análisis de micotoxinas. método fácil, robusto y validado ... · beauvericina ergotamina,...

1 E-Seminar, 11 Julio 2012

Cuantificación de micotoxinas reguladas

Análisis de micotoxinas.

Método fácil, robusto y

validado de acuerdo a los

reglamentos europeos

mediante UHPLC-MS/MS. Jaume C. Morales

LC/MS Product Specialist

En cooperación con:

Elisabeth Varga, Thomas Glauner, Michael Sulyok,

Rainer Schuhmacher, Rudolf Krska, Franz Berthiller

Prefacio

Unido a HP/Agilent desde 1991

Ingeniero Químico IQS / Especialidad Análisis Químico

Antiguo ingeniero de aplicaciones y soporte especializado en LCMS

Actualmente Especialista de Producto de MS



The Agilent Mycotoxins e-seminar series

• Meeting EU regulation limits with entry level LCMS instruments

– 25/1/2012, 15:00 CET, Dr. Marco Zanotti, Food Market Manager EMEAI

• An easy, robust and validated method to comply with the EU regulations

– 29/3/2012, 15:00 CET, Dr. Thomas Glauner, Food Sector Specialist EMEAI

• Guarantee safety beyond regulation – screening for the unexpected

– 19/4/2012, 15:00 CET, Dr. Thomas Glauner, Food Sector Specialist EMEAI

E-Seminar, 11 Julio 2012


Agenda

Micotoxinas

Regulación de la UE

Ensayo por Dilución Isotópica Estable (SIDA) para micotoxinas regulado por

la EU

Razones

• Enfoques

• Preparación de muestra y método

• Resultados

Resumen y conclusiones



}

Micotoxinas Fundamentos

Bajo peso molecular, tóxicas, metabolitos secundarios del hongo

Producidos por e.g.:

• Fusarium esp., Aspergillus esp., Penicillium esp.

toxicidad:

• aguda, carcinógenos, mutagénicos,

efectos teratogenico, estrogénico

e inmunotóxicos.

5

pro

vid

ed

by P

rof.

Bü

rstm

ayr

myces (Greek) = hongo

toxicum (Latin) = tóxico = Micotoxina



• Cientos de compuestos

• Existen dos clases principales :

Micotoxinas mayoritarias

• Aflatoxinas

• Ocratoxinas (OTA)

• Tricotecenos

• Zearalenona

• Fumonisinas

• Patulina

Micotoxinas minoritarias

• Ergot alkaloides

• Citrinina

• Acido Ciclopiazonico

• Esterigmatocistina

• Monoliformina

• Gliotoxina

• Citreoviridina

• Micotoxinas Tremorgenicas

• Acido Penicillico

• Roquefortina

• Acido 3-Nitropropionico

• Fusaproliferina

Micotoxinas ¿Cuantas micotoxinas diferentes existen?



ON

O

N

NO

O

OO

O O

O

Eniatinas

beauvericina eniatina A, A1, B, B1

APOLAR

beauvericina

O

O

[COOH][COOH]

O

O [COOH]

[COOH]

CH3 CH3 OH

OH

CH3

OH

NH2

Fumonisinas

fumonisina B1, FB2, FB3, FB1hidrolizada

POLAR, ACIDA

FB1

Alcaloides Ergot

ergotamina, ergocornina, ergovalina, dihidroergosina

POLAR, BASICA

ergovalina

Micotoxinas Diversidad química - un reto para la preparación de muestra



Micotoxinas ¿Porqué son una preocupación?

>25% de todos los productos agrícolas se hayan contaminadas por

micotoxinas

A nivel mundial se producen pérdidas de

varios centenares de millones de toneladas

de alimentos

Pérdidas económicas anuales :

1 billón de $ (sólo en EEUU)

Más de 100 países disponen de regulación para

el control de las micotoxinas en alimentación



• Se encuentran en cereales, frutos secos, especias, uva, café, cacao,

zumos de fruta;

• Como contaminación secundaria se encuentran en leche, huevos y carne;

• Son resistentes al cocinado doméstico;

Micotoxinas Alimentos infectados



Micotoxinas Relevancia en el control alimentario

Notificationes concernientes a micotoxinas

• (RASFF-Annual reports 2002-2008)

10

3 % 7 % 6 % 9 % 8 % 8 % 10 %

0

200

400

600

800

1000

1200

2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

alert notifications

mycotoxins total

10 % 39 % 44 % 40 % 40 % 34 % 35 %

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

information notifications

mycotoxins total



Contaminantes alimentarios online Acceso a la base de datos FERA FC24

Acceso libre a las alertas de RASFF y notificationes via FC24

Registro a través de la web de Agilent

(http://www.chem.agilent.com/en-US/solutions/foodtesting-agriculture/Pages/default.aspx)



http://www.chem.agilent.com/en-US/solutions/foodtesting-agriculture/Pages/default.aspx





Regulación de la UE

Analytes

MRLs µg/kg

(EC Reg. No

1881/2006)

Commodities

Aflatoxin B1

0.1 processed cereal-based baby food

2.0-12

sum of aflatoxins:

4.0-15.0

nuts and cereals

Deoxynivalenol 200

500 - 1750

processed cereal-based baby food

processed / unprocessed cereals,

bread, pasta, breakfast cereals

Fumonisin B1 200

800

1000 / 4000

processed maize-based baby food

maize-based breakfast cereals

maize / unprocessed maize Fumonisin B2

Patulin 10-50

fruit juices, apple products, baby food

other than processed cereal-based

foods

Ochratoxin A

0.5

3.0 / 5.0

10.0

15 / 20 / 80


processed / unprocessed cereals

dried vine fruit

spices / liquorice root / extract

Zearalenone

20

50

75-350


bread, biscuits, breakfast cereals

processed / unprocessed cereals



Regulación de la FDA

Analytes Limit µg/kg Commodities

Aflatoxins, sum 20 All foods except milk

Patulin 50 Apple juice, apple juice concentrate,

apple components in processed food

Deoxynivalenol 1000 Finished wheat products

Fumonisins sum

of B1, B2, B3

2000

degermed dry milled corn products

(e.g. flaking grits, corn grits, corn meal,

corn flour)

3000 cleaned corn intended for popcorn

4000

whole of partially degermed dry milled

corn products (e.g. flaking grits, corn

grits, corn meal, corn flour

Aflatoxin M1 0.5 milk



Exactitud en la Cuantificación de Micotoxinas Razones

European Commission Regulation (EC) No 1881/2006

• Establece el Maximum Residue Level (MRL) para micotoxinas

Métodos simples versus multi-contaminantes

PERO:

Electrospray ionisation (ESI)

• El efecto matriz obstaculiza

la cuantificación exacta por

espectrometría de masas

Para la cuantificación de micotoxinas

reguladas se requiere una cuantificación de alto

nivel de exactitud



Efectos Matriz en ESI-MS y cuantificación Estrategias

Dilución de la muestra

• menor sensibilidad del método

Calibración en misma Matriz

• tediosa

• diferencias dentro de un mismo producto no compensadas

Adición de Patrón a cada muestra

• más inyecciones

• mayor coste (tiempo y patrones)

Calibración Interna

• compuestos similares (ZAN por ZEN)

• compuestos marcados isotópicamente, Deuterio, 13C, 15N,18º

• hasta éste año: sólo algún analito o grupo de analitos por adición IS

• generalmente asociado a alto coste

16



Efectos Matriz en ESI-MS y cuantificación Estrategias

Dilución de la muestra

• menor sensibilidad del método

Calibración en misma Matriz

• tediosa

• diferencias dentro de un mismo producto no compensadas

Adición de Patrón a cada muestra

• más inyecciones

• mayor coste (tiempo y patrones)

Calibración Interna

• compuestos similares (ZAN por ZEN)

• compuestos marcados isotópicamente, Deuterio, 13C, 15N,18º

• hasta éste año: sólo algún analito o grupo de analitos por adición IS

• generalmente asociado a alto coste

17

IS A



Ensayo por Dilución Isotópica Objetivo

Desarrollo de un método que cumpla:

• contemplar todas las micotoxinas reguladas en alimentación sólida

• suminsitrar la mejor exactitud posible

• sencilla y fácil de llevar acabo

• sensible al coste

Stable isotope dilution assay (SIDA) para LC-MS/MS

• 11 micotoxinas

• compuestos marcados con C13 como patrones internos

• validación del método para maiz



Multiple Reaction Monitoring Principios

19

Q1 lets only target ion 210 pass through

190 210

210

Spectrum with background ions (from ESI)

170 210 250 290

210

222

268 280 165

Quad Mass Filter (MS2) Quad Mass Filter (MS1)

Collision Cell

Chromatogram High background



Multiple Reaction Monitoring Principios

20

Collision cell breaks ion 210 apart

150 170 190 210

210 158

191

Q3 monitors only characteristic fragments 158 from ion 210 for quant

160

158

Q1 lets only target ion 210 pass through

190 210

210

Spectrum with background ions (from ESI)

170 210 250 290

210

222

268 280 165

Quad Mass Filter (MS2) Quad Mass Filter (MS1)

Collision Cell

Low background

Chromatogram High background



Sistema Agilent G6490A QQQ Nuevos desarrollos para la mayor sensibilidad

21

• Tecnología de Ionización y Transferencia de Iones

– Agilent Jet Stream Ion Generation

– Hexabore capillary

– Tecnología Dual ion funnel (iFunnel)

• Doble fase de Foco de Iones y eliminación de gas

• Mejora para la transmisión de amplio rango de m/z

• Baja capacitancia

• Celda de colisión

– Campo Hexapolar, con foco Axial y celda curvada

• Estructura cónica para incrementar la entrada de iones

• Reducción del ruido

• Mejora an la Electrónica del Quad Drive

– Mejor respuesta de la frecuencia Quad DC

– Mayor capacidad de potencia RF

– Frecuencia del Quad drive aumentada a 1.4 MHz



Tecnología Agilent iFunnel El doble ion funnel elimina el exceso de gas

22

Fase 1

de Alta

Presión

Fase 2

de Baja

Presión

Linea de

Transfer

Fase 1

8-12 Torr

Fase 2

1-3 Torr

Desalineamiento de los ion funnels para prevenir el accesos de los neutros al MS



Mejor compromiso : Bajo contenido en Agua, bajo pH ACN:H2O:HAc (79:20:1, v:v:v)

n=3

1/4 sample/ solvent ratio

extract diluted 1:1

Sulyok M, Berthiller F, Krska R, Schuhmacher R. 2006. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20(18):2649-2659

Micotoxinas Evaluación de los métodos de extracción



Preparación de muestra Procedimiento universal de extracción

24

Sampling

1. Extraction

Centrifugation

2. Extraction

Centrifugation

Dry Down

Up-take

grind and homogenize sample + weight-in

acetonitrile:water:formic acid (80:19.9:0.1, v:v:v) 60 min at room temperature on a rotary shaker




Preparación de muestra Procedimiento universal de extracción

25

Sampling

1. Extraction

Centrifugation

2. Extraction

Centrifugation

Dry Down

Up-take




+ISTD



Sample preparation Universal extraction procedure

26

Sampling

1. Extraction

Centrifugation

2. Extraction

Centrifugation

Dry Down

Up-take




+ISTD

Agilent 6490 QqQ



Stable Isotope Dilution Assay (SIDA) HPLC method

27

Agilent 1290 Infinity LC system consisting of:

- binary pump

- wellplate sampler

- column compartment

- diode array detector (not used)

HPLC method

Separation column: ZORBAX Eclipse Plus C-18 RRHD column,

100 x 2.1 mm, 1.8 µm @ 30°C

Mobile phase: A: 5 mM HCOONH4+ 0.1% formic acid

B: methanol + 5 mM HCOONH4 + 0.1% formic acid

Flow: 0.35 ml/min

Gradient: 0.00 min 30 % B

0.50 min 30 % B

8.00 min 100 % B

9.50 min 100 % B

9.60 min 30 % B

Inj.Vol.: 3 µl



Stable Isotope Dilution Assay (SIDA) MS method

28

Spray chamber conditions:

Gas temp.: 140°C

Dry gas: 16 l/min

Nebulizer: 25 psi

Sheath gas temp: 350°C

Sheath gas flow: 11 l/min

Positive Negative

CapVoltage: 4000 V 3000 V

Nozzle voltage 0 V 0 V

DMRM : Automatic setup of MRM tables based on selected cycle time, retention times and

retention time windows for the individual compounds

• Cycle time 400 ms

• Interscan delay 3.5 ms

• Total No. of MRMs 33

• Maximum No. Of concurrent MRMs 12

• Minimum Dwell time 39.8 ms

• Maximum Dwell time 196.5 ms



Modo Dynamic MRM Comparación de MRM y DMRM

29

Time (min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Compounds (10/block)

Cycle Time (sec)

Max Coincident

Cycle Time (sec)

MRM

50 80

0.4 0.4 0.4 0.4

20 40 40

Dynamic MRM

0.5 0.8 1

30

Time Segment 1 Time Segment 2 Time Segment 3 Time Segment 4

0.7

100 70

• Cycle times 2x más cortos soporta picos cromatográficos más estrechos, más analitos o

dwell times más largos por analito.



Time >>>

Ab

un

da

nce >

>>

Concurrent

Compounds

30

Modo Dynamic MRM Simulación



5 x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

3.4

3.6

3.8 3.87

4.42

4.17

6.44

3.58

5.40

5.96 1.50

3.37 5.55

Counts vs. Acquisition Time (min) 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 5.8 6 6.2 6.4 6.6

Stable Isotope Dilution Assay (SIDA) Cromatograma

Debido a las mismas transiciones, se requiere una buena resolución

cromatogrçafica para :

• aflatoxina G1 y 13C-aflatoxina B1

• aflatoxina G2 y 13C-aflatoxina B2

31

DON T-2

FB1

FB2

ZEN

OTA

AFG2

AFG1

AFB2

AFB1

HT-2

Spiked maize sample, 6490 QqQ



Debido a las mismas transiciones, se requiere una buena resolución

cromatogrçafica para :

• fumonisina B2 y B3

Stable Isotope Dilution Assay (SIDA) Cromatograma

32

FB3

FB2

4 x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

Cpd 18: Fumonisin B2 + B3: +ESI MRM (706.4000 -> 336.4000)

6.461 58157

6.063 45538

Counts vs. Acquisition Time (min)

5.7 5.8 5.9 6 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8

FB3

FB2



Compuesto complicado debido a los bajos MRLs

• 0.1 µg/kg en cerales procesados para alimentación infantil

• 2 a 12 µg/kg in frutos secos y cereales

Calibración Interna sobre disolvente Aflatoxina B1

33

0.0075 ng/ml 0.0225 ng/ml 0.075 ng/ml Solapado de 4 calibraciones individuales

adquiridas en una worklist de 45 horas

S/N

74.1 (P2P)

S/N

204.4 (P2P)

S/N

532.5 (P2P)



Compuesto complicado debido a los bajos MRLs

• 0.5 µg/kg en cerales procesados para alimentación infantil

• 3.0 / 5.0 µg/kg en cerales procesados y no procesados

• 10.0 µg/kg en uvas pasas

Calibración Interna sobre disolvente Ocratoxina A

34

0.0077 ng/ml 0.0230 ng/ml 0.0765 ng/ml

S/N

8.6 (P2P)

S/N

13.8 (P2P)

S/N

25.3 (P2P)

Solapado de 4 calibraciones individuales

adquiridas en una worklist de 45 horas



Validación del método Condiciones experimentales y resultados

Rango de Linealidad (calibración externa en disolvente)

• 4 ordenes de magnitud para todas las toxinas, 5 ordenes para Aflatoxinas, T-2, y ZEN

Costes

• Precio adicional por ISTD por muestra entre 0.01 y 1.40 €

• Precio de los 11 ISTD por muestra < 2.00 €

Validación completa en maiz

• Maiz: - matriz para la cual la mayoria de micotoxinas están reguladas

- conocido por sus efectos matriz e interferencia

- representa mayores costes (tiempo y patrones)

• Adición de micotoxinas sobre material de referencia antes de la extracción

• Seis niveles de concentración y 3 replicados.

• Adición de micotoxinas marcadas con C13 antes del análisis para compensar los efectos de

matriz en ESI

• Sin limpieza de muestra



Blanco de maiz, contaminado con patrones antes del proceso de

extracción

Incluye la dilución 1:10 de matriz en el extracto final por el proceso de extracción (6490 Iny.directa)

Validación del método en maiz Extracción del blanco (mat.ref.) con adición de patrones

36

S/N

123.7 (P2P)

S/N

22.3 (P2P)

S/N

123.9 (P2P)

0.5 µg/kg 1.5 µg/kg 0.5 µg/kg 1.5 µg/kg

S/N

420.9 (P2P)

AFB1 OTA



Validación del método Resultados – Preparación de muestra

Eficacia de la extracción

• Calculada en base a la adición de patrones sobre blanco de matriz antes de la

extracción

• Primera extracción : 80% acetonitrilo (60 min)

- recuperación entre el 80 y 110% excepto para FB1 y FB2

• Segunda extracción: 20% acetonitrile content (30 min)

- mejora la recuperación de la extracción para FB1 y FB2 a

aprox. 90%

Efectos Matriz (Calculada por ITSD con C13 )

• Supresión de señal

− Entre un 50 y 60% para las aflatoxinas

− Aprox un 50% DON

• Amplificación de señal

− Fumonisinsa, HT-2, T2, OTA

• Compensación eficaz a traves de ISTD



Validación del método Resultados para maiz

38

Analito LOQ

en µg/kg

RA** en % ± RSD en %

Aflatoxin B1 0.04 105 6

Aflatoxin B2 0.04 100 4

Aflatoxin G1 0.05 101 5

Aflatoxin G2 0.24 101 8

Deoxynivalenol 2.5 99 9

HT-2 toxin 2.0 98 7

T-2 toxin 0.17 99 6

Ochratoxin A 0.23 93 7

Zearalenone 0.97 103 11

Fumonisin B1 2.5 101 10

Fumonisin B2 0.64 88 7

** promedio para los replicados y 6 niveles de concentración



Validación del método Resultados para los materiales oficiales de referencia

39

No Analyte assigned value a

± STDEV [µg kg-1]

measured value b

± STDEV [µg kg-1] Status c

TM_01 ZEN 83 ± 4.5 86 ± 10 ok

TM_02

Sum AFs 3.79 ± 1.67 4.6 ± 0.2 ok

AFB1 1.87 ± 0.83 2.3 ± 0.1 ok

AFB2 0.51 ± 0.23 0.6 ± 0 03 ok

AFG1 0.96 ± 0.43 1.0 ± 0 1 ok

AFG2 0.52 ± 0.23 0.7 ± 0.1 ok

TM_03 FB1 1650 ± 53 1960 ± 198 +

FB2 461 ± 16 496 ± 32 ok

TM_04 DON 1714 ± 64 1660 ± 145 ok

TM_05 DON 901 ± 55 908 ± 79 ok

ZEN 79 ± 13 84 ± 10 ok

TM_06 FB1 2630 ± 370 2300 ± 233 ok

FB2 690 ± 170 578 ± 38 ok

TM_07 FB1 270 ± 55 223 ± 23 ok

FB2 < 80 55 ± 4 ok



Validación del método Resultados para los materiales oficiales de referencia

40

No Analyte assigned value a

± STDEV [µg kg-1]

measured value b

± STDEV [µg kg-1] Status c

TM_08

Sum AFs 16.32 ± 2.03 13.3 ± 0.8 -

AFB1 15.47 ± 1.97 12.5 ± 0.8 -

AFB2 0.85 ± 0.17 0.6 ± 0.03 -

AFG1 < 0.1 0.2 ± 0.01 +

AFG2 < 0.1 < LOD ok

TM_09

Sum AFs 8.9 ± 0.13 d 8.3 ± 0.4 -

AFB1 7.4 ± 0.19 7.4 ± 0.4 ok

AFB2 0.7 ± 0.04 0.5 ± 0.2 ok

AFG1 < 0.1 0.4 ± 0.2 +

AFG2 < 0.1 < LOD ok

TM_10

Sum FB1+FB2 534 ± 33 598 ± 50 ok

FB1 442 ± 27 490 ± 50 ok

FB2 91 ± 6 108 ± 7 +

TM_11

Sum FB1+FB2 1194 ± 62 1180 ± 99 ok

FB1 987 ± 54 967 ± 98 ok

FB2 197 ± 10 212 ± 14 ok

TM_12

Sum FB1+FB2 1954 ± 126 2140 ± 183 ok

FB1 1626 ± 108 1800 ± 182 ok

FB2 328 ± 22 343 ± 22 ok E-Seminar, 11 Julio 2012


Validación del método Publicado recientemente en Anal. Bioanal. Chem, 402 (9) 2675-2686



Validación del método Romer LCMS Mycotoxin kit – desarrollado para ésta aplicación

42

Native mycotoxins:

• Mix 3 (fumonisins)

• Mix 9 (aflatoxins)

• Mix 8 (fusarium toxins)

• Ochratoxin

13C labeled mycotoxins:

• Mix 12 (13C fumonisins)

• Mix 11 (13C aflatoxins)

• Mix 10 (13C fusarium toxins)

• [13C20]-Ochratoxin



DMRM database for mycotoxins Customize your mycotoxin method

43

Multi-mycotoxin method for 242 mycotoxins and other fungal metabolites

has been developed

• Validated for different nuts

• Transitions are shortly available as DMRM database

Kojic acid

Dihydrolysergol

Festuclavine

Gibberelic acid

Erythromycin Mevastatin

Actinomycin D

Verrucofortine

Roquefortine C

T-2toxin

Ochratoxin A

Fumonisin B1

Aflatoxin B1



Resumen

45

Método UHPLC-MS/MS

• Notable mejora cromatográfica

Extracción de doble paso

• Mejora en la eficacia de la extracción especialmente para fumonisinas

Dynamic MRM con fast polarity switching

• Permite trabajar con el modo de Ionización más abundante y maximizar los dwell times en un solo análisis

Adición de Patrones Internos C13 después de la extracción

• Compensación de los efectos matriz

• Minimización de los costes

Recuperaciones de entre 88 y 105% para todas las micotoxinas

• Calculado sobre la extracción de blancos de maiz contaminados

• Validado por la correcta cuantificación de 18 materiales de referencia cubriendo todos los grupos de

toxinas

Sensibilidad acorde a los MRLs

• La mejor sensibilidad del G6490 permite omitir el paso último de concentración inyectando directamente

• Aún teniendo que reconstituir, el método es sencillo y fácilmente asequible a otros equipos menos

sensibles.



Proximamente....

46

September 11th and 12th

Training center, Waldbronn, Germany

Hands on training on QQQ method development and optimization

Limited to 10 students, Registration until August 15th

Registration: +49 800 603 1000

More details: http://www.agilent.com/chem/kundenschulung

LC/MS QQQ Expert Workshop

Food Analysis



http://www.agilent.com/chem/kundenschulung

[email protected]

Agradecimientos

• Elisabeth Varga

•Thomas Glauner

• Katharina Mayer

• Franz Berthiller

• Rainer Schuhmacher, Michael Sulyok, Rudolf Krska

• Biopure Reference Materials, Romer Labs Diagnostic GmbH, Tulln



http://www.romerlabs.com/

análisis de micotoxinas. método fácil, robusto y validado ... · beauvericina ergotamina,...

Documents