrilamida en presencia del agente iniciador persulfato de amonio (iones persulfato) y del catalizador N'N'N'N'- tetrametilendiamina(TEMED). La poliacrilamida acta como soporte inerte y como tamiz y de acuerdo a la concentracin de sus polmeros se puede obtener diferentes tamaos de poro. Bajo la accin de un campo elctrico las protenasse desplazan a travs del gel de poliacrilamida de acuerdo a su carga neta (q) y a su tamao esta migracin se le conoce como movilidad electrofortica (p). Un punto importante en los sistemas electroforticos en geles de poliacrilamida, es el sistema de buffers utilizado. De acuerdo con ello, podemos clasificar dichos sistemas en: a) Sistemas Continuos, en donde el gel, reservnos de electrodo y muestras, tienen buffers con igual pH y la misma tensin inica y -b) Sistemas Discontinuos, en donde el buffer.utilizado en la formacin del gel es diferente en cuanto a iones y pH, al del buffer utilizado en los reservnos de los electrodos. De acuerdo a la estabilidad de la protena pueden ser: a. Sistemas Disociantes, que permite la disociacin de las protenas en sus subunidades polipeptdicas y b. Sistemas A/o Disociantes que permite el anlisis electrofortico de las protenas en su forma nativa conservando su actividad biolgica. Utilizando estos criterios se puede considerar los siguientes tipos de electroforesis en geles de poliacrilamida: 1- SDS-PAGE 2- Geles en gradiente 3- Isoelectroenfoque 4- Geles bidimensionales Terminada la corrida electrofortica la visualizacin de las protenas se hace mediante coloraciones especificas utilizando el colorante Azul Brillante de Coomasssie o tambin se puede emplear la tincin con nitrato de plata.

OBJETIVO Conocer el procedimiento para la preparacin y corrida electrofortica en geles de poliacrilamida. MATERIALES - Acrilamida al 30% Beakers (2) de 25ml Pipetas 1ml - Bisacrilamida al 0.8% - Buffer de resolucin (Tris-HCI 0,75M con SDS Pipetas automticas: 0,5 -200ul al 0,2% a pH 8,8. Papel toalla Tips - Buffer de stacking (Tris-HCI 0,25M, SDS 0,2% pH 6,8 -Jering a de tuberculina Papel filtro - Buffer de muestra (Tris-HCI 0,06M pH 6,8, SDS 0,2%, glicerol 10%, mercaptoetanol 10% y azul Cmara de electroforesis vertical debromofenol al 0,05%. Ependorf Guantes - Persulfato de amonio -Tetrametiletilendiamino (TEMED) Bao de temperatura Recipiente 15x15 cm (taper) - Solucin colorante (Azul brillante de Coomassie Fuente de poder 0,2%) - Sol.decolorante,metanol:cidoactico:agua (25:8:67)

PROCEDIMIENTO Se realizar el ensayo experimental siguiendo la tcnica descrita por Laemmli (1970) 1. Preparacin de Gel de Resolucin: - Mezclar en un beaker 0,5ml de agua destilada, 1,2 mi de acrilamida, 1,8 ml de buffer de gel de resolucin, 5ul de TEMED y 0,1 mi de persulfato de amonio (20mg/ml), homogenizar. - Armada la cmara, colocar la mezcla y 3 gotas de agua destilada con la ayuda de una hipodrmica. - Dejar que gelifique por 15 minutos. 2. Preparacin del Gel de Stacking: - Colocar en un beaker 0,4ml de agua destilada, 0,2ml de acrilamida, 0,8ml de buffer de gel de stacking, 5 ul de TEMED y 50 ul de persulfato amonio (20mg/ml), homogenizar y aplicar sobre el gel de resolucin ( previamente se retira la capa de agua). - Seguidamente se coloca el peine al sistema, a fin de generar los pocilios respectivos. Dejar que gelifique.

3. Preparacin y Aplicacin de la Muestra La muestra de protena a evaluarse (volumen 5 ul), se mezcla con el buffer de muestra (volumen 15ul) reductor o no reductor y luego se calienta a 100C por 5 minutos. - Retirar el peine del sistema y enjuagar con agua destilada, para eliminar el exceso de acrilamida y limpiar los pocilios sin deformarlos. - Colocar las placas as preparadas en la cmara e incorporar el buffer de corrida, para luego aplicar a los pocilios las muestras respectivas. - Suministrar corriente a voltaje constante de 100 voltios durante una hora.

4. TincinAl final de la corrida, colocar el gel en un recipiente que contiene 15 mi de azul brillante de Coomassie al 0,2% y dejarlo por 5 minutos. Luego, decolorar el gel en la solucin decolorante realizando los cambios necesarios hasta la observacin de la bandas correspondientes.

RESULTADOS - Analizar y realizar los clculos respectivos para el gel obtenido en la prctica - Analizar y realizar los clculos respectivos para los geles:

Ge/#;

Carril B: 1 Fosforilasa (97kDa) 4 Ovoalbumina (45kDa) 2 Fructuosa 6Pkinasa (84kDa) 5 Anhidrasa carbnica (29kDa) 3 Albmina (66kDa) 6 Lactoalbmina (14,2 kDa) Carril A: Muestra de Extracto crudo no dializado Carril C: Muestra del Extracto crudo dializado Mencione todas las caractersticas posibles de la muestra en estado dializado y no dializado.

Gel#2

Carril: 1 y 4 marcadores A: Albmina, (66kDa) B Ovoalbmina (45 kDa) C Lisozima (14,3 kDa) Carril 2: muestra No denaturada Carril 3: muestra denaturada Determine el peso molecular de la muestra

Gel # 3:250kDa 160kDa

15kDa

Determine el peso molecular de las protenas del carril 2

PAGINAS TILES http://www.ub.eS/biocel/wbc/tecnicas/paqe.htm#lntroduccion%20v%20tecnica%20basica www.uprm.edu/bioloqy/profs/velez/poli.htm Profesora Blga. Elena Arbaiza